Krooninen sairaus

tiivistelmä

syanogeeniset diglucoside amygdalin johdettu Rosaceae ytimissä, työskentelee monet potilaat vaihtoehtona anti-syövän hoitoon. Kuitenkin myös amygdalin todellakin toimii syöpälääkkeen ei ole selvä. Metastasis eristäviä ominaisuuksia amygdalin virtsarakon syövän solulinjoissa, siis tutkittu. Amygdalin (10 mg /ml) pantiin UMUC-3, TCCSUP tai RT112 virtsarakon syövän solujen kanssa 24 tunnin ajan tai 2 viikkoa. Kasvain solun tarttumisen verisuonten endoteeliin tai immobilisoituun kollageenin sekä kasvainten solujen vaeltamiseen tutkittiin. Vaikutukset lääkehoidon integriini α ja p alatyyppejä, on integriini-sitoutuvan kinaasin (ILK) ja kokonais- ja aktivoitu polttoväli adheesiokinaasi (FAK) määritettiin myös. Integriini knock-down suoritettiin arvioimaan integriiniin vaikutus migraation ja adheesion. 24 h tai 2 viikkoa amygdalin sovellus selvästi vähensi kasvainten soluadheesiota ja migraatio UMUC-3 ja RT112 soluja. TCCSUP tarttuvuus oli myös vähentynyt, mutta muuttoliike nostettiin alla amygdalin. Integriini alatyyppi ilmentyminen merkitsevästi ja nimenomaan muuttanut amygdalin riippuen solulinjasta. ILK oli kohtalaisen, ja aktivoitu FAK voimakkaasti, hävisi kaikki tuumorisolulinjoissa läsnäollessa amygdalin. Knock alas β1-integriinin aiheutti merkittävän laskun sekä tarttumista ja kulkeutumista UMUC-3-soluissa, mutta merkittävä kasvu TCCSUP tarttuvuus. Knock alas β4 integriini aiheutti merkittävän laskun kulkeutumista RT112 soluja. Koska eri toimien amygdalin erilaisista solulinjoissa heijastui β1 tai -p4 kaataa, oletetaan, että amygdalin vaikutteita tarttuvuus ja muuttavia ominaisuuksia virtsarakon syövän solujen säätelemällä β1 tai β4 integriinin ekspressioon. Amygdalin aiheuttama lisäys TCCSUP muuttavien käyttäytyminen osoittaa, että anti-kasvain hyötyy amygdalin (nähty kahden muun solulinjat) voi riippua syövän solutyypistä.

Citation: Makarević J, Rutz J, Juengel E , Kaulfuss S, Tsaur I, Nelson K, et ai. (2014) Amygdalin Vaikutteet virtsarakon syövän Cell Adhesion ja Invasion

In vitro

. PLoS ONE 9 (10): e110244. doi: 10,1371 /journal.pone.0110244

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 23 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 14 syyskuu 2014; Julkaistu: 15 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Makarević et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat ”Brigitta und Norbert Muth Stiftung” ja ”Freunde und Förderer der Goethe-Universität Frankfurt” (saama rahoitus RAB). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

käyttö täydentävä ja vaihtoehtoinen lääketiede (CAM) on kasvanut tasaisesti viime vuosikymmenien aikana. CAM sisältää ei-tavanomaista hoitoa, kuten homeopatian, vitamiinihoidosta, Phytomedicine ja perinteisen kiinalaisen lääketieteen, akupunktio ja jooga [1]. Kulutus luonnontuotteiden on laajimmalle levinnyt. Jopa 80% syöpäpotilaista Yhdysvalloissa [2], ja yli 50% syöpäpotilaista Euroopassa käyttää CAM yhdessä tai sijasta tavanomaista hoitoa [3]. Tyytymättömyys tavanomaisen hoidon ja vähentäminen kemoterapeuttisten sivuvaikutukset ovat yleisimmin perustellut käyttöön CAM [4], [5].

Toisin laajalle levinnyt käyttö luonnollisia yhdisteitä, tietoa niiden terapeuttista vaikuttavuutta on harva. Ristiriita käyttö ja tosiasiallinen etu on erityisen ilmeinen kanssa syanogeeniset diglucoside amygdalin (D-mandelonitrile-β-gentiobioside), läsnä ytimet hedelmiä Rosaceae lajit kuten Prunus persica (persikka), Prunus armeniaca (aprikoosi) ja Prunus amygdalus amara (kitkerä manteli). Amygdalin ensin eristetty vuonna 1873. Vuodesta 1920, amygdalin on suullisesti sovellettu hoitoon syöpäpotilailla Yhdysvalloissa. Vuonna 1950, suonensisäinen muoto amygdalin syntetisoitiin ja patentoitiin laetrile [6]. Vaikka laetrile on kemiallisesti erilainen kuin amygdalin termejä käytetään vaihdellen, joten tulkinta kliinisten tietojen vaikeaa. Tässä raportissa yksinomaan viitataan ”amygdalin”.

Amygdalin oli yksi suosituimmista, kuin perinteistä, anti-syöpähoitojen 1970 ja 1978, 70000 US syöpäpotilaat olivat käyttäneet amygdalin [7]. Silti näyttöön perustuva tutkimus amygdalin oli ja on harvaa ja sen hyöty kiistanalainen. Kannattajat pitävät amygdalin luonnollinen syövän hoito, kun taas vastustajat varoittavat, että amygdalin on tehoton ja jopa myrkyllisiä. Satunnaistetussa kliinisessä tutkimuksessa ja seurantatutkimusta ei ole koskaan tehty. Kliinisessä tutkimuksessa sponsoroida National Cancer Institute 30 vuotta sitten ei havaittu merkkejä kasvaimen regressio [8], kun taas Retrospektiivinen analyysi 67 kasvain potilailla amygdalin raportoitu 2 täydellistä ja 4 osittaista vastetta [9]. Ambivalence on näkynyt myös siinä tapauksessa, mikäli sellaisia ​​amygdalin oli tehoton viidessä ja tehokkaasti neljässä tapauksessa [6].

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida amygdalin muuttaa etäpesäkekasvainten solun etenemistä in vitro vuodesta invaasio ja etäpesäkkeiden ovat kriittisiä vaiheita pahanlaatuinen kasvain etenemisen ja tärkein syy hoidon epäonnistumiseen. Siksi häiritsee kasvainsolun invaasiota Cascade voisi olla innovatiivinen vaihtoehto vastapainoksi etäpesäkekasvainkudoksen levittämiseen. Käyttämällä paneeli virtsarakon syövän solulinjat, tehoa amygdalin estää kasvaimen-matriisi ja kasvaimen endoteelin vuorovaikutus arvioitiin. Lisäksi kyky amygdalin estää liikkuvia leviämistä arvioitiin. Kohortti adheesiomolekyylien on mukana monimutkainen prosessi kasvainsolujen levittämisen. Koska adheesioreseptoreina integriinin α ja β perhe ovat tiiviisti mukana kasvainsolun sitova ja transendoteelikulkeutumisessa levinneisyys, nämä olivat kohteina tutkimuksessa. Kalvomainen integriinin reseptorin ilmentymisen profiili, sekä solunsisäinen proteiinipitoisuus kunkin alatyypin, verrattiin amygdalin käsiteltyjen ja ei-käsiteltyjen solujen. siRNA kaataa tutkimuksia suoritettiin myös tutkimaan näiden parametrien muuta amygdalin, joilla voi olla kliinistä merkitystä. In vitro Tässä esitetyt tiedot osoittavat merkittävää tarttumista ja hyökkäyksen esto vaikutukset amygdalin, luultavasti indusoi muuttamalla β1 tai β4 integriinin ekspressioon.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

RT112, UMUC-3 (ATCC /LGC Promochem GmbH, Wesel, Saksa) ja TCCSUP (DSMZ, Braunschweig, Saksa) rakkosyöpä- soluja kasvatettiin ja jatkoviljeltiin RPMI 1640, 10% vasikan sikiön seerumia (FCS), 20 mM HEPES-puskuria , 1% glutamaxia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (kaikki: Gibco /Invitrogen, Karlsruhe, Saksa). Alakulttuurit mistä kohdista 7-24 valittiin koekäyttöön. Ihmisen endoteelisolujen (HUVEC) eristettiin ihmisen napalaskimoista ja kerättiin entsymaattisesti dispaasi (Gibco /Invitrogen). HUVEC kasvatettiin Medium 199 (M199; Biozol, Munich, Saksa), johon oli lisätty 10% FCS, 10% yhdistettiin ihmisen seerumia, 20 ug /ml endoteelisolujen kasvutekijän (Boehringer, Mannheim, Saksa), 0,1% hepariinia, 100 ng /ml gentamysiiniä ja 20 mM HEPES-puskuria (pH 7,4). Alakulttuurit mistä kohdista 2-6 valittiin koekäyttöön. HUVEC käytettiin tutkimuksessa. Institutionaalisten eettinen komitea Goethe-University Hospital, Frankfurt, Saksa, hyväksyi tutkimuksen ja luopua tarvetta suostumusta, koska HUVEC käytettiin anonyymisti in vitro määrityksiä ilman linkkiä potilastietoja.

Amygdalin hoito

Amygdalin päässä aprikoosinsiementen (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Saksa) oli juuri liuotettiin kasvainsolun elatusaineeseen ja lisättiin sitten kasvainsolut pitoisuutena 10 mg /ml joko 24 h tai 2 viikkoa [10 ] arvioida akuutin vs. pitkäaikaisesti. Valvonnan vastaanotetun kasvainsolun pelkästään viljelyalustassa. Kaikissa kokeissa kasvaimen soluviljelmiä verrattuna ei-käsitellyn niistä. Jos haluat sulkea pois myrkyllisiä vaikutuksia amygdalin, solujen elinkelpoisuus määritettiin trypaanisinisen (Gibco /Invitrogen).

Kasvain soluadheesiota

analysoida kasvaimen soluadheesiota, HUVEC siirrettiin 6-kuoppaisille multiplates ( Sarstedt, Nürnbrecht, Saksa) täydellisessä HUVEC-väliaineessa. Kun konfluentteja, RT112, UMUC-3 tai TCCSUP solut irrotettiin viljelypulloista mukaan Accutasella hoitoon (PAA Laboratories, Cölbe, Saksa) ja 0,5 × 10

6 solua lisättiin sitten HUVEC yksikerroksista 30, 60 tai 120 min. Tämän jälkeen tarttumattomat kasvaimen solut pestiin pois käyttämällä lämmitettyä (37 ° C) Medium 199. Loput solut kiinnitettiin 1% glutaraldehydillä. Kiinnittyneet kasvaimen solut laskettiin viidestä eri kentästä on määritelty koko (5 x 0,25 mm

2) käyttäen faasikontrastimikroskooppia ja keskimääräinen soluadheesiota laskettiin.

Asennus immobilisoituun kollageeniin

6-kuoppaisille levyille päällystettiin kollageenin G (uutettu calfskin, joka koostuu 90% tyypin I kollageeni ja 10% tyypin III kollageenista; Biochrom, Berliini, Saksa, laimennettiin 400 ug /ml PBS: ssä) yli yön. Muoviastiat toimi taustavertailuna. Levyt pestiin 1% BSA: ta (naudan seerumin albumiini) PBS-liuoksessa estää epäspesifisen soluadheesion. 0,5 x 10

6 kasvainsolut lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan ja jätettiin 60 min inkuboinnin. Tämän jälkeen tarttumattomat kasvaimen solut pestiin pois, jäljellä olevat tarttuneet solut kiinnitettiin 1% glutaraldehydillä ja laskettiin mikroskooppisesti. Keskimääräinen soluadheesiota nopeudella, määritelty tarttuvat solut

päällystetty hyvin – tarttuvat solut

tausta, laskettiin viidestä eri havainto aloilla.

mittaus kasvainsolun muuttoliikkeen

Serum aiheuttama kemotaktinen liike tutkittiin käyttäen 6-kuoppaista TranswellTM kammiot (Greiner, Frickenhausen, Saksa), jossa 8- um huokosia. 0,5 × 10

6 RT112, UMUC-3 tai TCCSUP solua /ml sijoitettiin ylempään kammioon seerumittomassa väliaineessa, joko vapaa amygdalin (päättyy ”amygdalin A”) tai jotka sisältävät amygdalin (päättyy ”amygdalin B”) . Seerumivapaassa ylemmässä kammiossa ja 10% seerumia alemmassa kammiossa edellyttäen seerumin kaltevuus välttämättömiä kasvaimen solujen vaeltamiseen tässä mallissa. 20 tunnin kuluttua inkuboinnin yläpinta Transwell kalvon varovasti pyyhittävä pumpulipuikolla solujen poistamiseksi, jotka eivät olleet vaeltaneet. Solut, jotka oli siirtynyt kohti seerumin gradientti alapintaan kalvon värjättiin hematoksyliinillä ja laskettiin mikroskooppisesti. Keskimääräinen maahanmuuttoluku laskettiin viidestä eri havainnon aloilla.

integriini pinnalla ilmenemisen

Kasvaimen solut pestiin estoliuoksessa (PBS, 0,5% BSA), ja sitten inkuboitiin 60 minuutin ajan 4 ° C: fykoerytriiniin (PE) konjugoitua monoklonaalista vasta-ainetta vastaan, seuraavat integriini alatyypeistä: anti-α1 (lgG1; klooni SR84), anti-α2 (IgG2a; klooni 12F1-H6), anti-α3 (lgG1; klooni C3II.1), anti-α4 (lgG1; klooni 9F10), anti-α5 (lgG1; klooni IIA1), anti-α6 (IgG2a; klooni GoH3), anti-β1 (lgG1; klooni MAR4), anti-β3 (lgG1; klooni VI-PL2 ) tai anti-β4 (IgG2a, klooni 439-9B, kaikki: BD Pharmingen, Heidelberg, Saksa). Integriinin ilmentyminen kasvainsoluissa mitattiin sitten käyttämällä FACscanilla (BD Biosciences, Heidelberg, FL-2H (log) kanavan histogrammi analyysi, 1 x 10

4 solua /skannaus) ja ilmaistaan ​​keskiarvona fluoresenssiyksiköinä. Hiiren IgG1-PE (MOPC-21) tai IgG2a-PE (G155-178, kaikki: BD Biosciences) käytettiin isotyyppikontrolli.

Western blotting

tutkimiseksi integriini sisältöä, kasvainsolun lysaatit levitettiin 7% polyakryyliamidigeelissä ja elektroforeesi 90 minuutin ajan 100 V: sitten proteiini siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Sen jälkeen, kun esto ei-rasva kuivamaitoa 1 h, kalvoja inkuboitiin yön yli monoklonaalisia vasta-aineita on lueteltu edellä. Lisäksi integriini liittyvä signalointi tutkittiin anti-integriini-sitoutuvan kinaasin (ILK, klooni 3, laimennus 1:1000), anti-polttoväli adheesiokinaasi (FAK, klooni 77, laimennus 1:1000) ja anti-fosfospesifisiä FAK (pY397; klooni 18, laimennus 1:1000) vasta-aineiden (kaikki: BD Biosciences). HRP-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG: llä (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA; laimennus 1:5.000) toimi sekundäärisenä vasta-aineena. Kalvot lyhyesti inkuboitiin ECL detektointireagenssia (ECL ™, Amersham /GE Healthcare, München, Saksa) proteiinien visualisoimiseksi ja analysoitiin sitten Fusion FX7 järjestelmä (Peqlab, Erlangen, Saksa). β-aktiinin (1:1.000; Sigma, Taufenkirchen, Saksa) toimi sisäisenä kontrollina.

Gimp 2.8 ohjelmistoa käytetään suorittamaan pikselimäärä analyysi proteiinijuovat. Suhde proteiinin intensiteetin /β-aktiini-intensiteetti laskettiin, ja prosentteina ilmaistuna kontrollien asetettu 100%.

siRNA kaataa tutkimukset

tuumorisoluja (3 x 10

5/6-kuoppa) transfektoitiin sirna (siRNA) suunnattu integriini β1 (2 uM, kohdesekvenssi: AAAAGTCTTGGAACAGATCTG, HS_ITGB1_5, Qiagen, Hilden, Saksa) tai integriinin β4 (2 uM, kohdesekvenssi: GTGGATGAGTTCCGGAATAAA; Hs_ITGB4_5 , Qiagen), jonka siRNA /transfektioreagenssi (HiPerFect transfektioreagenssi; Qiagen) suhde 01:06. Non-käsitellyt solut ja solut käsiteltiin 5 nM ohjaus siRNA (Kaikki tähdet negatiivinen kontrolli siRNA, Qiagen) toimivat kontrolleina. Sen jälkeen, kasvain solun tarttumista immobilisoitu kollageenin sekä kasvaimen solujen vaeltamiseen analysoitiin kuten edellä on esitetty.

Tilastot

Kaikki kokeet suoritettiin 3-6 kertaa. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin Wilcoxonin-Mann-Whitney-U-testillä. Erot katsottiin tilastollisesti merkittävä ap arvo on alle 0,05.

Tulokset

Amygdalin vähentää kasvaimen endoteelin ja kasvaimen matriisi vuorovaikutus

Amygdalin merkittävästi vähentää kiinnitys kaikkien kolmen virtsarakon syövän solujen linjat HUVEC verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuva 1). Cell kiinnittymistä TCCSUP ja RT112 oli voimakkaammin muutettu amygdalin kuin UMUC-3-soluissa. Ei eroa lyhyen aikavälin (24 h) ja pitkän aikavälin (2 viikkoa) amygdalin hoito oli ilmeinen. Sitoutumiskyky UMUC-3, TCCSUP ja RT112 solujen immobilisoituun kollageeniin oli myös merkitsevästi alassäädetty, kontrolleihin verrattuna (kuva 2). Laajentaminen hoitojakson aikana 24 tuntia 2 viikkoa ei entisestään esto potentiaalia amygdalin. Mitään merkkiä toksisuudesta amygdalin havaittiin, että trypaanisinieksluusiolla testi.

Kasvaimen soluja käsiteltiin 10 mg /ml amygdalin joko 24 h tai 2 viikkoa. Valvonnan vastaanotetun soluviljelyalusta yksin. 0,5 × 10

6 kasvainsolujen /hyvin lisättiin HUVEC yksisolukerroksiin 0,5, 1 ja 2 tuntia. Tarkoittaa kiinnittyneet kasvainsolujen viisi kenttää laskettiin ja kuvattu prosentteina 100% kontrolli (pisteviiva). Yksi edustaja kuudesta kokeesta. * Tarkoittaa merkitsevää eroa verrokkeihin.

Kasvaimen soluja käsiteltiin 10 mg /ml amygdalin joko 24 h tai 2 viikkoa. Käsittelemättömien solujen amygdalin toimi valvontaa. 0,5 x 10

6 solua /kuoppa lisättiin immobilisoitua kollageenia 60 min. Keskimääräinen lukumäärä kiinnittyneet syöpäsolujen viisi kenttää laskettiin. Yksi edustaja kuudesta kokeesta. * Tarkoittaa merkitsevää eroa verrokkeihin.

Amygdalin muuttaa vaeltavien käyttäytymistä kasvainsolujen

altistaminen kasvainsolujen amygdalin 24 tuntia ei muuttanut niiden muuttavien aktiivisuutta (kuva 3) . Kuitenkin sen jälkeen, kun 2 viikkoa esikäsittelyn aikana määrä UMUC-3 ja RT112 solujen alapuolella Transwell kammion kalvo vähentää, verrattuna käsittelemättömiin kontrollisoluihin. Inhiboiva vaikutus UMUC-3-soluissa oli selvempi, kun amygdalin pysyi soluviljelyaineessa aikana 20 h vaeltavien inkuboinnin ( ”amygdalin B”), verrattuna amygdalin väliaineessa ( ”amygdalin A”). Tämä ero 20 h muuttavien inkubaation kanssa tai ilman amygdalin ei havaittu RT112 soluissa, joissa muuttoliike oli tukossa samassa määrin. Toisin kuin RT112 ja UMUC-3-soluissa, jyrkän kasvun TCCSUP solujen vaeltamiseen 2 viikon kuluttua amygdalin esikäsittelyä todettiin.

tuumorisoluja käsitelty amygdalin 24 tuntia tai 2 viikkoa ympättiin ylemmässä kammiossa kemiallis-houkutin alemmassa hyvin. Solujen annettiin liikkua 20 h, joko amygdalin-väliaineessa (amygdalin-A) tai amygdalin sisältävässä väliaineessa (amygdalin-B). Solut siirryttäessä alemman kalvon pinnan laskettiin. Kontrollit asetettiin 100%. Yksi edustaja kuudesta kokeesta. * = Merkitsevä ero kontrolleihin. # = Merkitsevä ero amygdalin-A ja amygdalin-B.

Amygdalin toimii integriinin α ja β pinta ilmaisun

integriini alatyyppien α2, α3, α5, α6, β1 ja β3 voimakkaasti ilmentyy UMUC-3-soluissa, α4 oli hyvin maltillisesti ilmaistuna ja α1 ja β4 olisi esitetty (kuva 4, vasen). Amygdalin kohonnut α3 mutta pienentää α5, α6, β1 ja β3, riippumaton valotusaikaa. Ei amygdalin aiheuttama muutos havaittiin α4 integriinin. Α2-reseptorin alassäädetty kuluttua 24 h mutta säädelty 2 viikon kuluttua amygdalin altistus (kuva 4, oikea). TCCSUP solut selvästi ilmaissut α2, α3, α5, α6, β1 ja β4 integriini jäsenille (kuva 5, vasen). Β3 tyyppi oli kohtalaisesti läsnä solun pinnalla. Sekä α1 ja α4 alatyyppejä eivät olleet havaittavissa. Amygdalin johti merkittävään kasvuun integriinin α5, α6, β1 ja β4 on TCCSUP, jolloin 2 viikkoa sovellus indusoi huomattavasti tehokkaampi kuin 24 tunnin inkuboinnin (kuva 5, oikealla). Α2 ja β3 alatyyppejä parannettiin 2 viikon kuluttua, mutta ei sen jälkeen 24 tuntia. α3 ei muuttunut amygdalin. RT112 solut ominaista korkea α2, α3, α6, β1 ja β3 ekspressiotaso (kuva 6, vasen). Integriini α5 kohtalaisesti ilmaisi, ja β3 oli vain hieman koholla yli taustaa. Integriinit α1 ja α4 ei ilmentyy RT112 soluissa. Integriinien α3, α6, β3 ja β4 olivat kaikki tukahdutti amygdalin (kuva 6, oikealla). Vaikutukset α3 ja β3 ei riipu siitä amygdalin oli haettu 24 tuntia tai 2 viikkoa, kun taas α6 ja β4 oli vähentynyt suuremmassa määrin 2 viikon kuluttua, verrattuna 24 tuntia. α2 selvästi lisääntynyt 2 viikon, mutta ei 24 tunnin kuluttua, ja α5 ja β1 pysyi muuttumattomana amygdalin.

Vasemmassa paneelissa kuvaa integriinin ilmentymisen kuin histogrammit kanssa katkoviiva viittaa taustan fluoresenssi ja kiinteä viiva osoittaa erityistä fluoresenssi käsittelemättömissä soluissa. Oikeassa paneelissa näkyy integriini alatyypin ilmentyminen kuluttua 24 h ja 2 viikkoa amygdalin altistuminen, kontrolleihin verrattuna asetettu 100%. N. C. = Ei laskettu. * Tarkoittaa merkitsevää eroa kontrolleihin.

Vasemmassa paneelissa kuvaa integriinin ilmentymisen kuin histogrammit kanssa katkoviiva viittaa taustan fluoresenssi ja kiinteä viiva osoittaa erityistä fluoresenssi. Oikeassa paneelissa näkyy integriini alatyypin ilmentyminen kuluttua 24 h ja 2 viikkoa amygdalin altistuminen, kontrolleihin verrattuna asetettu 100%. N. C. = Ei laskettu. * Tarkoittaa merkitsevää eroa kontrolleihin.

Vasemmassa paneelissa kuvaa integriinin ilmentymisen kuin histogrammit kanssa katkoviiva viittaa taustan fluoresenssi ja kiinteä viiva osoittaa erityistä fluoresenssi. Oikeassa paneelissa näkyy integriini alatyypin ilmentyminen kuluttua 24 h ja 2 viikkoa amygdalin altistuminen, kontrolleihin verrattuna asetettu 100%. N. C. = Ei laskettu. * Tarkoittaa merkitsevää eroa verrokkeihin.

Muutokset integriini proteiinien amygdalin

Muutokset integriinin proteiinipitoisuus aiheuttama amygdalin on esitetty kuviossa 7 (vasemmalla) ja kvantifiointi ilmaistaan välinen prosentuaalinen ero ohjaus kasvainsolujen ja kasvainsoluja käsiteltiin amygdalin (oikealla). In UMUC-3-soluissa, α6 ja β3 tukahdutettiin sekä 24 h ja 2 viikkoa amygdalin sovellus, kun taas α2 ja β1 kasvoi säädelty. Amygdalin indusoima lisääntyminen α5 oli ilmeistä, mutta tämä vaikutus on rajoitettu 2 viikkoa amygdalin sovellus. α3 integriinin oli hieman parannettu kontrolleihin 24 tunnin jälkeen, mutta ei 2 viikon kuluttua. Integriinien α1, α4 ja β4 eivät olleet havaittavissa western blottauksella. Integriinin riippumaton merkinanto proteiineja ILK ja pFAK oli vähentynyt 2 viikon amygdalin sovellus. Samanlaisia ​​kanne kohdistu TCCSUP soluissa, koska α2, α5 ja β1 lisääntynyt ja β3 laskenut alle amygdalin (2 viikkoa 24 h). Toisin kuin UMUC-3, α6 on parannettu 24 tunnin kuluttua, mutta vähentää, kun 2 viikkoa. β4, ei ilmaistu UMUC-3, oli alas-säädellä amygdalin (2 viikkoa 24 h). 2 viikkoa amygdalin sovellus johti menetykseen pFAK ja hieman vähentynyt ILK. Arviointi RT112 paljasti lisääntynyt α2 integriini aiheuttamia 24 h tai 2 viikkoa amygdalin hoitoa. α6 ja β4 integriinit olivat alas-säädellä 2 viikkoa 24 h. Siellä oli myös lievä kasvu α3 kuluttua 24 h mutta 2 viikon kuluttua, ilmiö havaitaan myös UMUC-3-soluissa. Vastustavat UMUC-3 ja TCCSUP The α5 alatyyppiä RT112 oli vain kohtalaisen havaittavissa kontrolli soluissa ja edelleen vähentynyt seuraavat lääkehoitoa. Amygdalin lisäksi vaikuttanut integriiniin liittyvää signalointia RT112, osoituksena vähentynyt FAK ja pFAK.

Controls jätettiin käsittelemättä. p-aktiini toimi sisäisen valvonnan. Kuvassa on esitetty yksi edustaja kolmesta erillisestä kokeesta. n.d. osoittaa ”ei havaittavissa”. Kvantifiointi integriinin alatyypin ilmentyminen on kuvattu oikealla. Pikselimäärä annetaan prosentteina kontrolleihin verrattuna ei ole käsitelty amygdalin. * Tarkoittaa merkittävää kasvua sen jälkeen, kun sekä 24 h ja 2 viikkoa amygdalin hoidon, #indicates merkittävä lasku, kun sekä 24 h ja 2 viikkoa amygdalin hoidon, kontrolleihin verrattuna.

β1 ja β4 integriini pudotus

Amygdalin selvästi muuttunut integriini ilmentymisen profiili kaikkien kolmen virtsarakon syövän solulinjat. Tutkia integriinin muutokset ovat merkityksellisiä metastasointiin, kaataa tutkimuksia tehtiin kanssa β-integriiniä jäsenet palvelevat edustajina. Koska β1 (mutta ei β3 ja β4) oli ilmentyy voimakkaasti ohjaus UMUC-3 ja TCCSUP ja merkittävästi pienentynyt amygdalin, β1 pudotettiin näissä soluissa ja tarttuvuus ja muuttoliike kokeet toistettiin (kuva 8). Β1 integriini myös ilmentyy voimakkaasti RT112 mutta ei muutettu amygdalin, toisin kuin -p4 joka täytti molemmat kriteerit, toisin sanoen korkea alustavasti osoittaneet ja merkittävä modulaatiota amygdalin. Siksi β4 lyötiin-alas RT112 solulinjassa ennen alistuminen tarttumista ja migraatiokokeessa (kuva 8, alhaalla oikealla). Menetys β1 liittyi merkittävä väheneminen UMUC-3 sitovan (kuva 8) ja muuttoliike (kuva 9). Toisaalta, TCCSUP sitoutuminen kollageeniin tehostui (kuva 8), kun taas TCCSUP maahanmuutto ei vaikuttanut β1 kaataa (kuva 9). Down-säätelemällä β4 integriini RT112 soluissa ei muuttanut tartuntaominaisuudet (kuva 8), mutta massiivisesti tukossa muuttoliike (kuva 9).

Kasvaimen solut transfektoitiin integriini β1 tai -p4 siRNA. Ei- käsitellyt solut (kontrolli) ja soluja käsiteltiin salattu siRNA (siRNA kontrolli) toimivat kontrolleina. Tehoa reseptori Knockdown arvioitiin western blottauksella (alhaalla oikealla). Yksi edustaja kuudesta kokeesta. * Tarkoittaa merkitsevää eroa kontrolleihin.

Kasvaimen solut transfektoitiin integriini β1 tai -p4 siRNA tai salattu siRNA (siRNA kontrolli). Controls jätettiin käsittelemättä (kontrolli). Arvot näkyvät siirretty solua kohti 0,25 mm

2. Yksi edustaja kuudesta kokeesta. * Tarkoittaa merkittävää eroa käsittelemättömään kontrolliin. Insert otettu kuva 8.

Keskustelu

Koska tuumorisolun vuorovaikutus verisuonten endoteelin on välttämätöntä kasvainsolujen poistua verenkiertoon sijoittautumista keskiasteen sivustoja, häiritsee tätä prosessia on tärkeää estää etäpesäkkeiden. Tämä kertomus osoittaa, että amygdalin estää merkittävästi kiinnittymisen virtsarakon syövän sisäkalvon soluihin. Koska amygdalin vähentää kasvainsolujen, vähemmän soluja voi indeksoida alla endoteelikerros luomaan yhteyksiä matriisin proteiineja etäispesäkkeitä. Seuraava vaihe etäpesäkkeitä liittyy kollageenimatriisia. Vuorovaikutus kasvainsolujen kollageeni ei saa tapahtua vain paeta ensisijaisen kasvaimen, mutta myös siksi, että invasiivisia leviäminen kohde-elimen, kun kasvainsolut ovat kulkeneet endoteelin veriaivoesteeseen [11]. Läsnä ollessa amygdalin, kasvaimen soluihin, joita käytetään tässä tutkimuksessa menettäneet kyky sitoutua immobilisoituun kollageeniin. Näin ollen, amygdalin voi hidastaa metastasointiin estämällä mekaanisesti koskettimien verenkierrossa olevia kasvainsoluja verisuonen seinämän ja sub-endoteeli-matriisi. Kasvain levittäminen, ei kuitenkaan rajoitu sitovia. Solut on myös irtautua matriksiproteiineihin hyökätä kudokseen. Amygdalin vaikutti siirtyminen kapasiteetti kaikkien virtsarakon syövän solulinjat jälkeen 2 viikkoa, mutta ei 24 tunnin kuluttua, mikä osoittaa, että pitkäaikainen hoito voi olla tarpeen muuttaa kasvain solun liikkuvuus.

amygdalin: n toimintaa eri kasvainsolun linjat ei ollut sama. Migraatio UMUC-3 ja RT112 oli tukossa, kun taas määrä vaeltavia TCCSUP solujen lisääntyi amygdalin. Tämä tarkoittaa, että vaikka amygdalin vähentää kiinnitys korko kaikissa syöpäsolulinjoissa, on olemassa vaara, että krooninen amygdalin altistuminen muutama jäljellä soluja tietyn kasvaimen alatyypin kuten TCCSUP voi suurentaa veturin toimintaa. Olipa takia hankittu tai luontainen vastustuskyky tai kehittymisen ansiosta toivottujen takaisinkytkennät epäselvää, mutta se osoittaa, että kaikki virtsarakon syöpä potilaat voivat hyötyä yhtä hyvin amygdalin. Tämän mukaisesti spekulaatiota, se on äskettäin osoitettu, että vastustuskyvyn kehittyminen liittyy toiminnallinen kytkin integriinireseptoreita, ajo kasvainsolujen korkea liikkuvuutta [12].

Chen et al. äskettäin arveltu, että kasvainsolut, joilla on korkea siirtonopeutta ovat paljon todennäköisemmin etäispesäkkeitä kuin ne, joilla on alhainen muuttonopeus [13]. Tämä ei kuitenkaan voitu vahvistaa toinen tutkimus, jossa määrä vaeltavia kasvainsolujen sekä etäisyyden ja nopeuden maahanmuuton eivät korreloi pahanlaatuinen potentiaalia kasvainsolujen [14]. Pikemminkin suuntaan solun liikkuvuus osoitti pahanlaatuistumisriskin syöpäsolujen [14]. Saadaksemme lisää ymmärrystä, eläinkokeissa on juuri aloitettu tutkia in vivo kasvaimen etenemistä alle amygdalin hoitoon.

rooli integriinien muodostamisessa solu-solu- ja solu-matriisi joukkovelkakirjojen tarpeen tarttuvuus, ekstravasaatio ja muuttoliike on ollut puheeksi [15], [16], jolloin β1 integriinin alayksikköä keskeisessä asemassa virtsarakon syövän solulinja T24. Kuitenkin kaikki virtsarakon syövän solulinjat on tunnusomaista saman integriinin kuvio. Tässä tutkimuksessa amygdalin muutettu tarttuvuus ja muuttoliike ja muuttunut integriinin ilmentyminen profiileja eri tavalla eri solulinjoissa. Integriini β4 ei ilmentyy UMUC-3 vaan RT112 ja TCCSUP, kun taas β3 oli vain hieman havaittavissa RT112 mutta voimakkaasti havaittavissa UMUC-3 ja TCCSUP soluja. Tutkimus, johon vaikutus valproiinihapon virtsarakon solun tarttumista kollageeniin [17], on myös paljastanut muuttaminen integriinin ilmentymisen profiilin riippuen solulinjasta palveluksessa. Muut tutkijat ovat raportoineet erilaisia ​​integriinin subfamilies in UMUC, T24, J82, RT-4, 253J ja Hu456 soluihin [18], [19]. Kukin solulinja voi tämän vuoksi oltava ominaisuus reseptorin asettaa ja päihdehuollon saattaa vaikuttaa integriinin alaperheiksi toisin.

Tutkimukset syöpäsolujen ovat osoittaneet, että alkuperäisen integriini profiilia tietyn kasvaimen klooni voi määrittää molekyyli vastauksen lääkehoitoa [20]. Todellakin, amygdalin vaikutti integriini koostumus arvioitiin virtsarakon kasvainsoluja eri tavalla. Vuonna UMUC-3-solujen β1 ja β3 pinta ilmentyminen väheni amygdalin, mutta parannettu TCCSUP soluissa. Vuonna RT112 soluissa β4 sijasta β1 muuttui amygdalin. Solunsisäinen ja kalvo integriinin tasot olivat myös eri vaikutti amygdalin in UMUC-3 ja TCCSUP soluja. In UMUC-3-solujen solunsisäinen β1 integriini nostettiin ja pinnan ilmentyminen väheni, mikä osoittaa, että amygdalin indusoi translokaatio β1-integriinin pois pinnalta kalvon. Vuonna TCCSUP soluissa p1 integriinin ilmentyminen lisääntyi sekä solun ja pinnalla kalvon. Amygdalin aiheuttama lasku solunsisäisessä β3 integriini sekä UMUC-3 ja TCCSUP soluja. Pinta ilme, ei kuitenkaan ollut sama, jossa UMUC-3-solujen esittäen amygdalin aiheuttama lasku β3 integriinin ja TCCSUP solujen jossa kasvua. Tärkeimmät translokaatiota TCCSUP solujen sytoplasmasta pintakalvon näyttää, joten ne on suunnattu β3 integriiniin.

Poistetaan osa integriini-alatyyppien solun pinta ei ole ainoa mekanismi säätelevä syöpäsolujen tarttumista. Integriini välistä laitonta solunsisäisiin osastoihin ja solun pinnalla on osoitettu olevan välttämätön edellytys reseptori poiston juuressa solun ulokkeita. Kierrätys integriini takaisin johtava solun reuna tukee tartunta [21]. Prekliinisessä tutkimuksessa munuaissyöpäsoluissa osoitti sekä integriinireseptoriantagonisteja ylä- ja down-regulation voi ajaa syöpäsoluja kohti maligniteetti. Niinpä hoitotoimenpiteitä, joilla pyritään ”uudelleen translokaatiota” tietyt integriiniin molekyylit saattavat tarjota mahdollisuus estää pahanlaatuisen [22].

merkitystä integriinien ja tarttumisen muuttoliikettä osoitettiin knock-down tutkimuksia β-integriinien kanssa joko korkea alkuperäisen pinnan ilmentyminen tai voimakas amygdalin aiheuttama muutos. Nämä kriteerit täyttyivät β1 in UMUC-3 ja TCCSUP soluja sekä β4 in RT112 soluissa. Suppressio β1 korreloivat hyvin vähentyneestä sitoutumisesta ja muuttoliike aktiivisuus UMUC-3, joka myöntää in vitro tutkimukset T24 ja 5637 soluihin [23], [24]. Siksi menetys β1 voisi olla mekanismi, jonka amygdalin hidastaa UMUC-3 kasvain levittämistä. TCCSUP solut kuitenkin toiminut toisin alle β1 saarto. Sidonta tapahtumia kollageenin itse asiassa kasvoi, mikä osoittaa, että tämä reseptori näissä soluissa estää solu-solu- tai solu-matriisi yhteyksiä. Differential integriini opastettu liima käyttäytymistä eri kasvain alilinjat on aiemmin havaittu. Estää α3 alayksikön on osoitettu estävän HCV29 virtsarakon syövän solun sitoutumista matriisiin proteiinien laminiinin ja fibronektiinin, mutta on vastakkainen vaikutus T24 ja Hu456 soluadheesiota.