Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kilpirauhasen syöpä on yleisin hormonitoimintaan liittyvät syöpään yhä ilmaantuvuus viimeisen viiden vuoden aikana. Nykyiset hoidot kilpirauhassyöpä, kuten leikkaus tai radioaktiivista jodia hoito, vaativat usein potilaat olla elinikäinen tyroksiinia ja koska merkittävä uusiutuminen kilpirauhassyövän, uudet ennaltaehkäisevät säännöt ovat tarpeen. Tässä tutkimuksessa selvitetään omaisuuden luonnollisen ravinnon yhdiste löydetty cruciferous vihannekset, 3,3′-di-indolyylimetaani (DIM), kohdistaa metastaattisen fenotyypin kilpirauhassyövän solujen kautta toimiva estrogeenireseptorin.

Menetelmät /Principal havainnot

kilpirauhassyöpä solulinjoja käsiteltiin estrogeenin ja /tai DIM ja alistettiin

in vitro

tarttuvuus, muuttoliike ja invaasio määrityksiä tutkimaan antimetastaattisia ja anti-estrogeenisiä vaikutuksia DIM. Havaitsimme, että DIM estää estrogeenin välittämän kasvu kilpirauhasen solujen vaeltamiseen, tarttuvuus ja invaasio, joka tukee myös ER-α downregulation (siRNA) tutkimukset. Western blot ja zymografian analyyseihin suoraa näyttöä tästä DIM estoa E

2 tehostetun etäpesäke liittyvien tapahtumien nojalla kohdentamalla olennaista proteolyyttisten entsyymien, nimittäin MMP-2 ja MMP-9.

Päätelmä /Merkitys

tiedot raportit ensimmäistä kertaa, että DIM näyttää anti-estrogeenisiä kaltaista aktiivisuutta estämällä estradioli tehostetun kilpirauhassyöpä solujen lisääntymisen ja

in vitro

etäpesäkkeitä liittyviä tapahtumia, eli tarttuvuus, muuttoliike ja hyökkäystä. Mikä tärkeintä, MMP-2 ja MMP-9, joiden tiedetään edistää ja tehostaa etäpesäke, määritettiin olevan tavoitteita DIM. Tämä anti-estrogeeni kuten omaisuutta DIM voi johtaa kehittää uusia ennalta ehkäiseviä ja /tai terapeuttisia ravintolisä kilpirauhassyöpä potilaiden kohdentamalla sairauden etenemistä.

Citation: Rajoria S, Suriano R, George , Shanmugam A, Schantz SP, Geliebter J, et al. (2011) Estrogeeni aiheuttama Metastaattinen modulaattorit MMP-2 ja MMP-9 ovat kohderyhmä 3,3′-di-indolyylimetaani kilpirauhassyövän hoitoon. PLoS ONE 6 (1): e15879. doi: 10,1371 /journal.pone.0015879

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 lokakuu 2010; Hyväksytty 25 marraskuuta 2010 Julkaistu: 18 tammikuu 2011

Copyright: © 2011 Rajoria et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Cancer Institute 1R01CA131946 ja kliiniset rahoitusta New York silmän ja korvan sairaala, New York, New York. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ilmaantuvuus kilpirauhasen proliferatiivisten sairauksien (TPD) sisältäen kilpirauhassyöpä ja struuma, ovat yhä kilpirauhassyöpä on yleisin keskuudessa hormonitoimintaa syövistä [1], [2]. Viimeaikaiset tilastot osoittavat 37.000 uutta tapausta diagnosoitiin pelkästään Yhdysvalloissa vuonna 2009 ja maailmanlaajuisesti lähes 27 miljoonaa potilasta kärsii [2]. Hyvin eriytetty papillaarinen ja follikulaarinen kilpirauhassyövän variantteja osuus on yli 90% kaikista kilpirauhasen syövistä ja ovat invasiivisia metastaattinen [3]. Nykyiset hoidot TPD sisältää leikkaukseen liittyy täydellinen tai osittainen poistaminen kilpirauhasen, radioaktiivisen jodin (I

131), kemoterapia tai yhdistelmä kaikista [4]. Nämä hoidot vaativat usein potilasta ottamaan korvaavan kilpirauhashormonien koko elämän [4], [5] kanssa toistumisen määrä on liian korkea ja oli lähes 20-30% [5], [6]. Viime vuosina toistumisen määrä ja ei-vaste tavanomaisille kilpirauhasen hoitoja on noussut siten oikeuttaneet tutkimus uusien ennaltaehkäisy- ja hoitotoimenpiteet mieluiten luonnollisia yhdisteitä esiintyy ruokavalioon.

Ruokavalio on aina ollut ensiarvoisen tärkeää sen yhdistys syövän kehityksen ja ennaltaehkäisy [7] – [9]. Mitä tulee syövän ehkäisyä, useat tutkimukset ovat osoittaneet käänteisen yhdistys syöpäriskiä, ​​jossa kulutus oli ruokavalion tuotteiden, kuten tomaatit, soija ja cruciferous vihannekset [7] – [10]. Erityisesti cruciferous vihannekset, kuten parsakaali, lehtikaali, kukkakaali ja kaali on hyväksynyt useat organisaatiot, kuten National Cancer Institute ja Federal Drug Administration, on ennalta ehkäisevä vaikutus vastaan ​​kasvaimen kehitystä, erityisesti estrogeenin vastata kudosten [7], [8 ]. Cruciferous vihannekset sisältävät useita kasvien kemikaaleja kuten indoli-3-carbinol (I3C), joka on tehokas suun kautta chemopreventive aine rinta- ja eturauhasen syöpiä [11] – [13]. I3C spontaanisti muuntaa sen dimeerinen tuote, 3,3′-di-indolyylimetaani (DIM) alhaisessa pH: ssa [11] – [14]. DIM on stabiili yhdiste ja turvallisuuden arvioinnissa käy ilmi, että pitkäaikainen anto DIM (Jopa 12 kk) hiirillä ei johtanut minkäänlaista avointa munuais-, sydän- tai ruoansulatuskanavan myrkyllisyys [15]. Tämä viittaa siihen, että DIM voi olla lupaava luontaisesti bioaktiivisten yhdisteiden, joita voidaan käyttää syöpää aineena, koska se tarjoaa turvallisemman ja ennakoitavaa.

Tällä hetkellä, tarkka solun ja biokemiallisia mekanismi, jonka avulla DIM kykenee sen antikarsinogeenisia vaikutukset pysyy täysin selvitetty, mutta perustuu kirjallisuutta, DIM häiritsee eri signaalintransduktioreitteihin. Rinta- ja eturauhasen syövät, DIM on havaittu aiheuttavan annoksesta riippuvainen apoptoosi estämään AKT-kinaasin ja IKK-välitteisen IκBα fosforylaation, mikä johtaa inaktivaation AKT ja translokaation NFKB tumaan, mikä laski solujen kasvua ja proliferaatiota [16] , [17]. Lisäksi on raportoitu, että DIM kykenee sen chemopreventive vaikutuksia hormoniriippuvaisten syöpien, kuten rintasyövän, jonka säätelyä p21

WAFI /CIP1 ja aktivointi JNK-reitin [18]. Kiinnostavaa, yksi potentiaalinen kohde DIM: n toiminta on estrogeeniaineenvaihdunnan. Dalessandri et ai. on osoittanut, että DIM nostivat 2-hydroxyestrones postmenopausaalisilla naisilla, joilla on ollut rintasyöpä johtaa lisääntymiseen 2-hydroxyestrones ja 16a-hydroxyestrone suhde [19] mikä on lisännyt antiproliferatiivisia olosuhteissa. Smith et ai. ovat osoittaneet, että DIM, yhdessä phytoestrogen, Genistein voi moduloida estrogeeniaineenvaihdunnan kohti 2-hydroksylaation in estrogeeniherkkiä eturauhassyövän solut [20]. Viime aikoina olemme myös havainneet laboratoriossamme että DIM voi moduloida estrogeeniaineenvaihdunnan sairastavilla potilailla TPD johtaen kasvuun suhteessa 2-hydroxyestrones ja 16a-hydroxyestrone (julkaisematon data), mikä viittaa käytöstä ravinnon yhdisteiden, kuten DIM, vuonna TPD ehkäisy.

perusteella kaikki saatavilla olevat tiedot ja käsitelty kirjallisuudessa, tämä tutkimus suunniteltiin määrittämään mekanismi (t), joka vastaa syöpälääkkeen vaikutuksia HIMMENNYS kilpirauhassyöpä. Me raportoimme että DIM voi olla terapeuttisia vaikutuksia toimimalla kemiallis estävän aineen, jolla anti-estrogeenisiä ominaisuuksia kilpirauhassoluja nojalla vähen- tämisessä estrogeenin aiheuttamaa solujen fenotyypit tarttuvuus, invaasio ja muuttoliike. Tuloksemme osoittavat, että anti-estrogeeni kuten omaisuutta DIM johtuu kohdistettu ilmaus matriisin metalloproteinaasien (MMP: t), jotka ovat välttämättömiä proteaasit osallistuvat tarttuvuus, invaasio ja migraatio syöpäsoluja. Lisäksi se, että MMP: t ovat alle transkriptionaalisen säätelyn estrogeenin vaste-elementin (ERE) lainaa lisää uskoa, että DIM jolla on anti-estrogeenisiä ominaisuuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

neljä kilpirauhasen solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa, BCPAP (ihmisen papillaarinen kilpirauhassyöpä solulinja), 8505C (ihmisen papillaarinen kilpirauhassyöpä solulinja), CGTHW-1 (ihmisen follikulaarisen kilpirauhassyöpä solulinja) ja ML-1 (ihmisen follikulaarinen kilpirauhassyöpä). BCPAP, 8505C ja CGTHW-1 viljeltiin RPMI-1640 (Mediatech, Herndon, VA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Atlanta Biologicals, Atlanta, GA), penisilliiniä 10000 IU /ml, streptomysiiniä 10000 ug /ml (Mediatech) ja 2 mM L-glutamiinia (Mediatech) mL-1 kasvatettiin DMEM (Mediatech), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, penisilliini 10000 IU /ml, streptomysiiniä 10000 ug /ml, ja 2 mM L-glutamiinia. BCPAP, 8505C, CGTHW-1 ja ML-1 solulinjoja ostettiin DSMZ, Braunschweig, Saksa. MCF-7 (ihmisen rintasyöpäsolulinja) saatiin American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) ja niitä kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, penisilliini, streptomysiini, insuliinin ja L-glutamiinia.

Western Blot-analyysi

Solut kerättiin käyttämällä 0,25% trypsiiniä (Mediatech), pestiin PBS: llä, ja hajotettiin (1 x 10

6/100 ui lyysipuskuria) käyttäen radioimmunosaostuskokeella (RIPA) puskurissa [50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,2% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS: ää, 0,5% NP40, 1 uM Pefabloc] ja inkuboitiin jään päällä 30 minuutin ajan ajoittain vorteksoimalla. Lysaatteja sentrifugoitiin 14000 rpm 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantti otettiin talteen. Solulysaateista (20 ug proteiinia), tehtiin 12% SDS-PAGE pelkistävissä olosuhteissa (läsnä β-merkaptoetanoli), kuten aiemmin on kuvattu [21], [22]. Lyhyesti, proteiinit siirrettiin Immobilon-P-kalvoille 220 mA: ssa 2 tuntia ja membraanit blokattiin 4% maitojauhetta TBST [200 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl ja 0,01% Tween-20 lisättiin tuoretta /litra 1 x TBS: ää (TBST)] vähintään 2-3 tunnin ajan ravistelijalla huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen kalvoja inkuboitiin yli yön 4 ° C: ssa joko ER-α (Abcam, Cambridge, MA), ER-β (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), vasta-aine tai aktiini (Santa Cruz Biotechnology) TBST: ssä. Membraanit pestiin kolme kertaa TBST: llä ja inkuboitiin vastaavan piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta, 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa TBST, joka sisälsi 2% maitoa. Neljän pesun jälkeen TBS-T ja yksi pesu TBS, kalvot kehitettiin ECL alustan (Pierce Rockford, IL) ja havaittujen Denville autoradiografialla elokuvia.

XTT soluproleferaatiomäärityksessä

Kaksi tuhatta solut 200 pl: ssa väliaineessa maljattiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin yön yli, jotta solujen kiinnittyminen. Väliaine poistettiin ja 3,3′-di-indolyylimetaani (DIM), toimitti ystävällisesti Dr. Michael Zeligs (BioResponse, Boulder, Colorado) lisättiin pitoisuuksina joko 10, 25, 50, 75, 100 tai 500 uM yhteensä 200 ui ja inkuboitiin 24 tuntia. Media heitettiin pois ja tuoretta kasvualustaa lisättiin ilman DIM, minkä jälkeen lisättiin 50 ui XTT [1 mg /ml seerumivapaassa RPMI + fenatsiinimetosulfaatilla (25 nM)]. 4 tunnin inkubaation, OD otettiin mikrolevylukijalla 450 nm: ssä ja viite 630 nm: ssä. Keskiarvo OD-arvot laskettiin kullekin annos kunkin ajankohtina ja eloonjäämisprosentteina funktiona ajasta ja annoksesta käytettiin vertaamaan koe- ja kontrolliryhmissä.

klonogeeninen määritys

vaikutuksen määrittämiseksi DIM on kyky muodostaa klooneja, BCPAP, 8505C, CGTHW-1 ja ML-1-solut maljattiin kuuden kuoppalevyille (200 solua per kuoppa). Solujen annettiin kiinnittyä yön yli, jonka jälkeen tuore media, joka sisältää ± 10

-8 M E

2 ± 50 uM DIM lisättiin tai jätettiin käsittelemättä. 21 päivän jälkeen viljelmässä, solut kiinnitettiin ja värjättiin käyttäen 0,025% Coomassie brilliant blue R250 (50% metanolia ja 10% etikkahappoa) visualisoida solujen pesäkkeitä. Pesäkkeet laskettiin, ja prosentuaalinen esto kyky muodostaa klooneja määritettiin käsitellyistä soluista.

TranswellTM migraatiokokeessa

BD BioCoat Ohjaus lisäosien (BD Biosciences, Bedford, MA) ja 8-um huokosia kalvoon suodattimia käytettiin migraatiokokeessa kuten aikaisemmin on kuvattu [21], [23]. Lyhyesti, soluja ilman ravintoa 18 tuntia käyttäen nälkiinnityskasvatusaine [fenolipunaista väliaineessa, jota täydensi 10% hiilellä käsiteltyä FBS: aa (Sigma Chemical Co.) ja penisilliiniä (10000 IU /ml)]. Sitten solut kerättiin talteen trypsinaatiolla ja 2,5 × 10

4-soluja ympättiin ylemmässä kammiossa 500 ul: aan väliainetta, joka sisälsi 1% FBS ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestranttia ± 25 uM DIM. Alempi kammio sisälsi 750 ui elatusainetta, johon oli lisätty 5% FBS: ää. 18 tunnin inkubaation jälkeen ei vaeltavat solut poistettiin ylemmältä pinnalta kalvon varovasti pesemällä käyttäen pumpulipäinen vanupuikolla. Solujen alapinnalle kalvon kiinnitettiin sitten käyttäen metanolia ja värjättiin käyttäen 1% toluidiinisinisellä 1% booraksia tahra seurasi kaksi pesua tislatulla vedellä. Insertit annettiin sitten airdry ja laskettiin 10X alalla. Tiedot on ilmaistu määrä siirtää solua per 10X kenttä mikroskooppikuva kustakin näytteestä hyvin ja normalisoitiin solumäärät saatu käsittelemätön kontrolli.

Scratch Haavan Pitoisuus

muuttavien kykyä BCPAP, 8505C, CGTHW -1 ja ML-1-soluissa arvioitiin myös naarmu haava määritystä. 5 x 10

5 solua maljattiin kuuden kuoppalevyllä ja annettiin tarttua ja kasvaa 60-70% konfluentteja yksisoluiset kerrokset. Sen jälkeen, kolme pystysuoraa haavat johtuivat kuoppaa kohti käyttäen 2,5 ul: aan steriiliä pipetin kärjen ja poistamalla sen jälkeen mahdolliset soludebriksestä ja irrottaa solut. Haavoittunut Yksisolukerros inkuboitiin tuoreessa täydellinen median kanssa tai ilman 25 ja 50 uM DIM ja estradioli. Yhden vaakaviivan tehtiin visualisoimiseksi soluja samassa pisteessä. Solut tarkastettiin kolmen tunnin välein, kunnes alusta solujen ohjaus on siirretty kokonaisuudessaan yhdestä päästä haavan muihin, joka oli 24 tuntia BCPAP, 8505C ja CGTHW-1 ja 48 tuntia ML-1. Kuvat otettiin yläpuolella ja alapuolella merkin valomikroskoopilla 5x.

Soluadheesioanalyysi

BCPAP, 8505C, CGTHW-1 ja ML-1-solut kerättiin, kuten on kuvattu ja kylvetään tiheydellä 5 x 10

5 solua per kuoppa 6-kuoppaisille kulttuuri ruokia alusta täydennettynä ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrantti ± 25 uM DIM tai hoitamattomana ja annettiin kiinnittyä 2 tunnin ajan. Jälkeen ilmoitettuina ajankohtina, keskipitkän ei-kiinnittynyt soluihin heitettiin pois ja kuopat pestään varovasti kahdesti PBS: llä poistaa löyhästi kiinnittyneitä soluja. Kiinnittymättömät solut kaavitaan ja laskettiin käyttäen 0,4% trypan blue-liuosta (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Numerot kiinnittyneet solut laskettiin käyttäen hemosytometria ja vaikutus DIM soluadheesiota ilmaistiin prosentin lasku kiinnittynyt solumäärän varten solut, joita käsiteltiin DIM suhteessa kontrollisoluihin.

Invasion määrityksessä

Invasion määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [21] käyttämällä BD BioCoat kasvun Factor Reduced Matrigel Invasion kammioiden (BD Biosciences, Bedford, MA), 8 um huokosia kalvosuodattimia, jotka oli päällystetty matrigeeliä. Protokolla oli oleellisesti sama kuin migraatiokokeessa paitsi että kasvutekijä pienentää matrigeeliä invaasio kammiot rehydratoitiin 2 tuntia käyttäen seerumitonta RPMI-väliainetta 37 ° C: ssa ennen lastausta soluihin päälle lisää. Kun niihin lisätään, 2,5 x 10

4 solut uudelleensuspendoitiin RPMI (500 ui), joka sisälsi 1% FBS kanssa ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrantti ± 25 uM DIM ja siirrettiin varovasti yläpintaan suodattimien kammiossa. Solujen annettiin tunkeutua 18 tuntia, minkä jälkeen solut värjättiin ja laskettiin samalla tavalla kuin on kuvattu migraatiokokeessa. Prosentuaalinen invaasio laskettiin solujen prosenttiosuus tunkeutuvat läpi kasvutekijä vähentää matrigeeliä invaasio kammioihin verrattuna liikkuvien solujen säätämällä kalvon.

MMP havaitseminen

Kilpirauhasen soluja ympättiin tiheydellä 5 x 10

5 solua per kuoppa 6-kuoppaisille viljelylevyille ja annettiin kiinnittyä yön yli, jonka jälkeen ne kytketään seerumittomalle väliaineessa ja inkuboitiin ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrantti ± 25 uM DIM tai jätetään hoitamatta 24 tuntia. Väliaine kerättiin, sentrifugoitiin mahdollisten roskien poistamiseksi, ja alikvootteja säilytettiin -80 ° C: ssa kunnes analysoitiin MMP-2 ja MMP-9 eritystä ja toiminnan kuten aiemmin on kuvattu [24], [25]. Lyhyesti, kokonais-proteiinin pitoisuus elatusainetta määritettiin käyttämällä Bio-Rad proteiinimäärityksellä väriainetta ja yhtä suuri proteiineja käytettiin kussakin kokeessa. Sillä gelatiinitsymografialla, SDS-PAGE-geelit kopolymeroidaan 0,1% gelatiinia (Sigma Chemical Co.) ja 1 ug proteiinia erotettiin ei-pelkistävissä olosuhteissa. Elektroforeesin jälkeen geelit pestiin kahdesti rena- (2,5% Triton X-100 tislatussa vedessä) 1 h pyörivässä ravistelijassa. Tsymogrammeista inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen 36 tuntia 37 ° C: ssa zymografian puskurissa (5 mM CaCl

2, 0,2 mM NaN

3 ja 1 uM ZnCl

2 50 mM Tris HCl) puskurilla vaihtuu 12 tunnin välein. Sitten geelit värjättiin Coomassie-sinisellä (G-250 tahra, Bio-rad Laboratories, Hercules, CA), ja väri poistettiin 10% metanolia ja 7,5% etikkahappoa. Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen kunnostettua alustaa kilpirauhasen syöpäsolujen (yhtä proteiinia pitoisuuksina), kuten on kuvattu edellisessä kappaleessa käyttämällä MMP-2 ja MMP-9 (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA) vasta-aineita. MMP inhibitio, yleisesti MMP-estäjä 1,10 fenantroliini (Sigma Chemical Co.) käytettiin. 2.5 x 10

4 solut uudelleensuspendoitiin RPMI (500 ui), joka sisälsi 1% FBS kanssa ± 10

-8 ME

2 ± 20 uM 1,10 fenantroliini ± 25 uM DIM ja ympättiin BD BioCoat ohjaus Sisälaatikot muuttoliikkeen ja Matrigel päällystetty insertit Invasion kuvattu edellisissä kappaleissa.

siRNA ja transfektio olosuhteet

hiljentäminen estrogeenireseptori tutkimuksia, ER-α sirna (siRNA) ja siRNA transfektion reagenssia (DharmaFECT1) saatiin Dharmacon (Dharmacon, Inc., Lafayette, CO). BCPAP ja MCF-7-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Solut transfektoitiin 48 tuntia, ja sen jälkeen transfektoitiin solut kerättiin ja ympättiin BD BioCoat valvonnan Inserts (siirtymä) ja Matrigel päällystetty insertit (hyökkäys) väliaineessa, joka sisälsi 1% FBS ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrantti ± 25 uM DIM. Non-transfektoidut kilpirauhasen syöpäsoluja käsitellään ± 10

-8 M E

2 ± 10

-6 M fulvestrantti ± 25 uM DIM suoritettiin tarvittaessa positiivisesta kontrollista. Siirtyminen ja invaasion tutkimukset suoritettiin kuten kuvattu edellisissä kappaleissa.

tilastolasku

Kokeet esitetään tässä ovat kolme toistoa kanssa tilastollista merkittävyyttä määritetään käyttämällä pariksi opiskelijan

t

testi todennäköisyys ( ”

p

’arvo) ≤0.05 käytetty hylätä nollahypoteesin.

tulokset

kilpirauhasen solut ilmaista estrogeenireseptori

kilpirauhanen on ei tiedetä toimia perinteisen estrogeenin vastata kudosten, kuten rinnan. Sen määrittämiseksi tilan estrogeenin reseptorin kilpirauhassoluja käytimme neljää kilpirauhasen solulinjojen kuin meidän soluviljelymalleissa. BCPAP ja 8505C ovat ihmisen papillaarinen kilpirauhassyöpä solulinjoissa, CGTHW-1 ja ML-1 on ihmisen follikulaarisen kilpirauhassyövän solulinjoissa. Havaitsimme, että kaikki kilpirauhasen solulinjoista määritettiin ilmoitetaan sekä isoformia estrogeenireseptorin (ER), ER-α ja ER-β (Fig. 1) samalla tasolla. MCF-7, joka on klassisen ER ilmentävät rintasyövän solulinjaa käytettiin positiivisena kontrollina havaitsemiseksi sekä polymorfisten muotojen Keskeisten (ER-α ja ER-β).

kokosoluproteiinikuviot (20 ug) erotettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen Western blot-analyysin ER-α (laimennus 1:500), ER-β (laimennus 1:1000) ja aktiinin (laimennus 1:5000). Kaikki solulinjat tässä tutkimuksessa käytetyt (BCPAP, 8505C, CGTHW-1 ja ML-1) ekspressoivat sekä ER-α ja ER-β samalla tasolla.

DIM on anti-proliferatiivinen vaikutus kilpirauhassoluja

DIM, luonnollinen yhdistettä cruciferous vihannekset on havaittu olevan antiproliferatiivisia ominaisuuksia vastaan ​​useita hormoni reagoiva syöpiä [14], [16] – [18]. Halusimme vaikutuksen arvioimiseksi DIM proliferatiivinen aktiivisuus kilpirauhassyövän ja tehdäkseen näin on, XTT-määritys suoritettiin, ja tulokset on esitetty taulukossa 1. Kaikki solulinjat (BCPAP, 8505C, CGTHW-1 ja ML -1) tässä tutkimuksessa käytetyt käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla DIM 24 tuntia. Annosriippuvainen inhibitio solujen elinkyky havaittiin 50%: n inhibitio pitoisuutena noin 50 uM DIM aikana 24 h hoidon kaikki neljä solulinjoissa, BCPAP, 8505C, CGTHW-1 ja ML-1. Näiden havaintojen perusteella (taulukko 1), 25 uM DIM pitoisuus käytettiin edelleen luonnehtia vaikutuksia DIM kilpirauhassoluja sekä molekyyli- ja fenotyyppiset tasolla.

DIM estää klonogeeniset kyky kilpirauhasen solut

Yksi tunnusmerkki ominaisuudet syöpäsolujen on kyky jakaa mukaisesti eristetty olosuhteissa käyttäen mahdollisimman vähän parakriinisen ja mahdollisesti autokriininen tekijät [26]. Syövän vastainen vaikutus DIM kykyyn BCPAP, 8505C, CGTHW-1 ja ML-1 soluja jakautumaan rajattomasti arvioitiin jonka klonogeeniset solun eloonjäämisen määritys. Kaksisataa solua per kuoppa kuusikuoppaisille levyjä käsiteltiin 50 uM DIM ± estradiolia 21 päivää. Kuten on esitetty taulukossa 2, käsittelemättömien kilpirauhasen soluilla on kyky muodostaa klooneja, kun taas estrogeeni-hoito johti noin 8 (8505C) -33% (ML-1) lisäys klooni muodostumista riippuen solulinjoissa. DIM kumosi kokonaan klooni muodostumista kaikissa solulinjoissa riippumatta siitä, onko niitä käsiteltiin estradioli. Nämä kokeet vahvistaa ero reagointikykyä eri kilpirauhasen syöpäsoluja estradiolille ja anti-estrogeenisiä toimintaa DIM.

DIM vähentää muuttavia kykyä kilpirauhassoluja

kasvainsoluista on tehostettu kyky siirtyä ympäröiviin kudoksiin ja tietyt aineet, kuten estradioli on havaittu tukea tässä siirtymisprosessissa. Terapeuttisia aineita, joita voidaan alentaa kykyä näiden solujen siirtyä voi todennäköisesti tehokkaasti alentaa etäpesäkkeiden riski. Olemme aiemmin osoittaneet, että kilpirauhasen solut ovat kyky lisätä maahanmuuttoa vastauksena estrogeenin [21] ja onko DIM voi vaikuttaa muuttavia mahdollisuuksia näiden solujen,

in vitro

muuttoliike määritykset suoritettiin. Nälässä kilpirauhassoluja ympättiin siirtokuoppaan muuttoliikkeen kammio estradioli ± fulvestranttia tai ± 25 uM DIM ja annettiin siirtyä. Havaitsimme, että kilpirauhasen solut kykenivät muuttavien ja tämä kyky siirtää tehostui, kun solut käsiteltiin E

2 (harmaat palkit) verrattuna hoitamattomiin solujen 30%: n nousu muuttoa BCPAP, 50% 8505C, 89% for CGTHW-1 ja 63% ML-1 (Fig. 2A). Tämä lisäys solujen vaeltamiseen kumottiin, kun fulvestranttia käytettiin yhdessä estradioli [pilkullinen baaria) viittaa siihen, että leviämiskyky näiden kilpirauhassoluja vaikuttaa estrogeenin ja estrogeenireseptorin antagonisti on kumottu muuttoa näihin soluihin. DIM (25 uM) vähensi merkittävästi kulkeutumista kilpirauhassoluja (mustat palkit). Tämä lasku havaittiin olevan noin 37-57% ja oli solulinjan riippuvainen. Lisäksi lisäämällä estradioli yhdessä 25 uM DIM (raidalliset palkit) ei parantanut muuttavia kykyä kilpirauhassoluja merkitsee antiestrogeeni kuten kyky DIM.

(A) 2,5 x 10

4 solut resuspendoitiin 500 ul: aan RPMI 1% FBS ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrantti ± 25 uM DIM ja kylvetään ylemmässä kammiossa BD BioCoat valvonta lisäosien (8- um huokoskoko kalvosuodattimia). 750 ui RPMI: tä, joka sisälsi 5% FBS: ää, lisättiin alaosaan kuin kemoattraktantti. 18 tunnin kuluttua solut, jotka vaelsivat fiksoitiin, värjättiin ja laskettiin 10X tavoitteen. Ryhmät ovat seuraavat- käsittelemättömiä (valkoiset pylväät), E

2 käsitellään (harmaat palkit), E

2 + fulvestranttia (pisteviiva baaria), 25 uM DIM (mustat palkit) ja E

2 +25 uM DIM käsitelty (raidalliset palkit). Data ilmaistaan ​​solujen lukumäärä laskettiin (siirretty solut) kullekin näytteelle ja normalisoidaan solujen määrä on saatu käsittelemätön kontrolli. Tähti tarkoittaa tilastollisesti merkitseviä eroja (

p

0,05) välillä osoitti näytteiden. Scratch haavan määritys BCPAP (B) ja CGTHW-1 (C). 5 x 10

5 solua maljattiin, ja niiden annettiin kasvaa osittain konfluentteja yksisolukerroksiin, minkä jälkeen ”pystysuora haava” on luotu ja solujen annettiin sitten siirtyä, kun läsnä on joko 25 uM tai 50 uM DIM. Solut näkyviksi 5x kolmen tunnin välein ja valokuvaus dokumentointi tehtiin 18 tuntia, kun solut kokonaan siirretty toisesta päästä ”tyhjästä” muihin pää käsittelemättömiin verrokkeihin.

edelleen vahvistaa vaikutuksen dim muuttavaa valmiutta kilpirauhassoluja naarmu haava koe suoritettiin, joka on osittainen

in vivo

edustus metastaattisen fenotyypin [27]. Kilpirauhasen soluja (BCPAP, 8505C, CGTHW-1 ja ML-1) kasvatettiin 60-70% yksisolukerros minkä jälkeen muodostetaan naarmuja ja sen jälkeen inkubointi ± DIM. Olemme havainneet, että DIM vähensi migraatiota 50-60% (kuten havaittiin silmämääräisesti) annoksesta riippuvalla tavalla kilpirauhassolut [BCPAP (Fig. 2B) ja CGTHW-1 (Fig. 2C)]. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin 8505C ja ML-1 (tietoja ei esitetty). Olemme myös aiemmin havaittu, että estradioli vahvistaa muuttoliikkeen ja tähän siirtoon estyi fulvestrantti, samanlainen tyhjästä haava määrityksen tulokset Tässä tutkimuksessa saadut käyttämällä DIM [21].

DIM vähentää tarttumista kykyä kilpirauhassoluja

jotta onnistuneesti etäispesäkkeitä, kasvainsolujen tulee noudattaa soluväliaineen (ECM) toissijaisten elinten [26], [28]. Arvioimme vaikutus DIM tarttumisen kilpirauhassoluja suorittamalla adheesiomäärityksellä. Kilpirauhassoluja annettiin tarttua läsnäollessa 10

-8 ME

2 tai ± 10

-6 M fulvestranttia (klassinen estrogeenireseptorin antagonisti) ± 25 uM DIM 2 tuntia ja% tarttuvuus laskettiin (Fig. 3). Nostamalla tarttuvuuden havaittiin, kun solut käsiteltiin E

2 (harmaat palkit), joka kumotaan fulvestranttia (pilkullinen palkit) viittaa siihen, että tartunta on aktiivinen fenotyypin kilpirauhassoluja mahdollisesti edellyttää toiminnallista ER aktiivisuutta. Mielenkiintoista on, että merkittävä lasku tarttuvuuden havaittiin, kun soluja käsiteltiin 25 uM DIM (mustat palkit), jossa on 58% pienempi tarttuvuus BCPAP, 42% 8505C, 70% CGTHW-1 ja 45% ML-1 . Estradiolin ja 25 uM DIM (viivoitetut pylväät), ei parantamaan tarttuvuutta kilpirauhasen soluja, mikä viittaa siihen, että DIM voi estää estrogeenin parantuneen tarttuvuuden ja voi mahdollisesti toimia tehokkaasti anti-estrogeeni /metastaattinen ainetta, kuten lasku soluadheesiota DIM on samanlainen lasku tarttuvuus havaittu estrogeenireseptorin antagonisti fulvestranttia.

5 x 10

5 solut suspendoitiin täydelliseen alustaan, joka sisältää ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrantti ± 25 uM DIM ja maljataan 6 hyvin viljelymaljoihin. 2 tunnin kuluttua elinkelpoisten kiinni solut poistettiin raaputtamalla ja laskettiin trypan blue. Ryhmät ovat seuraavat- käsittelemättömiä (valkoiset pylväät), E

2 käsitellään (harmaat palkit), E

2 + fulvestranttia (pisteviiva baaria), 25 uM DIM (mustat palkit), ja E

2 + 25pM DIM käsitelty (raidalliset palkit). Data on ilmaistu% kiinni soluja käsittelemättömiin soluihin verrattuna, joka oli asetettu 100% tarttuvuuden. Yhdellä asteriskilla tarkoittaa tilastollisesti merkitseviä eroja (

p

0,05) välillä osoitti näytteiden.

DIM estää hyökkäyksen kilpirauhassoluja

muodostuminen toissijaisen metastaasipesäkkeiden kasvainsolujen edellyttää valtaavat ECM johdetun elinten [26] ja inhiboimaan tämän hyökkäyksen on strategia syövän hoito, joka on laajalti tutkittu. Vaikutus DIM invasiivista potentiaalia BCPAP, 8505C, CGTHW-1 ja ML-1 määritettiin käyttämällä Transwell hyökkäyksen kammio, joka on päällystetty biologisen matriisin

in vitro

(matrigeeliä). Kilpirauhasen soluja lisätyn siirtokuoppaan kammio estradioli ± fulvestranttia tai ± 25 uM DIM ja annettiin hyökätä läpi matrigeeliä. Havaitsimme, että kilpirauhasen solut kykenivät tunkeutumaan läpi matrigeelin ja hyökkäys nämä solut on parantunut, kun solut käsiteltiin E

2 (harmaat palkit), jossa on 40% lisäys invaasio varten BCPAP, 36% 8505C, 30% CGTHW-1 ja 31% ML-1 (Fig. 4). Tämä lisäys soluinvaasiota kumottiin, kun fulvestranttia käytettiin yhdessä estradioli (pilkullinen palkit) viittaa siihen, että estrogeenireseptorin antagonisti voi estää invasiivisia taipumus kilpirauhasen soluja. Vaikutuksen arvioimiseksi on DIM hyökkäystä kilpirauhassoluja kaikki solulinjat käsiteltiin 25pM DIM (mustat palkit) ja merkittävä lasku (

p

0,05) invaasio havaittiin. Tämä lasku invaasio oli noin 52% ja BCPAP, 50% 8505C, 80%, CGTHW-1 ja 48%: ML-1 verrattuna kontrollisoluihin (normalisoitu 100%: iin ja

p

0,05 ). Lisäksi pro-proliferatiivinen estradioli yhdessä DIM (viivoitetut pylväät), ei parantanut invasiivisia kykyä kilpirauhassoluja. Nämä tiedot viittaavat siihen, että DIM kumoaa estrogeeni tehostettu soluprosesseissa invaasion siten mahdollisesti kohdistaminen on merkittävä askel kasvainprogression ja etäpesäkkeitä.

2.5 x 10

4 solut uudelleensuspendoitiin 500 ui, joka sisälsi 1% FBS ± 10

-8 ME

2 ± 10

-6 M fulvestrantti ± 25 uM DIM ympättiin ylemmässä kammiossa kasvutekijän pienentää matrigeeliä hyökkäystä kammioita. 750 ui kasvualustaa, joka sisälsi 5% FBS: ää käytettiin kemoattraktantti alakammiossa. Prosentuaalinen invaasio laskettiin solujen lukumäärä valtaavat kammioiden läpi suhteessa liikkuvien solujen säätämällä kalvon 18 tunnin jälkeen. Ryhmät ovat seuraavat- käsittelemättömiä (valkoiset pylväät), E

2 käsitellään (harmaat palkit), E

2 ja ICI (pisteviiva baaria), 25 uM DIM (mustat palkit) ja E

2 25pM DIM käsitelty (raidalliset palkit). Tiedot edustettuina% invaasio joka on keskimääräinen lukumäärä tunkeutuneet solua per 10X kenttä mikroskooppikuva kustakin näytteestä hyvin suhteessa migraation kautta kontrollimembraanilla ja normalisoitiin käsittelemättömään kontrolliin. Tähti tarkoittaa tilastollisesti merkitseviä eroja (

p

0,05) välillä osoitti näytteiden.

DIM tukahduttaa estrogeenin aiheuttama MMP eritystä

MMP ovat luotettavia markkereita kasvaimen soluinvaasiota ja muuttoliike. Lisäksi pahanlaatuisia kasvaimia tiedetään kasvaneen MMP ilmaisuja verrattuna hyvänlaatuisia kasvaimia, joka aiheuttaa hajoamista soluväliaineen, mikä lisää invaasion ja kasvainsolujen vaeltamista [29], [30]. Fytokemikaaleja, kuten genisteiini ja I3C on osoitettu kohdistaa aktiivisuus ja eritys MMP: iden estrogeenin reagoiva syövissä [31]. Aktiini käytettiin latauskontrollina.