Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että syöpä kantasolut (CSCS) on korkeampi kasvaimen kehittymisen ominaisuuksia kuin eriytetyn syöpäsolujen ja että transkription tekijä-

Sox2

on tärkeä rooli ylläpitämisessä ainutlaatuisia ominaisuuksia CSCS; kuitenkin, toiminta ja taustalla mekanismi Sox2 karsinogeneesis- keuhkosyöpään ovat edelleen vaikeasti. Tutkimuksessa sovellettiin immunohistokemia analysoida ilmentymisen Sox2 ihmisen keuhkojen kudoksissa normaalien yksilöiden sekä potilailla, joilla adenokarsinooma, levyepiteelisyöpä ja suuri solu ja pienisoluinen karsinooma ja ilmaisseet tiettyjä yliekspressio Sox2 kaikentyyppisissä keuhkosyöpään kudosten. Tämä havainto tukee käsitystä, että Sox2 myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn keuhkosyövän soluja ja niitä voidaan käyttää diagnostisena koettimena. Lisäksi luonnollisesti korkeampi ilmentyminen onkogeenien c-

MYC, WNT1, WNT2

, ja

Notch1

havaittiin puolella väestöstä (SP) soluja kuin ei-puolella väestöstä (NSP) solujen ihmisen keuhkojen adenokarsinoomasolulinja-A549, paljastaen mahdollinen mekanismi sitkeästi Tuumorigeenisuustutkimuksissa CSCS. Edelleen selvittämiseksi funktio

Sox2

tuumorigeneesiin syöpäsolujen, A549-soluja perustettu lusiferaasin ilmentymistä ja doksisykliini-indusoituva shRNA kohdistaminen

Sox2

. Löysimme vaiennettu

Sox2

geeni vähentää kasvaimia omaisuutta A549 heikennetyillä ilmentyminen c-MYC, WNT1, WNT2, ja Notch1 in ksenosiirrettyjä NOD /SCID-hiiriin. Käyttämällä RNA-Seq menetelmä, lisäksi 246 tavoite syöpä geenit Sox2 paljastui. Nämä tulokset läsnä todisteita siitä, että Sox2 voi säätelemään onkogeenien CSCS edistää ihmisen keuhkosyöpää.

Citation: Chen S, Xu Y, Chen Y, Li X, Mou W, Wang L, et al. (2012)

Sox2

Gene Säätelee Transcriptional verkoston Onkogeenit ja Vaikuttaa kasvaimen kehittymisen of Human Lung Cancer Cells. PLoS ONE 7 (5): e36326. doi: 10,1371 /journal.pone.0036326

Editor: Qian Tao, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 20 syyskuu 2011; Hyväksytty: 30 maaliskuu 2012; Julkaistu: May 15, 2012

Copyright: © 2012 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat National Science Foundation of China myöntää 31000616 (NL), Kiina Junior tiedekunta Funds myöntää 20090031120044 (NL) Kiina perustutkimus rahastoja Keski yliopistojen myöntää 65011241 (NL), National Science Foundation of China avustuksen 30830096 (RX ), Major valtion Basic Research Development Program of China (Kiina 973 Program) 2007CB914804 (RX), tukihanke Tianjin Scientific Teknologinen komissio 973 Program 08QTPTJC28700 (RX), ja Key Project Tianjin Scientific Teknologinen komission Kiinan-Ruotsi yhteistyö tutkimusohjelma 09ZCZDSF04000 (RX). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä kantasolut (CSCS) muodostavat hyvin pienen populaation syöpäsolujen kasvaimia peräisin. Heillä sama ainutlaatuinen luonne kuin alkion kantasoluja (ES-solut), kuten kyky muodostaa klooneja, pluripotenttisuus ja itsensä uudistumista ja siten on kyky aloittaa kasvain, yllä sen kasvu ja vastaa syövän uusiutumiseen [1]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että CSCS kuten solualapopulaatioiden voitiin eristää eri viljellyistä kasvainsolulinjoja tai kudoksiin käyttämällä Hoechst33342 väriaine ulosvirtauksen menetelmä erottaa puolelle väestöstä (SP-soluja) [2] tai lajittelemalla solut, jotka ilmentävät tiettyä kantasolujen pinnalla markkereita, kuten kuten CD133 (+), CD44 (+), CD34 (+) ja CD38 (+) [3] – [5] et ai.

Keuhkosyöpä edustaa yleisin syy syöpään liittyvien kuolleisuutta sekä miehet ja naiset kaikkialla maailmassa erittäin alhainen viiden vuoden eloonjäämisluvut, vaikka kliinisen hoidon [6], [7]. Tämä pahanlaatuisuus on yleensä jaettu eri histologisia tyyppejä mukaan fenotyypit soluja, joista kasvain ilmenee, mukaan lukien okasolusyöpä (SCC), adenokarsinooma ja neuroendokriinisten karsinooma, kuten pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) sekä suuret keuhkosyöpä [8]. Adenokarsinooma, SCC ja suuret keuhkosyöpä ovat myös kollektiivisesti nimetty ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joka edustaa yleisimpiä keuhkosyövän pienemmillä kasvu ja leviäminen nopeus kuin SCLC. Joukossa NSCLC, perifeerinen adenokarsinooma on johtava alatyyppi, joka vastaa noin 80% tapauksista keuhkosyöpäpotilaita [9]. Useat tutkimukset osoittivat, että CD133 (+), CD44 (+) ja CD87 (+) voidaan käyttää pinnan markkereita tunnistamaan CSCS keuhkosyövän [10] – [12]. Viimeaikaiset tutkimukset raportoitiin eristetty SP sekä hiiren kasvain malli [13] ja erilaisia ​​keuhkosyövän solulinjoja käyttämällä Hoechst dye ulosvirtauksen menetelmän [14] – [16]. Havaittiin, että eristetyt SP solut näyttävät korkeampia ekspressiotasoja kantasolujen geenejä, kuten

Sox2

ja

Oct4

ja kasvaimen kehittymisen ominaisuudet kuin NSP solut [2].

tärkeä tehtävä transkriptiotekijän

Sox2

ylläpitää ainutlaatuisia ominaisuuksia ES-solujen ja CSCS on tutkittu laajasti. Lisäksi todettiin, että aiheuttama pluripotenttien kantasolujen (IPS) tai pluripotentteihin syöpä (IPC) soluja voisi syntyä kotransfektoimalla

Sox2

cDNA muiden transkriptiotekijöiden kuten

Oct4

,

Klf4

ja

c-Myc

osaksi fibroblastien tai syöpäsoluja [17] – [20]. Itse asiassa, Sox2 oli hyvin ilmaistu eristyksissä CSCS kaltaisten solujen sekä mRNA ja proteiini tasoilla. Laajat tutkimukset paljastivat, että Sox2 säätelee monimutkainen transkription verkko säilyttää ainutlaatuisia ominaisuuksia kantasolujen [21] ja anti-apoptoosin ominaisuus CSCS [15], [22]. Niinpä kohdentaminen Sox2 on lupaava strategia kasvaimen hoito. Vaikka lukuisia tutkimuksia kliinisesti johdettujen tuumorikudoksista raportoitu erityisiä yliekspressio Sox2 tietyntyyppisten kasvainten kudokset, kuten eturauhas- ja rintasyövistä [22], [23] ja ilmoitti sen merkitys kasvaimien synnyn, taustalla mekanismi kasvaimia omaisuutta

Sox2

geeni on yhä suurelta osin tuntematon.

Onkogeenit tärkeitä rooleja kehittämisessä syöpä. Niistä

NOTCH

,

WNT

ja

c-MYC

ovat vakiintuneita onkogeenien käynnistymiseen ja etenemiseen keuhkosyöpään solujen. On raportoitu, että WNT proteiinit-WNT1, WNT2 ja NOTCH proteiinien -NOTCH1, NOTCH3 sekä niiden alavirran proteiini HES-1 yli-ilmentyy NSCLC solulinjoja tai kudoksissa [24] – [31]. Yli-ilmentyminen näiden onkogeenien tai aktivoitumista niiden signaalien kulkureiteillä aiheuttama keuhkosyöpä [32], [33]. Sinänsä kohdistaminen näistä geeneistä käyttämällä siRNA /shRNA, mutaatio, spesifisiä inhibiittoreita tai monoklonaalisia vasta-aineita voitaisiin estää kasvaimen kasvua ja indusoivat apoptoosia keuhkosyövän solulinjoja kokeellisen hiiren malleissa [4], [34] – [36]. Sen lisäksi niillä on tärkeä rooli kasvainten synnyssä keuhkosyöpään, nämä onkogeenien muodostuu myös toiminnallista vuorovaikutusta verkossa. On myös raportoitu, että Notch1 indusoi c-MYC, lisäksi molemmat proteiinit säätelemään samaan kohteeseen osallistuvien geenien solun kasvun säätelyssä [37]. c-MYC Paljastui myös olevan loppupään tavoite WNT /β-kateniinin signalointi ja edelleen tutkimukset osoittivat promoottori

c-MYC

yhtymään WNT /β-kateniinin reagoiva parantajina [38], paljastaen mahdollinen sääntelyn mekanismi WNT signalointi c-MYC.

Koska suuren panostuksen ja Sox2 ylläpitämisessä stemness omaisuutta CSCS oletamme, että Sox2 voisi ohjaavat transkription verkosto onkogeenien vaikuttaa tuumorigeneesiin keuhkojen karsinooma. Tuloksemme toistaiseksi osoittavat, että Sox2 säätelee transkription verkoston onkogeenien, kuten

WNT1, WNT2, Notch1 ja c-MYC

ja edistää kasvaimen kehittymisen ihmisen keuhkojen syöpäsoluja. Tämä tutkimus tukee myös käsitteitä, että kohdentaminen Sox2 on tehokas strategia keuhkosyövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet suoritettiin tiukasti alle suuntaviivat laboratorioeläimillä Nankai yliopiston ja hyväksyi Institute Research eettinen toimikunta on Nankai yliopisto (Luvan numero: 10011). Hiiret nukutettiin seoksella hapen /Isofluraanin ennen kutakin koetta yritettiin minimoida niiden kärsimyksiä. Sillä ihmisen näytteitä, kaupallistaa tiheäksi kudossiruina ostettiin ja käyttöä ihmisen kudosta tässä tutkimuksessa hyväksyi Human tutkimuskomitea Nankai yliopisto.

Vector Hakemisto Rakentaminen

shRNA järjestyksessä hiljentää ihmisen

Sox2

geeni etsittiin ja puhallettu käyttäen RNAi suunnittelija Invitrogen verkkosivuilla (https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/index.jsp). Yksi shRNA kohdistaminen ihmisen Sox2 suunniteltiin ja kemiallisesti syntetisoida, kuten shRNA-Sox2 (AAAAGGGACATGAT CAGCATGTATTGGATCCAATACATGCTGATCATGTCCC), ja sekoitettua sekvenssiä (AAAAGCTACACTATCGAGCAATTTTGGATCCAAAATTGCTCGATAGTGTAGC) käytettiin kontrollina pudotus analyysiä. Palindromisen DNA oligot hybridisoitiin toisiinsa muodostaen kaksijuosteisen oligo- ja liitetään linearisoituun pLV-H1TetO-GFP-Bsd (Cat # SORT-C03, Biosettia Inc., San Diego, CA) ja pLV-H1-EF1α -puro (Cat # SORT-B19, Biosettia Inc., San Diego, CA) vektori generoimaan ympyröity pLV-H1TetO-shRNA-Sox2-GFP-BSD ja pLV-H1-EF1α-shRNA-Sox2-puro-plasmidin erikseen. Puromysiini kestävä cDNA pLV-H1-EF1α-shRNA-Sox2-puro plasmidi leikattiin NheI Ι ja Sal Ι entsyymin tilalle GFP-Bsd fragmentti in pLV-H1TetO-shRNA-Sox2-GFP-Bsd tuottaa pLV- H1TetO-shRNA-Sox2-puro-plasmidin.

Cell Culture

Wild tyypit (Wt) A549 ja H460-solut saatiin ATCC: ltä. A549-Wt-solut infektoitiin lentiviruksen, joka koodaa tulikärpäsen lusiferaasi (FL) geenin (Cat. # GlowCell-14b-1, Biosettia, sandiego, CA), ja valitaan 10 ug /ml Blasticidin (BSD) tuottaa A549-soluja, joilla on stabiili yliekspressio FL (A549-FL). A549-Wt, H460-Wt ja A549-FL-solut infektoitiin lentivirus kuljettavat pLV-H1TetO-shRNA-Sox2-puro-plasmidin (Biosettia, sandiego, CA), jota seurasi kloonivalinnalla käyttämällä puromysiiniä (10 ug /ml A549 ja 2 ug /ml H460) tuottaa polyclone A549, H460 tai A549-FL-soluja, joilla on stabiili ilmentyminen Dox indusoituvan shRNA-Sox2 (A549-H1tetO-shRNA-Sox2, H460-H1tetO-shRNA-Sox2 tai A549-FL /H1tetO -shRNA-Sox2). A549 ja H460-soluja ylläpidettiin F12K ja RPMI 1640-alusta täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia, kun läsnä on 100 u /ml penisilliiniä ja 0,1 mg /ml streptomysiiniä erikseen. Vertailua varten A549-Wt, H460-Wt ja A549-FL infektoitiin lentiviruksen kuljettavat salattu shRNA ja altistettiin identtinen kloonin valintamenettelyä tuottaa säädöt solulinjat A549-H1tetO-shRNA-Con, H460-H1tetO-shRNA- con ja A549-FL /H1tetO-shRNA-Con.

immunohistokemia ja kudossiruina

ilmentymistä Sox2 korkean tiheyden kudossiruina (Cat. # BC04119b, LC727, LC2085b , LC2161, Alenabio, Xi’an, Kiina PR) havaittiin standardin biotiini-avidiini-kompleksin menetelmä, jossa hiiren monoklonaalinen vasta-aine Sox2 (Cat. # ab75485, Abcam Inc, Cambridge, UK), jonka 1:200 laimennus. Kuvat tallennettiin Olympus BX51 Epi-fluoresenssimikroskopialla alle 10 × tai 40 × tavoite (Olympus Co. Tokio, Japani).

virtaussytometria analyysi ja lajittelu

A549- wt solut otettiin talteen ja suspendoitiin uudelleen esilämmitetyssä DMEM + puskuria (DMEM, jossa oli 2% FBS: ää ja 10 mM HEPES-puskuri) tiheydellä 1,0 x 10

6 solua /ml. Hoechst 33342 väriaine lisättiin lopulliseen konsentraatioon 10 ug /ml läsnä tai poissa ollessa 10 uM Fumitremorgin C (FTC). Cell näytteet laitettiin 37 ° C: ssa vesihauteessa 60 minuuttia (min) ja sekoitetaan 10 minuutin välein. Solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen kylmään HBSS + puskuria (Hanks ’Balanced Salt Solution 2% FBS ja 10 mM HEPES-puskuria). Lopussa värjäyksen jälkeen solut suspendoitiin uudelleen kylmään HBSS +, joka sisälsi 2 ug /ml propidiumjodidia (PI) kuolleiden solujen syrjintää. Hoechst-väriaine oli innoissaan UV laser 355 nm, ja sen fluoresenssi mitattiin 460/50 BP suodatin (Hoechst Blue) ja 670/30 BP suodatin (Hoechst Red).

RT -PCR ja Reaaliaikainen RT-PCR

Yhteensä mRNA: A549-solut eristettiin TRIzol reagenssia (Cat. # 15596-018, Invitrogen Inc, Carlsbad, CA) ja käänteistranskriptoituneet cDNA kanssa MMLV-käänteistranskriptaasia (Promega, Madison, MI). Tämän jälkeen semi-kvantitatiivisia RT-PCR suoritettiin havaitsemaan mRNA ekspressiotasot

Notch1

,

WNT1

,

WNT2

,

c-MYC

,

Sox2

,

Oct4

,

Nanog

,

ABCB1

ja

ABCG2

. Yhtäläisestä latauskontrollina, mRNA ihmisen

β-aktiini

testattiin samaan aikaan. Käytetyt alukkeet Molemmissa kokeissa on esitetty taulukossa 1. Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin Opticon (Bio-Rad, Hercules, CA) 25 ui: aan reaktioseosta määriä käyttäen TransStart Green qPCR SuperMix Kit (transgeeniset Biotech, Peking, Kiina, PR ). 2

-ΔΔCt menetelmää käytettiin määrittämään suhteellinen mRNA taitto muutoksia. Tilastolliset tulokset laskettiin keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena.

edustaja värjäytyminen Sox2 näissä kudoksissa tehtiin erikseen mikroskopian kuvia alle 10 × (A) ja 40 × tavoite (B).

Western-blottaus

Solulysaatit A549 ja H460-solulinjoja valmistettiin RIPA-puskuriin, kun läsnä on proteaasinestäjä cocktailien kuten aiemmin on kuvattu [22]. Proteiinia (20 ug) ladattiin 5-12% Tris-akryyliamidigeeleillä ja blotattiin vasta-aineita, jotka sisältyvät: polyklonaalinen anti-Sox2, WNT2 (Cat. # Sc-20088, SC-50361, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz , CA), WNT1 (Cat. # ab85060, Abcam Inc, Cambridge, UK), monoklonaalinen anti-Notch1 (Cat. # 3608, Cell Signal Technology Inc, Danvers, MA), c-MYC, β-aktiini (Cat. # sc-40, sc-47778, Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA), ja piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita. Blotting tuloksia havaittiin ECL chemiluminescence Kit (Millipore, Billerica, MA).

. SP solut A549 havaittiin ja erotettiin FACS käyttämällä Hoechst33342 väriaine ulosvirtaus menetelmä (vasemmalla) ja varmistettiin niiden epäonnistuminen pumpata tämän väriaineen inkubaation jälkeen FTC, erityinen estäjä monilääke kuljettajaproteiini ABCG2 (oikealla). Tämä luku vastaa 1 3 kokeen. MRNA ekspressiotasot onkogeenien ja kantasolujen geenien verrattiin välillä SP ja NSP-soluista käyttämällä semi-kvantitatiivinen RT-PCR: llä, reaaliaikainen RT-PCR-menetelmällä B ja C erikseen, n = 3. D. Western blotting tulokset WNT1 , WNT2, Notch1, c-MYC ja Sox2 proteiinien SP ja NSP A549 soluja.

-tuumoriksenografti

Male NOD /SCID-hiiriin, 6-8 viikkoa iässä erotettiin satunnaisesti kahteen ryhmään (n = 5 kussakin ryhmässä). 1 x 10

6 A549-FL /H1tetO-shRNA-Con tai A549-FL /H1tetO-shRNA-Sox2 solut ksenosiirrettyjä kuhunkin hiiren kautta häntälaskimoinjektio. Kaikki hiiret syötettiin 0,2 mg /ml Dox plus 0,05% sakkaroosia juomavedessä ensimmäisestä päivästä siirrostuksen jälkeen.

. A549-H1tetO-shRNA-Sox2 ja ohjaus soluja inkuboitiin Dox ja 4 päivää ja hiljentäminen

Sox2

geeni vahvistettiin Western-blottauksella. B. FACS analyysi SP: A549-soluja tai ilman

Sox2

hiljentäminen. SP solut A549 vahvistettiin niiden kyky pumpata Hoechst 33342 väriaine puuttuessa FTC (up paneeli, FTC-), mutta ei pumpata väriaine inkubaation jälkeen FTC (pieni paneeli, FTC +). C. prosenttiosuus SP: A549-solut kustakin koeryhmä oli keskimäärin kolmesta itsenäisestä kokeesta ja piirretään. D. Reaaliaikainen RT-PCR: ää käytettiin vertaamaan mRNA ekspressiotasot onkogeenien A549 solulinjassa tai ilman alas-säätely Sox2, n = 3. E. Proteiinin ilmentymisen tasot

WNT1

,

WNT2

,

Notch1

ja

c-MYC

geenien havaittiin A549 ja H460-solujen kanssa

Sox2

hiljentäminen Western-blottauksella.

Bioluminescent Kuva

Hiiret nukutettiin seoksella, jossa oli happea /isofluraanilla, ja ne vastaanotetaan lusiferiinin (Cat. # 119222, Etu Life Sciences, Hopkinton, MA) ip 150 ug /g kehon paino. Bioluminescent signaaleja mitattiin 10 minuuttia myöhemmin, jonka IVIS 100 kuvantamisjärjestelmä ja määrällisesti Living Image Software (Xenogen, Alameda, CA).

. A549-soluja injektoitiin häntälaskimon NOD /SCID-hiiriin, ja bioluminenssi kuvia Ksenosiirretyn kasvaimen otettiin osoitettuina aikoina. B. Bioluminesenssi intensiteetti mitattiin ja piirrettiin, n = 5. C. HE-värjäys havaitsemiseen käytettiin ksenosiirrettyjä kasvaimia keuhkokudoksissa Ksenosiirretyn NOD /SCID-hiiriin. D. immunohistokemia värjäys Sox2, c-MYC, Notch1 ja WNT1 (kaikki esitetty ruskea väri) alkaen keuhkojen kudoksia Ksenosiirretyn NOD /SCID in situ. E. Immunofluoresenssikoe of WNT2 (vihreä) in ksenosiirrettyjä hiiren keuhkojen kudoksia. Kaikki mikroskopia kuvat kirjattiin alle 40 × tavoite. Luvut C, D ja E ovat 1 5 kokeiluja. Kasvain alueet C, D ja E olivat kaikki kierrätettiin katkoviivoin.

RNA-Seq

A549-H1tetO-shRNA-Sox2 ja sen valvontaa solut kerättiin oltuaan inkuboitiin Dox 4 päivää. 4 ug kokonais-RNA: ta kustakin näytteestä uutettiin TRIzol reagenssia. Oligo (dT) magneettiset helmet adsorptio menetelmää käytettiin mRNA: n puhdistamiseksi, niiden transcriptome tietoja profiloitu ja verrattiin seuraavien vakioprotokollia (digitaalinen geenien ilmentyminen, DG, 3 miljoonaa lukee, Beijing Genomics instituutin Shenzhen, Kiina). Syöpä geenit valittiin 7 tietokannoista yhteenveto sivuston: https://microb230.med.upenn.edu/protocols/cancergenes.html ja ne geenit vääriä löytö määrä (FDR) 0,001 valittiin ulos kuin kohdegeenien of Sox2. RNA-Seq tiedot on talletettu NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) tietokannasta (GSE36597; arvostelija pääsylinkin: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=druvhickewcwcvy acc=GSE36597).

Standardized TPM (selostukset miljoonasosaa puhdas tunnisteet) arvot levitettiin verrata muihin kohde syövän geenien ilmentymisen tasojen A549-solujen

Sox2

hiljentäminen (shRNA-Sox2) ja niiden ohjaus (shRNA-Con). Transkription Jokaisen geeni edustaa neliö väri, joka koodaa arvot Lg TPM. Erityisesti kirkkaan vihreä edustaa heikkoa ilmentymistä, kirkkaan punainen edustaa voimakas ilmaus. Tavoitteena geenejä, joiden transcriptions ovat ajan säädellä vaiennettaisi

Sox2

esiteltiin ja niitä alas geenien esiteltiin B.

tilastollinen analyysi

Arvot ilmaistiin keskiarvoina ± SEM merkitys määritettiin χ

2 testi taulukossa 2 ja hypergeometrisen testi taulukossa 3, toiset määritettiin Studentin t-testiä. arvoa

p

0,05 käytettiin kriteerinä tilastollista merkittävyyttä. * tarkoittaa eroa suuresti

p

0,05, ** osoittaa merkittävää eroa

p

0,01.

tulokset

Sox2 on Tarkemmin ilmaistuna Human Lung Cancer kudokset

sen määrittämiseksi, Sox2 myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn keuhkosyöpä, immunohistokemiallinen menetelmää käytettiin havaitsemaan ilmentymisen Sox2 ihmisen keuhkoissa normaali /paracarcinoma (n = 38), adenokarsinooma (n = 200), SCC (n = 150 ), SCLC (n = 36) ja suuri keuhkosyöpä (n = 31). Korrelaatio Sox2 kliinisiä potilaan asemaan keuhkosyöpä oli koottu taulukkoon 2. Pääosin korkeampi ilmentyminen Sox2 havaittiin sekä NSCLC ja SCLC kuin normaaleissa /paracarcinoma kudosten (

p

0,001), mikä osoittaa, tärkeän roolin Sox2 että kasvainten synnyssä keuhkosyöpään. Tilastollisesti tuloksia huomattava osoitti lukumäärä Sox2 positiivisia soluja voidaan korreloi positiivisesti ikä diagnoosin (

p

= 0,024). Lisäksi SCLC kudoksissa paljasti suuremman ekspressiotason Sox2 kuin NSCLC kudoksia (

p

= 0,011). Oli positiivinen korrelaatio Sox2 ja patologinen aste ihmisen adenokarsinooman (

p

= 0,002), mikä osoittaa, että Sox2 voi estää erilaistumista adenokarsinoomasolua. Vuodesta tulokset immunohistokemiallisella värjäyksellä (kuvio. 1), löysimme joko sytosoliin tai molemmat ytimet ja sytosolin lokalisaation Sox2 syöpäsoluissa, mikä oli yhdenmukainen aiempien havaintojen ihmisen eturauhasen syöpäsolujen [22]. Lisäksi suurin osa kasvain kudosten korkean ilmentymistason Sox2 osoitti sekä ydin- ja sytosolin lokalisoinnin Sox2; Sen sijaan ne kudoksen alemman ilmentymistason Sox2 aina paljasti vain sytosoliin lokalisointi. Korrelaatio Sox2 ekspressiotason ja sen lokalisointi oli merkittävä (

p

0,001); kuitenkin, ei ollut tilastollisesti merkitsevä suhde Sox2 positiivisen syöpäsolun laskee ja TNM vaiheita tai sukupuoli.

Onkogeenit WNT1, WNT2, Notch1 ja c-MYC yli-ilmennetään klo Sekä mRNA ja proteiini-tasot SP solut A549 Cell Line

tunnistamisen jälkeen erityisiä yli-ilmentymisen Sox2 ihmisen keuhkojen kasvain kudosten, ilmaus Sox2 ja vakiintunut onkogeenien vertailtiin SP ja kukaan puolella väestöstä (NSP) vuonna A549-soluja. SP-solut ovat CSCS kaltaisia ​​soluja, jotka osoittavat korkeampaa kasvaimen kehittymisen ja Chemo-kestävät ominaisuudet kuin NSP-solujen [39], [40]. Koska ne ilmentävät korkeita ilmentymisen tasoja ATP-sitova kasetti (ABC) kuljettajan perheenjäseniä, jotka auttavat heitä puristamiseen Hoechst 33342 väriaine ja jotkut lääkkeet tehokkaammin, SP soluja voitaisiin eristää Hoechst 33342 ulosvirtaus menetelmää käyttäen FACS. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, noin 13% soluista voitiin eristää SP jota Hoechst väriaine ulosvirtausta menetelmällä. Stemness eristettyjen SP solujen osoitettiin erityisten yliekspressio

Sox2

,

Oct4, Nanog, ABCB1

ja

ABCG2

geenejä. Merkittävästi suurempia ekspressiotasot

WNT1

,

WNT2

,

Notch1

ja

c-MYC

havaittiin SP-soluissa kuin havaittiin NSP solujen molemmat mRNA (Fig. 2B, Fig. 2C) ja proteiini tasoilla (Fig. 2D), mikä viittaa molekyylimekanismi taustalla korkea tuumorigeenisen omaisuutta CSCS.

Sox2 Säätelee ilmentäminen Onkogeenit A549 ja H460 Cells

Koska

Sox2

on tärkeä transkription tekijä, joka ylläpitää toimintaa CSCS, me arveltu, että Sox2 voisi säätelevät transkription tiettyjen onkogeenien kasvainsoluissa. Testata tätä väitettä, A549-soluja perustettu vakaa ilmentyminen doksisykliini (Dox) indusoituva shRNA kohdistaminen Sox2 (A549-H1tetO-shRNA-Sox2). Indusoituvan pudotus on Sox2 vahvistettiin Western-blottauksella jälkeen 4 päivää inkuboinnin A549 soluja Dox, ja 70% hiljentäminen tehokkuutta shRNA osoitettiin ilmentymisen

Sox2

geenin (Fig. 3A). Samaan aikaan, merkittävää vähenemistä prosentteina SP: A549-solujen

Sox2

geenien paljastui (Fig. 3B ja 3C), mikä osoittaa tärkeä tehtävä Sox2 ylläpitämisessä CSC ominaisuuksia A549-solut. Lisäksi tämä havainto tukee myös panos Sox2 että kasvaimien syntyyn kapasiteetti keuhkosyövän soluista, koska se oli hyvin vakiintunut, että SP on suurempi tumorigeneesin ominaisuus kuin NSP erilaisissa keuhkosyövän solujen [16]. Käyttämällä reaaliaikainen RT-PCR ja Western blotting merkittäviä vähennetään ilmauksia

WNT1

,

Notch1

ja

c-MYC

sekä mRNA ja proteiini tasot esitetään A549 solut Sox2 alassäätöä (Fig. 3d ja 3E). Mielenkiintoinen ilmiö havaittiin oli, että vaikka mRNA ilmaus

WNT2

oli hieman koholla, kun vaiennettu

Sox2

, sen ekspressiotaso laski, mikä osoittaa translaation esto

WNT2

vuonna A549-soluja, joissa

Sox2

hiljentäminen. Sama sääntelyn vaikutukset Sox2 ilmoitustapa

WNT1

,

WNT2, Notch1

ja

c-MYC

havaittiin myös ihmisen suuri keuhkosyövän solulinjassa H460 jossa

Sox2

hiljentäminen (Fig. 3E) .Tämä havainto osoittaa universaali sääntelyn mekanismi Sox2 on onkogeeni verkossa sekä ihmisten keuhkojen solulinjoissa. Tulokset tukevat käsitystä, että Sox2 voi säädellä transkriptiota keskeisten onkogeenien keuhkosyövässä edistää kasvaimien syntyyn.

vaiennettu Sox2 vaimentaa kasvaimen kehittymisen of Human Lung Cancer Cells in ksenosiirrettyjä NOD /SCID Hiiret

jälkeen tunnistaminen Sox2 n toiminnon kasvaimen kehittymisen ja sen sääntelyn vaikutus ilmentymisen onkogeeneistä ihmisen keuhkosyövän soluja, me seuraavaksi tutkitaan sen toimintaa in vivo. Tätä tarkoitusta varten A549-FL /H1tetO-shRNA-Sox2 ja ohjaus inokuloitiin NOD /SCID-hiiriin injektoimalla niitä häntälaskimoon. Läsnäolo A549-FL solujen seurattiin invasiivisen bioluminenssina kuvantaminen. Hiiret ksenosiirrettyjä A549-FL /H1tetO-shRNA-Sox2 ja A549-FL /H1tetO-shRNA-Con-soluja ruokittiin Dox juomaveden ensimmäisestä päivästä siirrostuksen jälkeen ilmentymisen indusoimiseksi shRNA. Kuten havaitaan kuviossa. 4A ja 4B, sama määrä bioluminenssin signaalit voitiin havaita hiirissä 1 päivä injektion jälkeen, mikä osoittaa, että sama määrä keuhkojen kasvainsolujen tuli loukkuun keuhkokapillaareihin molemmissa koeryhmissä. Myöhemmät lasku bioluminesenssi signaaleja havaittiin 7 seuraavina päivinä johtuen puuttuessa eloonjäämisessä Ksenosiirretyn keuhkosyövän soluihin [41]. Lisätään asteittain signaalit voitiin havaita hiirissä ksenosiirrettyjä A549-FL /H1tetO-shRNA-Con soluissa 14 päivän jälkeen hoidon, mikä osoittaa, että nämä solut oli onnistunut itseohjautuva ja lisääntyvissä. Kaksikymmentäyksi päivää kasvainsolualtistuksen, 5 5 A549-FL /H1tetO-shRNA-Con ksenosiirrettyjä hiirille kehittyi kasvain, mutta vain 2 5 A549-FL /H1tetO-shRNA-Sox2 ksenosiirrettyjä hiirille kehittyi kasvaimen 42 päivän kuluessa alkuperäisen tuumorisolujen haaste. Ksenosiirrettyjä keuhkotuumoreista NOD /SCID-hiiriä vahvistettiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) värjäykset kuten on esitetty kuviossa. 4C. Proteiini ekspressiotasot

Sox2

ja onkogeenien hiiren keuhkojen kudoksia analysoitiin immunohistokemiallisesti tai immunofluoresenssilla menetelmiä. Olemme löytäneet vähentää kasvaimen kehittymisen potentiaali A549-solut in vivo, sekä merkittävästi heikennetty ilmaus WNT1, WNT2, Notch1 ja c-MYC jälkeen hiljentäminen on

Sox2

geenin (Fig. 4D ja kuviossa. 4E). Yhdessä nämä tulokset tukevat kasvaimia omaisuutta Sox2 ja sen sääntelyn vaikutus onkogeenien in vivo.

Sox2 Säätelee Transcriptional verkoston Onkogeenit

on yksilöity toiminta Sox2 vuonna tuumorigeneesiin omaisuutta keuhkosyövän soluja ja sen tavoite onkogeenien me testataan kaikki muut kohdennetut geenien RNA-Seq ja löysi 246 syöpä geenit. Niistä 74 geenit (30%) oli säädelty (Kuva. 5A) ja 172 geenit (70%) oli alassäädetty (Fig. 5B) A549-solujen

Sox2

hiljentäminen. Huomasimme transkription tasot

NOTCH3

ja

WNT 7B

vähenevät merkittävästi, paljastaen kattava vaikutuksia Sox2 on transkriptio

WNT

ja

NOTCH

geeniperheistä. Lisäksi mRNA ekspressiotasot vakiintunut onkogeenien kuten

Klf4

,

EGFR

,

BCL10

,

kesäkuu

,

YAP1

ja

JAK1

et al. vähensi merkittävästi verrattuna ohjaus soluihin, mutta puhtaaksikirjoitukset

EGF

,

RHOC

et al. oli kasvanut huomattavasti, mikä osoittaa monimutkainen molekyyli mekanismi kasvainten synnyssä prosessissa Sox2. Lisäksi meidän RNA-Seq tulos paljasti 840 ilmentyvät eri geenit (DEG), jossa polku merkintä jälkeen

Sox2

hiljentäminen A549-soluissa. Kautta rikastamiseen analyysi Sox2 kohdegeenien solussa signalointireitin tietokanta Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (Kegg), löysimme väylän syöpä on yksi merkittävästi rikastettu niitä (taulukko 3 ja kuvio. S1). Tämä tulos tukee edelleen tärkeä tehtävä Sox2 kehittämiseen kasvain.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa käytimme immunohistokemia systeemisesti ekspression analysoimiseksi Sox2 erilaisissa keuhkosyövässä ja totesi, että Sox2 on pääasiassa yli-ilmennetään adenokarsinooma, SCC, suuri solu karsinoomat ja SCLC kudoksissa, mikä osoittaa, että Sox2 voidaan käyttää yleisen markkeri diagnoosia varten ihmisen keuhkosyöpä. Täällä myös läsnä näyttöä siitä, että Sox2 on tärkeä rooli syövän synnyssä keuhkosyöpään.

Koska käsitettä CSC on todettu, monet tutkimukset tukevat tätä käsitettä osoittamalla, että CSCS tai CSCS kuin solut ovat erittäin tuumorigeenisia [ ,,,0],16]; Kuitenkin vain harvat ole tehty selvittämään molekyylitason mekanismia tämän ilmiön. Tässä osoitimme suuremman ilmaus

Sox2

ja oncogenes-

Notch1, WNT1

,

WNT2

sekä

c-MYC

SP-soluissa kuin ne, NSP soluissa, mikä tukee mahdollista edistää näiden onkogeenien on stemness omaisuutta CSCS.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat paljastaneet monimutkaista vuorovaikutusta Sox2 ja WNT signalointireitin. Esimerkiksi on raportoitu, että Sox2 antagonisoi WNT signalointi estämään erilaistumista aikuisen kantasoluja (ASC: tä) [42] ja osteoblastien linjaa [43] ja parantaa kasvaimen kehittymisen ja itseuudistumiseen omaisuutta osteosarkoomia [44] edistämällä transkriptio negatiivinen säätelijä WNT signalointi, kuten DKK1, APC ja GSK3p. Sox2 raportoitiin myös synergistisesti vuorovaikutuksessa β-kateniinin, alavirran molekyyli WNT signaalireitin, säädellä transkriptiota kohdegeenin edistää soluproliferaatiota ja tuumorigeneesiä ihmisen rintasyövän [23]. Kuitenkin tärkeänä kantasolu geeni, taustalla molekyylitason mekanismi Sox2 tehtävänä kasvainten synnyssä on kattava ja vaatii vielä intensiivisesti. Tässä suhteessa tuloksemme osoittivat, että hiljentäminen

Sox2

vähentää merkittävästi proteiinin ilmentymisen taso oncogenes-

WNT1

,

WNT2

,

c-MYC

ja

Notch1

ihmisen keuhkosyöpää ja kertoo vielä muita kohde syövän geenien Sox2. Näin ollen on mahdollista, että Sox2 voi toimia näiden tärkeiden onkogeenien edistää kasvaimen esiintymisen. Äskettäin tehdyn tutkimuksen säätely alaspäin

Sox2

geeni estää proliferaatiota ja indusoi apoptoosia kasvainsoluissa [15], [45], [46], havaitsimme saman ilmiön ihmisen keuhkosyövän solulinjat (tuloksia ei esitetty ), ne voivat myös olla tärkeitä tekijöitä, jotka lopulta johtavat tukahdutti kasvaimen kasvun A549-soluja;