Krooninen sairaus

tiivistelmä

galektiini-3 (Gal-3), 31 kDa perheenjäsen beta-galactoside- sitovia proteiineja, on liitetty etenemistä eri ihmisen syövissä. Kuitenkin ehdotettu roolit vaihtelevat suuresti aina kasvain edistäviä solutoiminnoille ja negatiivinen vaikutus potilaan ennusteeseen kasvaimeen ehkäisevästä ominaisuuksia ja positiivisia ennustetekijöiden vaikutus. Me ja muut ovat aikaisemmin tunnistettu Gal-3 yliekspressoitiin haimasyövän verrattuna krooninen haimatulehdus ja normaalin haiman kudosta. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli siis kattava analyysi otaksutun solutoiminnoille Gal-3 ohimenevä sekä vakaa hiljentäminen tai yliekspressio Gal-3 paneelin 6 vakiintunut haimasyövän solulinjoissa. Meidän tulokset vahvistavat, että galektiini-3 on säädelty mRNA-tasolla haimasyövän ja ilmentyy voimakkaasti suurimmassa osassa haimasyövän solulinjoissa. Yksittäisissä solulinjoissa, ohimenevä knockdovvn Gal-3 ilmentyminen johti kohtalaisesti estävä vaikutus jakaantumiseen, kulkeutumiseen tai kiinnittymisestä riippumaton solujen kasvua, mutta nämä vaikutukset eivät olleet yhdenmukaiset kirjon analysoitiin solulinjoja. Lisäksi toiminnalliset vaikutukset modulaation Gal-3 ilmaisua ei havaittu vakaa Knockdown tai yliekspressio lähestymistapoja

in vitro

ei muuttanut kasvuominaisuudet nude mouse ksenograftikasvaimissa

in vivo

. Tietomme eivät näin ollen tue suoraa toiminnallista roolia Gal-3 pahanlaatuisiin haiman epiteelisolujen, vaikka parakriinistä tai systeemisiä vaikutuksia Gal-3: n ekspressio ei ole suljettu pois.

Citation: Hann A, Gruner Chen Y, Gress TM, Buchholz M (2011) Kattava analyysi Cellular galektiini-3 paljastaa ole johdonmukaista onkogeeninen Tehtävä haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 6 (6): e20859. doi: 10,1371 /journal.pone.0020859

Editor: Iris Schrijver, Stanford University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 10 toukokuu 2011; Julkaistu: 16 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Hann et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoitettiin osittain Saksan liittovaltion opetus ja tutkimus (BMBF) puitteissa on NGFN ohjelman lääketieteellisen genomitutkimuksen (PaCa-Net; projekti ID PKB-01GS08) sekä EU FP6 apurahan LSHB-CT-2006- 018771 (Integrated Project ”MolDiag-Paca”). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma, yleisin haimasyövän, on yleinen 5 vuoden pysyvyys on alle 5%. Yli 80% potilaista läsnä kehittynyt taudin vaiheessa ilman mahdollisuutta mahdollisten parantavaa tuumoriresektion [1], [2]. Vaikka kemoterapia yhdistettynä pienimolekyylinen estäjä kohdistaminen EGF-reseptorin signalointi on viime aikoina osoitettu johtavan vaatimaton, mutta merkittävää kasvua eloonjääminen paikallisesti edennyt tai etäpesäkkeitä, ennuste on edelleen synkkä, jossa mediaanielossaolosta enintään 6,2 kuukautta [3] . Niinpä uusia diagnostisia ja hoitomenetelmiä, jotka parantavat tulos tarvitaan kiireesti.

Perheen beeta-galaktosidi-sitovia proteiineja (Galectins) on 14 jäsentä nisäkkäillä. Yhteinen piirre, joka erottaa Galectins muista lektiinit on niiden hiilihydraatti-tunnustamista domain. Galektiini-3 (Gal-3), 31 kDa tämän perheen jäsen, on yhdistetty erilaisia ​​kasvaimia, vaikkakin hyvin erilaisia ​​rooleja [4]. Gal-3 yliekspressio syöpäkudoksessa on liittynyt huonoon ennusteeseen eri syöpätyyppejä kuten maksasyövän [5], [6], kirkas cell munuaissyöpä [7], [8] ja virtsarakon syöpä [9]. Toisaalta, vähentää Gal-3: n ekspressio tuumorikudoksessa verrattuna normaalissa kudoksessa on raportoitu munasarjasyöpä [10], kohdun adenokarsinooma [11], rintasyöpä [12], [13] ja kohdunkaulan neoplasian [14]. Kolorektaalisyövässä, raportit ovat olleet ristiriitaisia. Jotkut kirjoittajat kuvaavat positiivisen yhdistys korkeita Gal-3 ilmentyminen kehittyneitä kasvain vaiheissa ja huonon ennusteen [15] – [17], kun taas toiset korreloi vähentynyt ilmentyminen Gal-3 huonon ennusteen [18] – [20]. Mahasyövän, Okada et ai raportoi, että alennettu Gal-3 ilmentyminen korreloi imusolmuke etäpesäke ja kehittynyt kasvain vaiheessa [21], kun taas kaksi muuta ryhmää tunnistettu lisääntynyt ilmentyminen Gal-3 mahasyövän, mutta ei löytänyt korrelaatio histopatologinen erilaistumista tai syövän etenemistä [22], [23].

huolimatta ristiriitaisia ​​tuloksia mahdollisesta ennustetekijöiden roolin Gal-3 ilme, jotkut raportit ovat kuvanneet kasvainta edistävät toiminnot Gal-3 kasvainsolulinjoissa

in vitro

. Knockdown Gal-3 vähensivät solujen kulkeutumista ja solujen kasvun eturauhassyövän soluissa [24], tehostettu apoptoosin mahasyövän soluissa [25], ja se esti

in vitro

pesäkkeiden muodostumisen sekä paljaan hiiren ksenografti induktio rintasyöpäsoluissa [26]. Me ja muut ovat aiemmin osoittaneet, että Gal-3 on jatkuvasti yli-ilmentynyt haimasyövän verrattuna sekä krooninen haimatulehdus ja normaalin haiman [27] – [30]. Kuitenkin tutkimukset mahdollinen toiminnallinen rooli Gal-3 ilmentymisen haimasyöpäsoluissa ei ole raportoitu. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli siis kokeellisesti vaikutusten arvioimiseksi yli-ilmentymisen tai knockdovvn Gal-3 kattavia haimasyövän solulinjoissa (PATU 8988s, Patu 8988t, S2-007, S2-028, IMIM-PC-1 ja MIA PaCa-2). Funktionaaliset analyysit sisältyvät määritykset solujen elinkelpoisuuden, apoptoosin, jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja ankkurointi riippumatonta kasvua sekä kasvaimen kasvua vierassiirrännänmallissa hiirimallissa. Sen lisäksi yksittäisiä vaikutuksia yhden solulinjoissa, modulaatio Gal-3 ilmaisu ei ollut johdonmukaista vaikutusta kasvaimen koskevat ominaisuutensa haiman syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ihmiskudokset ja solulinjoissa

ihmisen haiman adenokarsinoomasolulinja IMIM-PC-1 [31] oli ystävällisesti FX Real (Instituten Municipale de Investigacion Medica, Barcelona, ​​Espanja). S2-028 ja S2-007 [32] olivat T. Iwamura (Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japani). MIA PaCa-2 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, RMD, USA). Patu 8988t ja Patu 8988s oli ystävällisesti H.P. Elsässer (Institut für Klinische Zytobiologie und Zytopathologie, Philipps Universität, Marburg, Saksa). Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä Dulbeccon modifioidussa olennaisessa vähimmäisalustassa (GIBCO, Invitrogen Corp., NY, USA) täydennettynä 10% FCS: ää (GIBCO, Invitrogen Corp., NY, USA) ja gentamysiiniä 0,045 mg /ml (GIBCO, Invitrogen Corp. , NY, USA).

Ethics lausunto

Kirurgisesti toistoleikattiin haiman adenokarsinooma ja krooninen haimatulehdus kudokset antamat kirurgian osastojen yliopistoissa Ulm ja Homburg /Saar. Normaali haima näytteet saatiin terveistä alueiden rajoilla krooninen haimatulehdus resectates. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ennen käyttämällä kudosnäytteistä. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea yliopistossa Ulm, Saksa (Ethikkommission der Universität Ulm) sekä eettinen komitea yliopistossa Homburg /Saar, Saksa (Ethikkommission der Universität Homburg).

Transfektio solulinjojen

sirna (siRNA) transfektoitiin Patù 8988s, S2-007 ja S2-028 soluihin käyttäen siLentFect Lipid reagenssia (Bio-Rad, Munchen, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa. SiRNA-transfektiolla MIA PaCa-2-soluissa tehtiin käyttämällä Transmessenger reagenssia (Qiagen, Hilden, Saksa) ja IMIM-PC-1-solut transfektoitiin X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent (Roche, Mannheim, Saksa) mukaan valmistajan protokollien, vastaavasti. Gal-3-spesifinen siRNA: t olivat: Sigal-3-1, Hs_LGALS3_1 FlexiTube siRNA SI00470036 ja Sigal-3-2, Hs_LGALS3_2 FlexiTube siRNA SI00470043 (Qiagen). Äänenvaimennin negatiivinen kontrolli Ambion käytettiin ei-hiljentäminen ohjaus.

Gal-3 ekspressiovektori rakennettiin kloonaamalla PCR-monistettu Gal-3: n avoimen lukukehyksen pcDNA V3.2 /V5 dest vektoriin käyttäen Gateway rekombinaatio kloonauksen tekniikka (Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Saksa). Transfektion jälkeen Patu 8988t soluihin käyttämällä Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen), valinta on stabiilisti transfektoitu solukloonien suoritettiin lisäämällä 800 ug /ml G418: aa elatusaineeseen.

Gal-3-spesifinen shRNA ekspressiokonstrukti että pGIPZ vektori hankittiin Open Biosystems, Huntsville, AL, USA (kissa. # RHS4430-99137619). Ei-hiljentäminen shRNAmir (cat. # RHS4348, Open Biosystems) käytettiin negatiivisena kontrollina. Stabiili transfektointi S2-007 solujen suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Stabiilisti transfektoidut kloonit valittiin lisäämällä hygromysiiniä (400 ug /ml), kasvatusalustaan.

RNA uuttaminen ja qRT-PCR

RNA solulinjoissa uutettiin käyttäen peqGold Kokonais-RNA Kit (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa. Bulk tuumorikudoksen homogenisoitiin kuivajäässä /nestetypessä käyttäen huhmaretta ja survinta. RNA uutettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen) mukaan valmistajan protokollaa. Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin 1 ug kokonais-RNA: sta käyttäen Omniscript RT Kit (Qiagen) valmistajan protokollan. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) suoritettiin käyttäen SYBR Green MASTERMIX (Applied Biosystems, Wellesley, MA, USA) ja erityiset alukeparit suunniteltu PrimerExpresss ohjelman (Applied Biosystems). Seuraavia alukepareja käytettiin qRT-PCR: ribosomaalinen proteiini, suuri, P0 (RPLP0) FWD: 5′-TGGGCAAGAACACCATGATG-3 ’; rev. 5’-AGTTTCTCCAGAGCTGGGTTGT-3 ’; Galektiini-3 fwd: 5’-AGAGGGAATGATGTTGCCTTCC-3 ’; rev: ACAATGACTCTCCTGTTGTTCTCATT-3 ’.

Solunosafraktiointi ja immunoblottaus

Solunosafraktiointi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [33]. Lyhyesti, solut pestiin kahdesti jääkylmässä PBS: llä ja otettiin talteen sentrifugoimalla 1,600 rpm 4 ° C: ssa. Lysaatit sitten uudelleen puskuriin A (10 mM Hepes, pH 7,9; 10 mM KCI; 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT: tä, proteinaasi-inhibiittorit) 15 minuutin ajan ja sen jälkeen sentrifugoitiin 20 min ajan 3,600 rpm Supernatantit siirrettiin uusiin kupit ja sentrifugoitiin 14000 rpm vielä 4 minuuttia. Pelletit resuspendoitiin 30-100 ml puskuria C (20 mM Hepes, pH 7,9; 0,4 M NaCl; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1 mM DTT; proteinaasi-inhibiittorit) ja inkuboitiin jäillä 30 min. Viimeinen sentrifugointivaihe 14000 rpm 10 min suoritettiin erottaa tumaproteiinien solujätteistä. Western blotting, tuloksena tumaproteiiniuutteet ajettiin elektroforeesilla 7,5% SDS-polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin PVDF Immobilon-P -kalvoille (Millipore, Bedford, MA, USA), kuten aiemmin on kuvattu [34]. Membraanit tutkittiin käyttämällä koettimena joko anti-Gal-3 (hiiren monoklonaalinen, cat. # A3A12, Abcam, Cambridge, UK), anti-ORC2 (polyklonaalinen kani, kissa. # 559266, BD Biosciences), anti-PARP (kanin polyklonaalinen, cat . # 9542, Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA), tai anti-β-aktiini (hiiren monoklonaalinen, cat. # A1978, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MI, USA) vasta-aineita, jotka on pesty TBS pesupuskurilla ja inkuboitiin peroksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita. Parannettu kemiluminesenssin reaktio järjestelmä (Roche) käytettiin visualisointiin.

MTT solunelinkykyisyysmääritys

Solut siirrostettiin 24 tunnin kuluttua transfektio 3,9 cm

2 ruokia 60000 100000 solua /kuoppa . Kun on kulunut vielä 24 h tai 48 h, elatusaine korvattiin MTT sisältävässä väliaineessa (tiatsolyyli sininen, Carl Roth, Karlsruhe, Saksa) ja maljaa inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa. MTT sisältävä väliaine korvattiin liuottamisen liuosta (10% Triton X-100 (Carl Roth), 0,1-molaarista suolahappoa (Fisher Scientific, Schwerte, Saksa) liuotettiin isopropanoliin (Sigma-Aldrich)) ja ekstinktio mitataan aallonpituudella 570 nm. 48 h arvot jaettiin 24 h arvot korjata mahdolliset vaihtelut määrä ympättiin soluja.

BrdU-solujen lisääntymisen määrityksessä

DNA: n replikaatioon, koska suoran mitan mitoosi-aktiivisuus mitattiin käyttäen Cell leviämisen ELISA, BrdU kemiluminesenssin Kit (Sigma) mukaisesti valmistajan protokollaa. Lyhyesti, 5000 ja 10000 solua siirrostettiin 24 tuntia transfektion jälkeen 96-kuoppaiselle μClear (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Saksa). BrdU sisältävä väliaine lisättiin 4 tai 6 tuntia. Poistamisen jälkeen BrdU sisältävää väliainetta, solut kiinnitettiin 1 h ja sen jälkeen inkuboitiin peroksidaasiin konjugoitua anti-BrdU-vasta-aineen 1,5 tuntia. Kemiluminesenssi reaktio mitattiin suhteellisen kevyt yksikköä sekunnissa (RLU /s).

Trail aiheuttaman apoptoosin

Jotta ulkoisesti apoptoosin Patu 8988s soluissa, 300000-soluja siirrostettiin 9,6 cm

2 kulttuuri ruokia ja käsiteltiin Trail proteiinia (R CP: krooninen haimatulehdus; NP: normaali haima. Proteiinin ilmentymistä eri haimasyövän solulinjoissa määritettiin Western blot (C) analyysit. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Expression taso Gal-3 ei ole vaikutusta kasvainsolujen kasvua

in vitro

arvioimiseksi toiminnallista roolia n poikkeavasti ilmaisi Gal-3 haiman syöpäsoluissa, Gal-3 oli ohimenevästi tai yli-ilmentyy tai vaiennettu eri haimasyövän solulinjoissa ja vaikutukset analysoidaan eri

in vitro

funktionaalisia määrityksiä. Ohimeneviä hiljentäminen, kaksi riippumatonta siRNA-sekvenssejä samoin kuin ei-hiljentäminen ohjaus siRNA käytettiin. Kunkin viiden solulinjojen analysoitiin (Patù 8988s, S2-007, S2-028, IMIM-PC-1 ja MIA PaCa-2), transfektioreagenssit ja-ehdot ovat optimaalisesti pudotus tehokkuutta 80% (kuvio. 2A).

(A) ohimenevä pudotus Gal-3 suoritettiin ohimenevän transfektion useiden solulinjojen kahdella eri Gal-3-spesifinen siRNA-sekvenssejä (Sigal-3 1 ja 2) tai ei-hiljentäminen ohjaus siRNA (NC). (B) Stable Knockdown in S2-007 suoritettiin käyttäen shRNA ilmentämiskonstruktioiksi. Kolme Gal-3-spesifinen shRNA transfektoidut kloonit (shGal-3 1, 2 ja 3) ja kolme nonsilencing ohjaus shRNA transfektoidut kloonit (SHC 1, 2 ja 3), valittiin lisäanalyysiä varten. (C) stabiili yliekspressio Gal-3 saatiin aikaan transfektoimalla Patu 8988t solut Gal-3-ekspressiovektoriin (PGAL-3 1, 2 ja 3) tai kontrollivektori (pC 1 ja 2). U tarkoittaa transfektoimattomiin soluihin. Kokosoluliuotteista analysoitiin qRT-PCR (ylempi paneeli) ja Western blot (alempi paneelit) Gal-3 ekspressiotasot. Gal-3-mRNA: n tasot määritettiin suhteessa RPLP0. Sigal-3 1 ja 2 normalisoitiin NC. β-aktiini käytettiin lastaus kontrollina Western blotit.

Stable pudotus klooneja käyttäen S2-007 transfektoitujen solujen shRNA sekvenssit kloonattiin pGIPZ vektoriin. Kolme stabiilisti transfektoidut kloonit sekä kolme kontrollivektorilla transfektoidut kloonit valittiin lisäanalyysiä varten (Fig. 2B).

Koska Patù 8988t solut osoittivat erittäin matala endogeeninen Gal-3 tasoa, tämä solulinja valittiin rakentamiseen vakaa Gal-3 yliekspressoivia klooneja. Kolme riippumatonta kloonia perustettiin. Kaksi näistä osoitti kohtalaista yli-ilmentyminen yhdistelmä-Gal-3: n mRNA, joka oli paljon selvempi proteiinitasolla (Fig. 2C, kaistat 4, 6). Jäljellä oleva klooni ei osoittanut merkittävää rekombinantti Gal-3 (Fig. 2C, kaista 5), ​​mutta on sisällytetty edelleen kokeissa lisäohjaus klooni. Mielenkiintoista, ohjaus kloonit transfektoitu tyhjällä vektorilla osoitti myös hieman kohonnut Gal-3 tasoa (Fig. 2C, kaistat 2, 3).

Ensimmäisessä toiminnallista määritystä, vaikutus Gal-3 ilmentymisen solun elinkelpoisuuden analysoitiin MTT määrityksissä. Kumpikaan ohimenevä Knockdown missään 5 testattujen solulinjojen, eikä vakiintunutta knockdown in S2-007 soluissa tai stabiili yliekspressio Patu 8988t soluissa ollut merkittävää vaikutusta solujen elinkelpoisuuteen tavanomaisissa viljelyolosuhteissa verrattuna soveliaita laitteita (Fig. 3 A- C).

Väliaikaisesti Gal-3 vaiennetaan solulinjoja (A), stabiilisti Gal-3 vaiennetaan S2-007 solukloonien (B) tai stabiilisti Gal-3 yli-ilmentävät Patù 8988t solukloonien (C) viljeltiin 24 ja 48 h jälkeen inkuboitiin MTT-reagenssilla. 48 h arvot jaettiin 24 h arvot (korjaamaan mahdollisia vaihteluita määrä kylvetään soluja) ja normalisoitu ohjaamaan siRNA transfektoituja soluja (NC). Arvot vakaa Gal-3 pudotus solukloonien (shGal-3 1, 2 ja 3) ja vakaa Gal-3 yliekspressoivassa solukloonien (PGAL-3 1, 2 ja 3) oli normalisoitu keskiarvo kontrollivektorilla transfektoidut vakaa solukloonien ( SHC 1, 2, 3 ja pC 1, 2) vastaavasti. Data sisältää vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta.

analyysi soluproliferaation käyttämällä BrdU määrityksiä paljasti kohtalainen, mutta merkittävä inhibitio proliferatiivisen aktiivisuuden S2-028 soluissa sen jälkeen, kun pudotus Gal-3 (Fig. 4A , paneeli 3). Kuitenkin suuntaus vähentää leviämisen ei saavuttanut merkitystä Patu 8988s ja S2-007 solujen puuttui IMIM-PC-1 ja jopa päinvastaiseksi MIA PaCa-2-solut (Fig. 4A). Kumpikaan vakaa Knockdown vuonna S2-007 soluissa, eikä vakiintunutta yliekspressio Gal-3 Patu 8988t soluissa ollut merkittävää vaikutusta proliferaatioon tuloksena solukloonien.

Ohimenevästi Gal-3 vaiennetaan solulinjoja (A), stabiilisti Gal-3 vaiennetaan S2-007 solukloonien (B) tai stabiilisti Gal-3 yli-ilmentävät Patù 8988t solukloonien (C) viljeltiin BrdU aineen 2 tai 4 tuntia. BrdU lisääntyvien solujen mitattiin ELISA. Arvot soluja transfektoitiin ohimenevästi eri Gal-3-spesifinen siRNA: ita (Sigal-3 1 ja 2), normalisoitiin ohjaamaan siRNA transfektoitujen solujen (NC). Arvot vakaa Gal-3 pudotus solukloonien (shGal-3 1, 2 ja 3) ja vakaa Gal-3 yliekspressoivassa solukloonien (PGAL-3 1, 2 ja 3) oli normalisoitu keskiarvo kontrollivektorilla transfektoidut vakaa solukloonien ( SHC 1, 2, 3 ja pC 1, 2) vastaavasti. Data sisältää vähintään kolmen erillisen kokeen. * Osoittaa

p

0,05 verrattuna ohjaus siRNA transfektoidut solut (kaksipuolinen parittomia

t

-testi).

Myös ohimenevää Gal-3 knockdown ei ollut vaikutusta apoptoottista aktiivisuutta (mitattuna PARP pilkkominen) PATU 8988s solujen puuttuessa (Fig. 5, kaistat 1-4) tai läsnä (Fig. 5, kaistat 5-8) että ulkoisten apoptoosin indusoija Trail. PARP pilkkominen indusoitiin transfektoimalla menettelyä ja oli huomattavampi, kun läsnä on Trail (Fig. 5, kaistat 2 ja 6), mutta sitä ei ole vielä parantaa pudotus Gal-3 (Fig. 5, kaistat 3-4 ja 7 -8).

solut transfektoitiin väliaikaisesti Gal-3-spesifinen siRNA: ita (Sigal-3 1 ja 2), nonsilencing ohjaus siRNA (NC) tai transfektoimattomat solut (U) analysoitiin Western blot poly ADP-riboosi polymeraasi (PARP) pilkkominen. Lisääntynyt pilkkominen, osoitetaan parannetun signaali alemman kaistan, tuli esiin kaikissa transfektoiduissa soluissa. PARP pilkkominen tehostui käsittelemällä ulkoista apoptoosin indusoija Trail, mutta ei vaikuttanut Gal-3 knockdown. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. Esitetyt tulokset edustavat kolmea erillisiä kokeita.

replikointi tämän koesarja seerumittomissa olosuhteissa tuotti samankaltaisia ​​tuloksia, koska se ei ole osoittaa mitään johdonmukaista vaikutuksen modulaation Gal-3 ilmentymisen solun kasvuun tai apoptoosin testattu solulinjoissa (tuloksia ei esitetty).

epäjohdonmukainen vaikutus Gal-3 solumigraatio

ext analysoitu vaikutuksen Gal-3 ilmentymisen solun muuttoliikettä Boyden kammio määritys. Solut pystyivät transmigrate suodattimen läpi pitkin vasikan sikiön seerumia kaltevuus. Numerot ohimenevästi Gal-3 vaiennetaan siirtynyt solujen normalisoituivat kuin hiljentäminen ohjaus siRNA transfektoiduista soluista. Ohimenevä Knockdown Gal-3 johti suuntauksena vähentynyt soluvaelluksen kolme viidestä analysoitiin solulinjoja, vaikka tämä vaikutus ei saavuttanut merkitystä useimmissa tapauksissa (Fig. 6A). Lisäksi tämä vaikutus ei toisteta S2-007 solukloonien vakaan Gal-3 taintumisen (Fig. 6, B). Päinvastaisessa analogisesti tuloksia ohimeneviä pudotus kokeissa, stabiili yliekspressio Gal-3 Patù 8988t soluissa indusoi lisääntymässä solujen vaeltamiseen (kuvio. 6, C), vaikka tämä suuntaus taas ei saavuttanut merkitystä, ja se oli ilmeinen myös klooni PGAL-3 2, joka osoitti vähän tai ei ollenkaan rekombinantti Gal-3 (katso Fig. 2C). Yhdessä modulaatio Gal-3 ilme oli lievä ja melko epäjohdonmukainen vaikutus Boyden kammiossa määrityksissä, siis väittää vastaan ​​on tärkeä rooli solujen Gal-3 in suunnattu migraatio haiman syöpäsoluja.

Ohimenevästi Gal- 3 vaiennetaan solulinjoja (A), stabiilisti Gal-3 vaiennetaan S2-007 solukloonien (B) tai stabiilisti Gal-3 yli-ilmentävät Patù 8988t solukloonien (C) viljeltiin Boyden-kammiossa insertit 2 tai 4 tuntia. Liikkuvien solujen huokosten läpi uppo pitkin vasikan sikiön seerumia kaltevuus kiinnitettiin, värjättiin metyleenisinisellä ja laskettiin valomikroskoopilla. Numerot siirtyneet solut transfektoitiin ohimenevästi eri Gal-3-spesifinen siRNA (Sigal-3 1 ja 2), normalisoitiin ohjaamaan siRNA transfektoitujen solujen (NC). Siirtyneet vakaan Gal-3-knockdown-soluja (shGal-3 1, 2 ja 3) ja vakaa Gal-3 yli-ilmentäviä soluja (PGAL-3 1, 2 ja 3) oli normalisoitu keskiarvo kontrollivektorilla transfektoidut vakaa solukloonien (SHC 1, 2, 3 ja pC 1, 2) vastaavasti. Data sisältää vähintään kolmen erillisen kokeen. * Osoittaa

p

0,05 verrattuna ohjaus siRNA transfektoidut solut (kaksipuolinen parittomia

t

-testi).

esto Gal-3 lauseke heikentää ankkurointi riippumatonta kasvua osajoukko haimasyövän solulinjoissa mutta sillä ei ole vaikutusta kasvuun ksenograftikasvaimissa

in vivo

mahdollisuuksia kiinnittymisestä riippumatonta kasvua syöpäsolujen arvioitiin arvioimalla numerot muodostuneiden pesäkkeiden pehmeässä agarissa määrityksissä. Ohimenevä Knockdown Gal-3 johti pienentynyt selvästi pesäkkeiden muodostumisen kapasiteetin solulinjoista Patu 8988s, S2-007 ja IMIM-PC-1, jossa vahvin vaikutus ja korkein tilastollinen merkitsevyys havaittiin S2-007 soluja (Fig. 7A ). Käänteisesti S2-028 ja MIA PaCa-2 solut eivät vaikuta Gal-3 knockdown. Koska aiemmissa raporteissa oli ilmoittanut, että kasvain edistäviä toimintoja Gal-3 muissa solun järjestelmät voivat riippua solunosasijaintia proteiinin [26], [36], [37], analysoimme onko ero vaikutus Gal-3 knockdown pesäkkeitä muodostavaa kykyä korreloi eri solunosasijaintia Gal-3 testattu solulinjoissa. Gal-3-proteiinin jakautui tasaisesti tuman ja sytosolin in MIA PaCa-2 ja S2-007 soluilla ja hieman yliedustettuina solulimafraktiot Patu 8988s, S2-028 ja IMIM-PC-1-solut (Fig. 7B), mikä osoittaa mitään korrelaatiota herkkyyttä Gal-3 knockdown.

(A) Gal-3 oli ohimenevästi vaiennettu haimasyövän solulinjoissa käyttämällä kahta itsenäistä siRNA sekvenssit (Sigal-3 1 ja 2). Knockdown ja ohjaus solut ympättiin pehmeässä agarissa ja pesäkkeiden muodostumisen arvioidaan 7 päivän jälkeen. Tulokset normalisoitiin ohjata siRNA transfektoitujen solujen (NC). Data sisältää vähintään kolmen erillisen kokeen. * Osoittaa p 0,05 verrattuna ohjaus siRNA transfektoidut solut (kaksipuolinen parittomia

t

-testi). (B) Western blot-analyysi ydinvoiman (n) ja sytoplasmista (c) proteiinin fraktiot, jotka ovat peräisin haimasyövän solulinjoissa. Gal-3 on esitetty ylemmän kaistan. p-aktiinivärjäyksen käytettiin latauskontrollina. Värjäys varten tumatekijä ORC2 käytettiin arvioimaan puhtauden subsellulaariset fraktiot. (C) Vieraslajisiirteen kasvaimia indusoitiin nude-hiirissä ihonalaisella kahden stabiilin Gal-3 pudotus S2-007 solukloonien (shGal-3 2 ja 3) ja kaksi nonsilencing ohjaus shRNA transfektoidut S2-007 kloonia (SHC 2 ja 3). Kuusi hiirtä per koeryhmä analysoitiin. Rasia ja hiuksenhienosti tonttien kuvaavat kasvainten päivänä 22 injektion jälkeen. Whiskers merkitsevät 1,5 × kvartiiliväli (IQR). Rajat ylittävät arvot esitetään täydet kolmiot. (D) Gal-3 mRNA-tasot irtotavarana kudoksessa ksenograftikasvaimissa jossa määritetään qRT-PCR. RPLP0 käytettiin vertailukohtana geeni.

sitten testata, jos vaikutus kiinnittämisestä riippumaton kasvu S2-007 soluissa käännetään myös eroja kasvaimen kasvu

in vivo

.

tätä varten ksenograftikasvaimissa indusoitiin nude-hiirissä ihonalaisella S2-007 solujen vakaa Gal-3 pudotus tai kontrollivektori-transfektoiduissa soluissa, vastaavasti. Mitään merkittävää eroa kasvainten välillä Gal-3 Knockdown ja ohjaus havaittiin kasvainten (Fig. 7C). Histologinen tutkimus kasvainten myös ei paljastanut mitään systemaattista eroja erilaistumiseen, paikallisia invasiivisuuden tai mikroverisuonitiheys eri ryhmien (tuloksia ei ole esitetty).

Jotta voitaisiin vahvistaa jatkuvaan supistamiseen Gal-3 tasot knockdown kasvaimet, mRNA valmistettiin suurin kasvain kudosten ja analysoitiin qRT PCR. Kuten odotettua, Gal-3-mRNA: n tasot olivat merkittävästi alhaisemmat kasvaimia, jotka ovat peräisin S2-007 pudotus kloonien kuin ne, jotka ovat peräisin kontrollivektorilla-transfektoidut kloonit (Fig. 7D).

Keskustelu

vapautuminen Gal-3: n ekspressio on kuvattu useissa ihmisen syövissä, vaikka prognostisen merkitys havaitut muutokset edelleen kiistanalaista [37], [38]. Haiman adenokarsinooma on yksi niistä ihmisen kasvaimista jossa huomattava yli-ilmentymisen Gal-3 sekä mRNA sekä proteiinin taso on vakiintunut [27], [30]. Omaa tuloksia microarray analyyseja mikropaloitelluista haiman kasvain kudosten osoitti, että Gal-3 on ilmaistu itse kasvainsoluihin sijaan strooman solut, jotka tyypillisesti muodostavat enemmistön kasvain [28]. Nykyisessä tutkimuksessa olemme vahvistaa yliekspressio Gal-3 mRNA: n kasvaimen kudoksissa qRT-PCR: llä ja osoittaa, että vahva Gal-3: n ekspressio pysyy useimmissa haimasyövän solulinjoissa

in vitro

.

Kuten tapauksessa tiedot ennustetekijöiden rooli syövän, raportoi otaksuttu solutoiminnoille Gal-3 syöpäsoluissa ovat osittain epäselviä tai jopa ristiriitaisia. Vaikka Honjo et ai. raportti menetys (seerumin riippumaton) lisääntymiskyvyn ja kumoamisesta kiinnittymisestä riippumatonta kasvua rintasyövän soluissa vaiennettu Gal-3 ilmaisun [26], Matarrese et al. ei havainnut mitään eroa solujen kasvun tai proliferaation yhteydessä modulaatio Gal-3 ilme, mutta kuvaavat tiiviimmän kestää apoptoosin seuraava yli-ilmentymisen Gal-3 [36]. Samoin sama ryhmä, joka havaittiin kasvua estäviä vaikutuksia Gal-3 hiljentäminen rintasyöpäsoluissa kuvattu voimakas anti-kasvain vaikutuksia Gal-3 knockdovvn eturauhassyövässä solujen, myös pienentää solumigraatio, invaasio, solujen lisääntymistä, kiinnittymisestä riippumaton siirtomaa muodostumista, ja kasvaimen kasvu nude mouse ksenografteissa [24]. Sen sijaan, Califice et ai. ei havainnut mitään vaikutusta Gal-3 ilme leviämisen eturauhasen syöpäsolujen millään Constellation, ja ilmoitti, että Matrigel invaasio ankkurista riippumaton kasvu ja paljaan hiiren ksenografti muodostumista edistettiin vain sytoplasmisen Gal-3 ilmaisu, kun taas ydinvoiman lokalisoinnin Gal -3 oli päinvastainen vaikutus [37].

yhteinen teema monissa näistä tutkimuksista on se, että usein hyvin vähän tai vain yksi solulinja analysoitiin, ja että joitakin vaikutuksia havaittiin vain alle hyvin erityinen koeolosuhteissa.