Krooninen sairaus

tiivistelmä

Koska sen aggressiivisuus ja tehokkaiden hoitojen puute, haiman adenokarsinooma on synkkä ennuste. Uusia strategioita parantaa hoidon ja eloonjäämisen vuoksi kiireellisesti. Lukuisat fukosyloituja antigeenejä seerumeista toimivat kasvainmerkkiaineet syövän havaitsemiseen ja arviointiin hoidon tehon. Lisääntynyt ilmentyminen fukosyylitransferaaseja on raportoitu myös haimasyöpä. Nämä entsyymit nopeuttaa pahanlaatuisiksi kautta fukosyloitu- of sialyloiduissa lähtöaineiden, mikä viittaa kriittinen vaatimus fukoosia haiman syöpäsoluja. Tässä mielessä olemme kehittäneet fukoosin sidottuja nanopartikkeleita ajoneuvojen toimittamiseen syöpälääkkeiden nimenomaan syöpäsoluja. L-fukoosin sidottu liposomeja sisältävä Cy5.5 tai Sisplatiini oli tosiasiassa aikaan osaksi CA19-9 ilmentävien haiman syöpäsoluja. Ylimääräinen L-fukoosia vähensi tehokkuutta Cy5.5 alustuksen L-fukoosia sidottu liposomeihin, mikä viittaa L-fukoosia-reseptorivälitteisistä toimitus. Ruiskutettiin laskimoon L-fukoosia sidottu kantavia liposomeja Sisplatiini onnistuttiin toimitettiin haimasyöpäsoluissa, välittävä tehokas kasvaimen kasvun estäminen sekä pidentää eloonjäämisen hiiren ksenograftimalleissa. Tätä välinettä edustaa uutta strategiaa haimasyövän soluja kohdistaminen terapia.

Citation: Yoshida M, Takimoto R, Murase K, Sato Y, Hirakawa M, Tamura F, et ai. (2012) Targeting syöpälääkettä Toimitus haimasyöpäsoluissa käyttäminen Fukoosin-Bound Nanoparticle lähestymistapa. PLoS ONE 7 (7): e39545. doi: 10,1371 /journal.pone.0039545

Editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center ja Beckman tutkimuslaitos, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 22 toukokuu 2012; Julkaistu: 11 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Yoshida et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli osittain tukevat opetusministeriö, tiede, urheilu ja kulttuuri, Grant-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (B), 21390231, 2009, JK. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma on yksi aggressiivinen maligniteetit ja on synkkä ennuste. On arvioitu, että haimasyövän kuolleisuus sijoittuu kahdeksanneksi syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti. Yleinen 5 vuoden pysyvyys on vain 1%: sta 4% johtuu kyvyttömyys havaita tämän taudin varhaisessa vaiheessa, sen aggressiivisuus, ja tehottomuuteen konservatiivinen hoitomuotojen [1] – [4]. Jopa ne potilaat, jotka pystyvät käymään kirurginen resektio enimmäkseen uusiutumisen, tuloksena on yleensä epäsuotuisa lopputulos [3]. Vaikka lähes 80% potilaista diagnosoidaan edistyksellinen käyttökelvottomaksi vaihe (IV) käsitellään gemsitabiinin, gemsitabiinin yhdistettynä Erlotinibi tai FOLFIRINOX mediaani elinaika on raportoitu olevan vain 5,7 kuukautta, 6,8 kuukautta, ja 11,1 kuukautta, vastaavasti [1], [5], [6].

Yksi todennäköinen selitys köyhien vasteen kehittyneen haimasyövän, että systeemistä kemoterapiaa johtaa erittäin tehotonta toimituksen syöpälääkkeiden kasvaimeen koska sen hypovascularity [7 ]. Yrittäessään voittaa huono toimitus syöpälääkkeet, olemme kehittäneet valtimoiden infuusio kemoterapiaa gemsitabiinihoidon ja 5-fluorourasiilin voida leikata kehittyneen haimasyövän jälkeen verisuonten tarjonnan uudelleenjaon kautta superselective embolisaatiota [8]. Vaiheen I /II tutkimus, kokonaisvasteeksi 33,3% ja keskimääräinen eloonjäämisaika 22,7 kk (95% CI; 9,5-24,5) saavutettiin, paremman tuloksen kuin laskimoon gemsitabiinin monoterapiana [1]. Kuitenkin 2 vuoden kokonaiselossaoloaika oli edelleen vain 25%, mikä johtuu huonosta valvonnasta etäpesäkeleesioita [8]. Tämä osoittaa, että vielä tehokkaampia hoitoja tarvitaan. Toimitusajat syöpälääkkeiden syöpäsolujen voi johtaa parempaan tehokkuuteen.

Anti-syöpälääkkeen toimitus nimenomaan syöpäsoluja edelleen suuri haaste. Useita lähestymistapoja, kuten liposomit, polymeerit, polymersome, ja misellit kuljettavat syöpälääkkeet, on hyödynnetty lääkeaineiden syöpäsoluja, odottaen passiivisen kohdistaminen tehostamalla läpäisyä ja säilyttäminen (EPR) vaikutukset [9]. Kuitenkin, lipidipohjaiset kantajia on raportoitu poistuu nopeasti verenkierrosta retikuloendoteliaalijärjestelmän (RES) [9]. Jotta päästäisiin eroon tästä ongelmasta, kemiallinen muutos lääkeaineen kantajina tiettyjen synteettisten polymeerien on usein käytetty yritettäessä nostaa

in vivo

pitkäikäisyys [10]. Suosituin ja muuttaminen onnistuu on pinnoite polyetyleeniglykolilla (PEG) saavuttaa ”steerinen stabilointi”, mikä haittaa vuorovaikutus veren komponenttien kanssa niiden pinta ja vähentää sitoutumista plasman proteiineihin, myrkyllisyys, immunogeenisyys, ja kertyminen RES [11 ], [12]. Yksi tällainen esimerkki, on doksorubisiini PEG-päällystettyjä liposomeja (Doxil® ja Caelyx®), joka on laajalti käytetty kliinisessä käytännössä käsitellä kiinteitä kasvaimia rintasyöpäpotilaalla [13]. Kuitenkin viime aikoina on saatu näyttöä siitä PEG, joka on aiemmin pidetty biologisesti inertti, voi silti aiheuttaa tiettyjä haitallisia vaikutuksia aktivoimalla komplementin järjestelmän [14]. Muut lähestymistavat käyttäen Polymeeripohjaisten tai orgaanisia nanohiukkasia (Abraxan®) käytetään kliinisesti, mutta nämä rajoittavat puute lääkkeiden annostelemiseksi tietyistä paikoista johtuen pitkäikäisyyden verenkiertoon, mikä johtaa haitallisten vaikutusten [15].

Toinen tapa aktiivisesti kohdistaa syöpäsolujen on käyttämällä nanocarriers konjugoitu molekyylit, jotka sitoutuvat antigeeneihin tai reseptoreihin syöpäsolujen [17], [18]; kuitenkin esteitä ovat edelleen tätä strategiaa, kuten epäspesifinen sisäänotto RES ja ei-kohteena oleviin soluihin [9], [16]. Esimerkiksi silloin, kun vasta-aineita käytetään natiivissa tilassa muutoksia nanocarriers, Fc-domeenin ehjän monoklonaalisen vasta-aine voi myös sitoutua Fc-reseptoreihin normaaleihin soluihin, kuten tapahtuu makrofageihin, mikä lisää immnunogenecity ja otto RES [ ,,,0],19], [20]. Vaikka tehoa näiden muutos on osoittautunut, tappavia haittavaikutuksia on myös havaittu, mikä johtuu todennäköisesti epäspesifisen sitoutumisen [21] välillä kohdistamisaineena ja muiden kuin kohde-ryhmiä solun pinnalla. Siten tietyn syöpäsolu-kohdentamalla harjoittaja, jossa ei tapahdu ansastusta RES tai ei-kohdesivustoistasi tarvitaan kiireellisesti.

Niinpä keskityimme biologisia ominaisuuksia haimasyöpä, erityisesti fukosyloitu antigeenejä, kuten sialyyli Lewis XI (SLX) antigeenin ja hiilihydraattiantigeeniä-19-9 (CA19-9), jotka on todettu, että seerumista ja kasvaimen potilaiden kudosten [22] – [25]. Niitä käytetään kasvainmerkkiaineet syövän havaitsemiseen ja arviointi hoidon tehon. Useiden tällaisten fukosyloituja antigeenejä, CA19-9 on tunnistettu laajalti käyttökelpoinen tuumorimarkkeri haiman adenokarsinooma, koska sen usein korkeus tässä sairaudessa (-80%) [26], [27]. On myös osoitettu, että leikkauksen eloonjäämisaste on huomattavasti huonompi haiman adenokarsinooma potilailla, joiden CA19-9 tasot selvemmin koholla [28].

Fukoosin, joka on deoxyhexose sokeri, näyttelee fysiologinen rooli muutettaessa eri molekyylejä nisäkkäillä. Esimerkiksi fukosyloitu- tärkeä rooli veriryhmä määrittämistä, immunologisia reaktioita, ja signaalitransduktioreaktioteiden [29]. Synteesi fukoosin tapahtuu kautta kaksi suurta väyliä [30]; so

de novo

pelastetun. Edellisessä, GDP-fukoosin syntetisoidaan GDP-mannoosia kahdella entsymaattisia reaktioita. Jälkimmäisessä, vapaa fukoosi peräisin solunulkoisia tai lysosomaalisen lähteistä [31], tai ravinnosta (tai viljelyväliaine

in vitro

) kuljetetaan solukalvon läpi sytosoliin. Vaikka täsmälliset mekanismit ovat edelleen epäselviä, kohonneeseen fukoosia esiintyvät usein seerumeista ja virtsan syöpäpotilaiden, kuten haimasyöpä, kolorektaalisyöpä, ja mahasyövän [32] – [34], mikä viittaa siihen, että fukosyloitu- lisääntyy syövässä soluja.

Tehostettu ekspressio fukosyylitransferaasien (FUTs) on myös raportoitu erilaisia ​​syöpiä. Synteesiin CA19-9, FUTs lisätä L-fukoosin α (1,3) ja α (1,4) kytkennän sialoidun esiasteita [35] – [37]. FUTs ovat keskeisiä entsyymejä kiihdyttää pahanlaatuisen muutoksen kautta fukosyloitu- eri sialyloiduilla esiasteiden [32], [35] – [37]. On raportoitu, että aktiivisuus on kohonnut FUT3 liittyy lisääntynyt metastaattista potentiaalia haiman adenokarsinooma soluihin [38], mikä viittaa siihen, että fukosyloitu- voi olla tärkeä rooli sairauden etenemisessä. Nämä havainnot osoittivat korkea vaatimus L-fukoosia eri syöpäsoluja [22], [24].

Tätä ajatellen olemme kehittäneet L-fukoosia sidottuja nanopartikkeleita kuljettimia syöpälääkkeiden nimenomaan nämä solut

kautta

reseptorivälitteisen endosytoosin. Muutimme koko nanohiukkasia, jotta läpäisy pienin kapillaarin huokosten syöpä verisuoniston, mutta ei läpi veri-aivoesteen, kautta EPR vaikutukset [16]. Lisäksi jotta estetään epäspesifinen ansastusta RES, hydrofilisointimenetelmä liposomin pinnan toteutettiin pyritään pidentämään systeemisiä säilyttäminen ja kapselointi syöpälääke, sisplatiinia. Tässä me raportoimme että ruiskutettiin laskimoon L-fukoosia sidottu liposomeja sisältävä sisplatiinia voidaan onnistuneesti toimittaa haimasyövän soluja, jotka ilmentävät fukosyloituja antigeenejä. Tämä johti tehokas kasvaimen kasvun estäminen sekä pidensi elinaikaa tuumoria kantavissa hiirissä.

Tulokset

Tuotanto ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet L-fukoosia sidottu liposomeja

Aminoidun L -fucose on silloitettu kautta 3,3’ditiobis [sulfosukkinimidyylipropionaatti] (DTSSP) liposomeihin valmistettiin modifioidun kolaattidialyysimenetelmällä saavuttamiseksi lopulliseen pitoisuuteen 25 ug /ml (F25) tai 50 ug /ml (F50). BS

3 ja Tris sitten kytkettiin päälle hydrofiiliseksi liposomin pinnalle (kuvio 1A), mikä voi estää otto RES maksassa ja pernassa ja makrofagien ja verisuonten endoteelisolujen ja voi myös estää adsorptiolla opsoniinin proteiineja plasma. Näin ollen systeeminen säilyttäminen liposomien pidennetään [39]. Tarkastelu transmissioelektronimikroskoopilla osoitti, että lähes kaikki L-fukoosia sidottu liposomeihin (Fuc-liposomit) ovat muodoltaan pallomaisia, ja jos kyseessä on Cy5.5-kapselointi, olivat noin 80-90 nm koko (kuvio 1 B, C, ja taulukko S1). Tämä hiukkaskoko on samaa mieltä hyvin tekemien mittausten Zetasizer Nano-S90 (kuvio 1 C). Zeta-potentiaali, joka edustaa negatiivinen sähkövaraus liposomin pintaan, on alle -40 mV (kuvio 1D, ja taulukko S1, S2), joka on riittävän hydrofilisoidut varten stealth-toiminto. Hiukkaskokojakauma pysyi varastoinnin jälkeen 4 ° C: ssa 6 kuukautta.

(A) Liposomien valmistus järjestelmä osoittaa sokerin ketjuja. HSA, BS

3, Tris, ja DTSSP tarkoittavat seuraavaa, vastaavasti: ihmisen seerumin albumiini; bis (sulfosukkinimidyyli) suberaatti; Tris (hydroksimetyyli) aminometaani; 3,3-ditiobis (sulfosukkinimidyylipropionaatti). (B) Electron mikroskooppikuva L-fukoosia sidottu liposomi. Mittakaava osoittaa 50 nm. (C, D) fysikaalis-kemialliset karakterisointi Fuc-liposomi-Cy5.5. Keskimääräinen hiukkaskoko (C) ja zeta-potentiaali (D) liposomeista, jotka valmistettiin veteen määritettiin dynaamisella valon sironta spektrofotometriassa.

siirtäminen Fuc-liposomi-Cy5.5 ja -FAM osaksi syöpäsolut

in vitro

kokeissa arvioimme tuotannon CA19-9 haiman syöpäsoluja ja totesi, että BxPC-3, AsPC-1, PK59, ja HuCCT1 erittyy huomattavia määriä tämän molekyylin (kuvio 2A). Lisäksi, virtaussytometria-analyysi osoitti myös, että määrä membraaniin sitoutuneiden CA19-9 oli korkea-soluja, jotka eritetään CA19-9 (kuvio S1). Membraaniin sitoutunut CA19-9 ei voitu havaita ELISA-solulinjoissa, jotka eivät eritä CA19-9 (kuvio S1). Näiden tulosten perusteella, jaoimme haimasyövän solulinjoissa kahteen ryhmään tasolle CA19-9; so CA19-9 korkea tuottaja ja ei-tuottaja soluissa.

(A) pitoisuus CA19-9 erittää eri haimasyövän solulinjoissa. Viisi miljoonaa solua inkuboitiin seerumittomassa väliaineessa 48 tuntia ja CA19-9 pitoisuus mitattiin ELISA: lla. (B) BxPC-3-soluja inkuboitiin Fuc-liposomi-FAM läsnä ollessa tai poissa ollessa ylimäärän L-fukoosia 2 tunnin ajan, pestiin sitten ja havaittujen konfokaalisella laser mikroskoopilla. Asteikko bar, 10 mikrometriä. (C) virtaussytometrinen analyysi Fuc-liposomi-Cy5.5-käsitellyt solut. BxPC-3, PK59, AsPC-1 (CA19-9 tuottavat syöpäsolujen) ja PANC-1, PK45H, MIA PaCa-2, KP4 (CA19-9 ei-tuottavien haiman syöpäsoluissa) soluja käsiteltiin Fuc-liposomi-Cy5 0,5 2 tunnin ajan tai ilman ylimäärän L-fukoosia ja analysoitiin virtaussytometrialla. Cy5.5 positiiviset solut ilmoitettu. NT, ei hoitoa: F0, F0-liposomi-Cy5.5: F25, F25-liposomi-Cy5.5: F50, F50-liposomi-Cy5.5: F50 + Fuc, ylimäärä L-fukoosi. (D) HuCCT1 (CA19-9 tuottavat) soluja inkuboitiin Fuc-liposomi-Cy5.5 ja osoitti tuntia läsnä ollessa tai ilman ylimäärän L-fukoosia, sitten pestiin kaksi kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, ja analysoitiin virtaussytometrialla. (E) Vaikutus monosakkaridien käyttöönoton yhteydessä Cy5.5 osaksi haiman syöpäsoluja Fuc-liposomit. Virtaussytometrinen analyysi Fuc-liposomi-Cy5.5-käsitellyt solut. Soluja käsiteltiin Fuc-liposomi-Cy5.5 tai Lipsome-Cy5.5 2 tuntia tai ilman ylimääräistä monosakkarideja ja analysoitiin virtaussytometrialla.

olivatko CA19-9 tuottavien syöpäsolut voitaisiin kohdentaa näiden Fuc-liposomit. Tulosten perusteella alustavien kokeiden, lisäsimme Cy5.5 tai FAM kapseloitu L-fukoosia-liposomit (Fuc-liposomi-Cy5.5, Fuc-liposomi-FAM) ja CA19-9 tuottavat tai ei-tuottavien syöpäsolujen spesifisyyden varmistamiseksi toimitukseen. Kuten on esitetty kuviossa 2B, fluoresenssimikroskopia osoitti, että F50-Fuc-liposomit, mutta ei F0-Fuc-liposomeja tehokkaasti käyttöön FAM sytosoliin BxPC-3. Lisäksi virtaussytometria analyysi osoitti, että F50-Fuc-liposomit, mutta ei F0-Fuc-liposomeja tehokkaasti käyttöön Cy5.5 sytosoliin BxPC-3 AsPC-1, ja PK59-solut erittävät runsaasti CA19-9 2 tunnin kuluessa (kuvio 2C ja 2D, kuvio S2). Ylimääräinen L-fukoosia esti käyttöönottoa Cy5.5 osaksi CA19-9 tuottavat solut, mutta ei merkittävää muutosta CA19-9 ei-tuottavia soluja, mikä viittaa siihen, L-fukoosin erityisiä käyttöönottoa. Lisäksi määrä Cy5.5 siirrettiin haimasyöpäsoluissa näytti lisäävän suorassa suhteessa tasoon CA19-9 ilmentymisen (kuvio 2C ja kuvio S2A). Ylimääräinen L-fukoosia, mutta ei D-glukoosi, D-mannoosi, D-ksyloosi tai D-galaktoosi vähentynyt tehokkuus tämän prosessin (kuvio 2E), mikä osoittaa, että käyttöönotto Cy5.5 by Fuc-liposomeja on todellakin L-fukoosia riippuvaisia .

reseptorivälitteisten-ottoa Fuc-liposomi soluihin

Jos haluat varmistaa L-fukoosia riippuvainen imeytymistä Fuc-liposomi, otto

14C-leimattua L-fukoosia by AsPC -1 tutkittiin. Sisällyttäminen

14C-leimattu-L-fukoosin AsPC-1 suureni ajan riippuvaisella tavalla, ja estyi kun läsnä oli ylimäärä kylmää L-fukoosin (Figure3A), mikä viittaa siihen, että läsnä on L-fukoosia-specific sitova proteiini. Inhibitio endosytoosin chroloquine johti tukahduttaminen Cy5.5 takaisinoton BxPC-3-soluja (kuvio 3B). Suoritimme sitten

14C-L-fukoosia reseptorisitoutumismääritystä käyttäen AsPC-1-soluissa ja havainneet korkea affiniteetti L-fukoosia-spesifistä reseptoria (3,25 x 10

6-reseptorit /solu, Kd = 28,74 nM), mikä osoittaa, että ottoa L-fukoosia välittyy sen reseptorit (kuvio 3C, 3D).

(A) liittäminen

14C-leimattu-L-fukoosin AsPC-1-soluissa. Soluja inkuboitiin kun läsnä ollessa tai ilman ylimäärän L-fukoosin (ylimäärä kylmää) on

14C-leimattu-L-fukoosia sisältävää väliainetta varten osoitetun ajan, sitten

14C-leimattu-L-fukoosin sisällyttäminen oli mitattu. (B) BxPC-3-soluja inkuboitiin kanssa tai ilman chroloquine 24 tunnin ajan, käsiteltiin F50-liposomi-Cy5.5 2 tuntia 37 ° C: ssa, ja sitten analysoitiin virtaussytometrialla. (C, D)

14C-leimattu-L-fukoosia sitoutumismääritys käyttäen AsPC-1-soluja. Scatchard juoni analyysi paljasti 3,25 x 10

6 reseptorit /solu, K

d 28.74 nM, ja BMAX 5,49 pmol /10

6 solua. Menetelmiä kuvataan

Materiaalit ja menetelmät

.

vaikutus Fuc-liposomi-Cisplatin kasvuun haimasyövän solulinjojen

Sitten kapseloidaan sisplatiinin Fuc -Liposomes. Fuc-liposomi-Sisplatiini hiukkaset olivat noin 200 nm kooltaan, ja lopullinen pitoisuus Sisplatiini arviolta 2 mg /ml (kuvio S3 ja taulukko S3). Tämä koko nanohiukkasten pitäisi mahdollistaa tunkeutumisen läpi pienimmän kapillaarisen huokoset sisällä syövän verisuoniston EPR vaikutuksia, mutta ei pitäisi rikkoa veri-aivoesteen [16]. Sytotoksisuuden Fuc-liposomi-Sisplatiini testattiin käyttämällä WST-1-määritys (kuva 4). Haimasyöpä solut altistettiin Fuc-liposomi-sisplatiini tai liposomi-Sisplatiini 2 tuntia ja sitten pestiin kaksi kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella tehokkuuden testaamiseksi ja spesifisyys sisplatiinia siirtämistä CA19-9-tuottavia soluja. Koska havaitsimme suurimman sytotoksisuus käyttäen F50-liposomi-Sisplatiini (50 ug /ml Fuc-liposomeja) (kuvio 4A), valitsimme tähän tilaan seuraavissa kokeissa. In CA19-9-tuottavia soluja (BxPC-3, AsPC-1, PK59), F50-liposomi-Sisplatiini voimakkaamman vaikutuksia kuin ohjaus liposomit (F0-liposomi-sisplatiini), mikä osoittaa, fukoosin riippuva sytotoksisuus (kuvio 4B). Sen lisäksi, että vaikutukset haiman adenokarsinooma solulinjojen kasvua muiden syöpien, kuten mahalaukun ja CRC solulinjan Colo205, jotka tuottavat CA19-9, myös tehokkaasti tukahdutettiin F50-liposomi-sisplatiinia, mikä osoittaa mahdollisen soveltuvuuden tämän nanohiukkasten teknologia hoitoon eri syöpien (tuloksia ei ole esitetty). Ei sytotoksisia vaikutuksia tämän aineen havaittiin ei-CA19-9 tuottavia soluja (MIA PaCa-2, PANC-1, PK45H). Lisäksi ei ole sytotoksisuutta normaaleissa soluissa, kuten perifeerisen veren mononukleaariset solut, fibroblastit, ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC), tai ensisijainen keratinosyyttien nähtiin, mikä todennäköisesti johtuu niiden alhaisesta vaatimus L-fukoosin (kuvio S4). Koska veriryhmäantigeenejä määräytyvät kuvio glykoproteiinien, mukaan lukien molekyylit, johon on liitetty L-fukoosia ryhmien molekyylit ilmentyvät punasolujen kalvo, olimme huolestuneita siitä, että erytroblasti esiasteita voi estyä. Siksi tutkimme CFU-E /BFU-E-pesäkkeiden muodostuksen CD34 + -solujen läsnä ollessa tai ilman F50-liposomi-Cisplatin. Kuitenkin pesäkkeiden muodostumista ei inhiboinut, riippumatta veriryhmä CD34 + solut testattiin (kuvio S5).

(A, B) Soluja käsiteltiin Fuc-liposomi, joka sisältää Sisplatiini 2 tuntia, sitten pestiin ja inkuboidaan 72 tuntia. Elävät solut mitattiin WST määrityksessä.

Hallinto D-mannoosista täydentää jakautuminen Fuc-liposomit CA19-9 tuottaminen kasvaimia ksenograftimallia

tutkimme seuraavaksi kasvain- erityiset toimitus Fuc-liposomien tuumoria kantavien hiirten

in vivo

. On osoitettu, että puhdistuma L-fukoosia on viivästynyt D-mannoosi-reseptori-hiirissä [40], sopusoinnussa läsnä mannoosi /fukoosin reseptoreihin maksassa ja Kupfferin solut [41] – [44]. Lisäksi mannoosi-sidottu liposomeihin kertynyt ei-parenkymaaliset solut ja Kupfferin solut, kun niitä annetaan häntälaskimoon [45]. Näiden selvitysten perusteella olemme samanaikaisesti annettiin D-mannoosi kanssa Fuc-liposomit kasvaimia omaavilla hiirillä estämään ottoa L-fukoosia kautta D-mannoosireseptorin. Ensimmäinen, testasimme vaikutus D-mannoosista tehokkuuteen Fuc-välitteisen oton virtaussytometriaa käyttämällä. Kuten kuviossa 2 on esitetty, olemme vahvistaneet, että Fuc-liposomit tehokkaasti sisällytettiin BxPC-3-solujen

in vitro

jopa ylimäärän läsnä ollessa D-mannoosia. Sen jälkeen me annettiin Fuc-liposomit

in vivo

ja havaittu kertymistä Cy5.5 kasvaimen mutta väheneminen maksassa, kun D-mannoosista annettiin ennen Fuc-liposomi injektio (kuvio 5A ja 5B, kuvio S6 ). Lisäksi kertyminen Cy5.5 on havaittu vain CA19-9 tuottavien kasvainsolujen BxPC-3 ja AsPC-1, mutta ei CA19-9 ei-tuottavien kasvainsolujen (ts MIA PaCa-2). Kertyminen Cy5.5 kasvaimen säilyi jopa 1 viikko sen jälkeen, kun Fuc-liposomi annon jälkeen (tuloksia ei ole esitetty), ja ilman mitään näkyvää sivuvaikutuksia ei havaittu.

(A) Fuc-Liposome- tai liposomi-Cy5. 5 annettiin häntäsuonen kautta (50 ul /hiiri). Kasvain alueet MIA PaCa-2, BxPC-3 ja AsPC-1-soluissa (takana molempiin kylkiin vaurio) hiiressä havaittiin ja Cy5.5 kerääntymisen määrä määritettiin käyttäen IVIS kuvantamisjärjestelmä 96 tunnin kuluttua injektion. D-mannoosia (1000-kertainen L-fukoosia) injektoitiin samanaikaisesti liposomien injektiosta. (B) yhteensä flux kasvain ja maksan laskettiin käyttäen Living Image ohjelmistot mukaan valmistajan ohjeiden.

Fuc-kantavia liposomeja Sisplatiini esti tuumorin kasvua ja pitkäaikainen Survival of Mice että ksenograftimallissa

jotta vaikutusten testaamiseksi Fuc-liposomi-Sisplatiini kasvaimen kasvuun

in vivo

kehitimme haiman adenokarsinooma ksenograftimallia hiirissä. Nämä eläimet hoidettiin Fuc-liposomi-Sisplatiinin kahdesti viikossa. Kasvaimen kasvu estyi merkittävästi käsittelemällä F50-liposomi-Sisplatiini verrattuna ilman hoitoa, F0-Liposome-Ciplatin tai sisplatiini yksin, mikä viittaa siihen, että F50-Fuc-liposomi voi toimittaa Sisplatiini erityisesti ja tehokkaasti (kuvio 6A ja 6B). HE-värjäys tuumorikudoksissa, monet elävät solut havaittiin käsittelemättömissä hiirissä. Määrä tuumorisolujen laski Cisplatin-käsitellyn ja F0-liposomi-Cisplatin käsiteltyjen-hiirissä verrattuna käsittelemättömiin hiiriin. Kuitenkin hiiret, joita käsiteltiin F50-liposomi-sisplatiini, kasvainsolut lähes täysin kadonnut. TUNEL värjäys paljasti, että läsnä on suurempi määrä apoptoottisten solujen kasvaimia käsiteltiin F50-liposomi-Sisplatiini kuin kontrolleilla (kuvio 6C), mikä mahdollisesti johtuu selvemmin kertyminen sisplatiinia tuumorikudokseen (kuvio 6D). Testasimme myös vaikutukset Fuc-liposomi-Sisplatiini eloonjäämiseen käytettäessä ortotooppisille ja maksan etäpesäke malli

in vivo

käyttäen BxPC-3-Luc soluissa. Kuten kuviossa 6E, eloonjäämistä käsiteltyjen hiirien Fuc-liposomi-sisplatiini oli merkittävästi pidentynyt verrattuna käsittelemättömiin hiiriä, tai suhteessa hiirillä, joita hoidettiin sisplatiini yksin tai F0-liposomi-Ciplatin. Kun potilaalle tehdä mallissa tuumorin koko hiirissä, joita käsiteltiin sisplatiinin kanssa yksin tai F0-liposomi-Cisplatin oli lähes sama koko, mutta kasvaimet molemmissa ryhmissä olivat pienempiä verrattuna käsittelemättömään. Sitä vastoin kasvain hiirillä, joille Fuc-liposomi-Sisplatiini ei havaittu

in vivo

kuvantaminen (kuvio 6F).

(A, B) Vertailu kasvaimen kasvun tukahduttaminen kanssa sisplatiini, F0-liposomi-sisplatiini, ja F50-liposomin-sisplatiinin AsPC-1-hiirille. Sisplatiini (2 mg /kg), F0-liposomi-sisplatiinia (2 mg /kg), tai F50-liposomi-sisplatiini-liuosta (2 mg /Sisplatiini /kg) injektoitiin häntälaskimoon AsPC-1-hiirille kahdesti viikko. 4, 8, 11, 15, 18, ja 22 päivää transplantaation jälkeen, kasvainten tilavuudet mitattiin. Edustavia kuva hoidettujen hiirien Sisplatiini (B). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD (n = 6). * P 0,01 verrattuna NT, sisplatiini, ja F0. (C) Tuumorikudos valmistettiin päivänä 22 hoidon jälkeen. HE värjäystä (yläpaneeli) ja TUNEL värjäys (alempi kuva) esitetään. (D) pitoisuus platinan kasvainkudoksessa mitattiin ICP. (E) Survival nopeus hiiret sisplatiinia yksin, F0-Liposome-Ciplatin, ja F50-liposomin-Ciplatin maksassa etäpesäkkeitä mallia käyttäen BxPC-3-soluissa. Tilastollinen analyysi suoritettiin yleisen Wilcoxonin testi. * P 0,01 verrattuna NT, sisplatiini, ja F0. (F) lokalisaatio BxPC3-Luc solujen potilaalle tehdä mallissa havaita käyttäen IVIS kuvantamisjärjestelmä 3 viikon hoidon.

Ei haittavaikutuksia, myös painon muutokset, viranomaisista johtuva joko D -mannoosia tai F50-liposomi-Sisplatiini havaittiin tämän tutkimuksen aikana (taulukko S4).

keskustelu

Olemme luoneet ja tunnettu L-fukoosia sidottu liposomeja sisältäviä sisplatiini, ja ovat osoittaneet, että Fuc -Liposome-Sisplatiini on paljon tehokkaampi kuin sisplatiini yksin proliferaation estossa CA19-9 tuottavien syöpäsolujen

in vitro

ja kasvaimen kasvu

in vivo

. Farmakokineettiset kokeet yhdessä määrällisesti sisplatiinin kohdennettuja vs. ei täsmäannostelujärjestelmiä sekä

vitro

ja

in vivo

vahvistivat lisäksi, että kasvaimen kasvun inhibition johtui kohdennettua antoa. Siten strategiamme hyödyntäen biologiset ominaisuudet CA19-9 tuottavien haiman syöpäsoluja on lupaava suhteen erityisiä syöpäsolun kohdistamista.

Muokkasimme liposomipinnan kytkemällä Tris kautta BS

3, ja silloittaminen aminoitu L-fukoosia kautta DTSSP saavuttaa riittävä stealth ja kohdentamalla toiminta (kuvio 1A). Hiukkaskokojakauma pysyi varastoinnin jälkeen 4 ° C: ssa 6 kuukautta. Meidän liposomit pystyvät suorittamaan erilaisia ​​lääkkeitä, joita käytetään yleisesti syövän hoitoon, kuten doksorubisiini, oksaliplatiini, ja CPT-11 (tuloksia ei ole esitetty).

Vaikka on raportoitu, että leikkauksen jälkeen eloonjäämisaste on merkittävästi huonompi adenokarsinooma potilailla, joiden CA19-9 tasot ovat huomattavasti koholla [28], tuloksemme osoittivat, että näillä potilailla, joilla haimasyöpä ilmentävien CA19-9 olisivat sopivia ehdokkaita hoidon Fuc-kantavia liposomeja syöpälääkkeiden.

fukoosi käytetään fysiologisesti varten fukosyloitu- glykoproteiinien monissa solutyypeissä, erityisesti maksan kautta mannoosi /fukoosin reseptoreita, jotka ovat runsaasti ilmaistaan ​​siinä [41] – [43]. Alustavissa kokeissa havaitsimme korkea kertyminen Cy5.5 todennäköisesti muilla kuin parenkymaalisolut ja Kupfferin solut. Tästä huolimatta onnistuimme säilyttämään liposomin kertymistä antamalla mannoosi häntälaskimoon, mikä johti kasvaimen kohdistaminen ja prekliinisissä vahvistuksen turvallisuuden mahdollisille kliiniseen käyttöön [45].

Escherichia coli

, ottoa solun sisään L-fukoosia välittyy Keskeinen mahdollistaja perhe protoni symporter, FucP [46]. Äskettäin rakenne L-fukoosia transporter tunnistettiin

E. coli

[47]. Kuitenkin ihmisillä, mekanismi L-fukoosia soluunottoa on yhä kiistanalainen, sekä diffuusio ja aktiivisen liikennejärjestelmän ehdotetaan merkittäviä väyliä ottoa L-fukoosia soluun [31]. Meidän Fuc-liposomit tunkeutua CA19-9-tuottavia soluja 10 minuutin kuluessa, ja estyvät ylimäärä L-fukoosia, joka osoittaa, että kyseessä on kuljettajan tai sisäistämisen järjestelmän välittyvät tiettyihin reseptoreihin soluissa, sen sijaan, että ainoastaan ​​ei-spesifinen diffuusio järjestelmään. Itse asiassa reseptori-sitoutumismääritykset paljastivat L-fukoosia erityisen korkean affiniteetin reseptorit AsPC-1-soluissa (kuvio 3). Kuitenkin lisätutkimuksia tarvitaan ongelman ratkaisemiseksi.

Haitalliset vaikutukset hematopoieesia, erityisesti punasolujen tuotantoa, olivat suuri huolenaihe käyttämällä Fuc-kantavia liposomeja syöpälääkkeet, mutta ei ollut muutosta joko pesäkkeenmuodostus

in vitro

tai luuydinsuppressio

in vivo

hoidon aikana. Vaikka näitä haittavaikutuksia on myös seulottava käytettäessä Fuc-kantavia liposomeja syöpälääkkeet muut kuin sisplatiini, kuten doksorubisiini, epäilemme, että rajallisen vaatimus normaalien solujen L-fukoosia tai sen rajoitettu toimitus normaaleja verisuonia, EPR vaikutus ja myrkyllisyys sivullisten solujen olisi minimaalinen.

Tämä raportti on ensimmäinen kuvata että kohdistettu annostelu sytotoksisen lääkeaineen kuin L-fukoosia nanoconjugate voi tehokkaasti estää

in vivo

kasvua haimasyövän soluja. Lisäksi L-fukoosia nanopartikkeleita kehitimme voidaan hyödyntää antovehikkeleinä muiden syöpälääkkeiden. Tämä strategia voitaisiin laajentaa niin yleinen lähestymistapa hoitoon monenlaisia ​​muita CA19-9 tuottavien karsinoomien, kuten kolorektaalisen (-80% CA19-9 positiivinen), sappiteiden (70~80% positiivinen), ja mahalaukun karsinooma (20~50% positiivinen) [48], lisäksi haiman adenokarsinooma (-80% positiivinen) [26], [27]. Lopuksi Fuc-liposomi sisältävien syöpälääkkeiden tulisi tarjota uuden strategian aktiivinen kohdistaminen syövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

cis-diammineplatinum (II) dikloridia ( sisplatiini), kaliumtetraklooriplatinaattia (II), kaliumjodidia, ammoniakin vesiliuosta (28%), hopeanitraattia, dipalmitoyylifosfatidyylikoliinia (DPPC), kolesteroli (Chol), dicetylphosphate (DCP), natrium- cholatehydrate (koolihappo), ihmisen seerumin albumiini ( HSA), natriumperjodaattia, deuteriumoksidia (D

2O), natrium hexachloroplatinate, tris (hydroksimetyyli) aminometaani (Tris), ja L-fukoosin hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). Gangliosidi hankittiin Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). Dipalmitoyylifosfatidyylietanoliamiini (DPPE) hankittiin Alexis (Plymouth Meeting, PA, USA). N-tris (hydroksimetyyli) metyyli-3-amino-propaanisulfonihappo (TAPS) ja N- (2-hydroksietyyli) piperatsiini-N ’- (2-etaanisulfonihappo) happoa ostettiin Dojin Chemical (Kumamoto, Japani). Natriumsyanoboorihydraattia hankittiin Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Bis (sulfosukkinimidyyli) suberaatti (BS

3) ja 3,3-ditiobis (sulfosukkinimidyylipropionaatti) (DTSSP) ostettiin Pierce Biotechnology (Rockford, IL, USA). Kolesteroli E-testi Wako ostettiin Wako (Osaka, Japani). Kalium diklooriplatinaa ostettiin Nacalai Tesque (Kioto, Japani). Chroloquine ostettiin Sigma.

valmistaminen Cy5.5, FAM ja sisplatiinia liposomeihin kapseloidut

Katso Teksti S1 kohta.

Solulinjat

haimasyövän solulinjoissa KP4, PK-59, PK-45H, MIA PaCa-2, PANC-1 ja HuCCT1 saatiin Riken BRC Cell Bank. AsPC-1 ja BxPC-3 hankittiin American Type Culture Collection. BxPC-3, AsPC-1, PANC-1, PK-45H, PK-59, ja HuCCT1 soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä (Gibco), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, L-glutamiinia ja 1% penisilliini-streptomysiiniä. KP4 ja MIA PaCa-2 viljeltiin DMEM (Gibco), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, L-glutamiinia ja 1% penisilliini-streptomysiiniä.