Krooninen sairaus

tiivistelmä

edistysaskelista huolimatta varhaisen diagnoosin ja multimodaalisuuden terapiaa syövät, useimmat keuhkosyöpäpotilaiden on paikallisesti edennyt tai metastasoitunut aikaan diagnoosi, mikä viittaa erittäin progressiivinen ominaisuus keuhkosyövän soluja. Mekanismeja kätyri invasiivisuus ja etäpesäkkeiden keuhkosyöpään ovat vielä selvittämättä. Esillä olevassa tutkimuksessa, immunohistokemia suoritettiin ekspression havaitsemiseksi CXCL16-CXCR6 ihmisen keuhkosyövän kudoksiin. On osoitettu, että samanlainen CXCL12 ja CXCR4, CXCL16 ja CXCR6 myös ekspressoidaan ihmisen primaarisissa keuhkosyöpä kudoksiin. Kun olet vahvistanut toiminnallinen olemassaolo CXCL16 ja CXCR6 proteiinia A549, 95D ja H292-soluissa ELSA ja virtaussytometria analyysi, me tutkia edelleen merkitystä CXCL16-CXCR6 akselia biologisia toimintoja keuhkosyövän solulinjoja

in vitro

. Havaittiin, että CXCL16 ollut vaikutuksia PCNA (proliferoivan solun tuma-antigeeni) ilmentymä A549, 95D ja H292-soluissa. Kuitenkin sekä eksogeenisen CXCL16 ja CM (väliaine A549, 95D tai H292) paransi merkittävästi

in vitro

elinkelpoisuutta ja hyökkäys kolme keuhkosyövän solulinjat. Neutraloiva vasta-aine CXCL16 tai alas-säätely CXCR6 kykeni estämään lisääntynyt elinkelpoisuutta ja invasiivisuus A549, 95D ja H292-soluissa stimuloida CXCL16 tai CM. Tuloksemme tarkoita, että CXCL16-CXCR6 akseli on mukana säätelyyn elinkelpoisuuden ja hyökkäyksen sijaan PCNA ilmentymä keuhkojen syöpäsoluissa, joka avaa oven paremmin ymmärtämään mekanismeja keuhkojen kasvainprogression ja etäpesäkkeitä.

Citation: hu W, Liu Y, Zhou W, Si L, Ren L (2014) CXCL16 ja CXCR6 Ovat yhdessä ilmenivät Human Lung Cancer

in vivo

ja välittävät Invasion of Lung Cancer Cell Lines

in vitro

. PLoS ONE 9 (6): e99056. doi: 10,1371 /journal.pone.0099056

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 syyskuu 2013; Hyväksytty: 11. toukokuuta 2014; Julkaistu 4. kesäkuuta 2014

Copyright: © 2014 Hu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat National Natural Science Foundation of China 81270753 (W.-HZ), Wuhan tieteen ja teknologian projekti 2013060602010249 (W.-DH), Natural Science Foundation of Science and Technology Department of Hubei 2010CDB05502 (W.-DH ) ja henkilöstön koulutus suunnitelma Health Care System of Beijing 2013-3-021 (W.-HZ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on yleinen pahanlaatuinen kasvain jotka hyväksytään johtava syy pahanlaatuisuuteen liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti, ja esiintyvyys keuhkosyövän on ollut kasvussa viime vuosina joissakin suurissa kaupungeissa Kiinassa [1]. Edistysaskelista huolimatta varhaisen diagnoosin ja multimodaalisuuden terapiaa syöpien, viiden vuoden eloonjäämisaste hinnan pisimmällä keuhkosyöpäpotilaita on edelleen alle 20%. Mekanismeja kätyri invasiivisuus ja etäpesäkkeiden keuhkosyöpään ovat herättäneet paljon huomaavainen rinta onkologit vuosikymmeniä vuosia. Jotkut hypoteeseja ja molekyylit on esitetty, mutta perusteellinen käsitys monimutkaisia ​​invasiivisen ja metastaattisen prosessit karsinoomasoluja on vielä avoin kysymys.

Koska löytö ensimmäisen kemokiinin vuonna 1987, yli 50 erilaista kemokiinit ja 20 erilaista kemokiinireseptoreita on kloonattu ja tunnistettu. Aktivointi kemokiinin /reseptorin signaalireitin on vahvistettu välittävän joukon fysiologisia ja patologisia tapahtumia, erityisesti rekrytointi lymfosyyttien sekä kasvaimen kasvua ja metastaaseja, mikä antaa mahdollisuuden selvittäminen metastaattisen prosessin pahanlaatuisten solujen immunologian näkökulmia [2], [3], [4], [5], [6].

joukossa eri kemokiinien ja kemokiinireseptorien, CXCL16-CXCR6 on ainutlaatuinen kemokiini /kemokiinireseptorin pari. CXCL16, joka tunnetaan myös nimellä SR-PSOX, kuuluu CXC-kemokiini perheen ja olemassa sekä transmembraani- ja liukoisessa muodossa [7], [8], [9]. Vuorovaikutus CXCL16 ja sen ”ainoa reseptori, CXCR6 (kutsutaan myös Bonzo, STRL33 ja TYMSTR) on mukana useita biologisia vaikutuksia, mukaan lukien selektiiviset kaupan lymfosyyttien alaryhmiä, soluadheesion, solujen eloonjäämistä, lihasten palautumista, aivojen kehitys, krooninen tulehdus ja anti- kasvainimmuniteetin [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Erityisesti viimeaikaiset tutkimukset ovat varmistanut yli-ilmentyminen CXCL16 ja /tai CXCR6 useaan eri ihmisen syövissä ja CXCL16 voisivat edistää kasvua, muuttoliike, invaasion ja aktivointi AKT signalointireitin syöpäsolujen kautta ”reseptorin CXCR6

in vitro

[15], [16], [17], [18]. Aikaisemmat tutkimus vahvisti myös liiallinen ilmentyminen CXCR6 proteiinin ihmisen natiivin eturauhassyövän solut ja aktivointi CXCL16-CXCR6 reitin voisi edistää siirtymistä ja hyökkäys PC3 ja LNCaP

in vitro

[19]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että CXCL16-CXCR6 voi olla uusi kemokiini ligandi /reseptori-pareihin tuumorigeneesiin ja etäpesäkkeiden. Jotkin ryhmät ovat alkaneet kiinnittää huomiota roolia CXCL16-CXCR6 kasvaimen, mutta suhde CXCL16-CXCR6 ja keuhkosyöpä on edelleen vaikeasti ja ansaitsee lisätutkimuksiin.

Esillä olevassa tutkimuksessa, ilmaus CXCL16 ja CXCR6 ihmisen keuhkosyövän kudoksia ja keuhkosyövän solulinjat, A549, H292 ja 95D, määritettiin immunohistokemiallisesti ja immunosolukemiallinen vastaavasti. Sitten entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) ja virtaussytometria suoritettiin tutkimaan funktionaalisen ekspression CXCL16 ja CXCR6 kolme syöpäsolulinjoissa. Edelleen selvittämiseksi roolin CXCL16-CXCR6 akselilla keuhkosyövän, myös havaittu toiminnan CXCL16 on PCNA (proliferoivan solun tuma-antigeeni) ilmaisun ja invasiivisia kykyä A549, H292 ja 95D-soluissa. Vaikutukset CXCR6 geenin alassäätöä by Sirna (siRNA) teknologian elinkelpoisuus ja invasiivisuus A549-soluja määritettiin myös MTT ja invaasiomääritys. Kautta tutkimalla muutos biologisen käyttäytymisen keuhkosyöpään solujen välittämiä CXCL16-CXCR6 akseli, toivomme tarjota oivalluksia paremmin ymmärtää etenemistä tämä aggressiivinen pahanlaatuinen kasvain.

Materiaalit ja menetelmät

Human Tissue Collection

Kaikki toimenpiteet, joihin tutkimukseen osallistuneet oli hyväksynyt Zhongnan sairaala Wuhan University Human Research Ethics komitea, ja osallistujat olivat antaneet kirjallisen tietoon perustuva suostumus.

Ihmisen keuhkosyöpä (33 tapausta) ja normaalin (5 tapausta) kudokset saatiin potilailta, joille tehtiin keuhkojen lohko resektio tai pneumonectomy syövän tai syöpäsolujen keuhkosairaudet at Zhongnan sairaala Wuhan University vuodesta 2003 vuoteen 2006. tunnistaminen kasvaintyypeille suoritettiin kaksi ammatillista patologit . 33 keuhkosyövässä, 13 tapausta olivat adenokarsinoomat (AC), 12 tapausta olivat levy- karsinoomista (SC), 7 tapaukset olivat adenosquamous karsinoomat (ASC) ja 1 tapaus oli bronkoalveolaarinen karsinooma (BC). Vaiheet kasvainten arvioitiin mukaan seitsemänteen Edition uuden TNM lavastus järjestelmä ehdottama kansainvälinen järjestö, jolla tutkitaan keuhkosyövän (IASLC) vuonna 2009. 33 näytettä, 3, 1, 9, 8, 10 ja 2 tapaukset olivat IA, IB, II A, II B, III A ja B, vastaavasti.

Cell Culture

Keuhkosyöpä solulinjat A549, H292 ja 95D-solut saatiin Cell Bank of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kiina). Soluja viljeltiin in 1640, joka sisälsi 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää (Gibco, Grand Island, NY, USA), 10 mM HEPES, 1 mM palorypälehapon natriumia, 4,5 g /l glukoosia, 100 UI /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Solut otettiin talteen ja siirrostettiin kolme kertaa, sitten sen annettiin kasvaa yhtenäisiksi seuraavat kokeet.

immunohistokemia

Menetelmä immunohistokemia perustuvat aikaisempaan menettelyyn [19]. Lyhyesti, kudokset rutiininomaisesti kiinnitettiin formaliinilla ja upotettiin parafiiniin. Antigeeni haku suoritettiin ja 0,3% H

2O

2 fosfaattipuskuriliuosta (PBS) käytettiin estämään endogeenisen peroksidaasin kohdissa. Sen jälkeen käsiteltiin proteiini estää seerumin estää ei-spesifinen sitoutuminen, leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa hiiren anti-humaani CXCR4 (25 ug /ml), hiiren anti-humaani CXCR6 (25 ug /ml), hiiren anti- ihmisen CXCL12 (20 ug /ml), ja vuohen anti-ihmisen CXCL16 (20 ug /ml) vasta-aineita (R 75% (pistemäärä = 4). Yhdistämällä immunovärjäyty- intensiteetti pisteet ja positiivisten solujen prosenttiosuuden, me luokitellaan pisteytys seuraavasti: 2, negatiivinen ilmaus; 2-3, heikko ilme; 4-5, maltillinen ilme ja 6-7 niin vahva ilmaus [19].

Immunosytokemia

Kun 70-80% yhtymäkohdassa soluista, A549, H292 tai 95D-solut hajotettiin 0,25 % trypsiiniä (Bio Basic Incon., BBI, Ontario, Canada), joka sisälsi 0,1% EDTA ja ympättiin tiheydellä 2 x 10

5cells /kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä esi-sijoitettu kansi luistaa. Sen jälkeen, kun niitä viljeltiin 48 tuntia, keuhkosyövän solulinjat kiinnitettiin 4% formaliiniin 20 minuuttia huoneen lämpötilassa, pestiin PBS: ssä ja läpäiseviksi 15 minuutin ajan 0,03% Triton X-100 PBS: ssä, sitten sitä käsiteltiin 0,3% H

2O

2 inaktivoimiseksi endogeenisen peroksidaasin. Seuraava menettely oli kuten edellä on kuvattu menetelmässä immunohistokemian ja ihmisen ensisijainen viljellyistä trofoblastisolut käytettiin myös positiivisena kontrollina [13], [19]. Tulokset analysoitiin Image-ProPlus 6.0 -ohjelmisto ja keskimääräinen ilmaisun tiheys CXCL16 ja CXCR6 kolmessa solulinjoissa kirjattiin. Kokeet toistettiin kolme kertaa.

valmistaminen Cell Viljellyt kunnostettua alustaa

eristetty A549, 95D ja H292 ympättiin viljelmässä pulloissa (6 ml /pullo) tiheydellä 1 x 10

6 /ml, vastaavasti, ja viljeltiin jatkuvasti 48 tuntia. Supernatantit, eli väliaine (CM), kerättiin ja sentrifugoitiin 2000 g, säilytettiin sitten -80 ° C: ssa. Supernatantit viljelyalustasta ilman soluja kerättiin myös kontrollina.

entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) B

pilkotun A549, H292 ja 95D-solut ympättiin 24-kuoppalevyille (500 ui /kuoppa) tiheydellä 5 x 10

5 /ml, vastaavasti. Supernatantit soluviljelmien kerättiin 24, 36, 48, 60, 72, 96 ja 100 tunnin viljelyn. Kukin kerätty supernatantti säilytettiin -80 ° C: ssa ELISA-analyysi. Määrä CXCL16 jokaisessa supernatantissa mitattiin ihmisen CXCL16 ELISA Kit (Shanghai Westang Bio-Tech Co Ltd, Shanghai, Kiina), mukaan valmistajan ohjeiden. CXCL16 iinianalyysikitissä osoitettu herkkyys on 40 pg /ml ja määrityksen sisäinen vaihtelukerroin on alle 12%. Kokeet toistettiin kolme kertaa.

virtaussytometria Detection CXCR6 Expression

kalvo ilmentymistä CXCR6 proteiinin A549, H292 ja 95D-solujen havaittiin virtaussytometrialla mukaan edellisessä menetelmä ja CXCR4 käytettiin myös kontrollina samanaikaisesti [20]. Lyhyesti, suojella kalvo lokalisoinnin kemokiinireseptori jotta mahdollisimman paljon, solut, 70-80% solun yhtymäkohta, hajotettiin 0,25% trypsiiniä vain 30-50 s, sitten puhalletaan pois varovasti ja pestiin PBS: llä [ ,,,0],20]. Kun oli salvattu, jossa 10% FBS, talteen soluja inkuboitiin hiiren anti-ihmis-PE (fykoerytriini) -CXCR6 monoklonaalinen vasta-aine (1:10; R eBioscience), hiiren PE-IgG2B isotyyppiä (R eBioscience) tai hiiren PE-IgG

2a isotyypin (eBioscience) 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä [21]. Seuraavat tutkii Menettely oli kuten edellä on kuvattu menetelmässä virtaussytometrian tunnistuksen CXCR6 ilmentymisen. Kokeet toistettiin kolme kertaa.

CXCR6 Silence A549 solut

eristetty A549-soluja ympättiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 2 x 10

5 /ml. 70-80% konfluenssiin, nämä solut transfektoitiin phU6 /GFP /Neo-plasmidin, joka sisältää lyhyen hiusneula-RNA (shRNA) molekyylejä kohdistettu CXCR6, jossa käyttö Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Sekvenssit kolme shRNA oligonukleotidit olivat: (CXCR6-2819-1): 5′-ctGAG GAC AAT TCC AAG ACT T-3 ’(sense) ja 5′-AAG TCT TGG AAT TGT CCT CAG-3′ (Anti-sense ); (CXCR6-2820-2) 5’-ctCAC CAT GAT TGT CTG CTA T-3 ’(sense) ja 5′-ATA GCA GAC AAT CAT GGT GAG-3′ (Anti-sense); (CXCR6-2821-1) 5’-gcTTG CTC ATC TGG GTG ATA T-3 ’(sense) ja 5′-ATA TCA CCC AGA TGA GCA AGC-3’ (Anti-sense) (GENECHEM, Shanghai, Kiina). Ryhmät jaettiin phU6 /GFP /Neo-CXCR6 (CXCR6-shRNA), ei-suunnattu siRNA oligonukleotidit negatiivinen kontrolli (phU6 /GFP /Neo, shRNA-ohjaus) ja tyhjä-ohjaus (ei mitään hoitoa). Stabiilit transfektantit valittiin G418 kulttuurin pitoisuutena 800 ug /ml. Kokeet toistettiin kolme kertaa ja hiljentäminen tehokkuus määritettiin western blot.

solunelinkykyisyysmääritys

MTT [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi, Sigma Chemicals] määrityksessä käytettiin vaikutusten arvioimiseksi CXCL16-CXCR6 solujen elinkelpoisuuden

in vitro

[21]. Kokeet jaetaan kahteen vaiheeseen: ensinnäkin eristetty A549-soluja tyhjä-ohjaus, shRNA-ohjaus ja CXCR6-shRNA (2819-1) ryhmät ympättiin 96-kuoppaisille tasapohjaisille mikrolevyillä, jonka tiheys on 2 x 10

3 solua /kuoppa ja viljeltiin 24, 48, 72, 96 ja 120 h, vastaavasti. Toiseksi, sen jälkeen, kun nälässä kanssa 1640 ilman FCS 12 h, solut tyhjä-ohjaus, shRNA-ohjaus- tai CXCR6-shRNA (2819-1) ryhmät käsiteltiin ohjaus alustaa (1640) tai CXCL16 pitoisuutena 100 ng /ml 48 h.

MTT-reagenssia (20 ui) lisättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisille mikrolevyille ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. Elatusaine dekantoitiin, ja 100 ui DMSO: ta lisättiin liuottamaan reaktiivinen kiteitä. Imukyky mitattiin aallonpituudella 570 nm automaattisella mikrolevynlukijalla. Näytteet ajettiin kolmena kappaleena ja kokeet toistettiin kolme kertaa [21].

ECM invaasiomääritys

invasiivisia kyky keuhkosyövän solulinjoja arvioitiin objektiivisesti

in vitro

invaasiomääritys perustuvat Aiempi menetelmä [19], [20]. Lyhyesti, soluviljelmä inserttien (8 um huokoskoko, 6,5 mm halkaisijaltaan, Corning, Corning, NY, USA) päällystettiin 10 ui puhdasta soluväliaineen (ECM) geeli (Sigma, St. Louis, MO 63103, Yhdysvallat) laitettiin 24-kuoppalevylle. Kokeet jaettiin seuraaviin kahteen osaan: Ensiksi eristetty A549, H292 tai 95D-solut (1 x 10

5/200 ui seerumitonta 1640) levytettiin ylemmässä kammiossa, ja käsiteltiin CM, CXCL16 ( 100 ng /ml), ja yhdistelmä CM tai CXCL16 kanssa CXCL16 neutralointi vasta-aineella (100 ng /ml). Toiseksi, A549-solut, aihiosta-ohjaus, phU6 /GFP /Neo ja phU6 /GFP /Neo-CXCR6 ryhmä, ympättiin ylempään kammioon tiheyteen (1 x 10

5/200 ui serum- vapaa 1640), käsiteltiin sitten CXCL16 (100 ng /ml) tai CM. Alakammioissa täytettiin 800 ul 1640 -alustaa mukana 10% FBS. Sen jälkeen inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 h, insertit poistettiin ja pestiin PBS: ssä. Sitten noninvading solut yhdessä ECM geeli poistettiin yläpintaan suodattimen pyyhkimällä pumpulipuikolla. Insertit kiinnitettiin 4% formaliiniin 10 minuuttia huoneenlämpötilassa, ja värjättiin hematoksyliinillä. Tuloksena havaittiin valomikroskoopilla (Olympus, Tokio, Japani) ja solut vaelsivat alapintaan laskettiin. Poistaa yksittäisiä vaihtelua, tulokset arvioitiin kaksi riippumatonta tutkijaa ja invasiivisen indeksi laskettiin osuus siirtynyt solujen koeryhmä kuin omaa valvontaa. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin kolme kertaa.

Tilastot

Kokeet

in vitro

oli esitetty keskiarvona ± SE. Data PCNA ilmaisun,

in vitro

elinkelpoisuutta ja invaasiomääritys arvioitiin kanssa post hoc Dunnettin

t

testiä ja Dunnettin T3 testi tarvittaessa. Erot olivat hyväksyttiin merkitsevä

P

0,05.

Tulokset

Protein Expression of CXCL16-CXCR6 Human Lung Cancer

in vivo

Immunohistokemia suoritettiin määrittämään proteiinin ilmentymistä CXCL16 ja CXCR6 ihmisen keuhkojen caner (33 näytettä) ja normaaleissa kudoksissa (5 näytettä). Tulokset on esitetty. 1 osoitti selvästi -parin CXCR6 ja CXCL16-proteiinia ihmisen keuhkosyövän kudoksia. Erityiset ruskean värinen värjäytymistä CXCR6 ja CXCL16 sytoplasmassa ja kalvo voitiin selvästi havaittiin ensisijaisen keuhkosyövän soluja, mutta positiivisen ilmaisun nopeutta ja värjäytymisen voimakkuus CXCR6 oli voimakkaampi kuin CXCL16. Vaikka kohtalainen-vahva, ruskean värinen värjäytymistä CXCL16 ja CXCR6 havaittiin myös normaaleissa keuhkojen kudoksissa, mutta positiivinen ilmentyminen rajoittuu pääasiassa alveolaarinen epiteelisolujen ja tulehdussolujen. Ei ollut todisteita epäspesifisen värjäytymisen kanssa kontrollivasta-aineella.

Immunohistokemia suoritettiin määrittämään proteiinin ilmentymistä CXCL16-CXCR6 ja CXCL12-CXCR4 ihmisen primaarisissa keuhkosyöpä kudoksiin. Vasta-aineita käytetään tässä kokeissa oli hiiren anti-humaani CXCR4 (25 ug /ml), hiiren anti-humaani CXCR6 (25 ug /ml), hiiren anti-humaani CXCL12 (20 ug /ml), ja vuohen anti-ihmisen CXCL16 (20 ug /ml) vasta-aineita. On osoitettu kuvassa. 1, että tiettyä ruskean värinen värjäytymistä CXCL16-CXCR6 ja CXCL12-CXCR4 sytoplasmassa ja kalvon ihmisen eri patologisten keuhkosyöpään soluja. Kohtalainen-vahva, ruskean värinen värjäytymistä CXCL16 ja CXCR6 havaittiin myös normaaleissa keuhkojen kudoksissa, mutta positiivinen ilmentyminen rajoittuu pääasiassa alveolaarinen epiteelisolujen ja tulehdussolujen. Ei ollut todisteita epäspesifisen värjäytymisen kanssa kontrollivasta-aineella. Kuvat olivat edustaja kokeita. AC: adenokarsinoomat; SC: levy- karsinoomia; BC: bronchoalveolar karsinooma; Con: normaali keuhkojen kudoksia; Villi: ihmisen ensimmäisen raskauskolmanneksen villous kudoksiin, positiivisena kontrollina. Suurennos, × 200.

Lisäksi olemme analysoineet yhdistys CXCL16-CXCR6 ekspressiokuviota eri patologinen keuhkosyöpään. On osoitettu kuvassa. 2, että havaitun 33 keuhkosyöpä näytteitä, ja CXCR6 proteiinin ilmentymistä, ainoastaan ​​3 SC tapausta oli heikko positiivinen ja muut olivat kaikki kohtalainen vahva positiivinen, kun taas CXCL16, värjäytymisintensiteettiä oli negatiivinen (10), heikko (8), kohtalainen (8) ja vahva (7). Niistä 10 CXCL16-näytteissä, 7 tapausta kuuluvat AC, 2 tapausta kuuluvat SC ja 1 tapaus oli ASC. Niistä 7 CXCL16-vahva näytteet, 5 tapaukset olivat SC ja 2 tapaukset olivat ASC. Loput 16 heikko tai kohtalainen näytteet olivat AC (6), SC (5) ASC (4) ja BC (1), tässä järjestyksessä (Kuva. 2).

mukaan Immunovärjäyksen voimakkuuden pisteet ja prosenttiosuus positiivisten solujen tulokset immunokemian analyysin luokiteltiin seuraavasti: 2, negatiivinen ilmaus; 2-3, heikko ilme; 4-5, maltillinen ilme, ja 6-7 niin vahva ilmaus. AC: adenokarsinoomat; SC: levy- karsinoomia; ASC: adenosquamous karsinoomat; BC: bronchoalveolar syöpä.

Esillä olevassa tutkimuksessa käytettiin myös CXCL12-CXCR4 positiivisena kontrollina ja sitä verrataan ekspressiokuviota välillä CXCL16-CXCR6 ja CXCL12-CXCR4. Kuten on esitetty kuviossa. 1,2 ja taulukko 1 suurin osa näytteistä ilmaistaan ​​CXCR4 (30/33) ja CXCL12 (28/33) proteiinin, vaikka valon eroa ilmaisun intensiteetin. Lisäksi 33 havaitsemista, oli 30 tapausta, jotka koekspressoi CXCR6 ja CXCR4-proteiinia, ja 19 tapausta, jotka koekspressoi CXCL16 ja CXCL12-proteiinia.

Protein Expression of CXCL16-CXCR6 in Human Lung Cancer Cell Lines

Kun olet vahvistanut -parin CXCL16-CXCR6 proteiini ihmisen natiivin keuhko- syöpäsoluja, me edelleen analysoineet ilmentyminen CXCL16-CXCR6 ihmisen keuhkosyövän solulinjat A549, H292 ja 95D immunosolukemiallisella. Kuten on esitetty kuviossa. 3, positiivinen ruskean värinen värjäytymistä sekä CXCL16 ja CXCR6 voitiin selvästi havaita sytoplasmassa ja cytomembrane A549, H292 ja 95D-soluissa, vastaavasti. Vaikka oli eroja ilmaisun intensiteetin A549, 95D ja H292-soluissa, värjäytyminen ligandille kaikki oli suhteellisesti heikompi kuin se -reseptorin kolmenlaisia ​​soluja. Lisäksi ilmaisu kuvio CXCL16-CXCR6 oli samanlainen kuin CXCL12-CXCR4, erityisen värjäystä sekä CXCR4: ää ja CXCL12 havaittiin myös kolmessa keuhkosyövän solulinjat, vaikka ero ilmentymisen intensiteetti eri soluissa.

Immunosytokemia suoritettiin havaita proteiinin ilmentymistä CXCL16-CXCR6 ja CXCL12-CXCR4 ihmisen keuhkosyövän solulinjat. Vasta-aineita käytetään tässä kokeissa oli hiiren anti-humaani CXCR4 (25 ug /ml), hiiren anti-humaani CXCR6 (25 ug /ml), hiiren anti-humaani CXCL12 (20 ug /ml), ja vuohen anti-ihmisen CXCL16 (20 ug /ml) vasta-aineita. Positiivinen ruskeata värjäytymistä sekä CXCL16 ja CXCR6 havaittiin selvästi sytoplasmassa ja cytomembrane A549, H292 ja 95D-soluissa, vastaavasti. Lisäksi CXCL12 ja CXCR4 myös yhteistyössä ilmaistu kolmen keuhkosyövän solulinjat. Ei taustaa värjäytymistä havaittiin isotyyppikontrollia. V: Kuvat olivat edustaja kokeet; B: Suhteellinen ilmentyminen intensiteetti CXCL16-CXCR6 ja CXCL12-CXCR4 A549, H292 ja 95D-soluissa. Tro: ihmisen ensisijainen viljellyistä trofoblastisolut positiivisena kontrollina. Suurennos, × 200.

Sitten ELISA-määritys suoritettiin tutkimaan julkaisun liukoisen CXCL16 viljellyissä A549, H292 ja 95D-solujen

in vitro

. Kuten on esitetty kuviossa. 4, kolme erilaista keuhkosyövän solulinjat kaikki erittyy CXCL16 spontaanisti lähes vakionopeudella, mutta oli hieman erilainen pitoisuus CXCL16 kasvualustaan. Määrä CXCL16 tuottaman H292-soluissa oli korkein kolmen solutyyppejä. Pitoisuus CXCL16 24 tunnin aikana viljeltiin väliaineessa H292 jo saavuttanut 1391,9 ± 13,43 ng /ml, ja kertynyt pitoisuus CXCL16 oli 2633,2 ± 9,84 ja 2566,9 ± 3,1 ng /ml viljelyn jälkeen 96 ja 120 h, vastaavasti. Vaikka tuotanto CXCL16 A549-soluissa oli suhteellisesti vähemmän kuin sekä H292 ja 95D-soluissa, tuotanto CXCL16 oli vielä aika-riippuvaisella tavalla ja määrä CXCL16 oli 977,45 ± 12,85 ng /ml viljelyn jälkeen 120 tuntia. Sillä 95D-solut, pitoisuus CXCL16 korreloi myös positiivisesti kulttuuriin ajan ja 120 h tuotanto CXCL16 oli 1165,2 ± 12,00 ng /ml.

pilkotun A549, H292 ja 95D-soluja istutettiin 24-kuoppalevyille (500 ul /kuoppa) tiheydellä 5 x 10

5 /ml, vastaavasti. Supernatantit soluviljelmien kerättiin 24, 36, 48, 60, 72, 96 ja 100 tunnin viljelyn. ELISA-analyysi suoritettiin tutkimaan julkaisun liukoisen CXCL16 viljellyissä A549, H292 ja 95D-solujen

in vitro

. Kuten on esitetty kuviossa. 4, kolme erilaista keuhkosyövän solulinjat kaikki erittyy CXCL16 spontaanisti ajan riippuvalla tavalla, Huolimatta siitä, että erilaisen pitoisuus CXCL16 viljelyalustassa. Kokeet toistettiin kolme kertaa. Virhejanat kuvaavat keskivirhettä keskiarvon.

Virtaussytometria havaitsemiseen käytettiin kalvon ilmaus CXCR6 A549, H292 ja 95D-soluissa. Vaikka osuus CXCR6 ilmentymisen H292-soluissa oli pienempi kuin molempien A549 (52,4 ± 5,79%) ja 95D-solut (56.03 ± 11,42%), keskimääräinen osuus oli vielä 34,87 ± 6,17 (Fig. 5). Lisäksi olemme havainneet kalvon ilmaus CXCR4 A549, H292 ja 95D solujen virtaussytometrialla. Todettiin, että prosenttiosuus CXCR4-positiivisten solujen A549, H292 ja 95D oli 25,56 ± 6,44, 46,00 ± 6,52 ja 28,57 ± 1,43, vastaavasti. Siten kalvo CXCR6 ja CXCR4 yhdessä ilmenivät kolmella keuhkosyövän solulinjoja huolimatta hieman erilainen positiivisen ilmaisun osuutta.

Virtaussytometria (FCM) käytettiin havaitsemaan kalvo ilmaus CXCR6 keuhkosyövän solulinjoissa . Solut 1 x 10

5 laskettiin ja laimennussuhde (fykoerytriini) -CXCR6 monoklonaalinen vasta-aine ja PE-CY5-CXCR4 monoklonaalinen vasta-aine olivat 01:10 ja 01:05 vastaavasti. Histogrammi osoitti keskimääräisen ilmaisu osuus CXCR6 ja CXCR4 A549, H292 ja 95D-soluissa, vastaavasti. FCM kuvia edustivat kokeita. Prosenttiosuus kalvon CXCR6-positiivisten solujen A549, H292 ja 95D oli 52,4 ± 5,80, 56,03 ± 11,42 ja 34,8 ± 6,17, tässä järjestyksessä. Lisäksi kalvo ilmentyminen CXCR4 havaittiin myös A549, H292 ja 95D-soluissa samaan aikaan. Kokeet toistettiin kolme kertaa ja kuvat olivat edustaja kokeissa. Virhejanat kuvaavat keskivirhettä keskiarvon.

vaikutukset CXCL16 on PCNA Expression of Lung Cancer Cell Lines

in vitro

tunnistamisen jälkeen toiminnallinen olemassaolo CXCL16 ja CXCR6 A549-, 95D ja H292, me edelleen havaittu vaikutusta CXCL16 stimulaation PCNA ilmentymistä näiden solujen. Kuten on esitetty kuviossa. 6, ei ollut merkittäviä muutoksia PCNA tasolla eri koeryhmään (P 0,05, verrattuna kontrolliin). Tulokset olivat erittäin tasainen kolmella keuhkosyövän solulinjat ja CXCL16-CXCR6 akselilla ei havaittu vaikutusta PCNA ilmentymä A549, 95D tai H292.

Kun ravinnotta 12 (100 ng /ml) tai näiden yhdistelmästä CXCL16 jossa CXCL16 neutraloiva vasta-aine (100 ng /ml) anther 48 tuntia. Sitten vaikutukset CXCL16 stimulaation PCNA (proliferoivan solun tuma-antigeeni) ilmentymistä havaittiin virtaussytometrillä. Kuten on esitetty kuviossa. 6, ei ollut merkittäviä muutoksia PCNA tasolla eri koeryhmään (P 0,05, verrattuna kontrolliin). Kuvat edustavat kokeet ja tulokset olivat toistettavia ja johdonmukainen kolme keuhkosyövän solulinjat. Virhejanat kuvaavat keskivirhettä keskiarvon.

CXCR6 oli Down-säännelty siRNA Techonology

tehokkuus RNA-häirintää vastaan ​​CXCR6 validoitiin Western blot. Se kuvassa. 7, että CXCR6 proteiinia oleellisesti ilmaistu A549-soluja (bank-kontrollilla ilman mitään hoitoa) ja RNA-interferenssi teknologiaa esti tehokkaasti CXCR6 ilmentymistä A549-soluja. Äänenvaimennusjärjestelmä tehokkuus CXCR6 shRNA- (2819-1) oli paras, siis kaikissa myöhemmissä kokeissa, käytimme tätä siRNA vaientaa CXCR6 mRNA: n ilmentymisen.

hiljentäminen CXCR6 geenien ilmentymisen, transfektoimme A549-soluja jossa phU6 /GFP /Neo-plasmidin sisältävä lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) molekyylejä kohdistettu CXCR6, jossa käyttö Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Sekvenssit kolme shRNA oligonukleotidit olivat: (CXCR6-2819-1): 5′-ctGAG GAC AAT TCC AAG ACT T-3 ’(sense) ja 5′-AAG TCT TGG AAT TGT CCT CAG-3′ (Anti-sense ); (CXCR6-2820-2) 5’-ctCAC CAT GAT TGT CTG CTA T-3 ’(sense) ja 5′-ATA GCA GAC AAT CAT GGT GAG-3′ (Anti-sense); (CXCR6-2821-1) 5’-gcTTG CTC ATC TGG GTG ATA T-3 ’(sense) ja 5′-ATA TCA CCC AGA TGA GCA AGC-3’ (Anti-sense). Tehokkuus RNA interferenssin vastaan ​​CXCR6 validoitiin Western blot. Se kuvassa. 7, että CXCR6 proteiinia oleellisesti ilmaistu A549-soluja (bank-kontrollilla ilman mitään hoitoa) ja RNA-interferenssi teknologiaa esti tehokkaasti CXCR6 ilmentymistä A549-soluja. Kaista 1: Blank-ohjaus; Kaista 2: RNA-ohjaus; Kaista 3: CXCR6 shRNA- (2821-1); Kaista 4: CXCR6 shRNA- (2820-2); Kaista 5: CXCR6 shRNA- (2819-1).

Effects of CXCL16-CXCR6 A549 elinkykyyn

in vitro

MTT määrityksen tulokset on esitetty. 8 osoitti, että ei ollut eroa

in vitro

elinkelpoisuuden välinen tyhjä-ohjaus ja shRNA-ohjaus. Kuitenkin, verrattuna tyhjä-ohjaus, elinkelpoisuutta A549 soluja CXCR6-shRNA (2819-1) ryhmät laski merkittävästi pitkittyminen kulttuurin aikaa (kontrolliin verrattuna, P 0,01 72, 96 ja 120 h) . Lisäksi ihmisen rekombinanttia CXCL16 pystyi lisäämään

in vitro

elinkelpoisuus A549-solut aihiosta-ohjaus ja shRNA-ohjaus (kontrolliin verrattuna, P 0,01), kun taas ei ollut vaikutusta elinkelpoisuudesta A549 soluja CXCR6 alassäädetty ryhmä (kontrolliin verrattuna, P 0,05).

MTT-määritystä käytettiin vaikutusten arvioimiseksi CXCL16-CXCR6 solujen elinkelpoisuuden

in vitro

. Kuten on esitetty kuviossa.