Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

Keuhkosyöpä on edelleen suurin syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti. Solusyklin sääntelyn purkaminen on merkittävä rooli patogeneesissä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). CDC25A on ratkaisevan solusyklin säädin joka parantaa solusyklin etenemisen. Tässä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään roolin uusi CDC25A transkription variantti, CDC25A

Q110del, sen sääntely CDC25A proteiinia, ja sen vaikutus ennusteeseen NSCLC potilaiden.

Menetelmät /Principal Havainnot

Kirjoittajat raportoivat uudenlainen CDC25A transkriptio variantti kodonilla 110 (glutamiini) poistetaan, että me kutsutaan CDC25A

Q110del in NSCLC soluissa. 9 (75%) 12 NSCLC solulinjat, CDC25A

Q110del ilmaisun osuus oli yli 20% CDC25A selostukset. Biologiset vaikutukset CDC25A

Q110del tutkittiin H1299 ja HEK-293F-soluissa käyttäen UV-säteilyä, virtaussytometrialla, sykloheksamidin hoitoa, ja konfokaalimikroskopialla. Verrattuna CDC25A

paino, CDC25A

Q110del proteiini oli pitempi puoliintumisaika; solut, jotka ilmentävät CDC25A

Q110del olivat UV-kesto ja osoitti enemmän mitoosi toimintaa. Taqman-PCR: ää käytettiin määrittämään CDC25A

Q110del ekspressiotasot 88 ensisijainen NSCLC kasvain /normaali kudos paria. Potilailla, joilla on NSCLC, Kaplan Meier käyrät osoittivat ilmentävien kasvainten korkeampi CDC25A

Q110del suhteessa viereiseen keuhkojen kudoksia on merkittävästi huonompi kokonaiselinaikaa (

P

= 0,0018).

merkitys

Tässä tunnistimme CDC25A

Q110del uutena transkription muunnelma CDC25A in NSCLC. Sekvenssi-erityisluonne poikkeavuuden voisi olla prognostinen indikaattori pienisoluista keuhkosyöpää sekä ehdokkaaksi tavoite tuleville hoitostrategioita.

Citation: Younis RH, Cao W, Lin R, Xia R, Liu Z, Edelman MJ, et ai. (2012) CDC25A

Q110del A Novel Cell Division Cycle 25A Isoformi poikkeuksellisesti Ilmaistuna ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 7 (10): e46464. doi: 10,1371 /journal.pone.0046464

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 30 elokuu 2012; Julkaistu: 05 lokakuu 2012

Copyright: © Younis DDS, MDS, PhD, et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tuettiin osittain NIH apurahoja R01 CA126818 ja R01 CA136635. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä edelleen johtava syy maligniteetin -aiheiset kuolemia maailmanlaajuisesti huolimatta kehitys hoitomuodot [1]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on yleisin keuhkosyövän ja on seurausta kertyneen molekyylitason muutoksia johtaa vapauttamiseen useiden solun prosessien kuten solusyklikontrollin [2]. NSCLC, useat solusyklin säätimiä, jotka on kriittinen rooli solukierron tarkastuspisteen hallintalaitteet ovat muuttuneet, mikä mahdollistaa syöpäsolujen ohittaa eri tarkistuspisteitä, erityisesti G1 /S ja G2 /M myöhempien kontrolloimaton soluproliferaatiota [3] – [ ,,,0],7].

Solunjakautumisen cycle 25A (CDC25A) on jäsen CDC25 perheen kaksoisspesifisten fosfataaseja ja sillä on keskeinen rooli solusyklin etenemisen [8], [9]. CDC25A tehtävänä on poistaa estävä fosfaatit treoniinin ja tyrosiinin tähteet ATP-sitoutumiskohtien CDK: iden, edistää solusyklin etenemistä [10], [11]. CDC25A on myös alavirran tavoitteeksi Chk1-välitteisen tarkastuspiste reitin: aktivointi Chk1 DNA vahingollista olosuhteet tavoitteet CDC25A varten proteasomin hajoamista, mikä estää solujen kromosomipoikkeavuuksien etenemisen solusyklin läpi [10], [12], [13]. Vaikka CDK1 on kriittinen rooli CDC25A vakauttamiseen mitoosin aikana [8], [10], [11]. CDC25A usein yli-ilmennetään syöpiä, kuten NSCLC. Tämä yli-ilmentyminen liittyy aggressiivisempi kliininen käyttäytyminen ja huonompi selviytymisen [7], [8], [12] – [19]. Vaikka CDC25A on tutkittu laajasti sen osassa kasvaimen etenemiseen ja mahdollisena kohteena syövän hoitoon, mekanismeja CDC25A yli-ilmentymisen syövän vielä tutkittava [12]. Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että yli-ilmentyminen CDC25A syövät voi johtua transkription jälkeisen sääntelyn purkaminen [20], kuten yliekspressio DUB3 ubikitiinipromoottori hydrolaasin [21], inaktivaatio glykogeenisyntaasikinaasi-3B (GSK-3B), joka fosforyloi CDC25A edistää sen proteolyysi alussa solusyklin faaseissa [22], aktivointi LIN28A joka säätelee CDC25A ilmentymisen estämällä biogeneesiä let-7 miRNA [23], ja microRNA-21, joka säätelee negatiivisesti CDC25A, niin, että sen alle ilmentyminen johtaa CDC25A yliekspression paksusuolen syöpä [24].

Kirjoittajat raportoivat tunnistamisen uusi vaihtoehtoisesti liitettyjä CDC25A isoformi, joka johti poistaminen kodonin 110 kutsutaan CDC25A

Q110del. Osoitamme, että CDC25A

Q110del ilmentyy korkeilla tasoilla 75% NSCLC solulinjoissa. CDC25A

Q110del proteiini oli korkeampi vakautta ja ydinaseiden jakelu. Solut, jotka ilmentävät korkeaa CDC25A

Q110del olivat UV-kesto. Potilailla, joilla on NSCLC, korkeampi CDC25A

Q110del tasot kasvaimia yhteydessä huonoon kliiniseen tulokseen. Tuloksemme osoittavat, että CDC25A

Q110del ilme on yleinen NSCLC ja voi olla rooli keuhkojen kasvainten synnyssä ja syövän etenemistä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

HEK293 ja NSCLC-solut saatiin ATCC: stä (Manassas, VA), ja pidettiin DMEM: ssä – 5% naudan sikiön seerumia. Ikuisti ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen solulinjoja (HBEC), HBEC2, HBEC3, HBEC4 ja HBEC5 (lahja tohtorit. John Minna ja Jerry Shay yliopiston Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas) [25], pidettiin keratinocyte serum- ilmainen (KSF) media rekombinantilla ihmisen orvaskeden kasvutekijän (rEGF) ja naudan aivolisäkeuutteella (Invitrogen, Carlsbad, CA). Plasmidi transfektio suoritettiin käyttäen lipofektamiinia 2000 (Invitrogen).

Western blotting

Solut kerättiin RIPA-puskurissa, jossa proteaasi-inhibiittori (Roche Bioscience), ja erotettiin SDS-PAGE: lla. Ensisijainen vasta-aineita CDC25A (kloonit 144 ja F-6), cdc2 p34 (H-297), Chk1, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, CA), fosfo-Chk1 (Ser345) (Cell Signaling Biotechnology, Danvers, MA), fosfo- CDK1 (Tyr15) (Calbiochem EMD kemikaalit Inc, Gibbstown, NJ) käytettiin. NE-PER-proteiinin uutto (Pierce Biotech, Rockford, IL) käytettiin fraktioida sytosoliset ja tumaproteiinit. Sykloheksamidin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) liuotettiin uudestaan ​​DMSO.

RNA käänteistranskriptio, ja reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia, ja muunnetaan cDNA käyttäen SuperScript III ensimmäisen Strand Synthesis kit (Invitrogen). Täyspitkä CDC25A cDNA monistettiin käyttäen iProof High-Fidelity DNA-polymeraasia (Bio-Rad, Hercules, CA), ja kloonattiin pEF6 /V5 His (Invitrogen, Carlsbad, CA) tai pEGFP-N1 (Clontech Laboratories, CA) standardisoinnin real aika PCR-reaktiot, UV-säteily, CHX hoitoja, sekvenssianalyysillä ja restriktioentsyymipilkkomisen pEGFP-N1 fuusioitu EGFP tai m-Cherry käytettiin kuvantamisen ja virtaussytometrialla analyysi tai jos ilmoitettu Kaikki DNA-manipulaatiot suoritettiin Biosafety tason 1 tai 2 laboratorioissa.

määrittää koko CDC25A transkriptio, real-time PCR koottiin käyttäen forward-aluketta 5′-GCTCCTCCGAGTCAACAGAT -3 ’, käänteinen aluke 5′-TGGACTACATCCCAACAGCTT-3’, ja FAM ™ dye-leimattua koetinta 5 ”-ATTCTCCTGGGCCATTGGACA-3 ’; määrittää villityypin CDC25A transkriptio, määritys koottiin käyttämällä forward-aluketta 5 ’-GCTCCTCCGAGTCAACAGAT -3′, käänteinen aluke 5’-ACTACATCCCAACAGCTTCTG- 3 ’ja FAM ™ dye-leimatun koettimen 5′-ATTCTCCTGGGCCATTGGACA-3’. Määritys ajettiin kolmesti TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystem, Carlsbad, CA) in Applied Biosystem 7900HT Fast Real Time PCR-järjestelmä. Kaikissa reaktioissa, GAPDH Fast TaqMan-määritys VIC väriaine-leimattu koetin lisättiin RNA loading ohjaus.

Kun yhteensä ilmentymistä CDC25A on nimetty endogeenisen viitegeenin, runsaasti CDC25A

Q110del voi olla laskettuna ACt = Ct

p-Ct

tot. Näin ollen suhteellinen runsaus CDC25

paino pariksi kasvain verrattuna normaaliin kudokseen lasketaan 2

-ΔΔCt menetelmä, jossa ΔΔCt = ΔctTumor- ΔctNormal (User Bulletin # 2 Applied Biosystem). Jos ekspressiotasoja CDC25A

Q110del ja CDC25

paino- ovat yhtä vastaavat kasvaimen ja viereisen normaalin keuhkokudoksen, laskettu suhteellinen runsaus arvo on 1. Arvo 1 osoittaa, että kasvain ilmentää korkeamman tason of CDC25A

Q110del kuin pariksi normaalin keuhkokudoksen. Vastaavasti arvo 1 osoittaa, että normaalin keuhkokudoksen ilmaisee korkeampaa CDC25A

Q110del kuin pariksi kasvain.

sekvenssianalyysi ja restriktioentsyymidigestiolla

DNA kloonit sekvensoitiin Marylandin yliopistossa Baltimore sekvensointi laitokseen tai Genewiz Inc. (South Plainfield, NJ). Tasaus suoritettiin vastaan ​​CDC25A viite NM_001789. CDNA-kloonit käytetään funktionaalisia määrityksiä monistettiin NSCLC solulinjoista (taulukko S1). Entsymaattisen ruuansulatuksen analyysi, joka on 292 bp: n fragmentti CDC25A cDNA monistettiin käyttäen alukkeita: välittämään 5′-CACTGGAGGTGAAGAACAACAG-3 ’ja reverse 5′-CAGCCACGAGATACAGGTCTTA-3’, pilkottiin restriktioendonukleaasilla Bpu10I (New England Biolabs, Ipswich, MA) erotetaan sitten agaroosigeelillä.

UV

UV-käsittelyyn viljellyistä soluista, väliaine poistettiin, solut pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja sitten säteilytetty paljastettuun kudosviljelymaljoilla, joissa 254 nm UV-valossa (UVC) in Stratalinkeriä UV Crosslinker (Stratagene, La Jolla, CA). Tuoreella viljelyalustalla lisättiin takaisin, ja soluja inkuboitiin edelleen kuvatun ajankohtina.

Solusyklianalyysiä

Solut kerättiin, kiinnitettiin 70% etanolilla, suspensoitiin PI /RNaasi värjäyspuskurissa (BD Pharmingen ™, San Jose, CA), joka sisälsi 0,1% natriumsitraattia ja 0,1% Triton X-100. Tietojen analysointi tehtiin University of Maryland Baltimore Medical Center, virtaussytometrialla Core ja analysoitiin FlowJo ohjelmisto.

Imaging analyysi

ilmentävät solut CDC25A

paino- tai CDC25A

Q110del- fuusioituneet mCherry tai EGFP fiksoitiin 2% paraformaldehydillä, tehdään läpäiseviksi 0,5% Triton X-100, värjättiin DAPI. Kuvat otettiin käyttäen Zeiss LSM 510 Meta laserskannaus konfokaalimikroskoopilla DAPI, FITC ja rodamiini fiters. Histogrammi edustaja FITC ja rodamiini ilmentyminen on tuotettu

kuva J

ohjelmisto.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elävyys mitattiin käyttäen Cell Proliferation Reagent WST-1 ( Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN).

Potilaille ja kudosten

Ensisijainen NSCLC kasvaimet ja niiden vastaavat ei-pahanlaatuisten viereisen keuhkojen kudoksissa 88 yksilöiden pathologic vaiheen I IIIa NSCLC arvioitiin. Kaikki potilaat hoidettiin pelkästään leikkauksen paitsi vaiheen III tauti, joka voi myös saaneet leikkauksen jälkeisen sädehoidon ja adjuvanttihoitoa, University of Texas MD Anderson Cancer Center (MDACC) vuodesta 1995 vuoteen 2000. Näytteet jäädytettiin välittömästi ja varastoitiin -80 ° C: ssa. Valinta näistä potilaista perustui saatavuuteen arkistoitu tuoretta kasvain ja vastaava normaali keuhkojen kudosten tutkijoille. Kliiniset tiedot ja seurantatietoa tutkimukseen perustuivat kaavio lue ja muoto raportteja MDACC kasvain rekisteristä palvelua. Tietoon perustuva suostumus käyttöön jäljellä resektoitiin kudosten tutkimukseen saatiin kaikista osallistuneista potilaista tutkimuksessa.

Ethics selvitys

Kirjallinen suostumus käyttää jäljellä resektoitiin kudosta tutkimukseen saatiin kaikista potilasta, jotka osallistuivat tutkimukseen. Lupamenettelyssä ja niiden käyttöä materiaalin ja kliinisten tietojen tarkasteli ja hyväksynyt University of Texas MDACC valvonnan komitea.

Tilastollinen

Opiskelijan

t

-testi käytettiin tilastollisia analyysi funktionaalisissa määrityksissä. Survival analyysi Kaplan Meier-kuvaajat valmistettiin log rank analyysi hyödyntäen Proc Lifetest SAS 9.2. Kaikki testit ovat kaksipuolisia ja P-arvot 0,05 pidetään tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

tunnistaminen CDC25A

Q110del NSCLC

Tutkitaan mahdollisia korjauksilla CDC25A mRNA tasolla, sekvensoimme CDC25A cDNA-klooneja, jotka ovat peräisin paneelin 10 NSCLC solulinjat. Niistä yhteensä 16 cDNA-kloonia 10 solulinjat, havaitsimme tietyn trinukleotidi deleetio 7 16 kloonit 5 10 solulinjojen (Fig. 1A) (taulukko S1). Poistaminen etsii asemissa 328-330 viitaten NM_001789.2, CDC25A transkriptio 1, joka ennustaa glutamiinin poisto kodonissa 110 (Fig. 1 B). Tämä aminohappotähde sijaitsee sääntelyn alalla CDC25A, ja on konservoitunut useiden selkärankaiset (Fig. 1 C ja D). Kutsumme romaanin CDC25A isoformin kodonilla 110 poistetaan niin CDC25A

Q110del. Tämä poisto on todennäköisesti seurausta vaihtoehtoisista Silmukointi, koska muuttaminen ei genomisen DNA-sekvenssin havaittiin NSCLC solulinjoissa (tuloksia ei ole esitetty) (Fig. 1 E) läsnäolon varmistamiseksi ja CDC25A

Q110del NSCLC solulinjoissa ja ensisijainen NSCLC tuumorikudoksissa, tutkimme cDNA 4 NSCLC solulinjojen ja 5 ensisijainen NSCLC tuumorikudoksissa käyttäen restriktioendonukleaasipilkkomisella jonka Bpu10I, joka voi hajottaa sekvenssi 5′-CCTNAGC, ainutlaatuinen sivuston CDC25A

Q110del sekvenssin tuottamiseksi lyhyempi katkaistujen DNA-vyöhyke. Kaikki näytteet osoittivat lyhyempi pilkotun DNA-vyöhyke eri tiheydet (Fig. S1).

. Nukleiinihapposekvenssiä kolmena poistetaan CDC25A-CAG (328-30) NSCLC solulinjoissa. B. CDC25A-CAG (328-30) käännettynä Q110 poisto (CDC25A

Q110del). C. Amino acid Q110 on CDC25A on kehittyvä säilytetyn muissa organismeissa. D. Q110 piilee sääntelyn ja lähimpänä CDK1 mitoottisiin vakauttamiseen fosforylaatiokohdan (S116) ja Chk1 degradaation fosforylaatiokohdan (S124). Punainen: CAG (328-30) nukleiinihapon poisto ja vastaava aminohapposekvenssi Q110, sävy: seriinifosforyloinnin sivustoja (S116 ja S124). E. Kaaviokuva ehdotti vaihtoehtoisen silmukoinnin päällä. Vaihtoehtoinen luovuttaja sivusto: 5 ’liitoskohtaan (luovuttajan sivusto), muuttamalla 3’ rajan alkupään eksonin, tuottaisi CDC25A

paino transkriptio, samalla kun toinen akseptorikohtaa: 3 ’liitoskohtaan (-akseptorikohdan), muuttamalla 5 ’rajan loppupään eksonin, tuottaisi CDC25A

Q110del transkriptin.

seuraavan kehitetty reaaliaikainen PCR (Fig. 2A) arvioimaan määrän CDC25A

Q110del joukossa koko CDC25A transkriptien NSCLC solulinjoissa ja kudosnäytteitä, osoittaa, että määritys voidaan kvantitatiivisesti mitata suhteellinen runsaus CDC25A isomuotojen rakensimme Ct käyrä käyttämällä puhdistettua plasmidi-DNA: ta, joka sisälsi joko CDC25A

paino- tai CDC25A

Q110del cDNA-insertti. Tulos osoitti lähes lineaarinen suhde eri villityypin ja Q110del suhde (Fig. 2B) .Tämä menetelmää käytettiin sitten aasin CDC25A

Q110del ilmentyminen solulinjoissa ja kudoksissa. 4 HBEC solulinjoissa, CDC25A

Q110del ilmentyminen oli havaittavissa, mutta on yleensä vähemmän kuin 20% koko CDC25A transkriptit (Fig. 2C). On syytä huomata, että nämä solulinjat olivat peräisin kuolemattomaksi ihmisen keuhkoputken epiteelisolut potilailla, joilla on keuhkosyöpä. Vertailun, 9 (75%) 12 NSCLC solulinjat ilmensivät CDC25A

Q110del suurempi kuin 20% koko CDC25A transkriptit, mukaan lukien 3 (20%), ja solulinjat ilmensivät CDC25A

Q110del lähes 50%: n tasolla (Fig. 2C). Ero CDC25A

Q110del ilmentymisen tasojen HBEC solulinjojen ja NSCLC solulinjoissa oli tilastollisesti merkitsevä (

P

= 0,003). Mielenkiintoista, H596 ja H549-solulinjoja, jotka osoittavat CDC25A

Q110del at 50% koko CDC25A, on suuri modaalinen kromosomi numeron suuri prosenttiosuus, NCI-H596 modaalinen lukumäärä = 71; alue = 65 75.This on lähellä triploideja ihmisen solulinjassa. Vaikka A549 on hypotriploid ihmisen solulinja modaalisen kromosomimäärän 66, esiintyy 24%: ssa soluista (mukaan ”American Type Culture Collection”). Tämä viittaa CDC25A

Q110del osansa genomi- epävakautta ja kumulatiivinen pahanlaatuisten muutosten [26]. Välinen korrelaatio CDC25A

Q110deland kertymistä hyperploid solujen on kuvattu alla solusyklin jakautuminen.

. Reaaliaikainen PCR-määrityksen arvioida määrää CDC25A

Q110del suhteessa koko CDC25A transkriptien NSCLC solulinjoissa ja kudosten näytteiden ”Total” reaaliaikainen-PCR ratkaisee yhteensä CDC25A templaattina reaktiossa (Ct

tot ) kun taas ”wt” real time-PCR määritys määrittää kohdegeenin, joka on CDC25A

paino mallin (Ct

p), sitten laskea CDC25A

Q110del = ACt = (Ct

p- ct

tot). B. Vakiokuvaajan havainnollistaa Ct-arvoja, jotka vastaavat eri suhteissa CDC25A

paino: CDC25A

Q110del, pEF6-V5-His-CDC25A

paino- ja pEF6-V5-His-CDC25A

Q110del sisällytettiin yhteen useilla suhdelukuja mallina kussakin Uniplex reaaliajassa PCR-reaktion, suoritetaan kolmena kappaleena, niin CDC25A

Q110del laskettu (CDC25A

Q110del = ACt = Ct

p-Ct

tot). C. 50% NSCLC osoittavat CDC25A

Q110del vastaavat arvot 30-50% koko CDC25A malleja viitaten standardikäyrän (B), kun taas HBEC solulinjat ilmentävät -20% kaikista CDC25A malleja (

P

= 0,003).

CDC25A

Q110del proteiinia vakautta ja Solujen eloonjääminen

CDC25A on labiili proteiini, säädeltyä useiden fosforylaatiotapahtumien sen säätelydomaini [8]. Tutkia vaikutuksen Q110 poiston kohtalosta CDC25A proteiinin sääntelyn, testasimme hajoamisnopeutta CDC25A

Q110del käyttäen syklohek- (CHX) käsittely. Vuonna H1299-soluja käsiteltiin CHX, me havaitsimme, että CDC25A

Q110del on pidempi puoliintumisaika verrattuna CDC25A

paino (Fig. 3A). Lisäksi, kun CDC25A

paino- ja CDC25A

Q110del kotransfektoitiin, lisää CDC25A

Q110del kertyi yli CDC25A

paino- 72 h transfektion jälkeen (kuvio. S2) sekä H1299 ja 293F-soluissa.

. Ajan myötä syklohek- (50 ug /ml) hoitoon H1299 transfektoitujen solujen pEGFPN1-CDC25A

paino- tai pEGFPN1-CDC25A

Qdel mukaisesti häiriöttömät olosuhteet oli kohonnut puoliintumisaika CDC25A

Q110 (-15 minuuttia) vastaan CDC25A

paino. B. UV-säteily, jota seuraa 30 minuutin inkubaatio 293F solujen 37 ° C: ssa, CDC25A

Q110del osoitti enemmän vakautta kuin CDC25A

paino-. C. 293F solut maljataan yhtä suuri solutiheys ja transfektoitu samalla määrällä EGFP leimatun CDC25A

Q110del tai CDC25A

paino. 72 tunnin kuluttua transfektion virtaussytometrialla analyysi ruiskutus yhtä monta EGFP ilmentävien solujen kunkin isoformin. Histogrammissa intensiteetti ilmentymisen CDC25A

Q110del-EGFP (keskiarvo 59,2) versus CDC25A

wt-EGFP (keskiarvo 40,5) (t-testi

P

= 0,05). D. Sama solupopulaatio aidatulla EGFP-CDC25A ilmentyminen tutkittiin solusyklin jakeluun. CDC25A

paino-EGFP osoitti pidättämään jälkeisessä G2-vaiheessa ( G2 /M) kontrolliin verrattuna (p = 0,055). EGFP-CDC25A

Q110del ilmentävät solut osoittivat vähemmän kertymistä hyperploid solupopulaation klo G2 /M vaiheessa ja nopeuttanut solujen enemmän läpi mitoosin verrattuna EGFP-CDC25A

paino ilmentävien solujen (p = 0,0047). E. Solujen elinkelpoisuus määritys H1299 ilmentävien CDC25A

paino vs. CDC25A

Q110del 24 tunnin kuluttua useita annoksia UV-säteilyä. CDC25A

Q110del ilmaisu pelastettiin H1299 herkkyys UV-säteilylle verrattuna kontrolliryhmään.

293F-soluja transfektoitiin joko CDC25A

paino- tai CDC25A

Q110del ja käsiteltiin 10 ja 20 j /m

2 UV-säteilyä, jotka on transfektoitu CDC25A

Q110del osoittautui paremmaksi proteiinin stabiiliuden 30 min sen jälkeen, kun UV-säteilyn, mutta ei soluissa, jotka on transfektoitu CDC25A

paino (Fig. 3B).

Jotta saat oman määrällinen mittaaminen CDC25A

Q110del ja CDC25A

paino tasoilla, mittasimme fluoresoiva intensiteetti CDC25A-EGFP fuusioproteiineja gating yhtä monta 293F soluja, jotka ilmentävät CDC25A

wt-EGFP tai CDC25A

Q110del-EGFP ja havaittiin huomattavasti suurempi loisteputki intensiteetin CDC25A

Q110del-EGFP transfektoiduissa soluissa (kuvio. 3C). Solusyklin analyysi sama aidatulla solujen populaatio, osoittivat lisääntynyttä post G2 populaatio (hyperploid solut) on CDC25A

paino-EGFP ilmentävien solujen verrattuna CDC25A

Q110del-EGFP, kun taas CDC25A

Q110del -EGFP kiihtyi solut enemmän postitse G2 vaihe (mitoosi) verrattuna CDC25A

paino (p = 0,0047) (Fig. 3d). Tämä viittaa siihen, että CDC25A

Q110del voi kumota G2 /M Check Point verrattuna CDC25A

paino, ajo solut enemmän läpi mitoosi [26], [27].

Tutkia jos CDC25A

Q110del voi vaikuttaa eloonjäämistä NSCLC soluja levoton olosuhteissa, H1299, jotka on transfektoitu CDC25A

Q110del hoidettiin UV-säteilyn eri annoksilla, H1299 ilmentävät CDC25A

Q110del olivat vastustuskykyisempiä UV solukuolema verrattuna soluihin, jotka oli transfektoitu kontrollivektorilla tai CDC25A

paino-, erityisesti suurten UV-annoksilla (Fig. 3E).

Cellular localization ja mitoottista aktiivisuutta CDC25A

Q110del

H1299-solut, CDC25A

Q110del osoittivat huomattavaa kasvua tumaanohjaussignaali kuin CDC25A

paino (Fig. 4A). 24 tunnin kuluttua UV-säteilyllä, solut, jotka on transfektoitu CDC25A

Q110del osoitti korkeampia proteiinin stabiiliuden joskin fosforylaatio lisääntyy ylävirran DNA-vaurion vaste (DDR) markkeri pChk1-ser345 (Fig. 4B). Koska uudet todisteet viittaavat CDC25A kuin CDC25 perheenjäsenen vaaditaan täyden aktivoinnin ydin- CDK1 [11], [28], [29], ja koska Q110del on lähimpänä S116 – CDK1 fosforylaatiokohdan kriittinen vakauttamiseksi CDC25A takaisinkytkentäpiirissä aikana mitoosin – [11], paitsi havaintomme, jotka osoittivat CDC25A

Q110del ajaa solujen kautta enemmän mitoosin verrattuna CDC25A

paino (Fig. 3d), me perused tutkia vaikutusta CDC25A

Q110del on mitoosi toimintaa ja CDK1 aktivointia. Jälkeen transfektoidaan 293F-soluja CDC25A

Q110del-EGFP, havaitsimme kasvu solujen osuus mitoosi vaiheessa, ilmiö, joka ei havaittu soluissa, jotka on transfektoitu CDC25A

wt-EGFP (Fig. 4C). Verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu CDC25A

paino–EGFP, solut, jotka on transfektoitu CDC25A

Q110del-EGFP osoitti alhaisempi fosforylaation CDK1- Tyr15, 24 tuntia transfektion jälkeen (Fig. 4D), joka on yhdenmukainen läsnäolo aktiivisempi CDK1 edistää G2 /M faasimuutoksen (Fig. 3d). Lasku koko CDK1 että CDC25A

paino- ja CDC25A

Q110del transfektoituja soluja-verrattuna ohjaus- odotetaan, koska pidätys on solusyklin G2 /M vaiheessa (Fig. 3d), voi aiheuttaa tukahduttaminen CDK1 ilme transkription tasolla kerrallaan ja solutyyppi riippuvasti [30].

. Immunoblottia H1299 soluista osoitti CDC25A

Q110del paikallistaa enemmän tumassa verrattuna CDC25A

paino. B. 24 tunnin kuluttua UV-säteilyn, CDC25A

Q110del osoitti lisää vakautta H1299 ja vastasi enemmän fosforylaatiota DDR merkki Chk1-ser345. C. Konfokaalimikroskopia of 293F solujen 24 h transfektion: CDC25A

Q110del ilme näytti usein mitoottisia (metafaasissa ”ohut nuolet”). Koekspressoimalla CDC25A

paino- ja CDC25A

Q110del at (01:01) suhde, mitoosi aktiivisuus oli vielä huomannut (sytokineesi, ”rohkea nuolia”). Histogrammi on tyypillinen pikseliluku varten FITC kohti kunto ja rodamiini. D. pCDK1-Tyr15 defosforyloinnilla alavirran lukija suhteellinen lisääntynyt fosfataasiaktiivisuutta CDC25A

Q110del verrattuna CDC25A

paino 24 h transfektion 293F-soluissa.

CDC25A

Q110delexpression NSCLC ja sen yhteyksiä kliinisiin parametreihin

Voit selvittää, onko mahdollinen vaikutus CDC25A

Q110del ilmentyminen kasvaimissa potilaille NSCLC, me määrällisesti CDC25A

Q110del ilmentymistä primäärikasvaimissa ja niiden viereisten pariksi keuhkokudokset 88 NSCLC potilaiden. CDC25A

Q110del ilmaisu vaihteli havaita lähes 100% koko CDC25A transkriptien kasvaimia, 50%: n ilmentävien kasvainten CDC25A

Q110del yli 20% joukossa koko CDC25A selostukset. Kiinnostavaa kyllä, monet viereisen normaalin keuhkojen kudoksiin samasta keuhkosyöpäpotilaita ilmaisi myös CDC25A

Q110del, viittaa siihen, että tämä on varhainen tapahtuma keuhkojen karsinogeneesissä.

analysoitiin sitten välisen liitännän ekspressiotasot CDC25A

Q110del kasvainkudoksessa ja kliinisen patologisen parametrit. Paitsi marginaalinen yhdessä adenokarsinooma histologia (

P

= 0,068), ei muuta yhdistys ei havaittu (Taulukko S2 ja S3). Erityisesti ei ollut yhdessä vaiheessa, sukupuolen tai tupakoinnin historiaa. Kuitenkin potilaat, joiden kasvaimet olivat korkeammat CDC25A

Q110del ekspressiotasot osoitti ei-merkitsevä suuntaus köyhempi kokonaiselinaikaa (

P

= 0,074 Log-rank test) (Fig. 5A, taulukko S2). Mielenkiintoista, kun otetaan huomioon CDC25A

Q110del ilmentymistä viereisessä normaalissa keuhkokudokset, me havaittu, että potilaat, joiden kasvaimet ilmaisivat huomattavasti suurempi CDC25A

Q110del kuin pariksi viereisen normaalin keuhkojen kudoksiin oli huomattavasti huonompi kokonaiselinaikaa (

P

= 0,0018 Log-rank test) (kuvio. 5B, taulukko S4 ja S5).

. Kaplan Meier selviytymisen käyrät osoittivat CDC25A

Q110del kasvainkudoksessa korreloivan huonon eloonjäämisaste NSCLC potilaiden (log rank

P

= 0,074). B. Kaplan Meier Eloonjäämiskäyrät osoitti, että kun CDC25A

paino on suurempi kasvainkudoksessa verrattuna normaaliin kudokseen paria, se korreloi paremmin kokonaiselinaikaa (log rank

P

= 0,0018). Suhteellinen kvantitointi kohdegeenin ”CDC25A

paino-” NSCLC kasvainkudoksessa verrattuna normaaliin kudokseen pari pienisoluista keuhkosyöpää kaavan mukaisesti: 2

-ΔΔct. CDC25A mallia kasvaimen tai normaali ajettiin kolmena rinnakkaisena ja Uniplex reaktion kullekin Ct

p ja Ct

tot määrityksiä, ja keskimääräinen laskettiin jokaisessa määrityksessä.

Keskustelu

CDC25A taso on tarkoin säädeltyä, jotta solusyklin etenemisen ja Checkpoint siirtyminen ylläpidetään fysiologisissa olosuhteissa [20], [26], [31] – [35]. Aiemmin kerroimme, että CDC25A on usein yli ilmaistu NSCLC klo transkriptio tasolla [7]. Tässä tutkimuksessa me raportoimme tunnistaminen romaani CDC25A isoformin, CDC25A

Q110del, tuloksena vaihtoehtoisesta Silmukointi. Olemme havainneet, että CDC25A

Q110del on ilmaistu suurin osa ei-pienisoluisen keuhkosyövän solulinjat sekä ensisijainen kasvaimia. Lisäksi todetaan, että histologisesti normaaleissa kudoksissa vieressä syövän toistuviin CDC25A

Q110del merkitsee sitä, että tämä on varhainen tapahtuma, ja se voi olla tärkeä biologinen toiminta keuhkojen kasvaimien syntyyn.

CDC25A

Q110del puuttuu glutamiini asemassa 110, joka on lähellä 2 säilyneitä seriinifosforyloinnin sivustoja asemissa 116 ja 124 (kuvio. 1). S116 voidaan fosforyloituu CDK1 vakauttamiseksi CDC25A mitoosissa kautta positiivista palautetta silmukka, kun taas S124 voidaan fosforyloida Chk1, Chk2, ja MAPKAPK-2 nopeuttamiseksi CDC25A liikevaihtoon [11], [14], [27], [36] . Ionisoiva säteilytys voivat aiheuttaa fosforylaatio S124 kautta Chk1 ja Chk2 kinaasien [37], [38]. Kun siirtogeeninen eläin malli S124 korvattu alaniinilla, CDC25A havaittiin sijaitsee sentrosomien ja että CDC25A tasot eivät vähentää, kun ionisoivan säteilytyksen [39]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että CDC25A

Q110del on pitkittynyt proteiini puoliintumisaika kuin CDC25A

paino, varsinkin kun UV-säteilyn, mikä viittaa siihen, että CDC25A

Q110del ilmentyminen voi vaikuttaa solujen vastauksena aiheuttaman vaurion ionisoivan säteilytys . Yhdenmukainen tämän käsitteen, olemme havainneet, että solut, jotka on transfektoitu CDC25A

Q110del ovat vastustuskykyisiä UV-indusoitu solukuolema kuin transfektoidut solut ohjaus-vektorilla tai CDC25A

paino (Fig. 3E), sopusoinnussa syvempi aktivointi CDK1 (Fig. 4D).

CDC25A fosfataasi säädellään pääasiassa proteiinien hajoaminen [8], [21], [31]. Fosforylaation erityisiä seriini- tai treoniinitähde by proteiinikinaasien, lähinnä Chk1, p38 ja GSK-3β, ovat tarpeen sen ubikitiinistä välitteisen proteolyysiä [22], [37], [40], kun taas fosforylaatio S18 ja S116 mukaan CDK1 voi vakauttaa CDC25A [11]. Fosforylaatio säätelee myös takavarikoimista CDC25A by 14-3-3-proteiinia [41]. Tutkimuksessamme havaitsimme, että CDC25A

Q110del proteiini on pienempi vaihtuvuus, jopa sen jälkeen UV-säteilyn (Fig. 3B ja 4B), ja lisää tumakertymään. Kaksi mahdollisuutta saattaa selittää nämä havainnot. Ensinnäkin, Q110 poisto polypeptidissä voi tuottaa merkittäviä konformaatiomuutoksia välittömässä läheisyydessä ja /tai lähialueiden, muuttamalla sitoutumisaffiniteetti sen kinaasien, jolla saavutetaan pienempi kiertonopeus CDC25A

Q110del. Toiseksi CDC25A

Q110del proteiini voi olla eri kyky välinen edestakainen soluliman ja ydinvoiman osastojen kautta 14-3-3 proteiinit [42]. Aminohapposekvenssi välittömästi edeltävän Q110, RRIHSLP muodostavat konsensus 14-3-3: lla sitoutumiskohta, (R) RxxSxP [43]. Koska sitoutuminen 14-3-3 kohteeseensa on fosforylaatiota riippuvainen ja vaikuttaa sekvenssikontekstissa, tämä herättää mielenkiintoisen mahdollisuuden, että tuntematon proteiinikinaasi voi fosfo- tämän sivuston ja vaikuttaa kaupan CDC25A. Nämä havainnot on potentiaalista merkitystä yhteydessä vastustuskyky DNA-vaurioita solujen ektooppisesti ilmentävät CDC25A

Q110del (Fig. 3E). Lisätutkimuksen tarvitaan sen määrittämiseksi, onko kasvaimia, joilla on korkeampi CDC25A

Q110del kestävät paremmin DNA: ta vaurioittavat aineet tai sädehoitoa ja jos kohdistaminen CDC25A

Q110del herkistää nämä kasvaimet näihin hoitoihin [44].