Krooninen sairaus

tiivistelmä

Setuksimabilla, monoklonaalinen vasta-aine, joka estää epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), on nykyisin hyväksytty hoitoon useita erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia. Olemme aiemmin osoittaneet, että setuksimabi voi estää hypoksia-indusoituva tekijä-1 alfa (HIF-1α) proteiinisynteesiä estämällä aktivoituminen EGFR alavirran signalointireittien myös Erk, Akt, ja mTOR. 1, 9-pyrazoloanthrone (1, 9 PA) on anthrapyrazolone yhdiste, joka tunnetaan parhaiten SP600125, joka spesifisesti inhiboi c-jun N-terminaalisen kinaasin (JNK). Täällä raportoimme 1, 9 PA voi downregulate HIF-1α riippumatta sen eston JNK. Tämä heikentävän säätelyn vaikutus poistettiin, kun hapen vaikutuksesta domain (ODD) HIF-1α (HIF-1α-ΔODD, verkkotunnus vastaa HIF-1α hajoaminen) Kokeellisesti poistettu tai kun aktiivisuutta HIF-1α propyylihydroksylaasia (PHD) tai 26S proteasomaalisten monimutkainen estyi, osoittaa, että 1, 9 PA downregulates HIF-1α edistämällä PHD-riippuvaisen HIF-1α hajoamista. Olemme havainneet, että yhdistelmä 1, 9 PA ja setuksimabi toimi synergisesti apoptoosin syöpäsoluissa, joissa setuksimabi tai 1, 9 PA yksinään ei ollut tai ovat vain heikosti apoptoottisen aktiivisuuden. Tämä synergistinen vaikutus väheni huomattavasti syöpäsoluissa transfektoitu HIF-1α-ΔODD, mikä osoittaa, että downregulation HIF-1α oli mekanismia synergistisen vaikutuksen. Vielä tärkeämpää on, 1, 9 PA voi downregulate HIF-1α syöpäsoluissa, jotka eivät ole herkkiä setuksimabia inhiboivan vaikutuksen HIF-1α ilmaisun takia yli-ilmentymisen onkogeenisen

Ras

(RasG12V). Tuloksemme viittaavat siihen, että 1, 9 PA on johtaa yhdisteen uuden luokan lääkkeitä, joita voidaan käyttää parantamaan vastetta syöpäsolujen setuksimabin täydentävällä vaikutus downregulation HIF-1α.

Johdanto-osan : Lu Y, Li X, Lu H, Tuuletin Z (2010) 1, 9-Pyrazoloanthrones downregulate HIF-1α ja herkistää syöpäsolut Setuksimabia välittämää Anti-EGFR Therapy. PLoS ONE 5 (12): e15823. doi: 10,1371 /journal.pone.0015823

Editor: Donald Gullberg, University of Bergen, Norja

vastaanotettu: 29., 2010 Hyväksytty: 29 marraskuu 2010; Julkaistu: 29 joulukuu 2010

Copyright: © 2010 Lu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Institutes of Health palkinnon 5R01CA129036 (ZF) ja apurahan Center for Kohdennettu Therapy of The University of Texas MD Anderson Cancer Center (ZF). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) lähettää useita tärkeitä rooleja kehittymistä ja etenemistä monenlaisia ​​kiinteitä kasvaimia [1]. Viimeisten kahden vuosikymmenen aikana, uusi syövän hoitomuotoja kohdistaminen EGFR on kehitetty ja tutkittu laajalti [2], [3]. Viimeaikaiset kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet objektiivinen vaste potilailla, joilla on useita erilaisia ​​syöpiä hoidettiin joko estämällä EGFR monoklonaalisilla vasta-aineilla (setuksimabi, panitumumabi, jne.) Tai estämällä EGFR-tyrosiinikinaasi-aktiivisuus pienimolekyylisiä estäjiä (gefitinibi, erlotinibi, jne. ) [4] – [9]. Nämä tutkimukset johtivat hyväksyntää näiden EGFR-kohdentamisaineita hoitoon peräsuolen, keuhko-, ja pään ja kaulan alueen syövät yhdessä perinteisten kemoterapiaa tai sädehoitoa; kuitenkin, vaikka tavoite vastausten kokonaisvasteeseen hoidetuista potilaista EGFR-täsmähoitoihin on alhainen, erityisesti silloin, kun nämä EGFR-kohdentamisaineita käytetään monoterapioita [10] – [12]. Lisäksi monet potilaat, joilla ilmentävien kasvainten tai jopa erittäin ilmentäviä EGFR voi olla optimaalinen vaste hoitoon EGFR-kohdentamisaineita [3]. Esimerkiksi potilailla, joilla peräsuolen syöpä, vain 20-30%: lla potilaista tauti, joka vastasi EGFR-estäviä vasta-aineita [4]. Niistä 70-80%: lla potilaista, joilla nonresponsive sairaus, 30-35%: lla oli

K-Ras

mutaatioita, 20%: lla oli

B-Raf

ja

PI3K

mutaatioita, ja loput oli muita poikkeamia [13]. Näin ollen vaikka EGFR on merkittäviä rooleja kasvainten synnyssä, syöpäsolut ovat geneettisesti epävakaita ja voivat väistää vaikutusta EGFR-täsmähoitoihin useiden hyvin tunnettu ja jotkut ei-vielä tiedossa resistenssimekanismeja. Paljon meneillään oleva tutkimus on keskittynyt kehittämään uusia kombinatorisista hoitomuotojen kohdistaminen EGFR ja molekyylien EGFR alavirran signaalireitteihin yrittää voittaa nämä resistenssimekanismit.

aiemmin raportoitu Setuksimabihoitoa voi merkittävästi downregulate suuren pohjapinta tasoilla hypoksia indusoitavissa tekijä-1 alfan (HIF-1α) estämällä HIF-1α proteiinisynteesiä syöpäsolulinjoissa, jotka ovat herkkiä EGFR inhibition [14], [15]. Olemme osoittaneet, että esto HIF-1α on tarpeen, vaikka se ei välttämättä riitä, välittävän vaste syövän solujen EGFR-täsmähoitoihin [14] – [17]. Knockdovvn HIF-1α RNA interferenssi (RNAi) huomattavan herkistetty syöpäsolut onkogeenisella

Ras

mutaatioita tai ne, joilla on

PTEN

inaktivointi tai poisto setuksimabista hoitoon [16]. Sen sijaan yli-ilmentyminen HIF-1α syöpäsoluissa, jotka olivat alun perin herkkiä hoitoon myönnetyn voimakasta vastahakoisuutta EGFR hoito [16]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että suoraan kohdistaminen HIF-1α voi ohittaa useita tunnettuja setuksimabia-resistenttiysmekanismi, kuten mutaatiostatuksesta aktivointia onkogeenien ja inaktivaation kasvaimen synnyssä on EGFR loppupään reittejä ja /tai vaihtoehtoinen aktivointi näiden loppupään reittejä muiden kasvutekijäreseptoreita . Novel yhdistelmä lähestymistapoja kohdistaminen EGFR ja HIF-1α voi siis johtaa parantunut hoitovasteen potilailla.

Useita strategioita, HIF-1α tai sen alkupään sääntelyviranomaisten tai alavirran kohdegeenien on testattu viime vuosina [18]. Lähestymistapoja suoraan kohdistettu HIF-1α-toiminto ovat estämällä HIF-1α-geenin ilmentyminen käyttäen antisense- tai RNA-interferenssi tai estämään transkriptionaalista aktiivisuutta HIF-1α /β-heterodimeerin häiritsemällä sen vuorovaikutusta DNA: n tai kofaktoreita. Näitä lähestymistapoja on pääasiassa testattu kokeellisesti, koska niitä on vaikea testata kliinisesti olevaa tekniikkaa. Vaihtoehtoisesti HIF-1α-proteiini voidaan kohdistaa epäsuorasti säätämällä sen proteiinisynteesiä tai vakautta käyttämällä farmakologisen strategioita, joita voidaan testata kliinisesti [19].

Meidän ponnisteluja löytää uusia pienimolekyylisiä lyijy yhdisteitä, joilla on anti -HIF-1α aktiivisuutta ja joita voidaan edelleen optimoida yhdessä setuksimabin parantaa terapeuttisia vaikutuksia syöpäsoluissa, olemme havainneet, että 1, 9-pyrazoloanthrone (1, 9 PA), joka on anthrapyrazolone tunnetaan parhaiten SP600125, joka spesifisesti inhiboi c -Jun N-terminaalista kinaasin (JNK) [20], [21], voidaan voimakkaasti downregulate HIF-1α useissa syöpäsolulinjoissa. Tässä tutkimuksessa tutkittiin suhdetta 1, 9 PA: n tunnetun estävä aktiivisuus JNK ja sen äskettäin löydetty aktiivisuuden vähen- tämisessä HIF-1α. Olemme myös tutkineet biokemiallisia mekanismeja, joilla 1, 9 PA downregulates HIF-1α. Lopuksi suoritimme proof-of-näyttöä kokeiluja testata hypoteesia, jonka hoitoon syöpäsolujen kanssa setuksimabin ja 1, 9 PA voi parantaa antituumorivaikutuksen ja herkistää syöpäsolujen Setuksimabihoitoa. Meidän päätelmät oikeuttavat uusien johdannaisten 1, 9 PA joita voidaan käyttää yhdessä setuksimabin syövän hoitoon täydentävien downregulation HIF-1α ilman samanaikaista estoa JNK.

Tulokset

1, 9 PA downregulates HIF-1α riippumaton estämään JNK

tässä tutkimuksessa havaitsimme, että sen lisäksi, että inhiboivat c-Jun-fosforylaation annoksesta riippuvalla tavalla, 1, 9 PA merkittävästi vähentänyt HIF -1α-proteiinin taso A431 emättimen levyepiteelikarsinooma karsinoomasoluja jo 15 min käsittelyn jälkeen, kun taas 1, 9 PA-indusoitua JNK havaittiin myöhemmin ajanhetkellä (kuvio 1A). Tämä viittaa siihen, että 1, 9 PA: n heikentävän säätelyn vaikutus HIF-1α on riippumaton sen estävä vaikutus JNK. Yhdiste myös indusoi ohimenevää tasot aktivointi-erityisiä fosforylaatioon Akt molemmilla T308 ja S473 sekä jatkuva ja asteittainen nostaminen taso fosforyloidun Erk soluissa, jotka ovat ajallisesti korreloivat elpymisen HIF -1α taso alkaen noin 4 tuntia käsittelyn jälkeen (kuvio 1A).

(A) Ajallinen järjestys ja korrelaatio 1, 9 PA aiheuttama HIF-1α downregulation ja JNK esto, ja hoidon indusoimista korvaavia aktivointi Akt ja Erk. A431-soluja käsiteltiin 5 uM 1, 9 PA 0,5% FBS viljelyalustan osoitetun aikavälein. Solulysaatit valmistettiin sitten Western-blottauksella vasta-aineiden kanssa on esitetty. (B) annosriippuvaisesti vaikutukset 1, 9 PA vähen- tämisessä HIF-1α, estäen JNK, ja aktivoimalla Erk. A431-solut altistettiin kasvavia konsentraatioita 1, 9 PA 16 h 0,5% FBS elatusaineeseen 37 ° C: ssa. Solulysaatit valmistettiin sitten Western-blottauksella vasta-aineiden kanssa on esitetty. (C) riippumattomuus 1, 9 PA aiheuttama HIF-1α downregulation sen JNK estävä toiminto. A431-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla 1, 9 PA tai 1-metyyli-1, 9 PA 1 h 0,5% FBS: ää elatusaineeseen. Solulysaatit valmistettiin sitten Western-blottauksella vasta-aineiden kanssa on esitetty. (D) Ei muutoksia HIF-1α tason aktivoinnin tai eston JNK. A431-solut wert ohimenevästi transfektoitu kontrollivektorilla tai yksi konstrukteja, jotka sisältävät konstitutiivisesti aktiivinen SEK1 S220E /T224D-mutantti (SEK1-CA), dominoiva negatiivinen SEK1 K129R mutantti (SEK1-DN), tai dominoiva negatiivinen MEKK1 K432M mutantti (MEKK1-DN) yön yli. Solulysaatit valmistettiin sitten Western-blottauksella vasta-aineiden kanssa on esitetty. (E) Korvaavat aktivointi Erk jälkeen HIF-1α hiljentäminen verrattuna hoitoon 1, 9 PA tai 1-metyyli-1, 9 PA. A431-solut altistettiin pudotus HIF-1α erityisiä tai ohjaus siRNA, tai niitä käsiteltiin 10 uM 1, 9 PA tai 1-metyyli-1, 9 PA 16 tuntia. Solulysaatit valmistettiin sitten Western-blottauksella vasta-aineiden kanssa on esitetty. (F) alassäätely HIF-1α 1, 9 PA erilaisissa syöpäsolulinjoissa. Indikoitu solulinjoja altistettiin 10 tai 40 uM 1, 9 PA 1 h 0,5% FBS: ää elatusaineeseen. Solulysaatit valmistettiin sitten Western-blottauksella vasta-aineiden kanssa on esitetty.

hoidon aiheuttama downregulation HIF-1α ja kompensatorinen solun signaloinnin oli myös 1, 9 PA annoksesta riippuvaa (kuvio 1 B) . Pienin annos 1, 9 PA tarpeen downregulate HIF-1α oli välillä 1,25 ja 2,5 uM, mikä oli hieman suurempi kuin pienin annos, joka tarvitaan vähentämään tehokkaasti c-Jun-fosforylaation eston kautta JNK (0,6 1,25 uM; kuvio 1 B ), mikä edelleen viittaa siihen, että äskettäin löydetty heikentävän säätelyn vaikutus 1, 9 PA HIF-1α on riippumaton sen tunnettujen estävä vaikutus JNK.

tämän havainnon varmistamiseksi, me kohdellaan samalla solut 1-metyyli -1, 9 PA, rakenteelliseen samankaltaisuuteen 1, 9 PA jota on käytetty negatiivisena kontrollina 1, 9 PA kirjallisuudessa, koska se ei estä JNK. Olemme vahvisti, että 1-metyyli-1, 9 PA ei vähentänyt c-Jun: n fosforylaation A431-soluissa verrattuna 1, 9 PA; kuitenkin, se oli yhtä tehokas vähen- tämisessä HIF-1α näissä soluissa (kuvio 1C). Toisaalta, transfektio A431-solujen joko konstitutiivisesti aktiivinen SEK1, joka aktivoi JNK, tai vallitsevasti negatiivista SEK1 tai määräävän-negatiivinen MEKK1, jotka molemmat poistaa JNK, ei vaikuta tasoon HIF-1α soluissa (Kuva 1 D). Nämä ylimääräiset ohjaus kokeita esiin vahvaa näyttöä siitä, että esto JNK yksinään ei ollut vaikutusta tasoon HIF-1α solussa mallissa tutkittiin.

Kuva 1E osoittaa, että hoito A431-solujen joko 1, 9 PA tai 1 metyyli-1, 9 PA tai knockdovvn HIF-1α ilmentymistä RNAi johti kompensatorinen tason fosforyloidun Erk näissä soluissa, mikä tukee päätelmää, että lisäys solusignalointia jälkeen 1, 9 PA hoito on korvaavat vaste, joka todennäköisesti liittyy downregulation HIF-1α, mutta ei inhibition JNK.

lisäksi A431 emättimen squamous karsinoomasoluja, olemme havainneet, että 1, 9 PA voisi downregulate HIF-1α PC3 eturauhasen syöpäsoluja, MDA468 rintasyöpäsoluja, MCF7- rintasyövän transfektoitujen solujen korkea HER2, ja H3255 ja HCC827 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut (kuvio 1 F). Yhdessä nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että 1, 9 PA voi downregulate HIF-1α ihmisen syöpäsoluissa mekanismilla (t), joka on riippumaton mekanismi (t), jolla se estää JNK. Nämä havainnot viittaavat myös siihen, että solut reagoivat 1, 9 PA tai 1-metyyli-1, 9 PA aiheuttama downregulation HIF-1α tai RNAi-välitteinen HIF-1α hiljentäminen kautta korvaava vasteen aktivoitumisen solun signaalireittien, joiden tiedetään lisätä HIF-1α ilmaisun [22] – [26].

1, 9 PA vähentää HIF-1α tasolla edistämällä ubikinaa- HIF-1α

sitten tutkitaan mekanismi (t) jolla 1, 9 PA downregulates HIF-1α. HIF-1α on erittäin epävakaa proteiinia happiolosuhteissa koska sillä on hapen vaikutuksesta domain (ODD), joka edellyttää posttranslational sääntelyn kautta proteiinia ubikinaation ja hajoaminen [27], [28]. Koska 1, 9 PA dramaattisesti vähentänyt HIF-1α tasolle alle 15 min (0,25 h; kuvio 1A), me arveltu, että 1, 9 PA toimii mekanismilla, joka parantaa HIF-1α proteiinien hajoaminen. Kuvio 2A osoittaa, että verrattuna ajoneuvon ohjaus hoitoon A431-soluissa salpaamalla uuden proteiinisynteesin sykloheksimidillä, käsittelemällä soluja 1, 9 PA huomattavasti nopeutetun hajoamisen HIF-1α; hajoamista aika lyheni 60 min kontrollisoluissa alle 20 min soluissa, joita käsiteltiin 1, 9 PA. Lisäksi 1, 9 PA aiheuttama downregulation HIF-1α estyi täysin käsittelemällä A431 soluja MG132 (kuvio 2B), joka estää 26S proteasomaalisten monimutkainen, mikä osoittaa, että väheneminen HIF-1α jälkeen 1, 9 PA hoito oli välittämä lisäämällä proteiinien hajoamista.

(A) Alennettu HIF-1α proteiinin stabiiliuden, kun läsnä on 1, 9 PA (1, 9 PA). A431-soluja käsiteltiin 10 uM sykloheksimidillä (CHX) plus 10 uM 1, 9 PA: n tai DMSO: ajoneuvon hallinnan 0,5% FBS viljelyväliaineessa 60 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solulysaatit valmistettiin käsittelyn jälkeen kunakin ajankohtana ja analysoitiin Western-blottauksella vasta-aineiden kanssa on esitetty. (B) esto 1, 9 PA aiheuttama HIF-1α hajoamista jonka proteasomaalisten estäjä MG132. A431-soluja käsiteltiin 10 uM 1, 9 PA ± 10 uM MG132 varten osoitetun aikavälein. Solulysaatit valmistettiin käsittelyn jälkeen kunakin ajankohtana ja analysoitiin Western-blottauksella vasta-aineiden kanssa on esitetty.

Vaikka 1, 9 PA selvästi vaimentua HIF-1α alle happiolosuhteissa, huomasimme, että kyky 1 , 9 PA säätelevät vaimentaen HIF-1α oli merkittävästi pienempi, kun happea ei ole käytettävissä tai kun soluja käsiteltiin deferoksamiini (DFO), rautaa kelatoivan aineen (kuvio 3A); molemmat O

2 ja Fe

2+ tarvitaan HIF-1α propyylihydroksylaasia (PHD) aktiivisuus hydroksyloida HIF-1α hyväksyttäviksi VHL ubikitiinipromoottori ligaasilla [29], [30]. Tuloksena hoidon DFO oli samanlainen kuin hoidon MG132: ubikitinoituja HIF-1α estyi hajoamiselta kautta proteasomi-reitin (kuvio 3A). Nämä havainnot viittaavat siihen, että 1, 9 PA voivat suoraan tai epäsuorasti vaikuttaa ubikinaa- HIF-1α [29], [30].

(A) Vaatimus O

2 ja Fe

2+ että 1, 9 PA aiheuttama downregulation HIF-1α. A431-solut olivat käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 10 uM 1, 9 PA 0,5% FBS elatusalustassa happiolosuhteissa puuttuessa tai läsnä DFO (100 uM) tai MG132 (10 uM), ja hypoksisissa olosuhteissa 16 tunnin ajan 37 ° C. Solulysaatit valmistettiin sitten Western-blottauksella vasta-aineiden kanssa on esitetty. (B) rooli ODD HIF-1α on 1, 9 PA aiheuttama downregulation HIF-1α. A431-soluja transfektoitiin ohimenevästi HIF-1α-ΔODD rakentaa tai kontrollivektori 48 tuntia ja oli sitten joko käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin ilmoitettuina pitoisuuksina 1, 9 PA 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Solulysaatit valmistettiin sitten Western-blottauksella vasta-aineiden kanssa on esitetty. (C) Resistance A431 /HIF-1α-ΔODD solujen 1, 9 PA aiheuttama downregulation HIF-1α. A431-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti HIF-1α-ΔODD konstrukti käsiteltiin, kuten on kuvattu (A). Solulysaatit valmistettiin sitten Western blotting vasta-aineiden kanssa on esitetty.

Edelleen testata tätä hypoteesia, tutkimme kykyä 1, 9 PA antaa määräyksiä HIF-1α mutantti, jossa PHD /VHL vuorovaikutuksessa domain on HIF-1α, eli pariton, poistettiin (HIF-1α-ΔODD). Kuten odotettua, kun taas 1, 9 PA laski tasolle villityypin HIF-1α, se ei vaikuta tasoon HIF-1α-ΔODD A431-soluja transfektoitiin väliaikaisesti HIF-1α-ΔODD rakentaa (kuvio 3B). Sitten perustettu yhdistetään A431-soluja, jotka pysyvästi ilmensivät HIF-1α-ΔODD ja edelleen vahvisti havainnot saatu vanhempien A431-solut käsittelemällä A431 soluja, jotka ilmentävät HIF-1α-ΔODD samalla tavalla (kuvio 3C). Yhdessä nämä havainnot vahvasti päätellä, että 1, 9 PA downregulates HIF-1α mekanismilla, johon vuorovaikutukseen PHD /VHL ja ODD HIF-1α. Kun keskeiset elementit (O

2, Fe

2+, ja 26S-proteasomin) vaaditaan PHD aktiivisuus hydroksyloida HIF-1α ja myöhemmän VHL-välitteisen ubikinaation ja hajoamisen puuttuvat tai estyy, tai kun ODD HIF-1α, joka on kohdistettu toimialueelle VHL ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkainen, on poissa, 1, 9 PA menettää kykynsä downregulate HIF-1α.

Jos haluat saada suoraa näyttöä, että 1, 9 PA edistää ubikitinaation HIF-1α, suoritimme HIF-1α immunosaostettiin solulysaateista 1, 9 PA-käsiteltyjen A431-solujen Western-blottauksella anti-ubikitiini-vasta-ainetta. Huomasimme, että taso polyubiquitinated HIF-1α oli selvästi lisääntynyt 10 minuutin kuluessa 1, 9 PA käsittely (kuvio 4A). Läsnäolo proteasomaalisten inhibiittorin MG132 aikana 1, 9 PA hoito esti ubikitinoituja HIF-1α: n hajoamisen (kuvio 4B).

(A). A431-soluja käsiteltiin 10 uM 1, 9 PA osoitettu aika. Solulysaatit valmistettiin HIF-1α immunosaostus, mitä seuraa Western blottaus immunosaostumia vastaan ​​suunnattuja vasta-ubikitiini (ylhäällä), HIF-1α, ja β-aktiini. (B) A431-solut olivat käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 10 uM 1, 9 PA: n läsnä ollessa 10 uM MG132 1 h 0,5% FBS: ia. HIF-1α immunosaostettiin seurasi Western blot -analyysillä anti-HIF-1α-vasta.

Yhteenvetona tietomme antaa vahvaa näyttöä siitä, että 1, 9 PA pienenee HIF-1α mekanismilla, joka parantaa vuorovaikutusta ODD HIF-1α ja PHD /VHL /ubikitinaation monimutkaisia, ja siten johtaa parannetun hajoamisen HIF-1α kautta proteasomin reaktiotien.

1, 9 PA synergistisesti setuksimabin apoptoosin yhteistyön avulla vähen- tämisessä HIF-1α

Osoitimme aikaisemmin Setuksimabihoitoa downregulates HIF-1α syöpäsoluissa herkkiä EGFR hoidon estämällä HIF-1α proteiinisynteesiä, joka esti ilmaus Myristoylated Akt joka on konstitutiivisesti aktiivinen [16]. Kuvio 5A esittää nykyisen havainnot, jotka ovat samanlaisia ​​kuin meidän aiemmin raportoitu; kiinnostavaa, toisin kuin aiempien havaintojen ilmaus konstitutiivisesti aktiivisen Akt ei vaikuttanut 1, 9 PA aiheuttama downregulation HIF-1α (kuvio 5B), syyllistämättä että rooli 1, 9 PA aiheuttama lisäys Akt-aktiivisuutta (katso kuva 1A) ei vastapainoksi 1, 9 PA aiheuttama HIF-1α proteiinien hajoaminen, vaan kompensoimaan 1, 9 PA aiheuttama HIF-1α proteiinien hajoaminen stimuloimalla uusien HIF-1α proteiinisynteesiä.

A431 -solut transfektoitiin väliaikaisesti kontrollina vektori tai Myristoylated Akt (Myr-Akt) 24 tunnin ajan 0,5% FBS: ää väliaineen. Vektori-tai Myr-Akt-transfektoituja soluja käsiteltiin sitten joko 20 nM setuksimabi tai PBS: ää yön yli (A), tai 10 uM 1, 9 PA: n tai DMSO ajoneuvon hallinnan 1 h (B). Hoidon jälkeen, solulysaatteja valmistettiin Western blotting vasta-aineiden kanssa on esitetty.

Meillä on siis oletettu, että yhdistelmä 1, 9 PA ja setuksimabi, joka voi estää Akt ja Erk reittejä ja siten estävät korvaavia mekanismeja, olisi lisäaine tai jopa synergiavaikutusta downregulation HIF-1α. Testasimme tätä hypoteesia 3 syöpäsolujen linjat, jotka ovat herkkiä Setuksimabihoitoa: A431, HN5 (pään ja kaulan alueen syöpä), ja DiFi (peräsuolen syöpä). Koska DiFi solut ovat erittäin herkkiä setuksimabi, niitä käsiteltiin 2 nM setuksimabi; A431 ja HN5 soluja, jotka eivät ole niin herkkiä setuksimabia kuin DiFi soluja, käsiteltiin 10 nM setuksimabia. Kuvio 6A esittää, että kun mikä tahansa 3 solulinjojen käsiteltiin joko 10 tai 40 uM 1, 9 PA tai setuksimabi yksin, HIF-1α säädeltiin vähentävästi. Kun soluja käsiteltiin sekä 1, 9 PA ja setuksimabi, HIF-1α edelleen vaimentua. Käsittelemällä soluja setuksimabi tai 1, 9 PA yksin indusoi vain vähäisiä tai ei lainkaan pilkkomisen PARP, merkki apoptoosin; kuitenkin, setuksimabin ja 1, 9 PA tehosti merkittävästi induktio PARP pilkkominen kaikki 3 solulinjoissa.

(A) induktio PARP katkaisun yhdistelmä 1, 9 PA ja setuksimabi. A431, HN5, ja DiFi solut olivat käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin setuksimabi (10 nM A431 ja HN5 soluja ja 2 nM DiFi soluja 16 h), 1, 9 PA (10 uM tai 40 uM lisätty viimeisen tunnin ennen solujen hajoamista) tai molemmat 0,5% FBS: ää elatusaineeseen. Solulysaatit valmistettiin ja analysoitiin Western-blottauksella vasta-aineiden kanssa on esitetty. (B) lisääminen apoptoosin yhdistelmä 1, 9 PA ja setuksimabi. A431-soluja käsiteltiin, kuten on kuvattu (A). Solulysaatit valmistettiin ja analysoitiin apoptoosin ELISA. Suhteellinen absorbanssi arvot piirretään.

p

arvo oli 0,01 verrattaessa apoptoosin taso 1, 9 PA yksin (10 tai 40 uM) tai setuksimabin yksin että apoptoosin yhdistelmä 2 aineet (huomautus: vain

p

vertailu- 10gM 1, 9 PA yksin ja yhdessä setuksimabin esitetty). (C) Riippuvuus apoptoosin yhdistelmä 1, 9 PA ja setuksimabi on HIF-1α downregulation. A431neo ja A431 /HIF-1α-ΔODD solut käsiteltiin kuten on osoitettu, ja solulysaatit valmistettiin ja analysoitiin kuten on kuvattu (A).

valittu A431-solut edelleen vahvistaa tämän tuloksen käyttämällä riippumattoman apoptoosin ELISA että määrällisesti mittaavasta histoni liittyvien DNA pirstoutuminen sytoplasmassa jälkeen apoptoosin (kuvio 6B). 1, 9 PA yksin pitoisuuksilla 10 ja 40 uM ei havaittavasti nostaa apoptoosin; setuksimabin yksinään vain hieman lisääntynyt taso histoni liittyvien DNA pirstoutuminen sytoplasmassa. Olemme kuitenkin havainneet, että yhdistelmähoito huomattavasti apoptoosin taso (

p

0,01). Edelleen vahvistaa, onko apoptoosin havaittu yhdistelmä hoidon välittämien täydentäviä vaikutuksia downregulation HIF-1α nämä 2 aineet, me toistuva kokeissa A431 soluja, jotka ilmentävät HIF-1α-ΔODD soluja. Kuvio 6C esittää, että verrattuna sen vaikutus kontrollivektorille transfektoiduissa A431neo soluja, yhdistelmä hoito oli selvästi pienempi vaikutus PARP lohkaisu A431 /HIF-1α-ΔODD soluissa. Vaikutus 1, 9 PA on downregulation endogeenisen HIF-1α myös vähennetty A431 /HIF-1α-ΔODD soluissa verrattuna A431neo soluihin. Nämä tulokset osoittavat, että downregulation HIF-1α oli mekanismi synergisen vaikutuksen yhdistelmän 1, 9 PA ja setuksimabi.

1, 9 PA voitetaan onkogeenisten Ras aiheuttama setuksimabi vastus

onkogeenisia mutaatio

Ras

on osoitettu olevan merkittävä mekanismi setuksimabin resistenssi potilailla, joilla peräsuolen syöpä [10]. Osoitimme aikaisemmin kuin proof of concept että knockdovvn HIF-1α kautta RNAi olennaisesti palauttaa herkkyyttä A431 transfektoitujen solujen onkogeenisessä

H-Ras

(G12V) mutantti setuksimabista hoitoon [16]. Edelleen todistaa tämän uuden käsitteen, tutkimme vaikutus 1, 9 PA yksin ja yhdessä setuksimabin käytöstä A431 transfektoiduissa soluissa

Ras-G12V

(A431 /RasG12V). Kuvio 7A osoittaa, että verrattuna kontrollivektorilla transfektoidut A431neo solut, A431 /RasG12V soluilla oli korkeampi perustason Akt-fosforylaation ja oli resistenttejä setuksimabia inhiboivan vaikutuksen Akt-fosforylaation, downregulation HIF-1α, ja lohkaisu PARP. Lisäksi, 1, 9 PA yksin inhiboi sekä perus- että Ras-induced upregulation Akt-fosforylaation ja vaimentua HIF-1α sekä A431neo ja A431 /RasG12V soluja, mutta se ei ollut havaittavaa vaikutusta induktioon PARP pilkkominen joko solulinjassa . Yhdistelmä 1, 9 PA ja setuksimabi kuitenkin selvästi lisääntynyt pilkkominen PARP sekä A431neo ja A431 /RasG12V soluja. Lohkaisu PARP A431 /RasG12V solut on erityisen tärkeää, koska setuksimabin yksinään pystynyt indusoimaan PARP pilkkominen näissä soluissa vuoksi ilmaus onkogeenisten

Ras

; kun taas yhdistelmä hoidon A431 /RasG12V solujen johti tason PARP pilkkominen, joka oli samanlainen taso PARP lohkaisu A431neo soluissa, mikä viittaa synergiaan 1, 9 PA ja setuksimabin apoptoosin indusoimiseksi setuksimabia-resistenttejä syöpäsoluja.

(A) vaikutus 1, 9 PA ja setuksimabi, joko yksin tai yhdessä, HIF-1α tason ja apoptoosin induktion. A431neo ja A431 /RasG12V solut olivat käsittelemättömiä tai käsiteltiin setuksimabi (10 nM: ssa 16 tuntia), 10 uM 1, 9 PA (lisätty viimeinen tunti ennen solujen hajoamista), tai sekä 0,5% FBS: ää elatusaineeseen. Solulysaatit valmistettiin ja analysoitiin Western-blottauksella vasta-aineiden kanssa on esitetty. (B) 1, 9 PA-välitteisen herkistymisen setuksimabista aiheuttama kasvun esto. A431neo ja A431 /RasG12V soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla setuksimabin ± 5 uM 1, 9 PA 0,5% FBS viljelyalustaa 5 päivää. Käsittelyn jälkeen solut altistettiin MTT-määritys. Optisen tiheyden arvoja käsiteltyjen ryhmien normalisoitiin arvot kontrolliryhmien (tai ilman 1, 9 PA hoito), ja ilmaistaan ​​prosentteina vastaavien ohjaus. Prosenttiosuus elossa solujen funktiona hoidon kasvavien pitoisuuksien kanssa setuksimabi. Erot solujen eloonjäämistä näiden kahden ryhmän välillä olivat tilastollisesti merkitseviä (

p

0,01), kun pitoisuudet setuksimabin olivat suurempia kuin 0,625 nM A431neo soluissa ja 1,25 nM A431 /RasG12V soluja. (C) 1, 9 PA-välitteisen herkistymisen setuksimabista aiheuttama VEGF tuotantoa. A431neo ja A431 /RasG12V solut olivat käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 10 nM setuksimabi, 10 uM 1, 9 PA, tai molemmat 0,5% FBS elatusaineeseen 16 tuntia. VEGF erittyy elatusaine solujen mitattiin ELISA: lla.

p

-arvot varten ilmoitettu vertailuja näytettiin. (D) Vertailu A431 ja GEO solut käsittelemällä 1, 9 PA ja setuksimabi, joko yksin tai yhdistelmänä. A431 ja GEO-soluja käsiteltiin kuten on kuvattu (A). Solulysaatit valmistettiin ja analysoitiin Western-blottauksella vasta-aineiden kanssa on esitetty. (E). 1, 9 PA-välitteisen herkistymisen GEO-solujen setuksimabista aiheuttama kasvun esto. GEO-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla setuksimabin ± 5 uM 1, 9 PA 0,5% FBS viljelyalustaa 5 päivää. Käsittelyn jälkeen solut altistettiin MTT-määritys. Tiedot käsiteltiin, kuten on kuvattu (B). Erot solujen selviytymistä kahden ryhmän välillä olivat tilastollisesti merkitseviä (

p

0,01) kaikilla pitoisuuksilla setuksimabin testattu.

Jos haluat saada lisänäyttöä solutasolla tukemiseksi pro-apoptoottisen yhdistämisen vaikutusta hoidon teimme perinteisen solujen kasvua ja selviytymistä määritys vertaamalla setuksimabia annoksesta riippuvainen vaikutus ja ilman 1, 9 PA A431neo ja A431 /RasG12V soluja. Huomasimme, että 1, 9 PA herkistyneet sekä A431neo ja A431 /RasG12V soluja setuksimabista (kuvio 7B). Lisäämällä 1, 9 PA setuksimabista siirtynyt IC

50 setuksimabin 3-10 nM alle 1 nM A431neo soluissa, ja mikä tärkeintä, se saavutti IC

50 3 nM Setuksimabin A431 /RasG12V solut; sen sijaan, IC

50 setuksimabin yksinään ei saavutettu (kuvio 7B), jopa jos pitoisuus on yli 10 nM (dataa ei esitetty).

havaittu, että käsittelemällä A431neo soluja 1, 9 PA ei yksinään merkittävästi estää VEGF tuotantoa verrattuna hoidettaessa näitä soluja setuksimabin yksinään; lisäämällä 1, 9 PA eivät enää alentaa tasoa VEGF tuotantoa, joka estyi setuksimabi (kuvio 7C). Mielenkiintoista kyllä, kun A431-solut tulivat vastustuskyky setuksimabista aiheuttama VEGF tuotannon takia ilmentymisen onkogeenisel- RasG12V, lisäämällä 1, 9 PA alensi merkittävästi taso VEGF tuotantoa (

p

0,01 ).

Lopuksi onko 1, 9 PA voi myös herkistää syöpäsolut joissa on luonnollisesti

Ras

mutaatioita, tutkimme vaikutus yhdistelmän 1, 9 PA ja setuksimabi päälle GEO peräsuolen syövän soluja, joiden tiedetään olevan muuntunut

Ras

[31]. Vaikka otetaan mutatoitunut

Ras

eksonin 2, GEO-solujen vastasi 1, 9 PA ja setuksimabin samalla tavalla kuin A431-solujen teki. 1, 9 PA johti korvaava kohoavan fosforyloidun Erk yön yli tapahtuneen käsittelyn (16 h) sekä A431 ja GEO-solujen, joka vähensi läsnäollessa setuksimabia. Näiden 2 aineita tehostetun PARP pilkkominen molemmissa soluissa (kuvio 7D) ja herkistyneet GEO-solujen setuksimabista inhiboivan vaikutuksen solujen kasvun ja eloonjäämisen (Kuva 7E).

Yhteenvetona havaintomme osoittavat, että 1, 9 PA voi herkistää syöpäsolut setuksimabista välittämää EGFR terapiaa vähen- tämisessä HIF-1α ja voi parantaa soluvastetta Setuksimabihoitoa syöpäsoluja joissa kasvaimia synnyttävän

Ras

mutaatioita.

keskustelu

Täällä raportoimme 2 tärkeitä havaintoja, jotka tietojemme mukaan ei ole aikaisemmin raportoitu.