Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

moniresistenssin (MDR) on yksi tärkeimmistä syistä kemoterapia-hoitoja epäonnistuvat. Hypoksia liittyy yleensä kasvain chemoresistance. Kuitenkin korrelaatio heterodimeerisen hypoksia-indusoituva factor-1 (HIF-1) ja monilääkeresistenssiin (MDR1) geenin /transporter P-glykoproteiinin (P-gp) on edelleen epäselvä. Tutkimuksen tavoitteena on selvittää molekyylitason mekanismeja kääntämään paksusuolensyöpä MDR keskittymällä kohdegeenin HIF-1α.

Methods

kemoterapia-herkkyys määritystä käytettiin tarkkailla tehokkuuden MDR kääntämistä LoVo monisoluisten sferoidia (MCS). Apoptoottiset taso aiheuttama eri lääkkeitä tutkittiin virtaussytometrialla (FCM). Sitoutuminen HIF-1α, että MDR1-geenin promoottori arvioitiin Kromatiini immunosaostuksella (chip). Suhde HIF-1α /P-gp: n ilmentyminen ja herkkyys kemoterapia analysoitiin.

Tulokset

herkkyyttä LoVo MCS kaikkiin neljään kemoterapiaa huumeiden laski eriasteisesti hypoksisissa olosuhteissa. Vaimentamisen jälkeen HIF-1α-geeni, herkkyyttä LoVo MCS kaikkiin neljään kemoterapiaa huumeita palautettiin. Apoptoottiset tasot että kaikki lääkkeet aiheuttama olivat kaikki laski vaihtelevassa määrin vuonna hypoksinen ryhmässä. Sen jälkeen hiljentäminen HIF-1α, apoptoosin taso indusoi kaikkien neljän kemoterapiaa huumeita lisääntynyt. Ilmaisu HIF-1α ja P-gp oli merkittävästi parannettu LoVo MCS hoidon jälkeen hypoksian. Inhiboiva HIF-1α merkittävästi vähentynyt ilmentyminen MDR1 /P-gp: n mRNA: n tai proteiinin sekä LoVo monokerrokset ja LoVo MCS. Siru määritys osoitti, että HIF-1α sitoutui MDR1-geenin promoottori. Advanced paksusuolisyöpä potilaalla on ilmaus sekä HIF-1α ja P-gp olivat vastustuskykyisempiä kemoterapiaa kuin ulkopuolisten ilme.

Johtopäätökset

HIF-1α-salpaaja vähentää monilääkeaineresistenssin paksusuolen syöpäsoluissa kautta downregulation MDR1 /P-gp. Ekspression HIF-1α ja MDR1 /P-gp voidaan käyttää ennustavan markkerina kemoterapian resistenssin paksusuolen syöpä.

Citation: Chen J, Ding Z, Peng Y, Pan F, Li J, Zou L, et ai. (2014) HIF-1α-salpaaja vähentää monilääkeaineresistenssin in koolonkarsinoomasoluissa kautta alassäätely MDR1 /P-glykoproteiinin. PLoS ONE 9 (6): e98882. doi: 10,1371 /journal.pone.0098882

Editor: Michal Zmijewski, Medical University of Gdańsk, Puola

vastaanotettu: 7. joulukuuta 2013 Hyväksytty: 08 toukokuu 2014; Julkaistu: 05 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (No.30973430 ja No.81101629). (https://isisn.nsfc.gov.cn/egrantweb/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Colon syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia kaikkialla maailmassa, ja kemoterapiaa on tärkeä rooli sen hoidossa. Kuitenkin herkkyys eri kemoterapeuttisten hoito vaihtelee suuresti yksilöittäin. Monet syöpäpotilaat kehittyy lääkeresistenssi, joka johtaa huonoon hoitotuloksia. Lisäksi lääkeresistenssin esiintyy useimmiten kiinteitä kasvaimia in vivo, mutta ei yksikerrosviljelmiin in vitro [1]. Kasvain microenvironment on keskeinen rooli kemoterapiassa epäonnistuminen ja lääkeresistensseihin [2] – [4].

Hypoksia on yhteinen piirre monissa pahanlaatuisia kasvaimia, kuten paksusuolen syöpä. Niukkahappiseen kasvain mikroympäristölle pidetään yhä kriittinen osa määritettäessä lääkeresistenssin [5], [6]. Hypoksia indusoituvat tekijä-1 (HIF-1) on avaintekijä muuttamalla biologisia ominaisuuksia kasvaimia. HIF-1α-proteiini on yli-ilmentynyt useissa eri ihmisen syövän ja liittyy huonompi ennuste monissa syövissä. Vaikka monet tutkimukset ovat osoittaneet, että hypoksia voimistaa kasvaimen vastustuskykyä kemoterapiaa ja sädehoitoa [7], [8], miten hypoksinen microenvironment myötävaikuttaa syöpälääkettä vastus ei ole vielä vahvistettu.

moniresistenssin (MDR) on yksi tärkeimmistä syistä, miksi kemoterapia-pohjainen hoito vika. Niistä monet mekanismit MDR, korkea ilmentyminen ihmisen MDR1-geenin ja P-glykoproteiinin (P-gp) kuljettaja koodaama MDR1 on tärkeä tutkimuksen painopiste [9]. Kasvainsoluja jotka yli-ilmentävät MDR1 /P-gp yleensä vastustuskykyisiä erilaisia ​​kemoterapeuttisia [10], [11]. Edellisessä tutkimuksessa osoitettiin, että HIF-1α-proteiinin ekspressio korreloi MDR1 /P-gp: n ilmentymisen paksusuolen syöpä kudoksen ja koolonisyöpäsolulinja, ja mRNA: n ilmentymisen tasoja HIF-1α ja MDR1 ovat huomattavasti korkeammat samantyyppistä solujen hypoksinen olosuhteet kuin happiolosuhteissa [12]. Jää epäselväksi, onko ja miten HIF-1α on mukana MDR paksusuolen syövän kautta vuorovaikutus MDR1 /P-gp: n.

Exploring vaikutusta hypoksia paksusuolensyöpä MDR auttaa parantamaan vaikutusta kemoterapiaa. Vuonna hypoksinen microenvironment, oletamme, että HIF-1α voivat suoraan indusoida MDR1 /P-gp: n, joka johtaa MDR, ja kääntyminen paksusuolen syövän MDR voidaan saavuttaa, kun HIF-1α ilmentyminen on spesifisesti estyy. Tässä tutkimuksessa, pyrimme tutkia mahdollisuuksia molekyylitason mekanismeja ja toteutettavuus kääntää paksusuolen syövän MDR keskittymällä kohdegeenin HIF-1α. Odotamme tarjota teoreettisen pohjan ja kokeellista näyttöä myöhemmin liittyvien sovellusten kliinisen hoidon.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen koolonisyöpäsolulinja LoVo saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) ja niitä viljeltiin korkean glukoosin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Gibco, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (HyClone, USA) ja antibiootteja (1% penisilliini ja 1% streptomysiiniä). Sillä hypoksia altistuminen, soluja viljeltiin 24 tuntia modulaattori inkubaattorissa kammiossa 37 ° C: ssa 1% O

2, 5% CO

2, ja 94% N

2. Monisoluisten sferoidit (MCS) saatiin käyttämällä nestemäistä overlay tekniikkaa [13]. Lyhyesti, eksponentiaalisesti kasvavia LoVo-soluja lisättiin viljelyalustaan ​​levyjä, jotka oli aiemmin päällystetty 2% agaroosia. Levyt varovasti ja vaakasuunnassa pyöritetään 10-15 minuuttia per 2-3 tuntia ensimmäisen 24 tunnin ajan ja sitten 10 minuuttia 4 tunnin välein. Asianmukaiset väliaine päivittyy joka toinen päivä. Sillä hypoksia kokeiluja, asianmukainen MCS perustettiin vuonna normoksia 48 tuntia ja sen jälkeen viljeltiin hypoksia vielä 24 tuntia.

Kemikaalit

adriamysiini (ADR, Hisun Pharmaceutica, Kiina), vinkristiini (VCR, Hisun Pharmaceutica, Kiina), 5-fluorourasiilin (5-FU, Sigma, MO, USA), tai irinotekaani (CPT-11, Hengrui Medicine, Kiina) olivat kaikki juuri valmistettu päivänä käyttöön liuottamalla tarvittava pitoisuus DMEM 10% naudan sikiön seerumia.

kemoterapeuttisia Herkkyys Pitoisuus

LoVo solut trypsinoitiin, suspendoitiin uudelleen ja laskettiin, ja 1000-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille joka aiemmin oli päällystetty 2%: isessa saada MCS normoksia. Hypoksian kokeissa, tarvittaessa MSC siirrettiin hypoksia 24 tuntia ja sitten inkuboitiin kaltevuus lääkkeiden pitoisuudet vielä 24 tuntia hypoksia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-z-yyli) -3, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT, BD Biosciences, NJ, USA) määritys. Levyjä inkuboitiin MTT 37 ° C: ssa 4 tunnin ajan, ja absorbanssi 490 nm: ssä mitattiin Model 550 Microplate Reader (Bio-Rad, CA, USA).

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA uutettiin TRIZOL-reagenssilla (Invitrogen, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käytetyt alukkeet olivat: 5′-GTTTGATTTTACTCATCCAT-3 ’ja 5′-TTCATAGTTCTTCCTCGG-3′ ja HIF-1α; 5’-CTTGGCAGCAATTAGAAC-3 ’ja 5′-TCAGCAGGAAAGCAGCAC-3′ varten MDR1; 5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA -3 ’ja 5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC -3 ”varten 18sRNA. Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi suoritettiin cDNA-synteesin (Takara, Dalian, Kiina). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green reaaliaikainen PCR-kittiä (TaKaRa). Kaikki normalizations tehtiin käyttäen 18sRNA tasoilla ja kannen muutokset laskettiin delta-delta-Ct-menetelmällä. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena biologisten rinnakkaisnäytettä.

Western blot -analyysi

Yhteensä proteiinia (50 ug) erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi. Sen jälkeen, kun proteiinin siirto polyvinylideenifluoridia mikrohuokoiset kalvot (Bio-Rad), membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa, ja inkuboitiin peräkkäin primaaristen vasta-aineiden (HIF-1α 1:500, P-gp: 1:200, p-aktiini 1 :5000), minkä jälkeen inkuboitiin fluoreskeiini-kytkettyä anti-hiiri (anti-kani) IgG (1:1000), ja sitten inkubointi anti-fluoreskeiini alkalinen fosfataasi-konjugoitu vasta-aine (1:5000). Kaikki vasta-aineet ostettiin Santa Cruz, CA, USA. Immuunikompleksien detektoitiin tehostetun kemiluminesenssin-reagenssia (Pierce, USA). Kvantifiointiin, signaalit olivat densitometrisesti normalisoidaan P-aktiini by Määrä Yksi kuva-analyysi-ohjelmisto (Bio-Rad).

HIF-1α siRNA Rakentaminen ja transfektio

Pre-miRNA RNAi sekvenssit kohde geenit HIF-1α ja MDR1 suunniteltiin ja syntetisoitiin. Kun kaksi erityistä miRNA RNAi ilmentämisvektorit, joissa reportterigeeni EmGFP kohdistaminen ihmisen HIF-1α ja MDR1-geenit, vastaavasti, rakennettiin ja tunnistettiin restriktioentsyymidigestiolla ja sekvensointi, RNAi-plasmidien HIF-1α ja MDR1 transfektoitiin LoVo-soluja käyttämällä liposomiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA). Vakaa positiiviset kloonit valittiin käyttäen blastisidiinia. Asteista knockdovvn HIF-1α ja MDR1 tunnistettiin PCR. RNAi plasmidit paremmalla tukahduttaminen vaikutuksia valittiin myöhempää rakentamista miRNA lentiviruksen ekspressiokloonien. Kaksi miRNA lentivirus kloonien, pLenti6 /V5-GW /EmGFP-miR-HIF-1α ja pLenti6 /V5-GW /EmGFP-miR-MDR1, konstruoitiin käyttäen Gateway rekombinaatiotekniikoita (Invitrogen) ja kotransfektoidaan 293FT solujen ViraPower pakkaus mix (Invitrogen). Titteri tutkittiin jälkeen tartuttamisesta NIH /3T3 virus supernatanttia. Sitten LoVo solut infektoitiin kahden lentivirusvektori välittämää miRNA RNAi järjestelmät ja vakaasti valitsemat blastisidiini.

Kromatiini Immunosaostaminen (chip)

Solut siirrettiin 100 mm: n läpimittaiset ruokia ja 24 tunnin jälkeen, inkuboitiin 1% formaldehydiä 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa cross-link proteiinien DNA: ta. Silloitus Reaktio pysäytettiin lisäämällä yksi kymmenesosa tilavuudesta 1,25 mol /l glysiiniä. Solut pestiin kahdesti jääkylmällä 1 x PBS; suspendoitiin uudelleen radioimmunosaostuskokeella puskuriin ja pidettiin jäissä 30 minuuttia. Sitten solulysaatteja sonikoitiin jäillä kanssa Hielscher UP200S ultraääni sonikaattorilla (Hielscher Ultrasonics GmbH, Saksa), kunnes silloitetun kromatiini jauhettiin, jolloin saatiin DNA-fragmenttien välillä 200 ja 1000 bp. Supernatantteja sekä lohen sperman DNA /proteiini-50% agaroosia lietteen vähentää ei-spesifisen tausta. Immunosaostus suoritettiin sitten yön yli 4 ° C: ssa 5 ug anti-HIF-1α-vasta-ainetta (Santa Cruz, CA, USA). Nämä supernatantit täydennetty 5 mol /l NaCl: a ja kuumennettiin yön yli 65 ° C: ssa taakse proteiini-DNA-cross-linkkejä. Immunokompleksien käsiteltiin lisäksi DNaasi-vapaa ja RNaasi-vapaata proteinaasi K, ja DNA puhdistettiin fenoli /kloroformi-uutolla ja etanolisaostuksella. PCR suoritettiin alukkeilla, jotka ovat spesifisiä alueelle, joka sisältää hypoksian reagoiva edistäjän päällä (5′-GCGTG-3 ’), että MDR1-promoottorin [14]. Käytetyt alukkeet olivat seuraavat: 5’-GGAGCAGTCATCTGTGGTGA-3 ’ja 5′-CTCGAATGAGCTCAGGCTTC-3’. Kuten aikaisemmin on raportoitu [24], ihmisen verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF, vakiintunut HIF-1 kohdegeenin) käytettiin positiivisena kontrollina ja alukkeita, jotka reunustavat hypoksian reagoiva tehostajana VEGF-promoottori olivat 5′-GCCTCTGTCTGCCCAGCTGC-3 ’ja 5 ”-GTGGAGCTGAGAACGGGAAGC-3 ’. Immunosaostus ei-spesifistä lgG: tä (Santa Cruz) suoritettiin negatiivisena kontrollina. Näyte edustaa lineaarisen vahvistuksen koko panos DNA: ta käytettiin lisäämisen valvonta.

Detection Apoptoosin virtaussytometrialla (FCM) B

Solut valmistettiin ja käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla ja sen jälkeen värjättiin allofykosyaniini (APC) konjugoitua anneksiini V ja propidiumjodidi (PI) 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, mukaan valmistajan ohjeiden (anneksiini V-APC /PI Apoptosis Detection Kit, Jingmei Biotech, Kiina). Väestön anneksiini V-negatiivinen elinkelpoinen ja anneksiini V-positiivisten apoptoottiset solut arvioitiin FCM. Tiedot kerättiin FACSCalibur väline (BD Biosciences) ja analysoitiin käyttäen CellQuest ohjelmistoa (BD Biosciences).

Potilaille ja kasvain näytteet

Satakaksikymmentä Histologisesti vahvisti kehittyneen paksusuolen syöpä ja jolle tehtiin 5-FU-kemoterapian Lounais sairaala, kolmas Military Medical University, Chongqing, Kiina, vuosien 2004 ja 2008 olivat oikeutettuja tähän tutkimukseen. Tämä tutkimus tarkasteli ja hyväksynyt eettinen ja pöytäkirjan arviointikomiteaan Southwest Hospital, kolmas Military Medical University ja kaikille potilaille tarjotaan kirjallisen suostumuksensa muotoon. Potilaat olivat ikä 30-79 vuotta (keski-ikä, 54 vuotta); 73 oli miehiä ja 47 oli naisia. Kemoterapia vaste arvioitiin TT tai muu radiologisesti keinoja kahden hoitokierron, hyväksymisestä Response arviointiperusteet kiinteitä kasvaimia Group kriteerit. Perustuen niiden kemoterapia vaste, potilaita vaste todettiin tai ei-vastetta. Kudosnäytteet kiinnitettiin 10% formaliinilla, upotettiin parafiiniin ja leikattiin 4 um leikesarjojen. Ekspression HIF-1α: n ja P-gp tutkittiin immunohistokemiallisesti kuten aiemmin on kuvattu [12]. Kirkas ruskea-keltainen värjäytyminen rajoittuu ytimet, sytoplasmaan tai solukalvon osoitti positiivista ilmentymistä HIF-1α tai P-gp. Positiivinen ilmaus kirjattiin (+) ja negatiivinen ilmaus kuten (-).

Tilastollinen analyysi

Kaikki luvut ovat keskiarvona ± SD. Tulokset analysoitiin chi-neliö testi, t-testiä, ja yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA).

p

0,05 pidettiin merkittävänä. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS versio 13.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Tulokset

LoVo MCS ovat vastustuskykyisempiä Kemoterapia kuin yksittäiskerroksina Hypoxic Ehdot

matkia hypoksinen microenvironment kasvaimen in vivo [15], [16], LoVo MCS saatiin käyttämällä neste overlay tekniikkaa. LoVo solut agglomeroitu keskenään ja lisääntyneet nopeasti. Oltuaan viljeltiin 48 tunnin ajan, LoVo MCS koostuivat useiden yhteenpuristettu soluja (kuvio 1 B). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR osoitti, että ilmentyminen HIF-1α oli merkitsevästi korkeampi LoVo MCS kuin LoVo yksisolukerroksissa, paitsi hypoksinen olosuhteissa, mutta myös normoksia (

p

0,05) (kuvio 1 C). Lääkeherkkyyksiä 5-FU arvioitiin, ja tulokset osoittivat, että LoVo MCS olivat resistenttejä 5-FU kuin olivat yksittäiskerroksina hypoksian (

p

0,05). Lisäksi sekä LoVo MCS ja yksisolukerrokset olivat vastustuskykyisempiä 5-FU hypoksinen olosuhteissa kuin normoksia (kuvio 1 D).

(A) Morfologia LoVo yksikerroksia. Mittakaava = 50 pm. (B) Morfologia LoVo MCS. Mittakaava = 50 pm. (C) Quantitative real-time PCR havaittu HIF-1α mRNA: n ekspression LoVo MCS ja yksikerrosviljelmiin alle normoxic ja hypoksinen olosuhteet. 18sRNA tasot käytettiin sisäisen valvonnan ja taitekohdan muutokset laskettiin delta-delta Ct menetelmällä. Kokeet suoritettiin kolmena biologisten rinnakkaisnäytettä ja PCR kullekin geenille tehtiin kaksoiskappaleet (*

p

0,05). (D) lääkeherkkyyksiä (keskiarvo ± SD, n = 3) Lövön MCS ja LoVo yksisolukerrokset 5-FU hypoksia tai normoksia (*

p

0,05, N: normoksia, H: hypoksia).

HIF-1α-salpaaja vähentää monilääkeaineresistenssin LoVo MCS

Koska LoVo MCS osoittivat suurempaa vastustuskykyä kemoterapiaa kuin yksisolukerroksiin teki hypoksia, halusimme tutkia lääkeresistenssin muuttui kun HIF- 1α ilmentyminen inhiboitui spesifisesti. Me muodostanut LoVo MCS malli ja vakaa LVV-HIF-1α ja LVV-MDR1 miR-tartunnan ryhmiä. Vuonna hypoksisissa olosuhteissa, herkkyys LoVo MCS kemoterapian kanssa kunkin neljän lääkkeiden vähentynyt eriasteisesti. 50% -inhibiting konsentraatio (IC

50) arvot hypoksinen ryhmässä olivat kaikki korkeampia kuin vuonna normoxic ryhmässä (ADR, videonauhuri, ja 5-FU,

p

0,01; CPT- 11,

p

0,05) (kuvio 2). Vaimentamisen jälkeen HIF-1α-geeni, herkkyyttä LoVo MCS kaikkiin neljään kemoterapiaa huumeiden palautettiin eri tahtiin. Suhteellinen kääntyminen suhde LVV-HIF-1α miR-tartunnan ryhmä (hypoksia) ja MCS (hypoksia) kunkin lääke oli seuraava: ADR, 82,8% (

p

0,01); Videonauhuri, 83,8% (

p

0,01); 5-FU, 70,7% (

p

0,01); ja CPT-11, 48,5% (

p

0,05). Vaimentamisen jälkeen MDR1-geenin suhteellinen kääntyminen suhde LVV-MDR1 miR-tartunnan ryhmä (hypoksia) ja MCS (hypoksia) kunkin lääke oli seuraava: ADR, 74,2% (

p

0,01) ; Videonauhuri, 70,9% (

p

0,01); 5-FU, 58,1% (

p

0,05); ja CPT-11, 15,2% (

p

0,05).

(A) ADR. (B) videonauhuri. (C) 5-FU. (D) CPT-11. (E) IC50 eri LoVo MCS ryhmien kemoterapeuttisia (keskiarvo ± SD, n = 3, **

p

0,01, *

p

0,05, N: normoksia, H : hypoksia).

HIF-1α esto Parantaa indusoiman apoptoosin kemoterapia Drugs LoVo MCS

sitten havainneet indusoiman apoptoosin kemoterapiaa huumeita LoVo MCS kun HIF-1α ilme inhiboitui spesifisesti. Analyysi apoptoosin FCM osoittaneet (kuvio 3), verrattuna LoVo MCS alle happiolosuhteissa, apoptoottisen tasot aiheuttama neljä lääkkeet olivat kaikki alemmat eriasteisesti hypoksia ryhmässä (ADR, videonauhuri, ja 5-FU,

p

0,01, CPT-11,

p

0,05). Sen jälkeen tehokkaasti hiljentäminen kohdegeenin HIF-1α, indusoitunut apoptoosi tasolla ADR, videonauhuri ja 5-Fu oli huomattavasti lisääntynyt (

p

0,01) ja oli 9,2-kertainen, 7,4-kertaiseksi, ja 2.6- kertaiseksi toisin kuin LoVo MCS (hypoksiaa ryhmä). Kuitenkin apoptoosin taso aiheuttama CPT-11 oli vain 1,1-kertaiseksi hypoksia ryhmä, jolla ei ole tilastollista merkitystä (

p

0,05).

osuus anneksiini V-positiivisia apoptoottisia soluja (alempi oikea neljänneksessä) arvioitiin virtaussytometrillä käyttämällä anneksiini V: allofykosyaniini (APC) ja propidiumjodidilla (PI) värjäys LoVo MCS-hoidon jälkeen (B) ADR (25 ug /ml), (C) VCR (25 ug /ml), (D) 5-FU: ta (200 ug /ml) ja (E) CPT-11 (200 ug /ml). Käsittelemättömiä soluja käytettiin negatiivisena kontrollina. Tiedot kunkin tilastollisen kuvaajan anneksiini V-APC /PI värjäytymistä ilmaistu% solujen oikeanpuoleiseen alanurkkaan ja edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Palkki kaavioita alareunassa virtaussytometrialla scatterplots edustavat% apoptoosin alaisten solujen oikeassa alakulmassa neljännekseen (**

p

0,01, N: normoksia, H: hypoksia).

MDR1 /P-gp Protein Expression on Alennettu LoVo MCS jälkeen LVV-HIF-1α miR transfektio vuonna Hypoksia

tutkia mahdollisuuksia molekyylimekanismeihin kääntää MDR keskittymällä kohdegeenin HIF- 1α, havaitsimme ilmaus MDR liittyvien geenien LoVo MCS kun HIF-1α ilmentyminen inhiboitui spesifisesti. Western blot osoitti, että ilmentyminen HIF-1α: n ja P-gp LoVo MCS on merkittävästi parannettu hoidon jälkeen 24 tuntia hypoksian (

p

0,01). Kun HIF-1α pudotettiin vuonna LVV-HIF-1α miR tartunnan MCS, sekä HIF-1α ja P-gp-proteiinin ilmentyminen säädeltiin vähentävästi verrattuna negatiiviseen kontrolliryhmään (

p

0,01). Ja siinä LVV-MDR1 miR tartunnan MCS, proteiinin ekspressiotaso HIF-1α havaittu eroa, kun taas P-gp väheni merkittävästi verrattuna negatiiviseen kontrolliryhmään (kuva 4). Tulokset osoittivat, että MDR1 oli alavirtaan geenin HIF-1α ja MDR1 /P-gp lauseke vähenee LoVo MCS kun HIF-1α estyi.

(A) Western blot analyysit tehtiin. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. (B) Suhteellinen proteiinin tasot (keskiarvo ± SD, n = 3) ja HIF-1α: n ja P-gp määritettiin kussakin ryhmissä (**

p

0,01, N: normoksia, H: hypoksia) .

MDR1 /P-gp: n mRNA ja Protein Expression vähenevät LoVo Yksikerrokset jälkeen LVV-HIF-1α miR transfektio vuonna Hypoksia

Koska MDR1 /P-gp-proteiinin ilmentyminen väheni LoVo MCS jälkeen LVV-HIF-1α miR transfektion me edelleen havaittu ilmentymistä MDR liittyvien geenien LoVo yksittäiskerroksina hypoksia. Sen jälkeen vakaasti tartuttamisesta LoVo yksittäis- kerroksissa LVV-HIF-1α miR ja LVV-MDR1 miR, Quantitative real-time PCR ja Western blot (kuvio 5) osoitti, että hypoksia, mRNA ja proteiini ekspressiotasot HIF-1α ja MDR1 että LVV -HIF-1α miR ryhmä olivat merkittävästi alhaisemmat kuin ei-käsitellyn ja negatiivinen kontrolli miR ryhmät (

p

0,01). Kuitenkin LVV-MDR1 miR ryhmä, vain mRNA ja proteiinin ilmentyminen tasoilla MDR1 geenin olivat tilastollisesti matalampia kuin ei-käsitellyn ja negatiivinen kontrolli miR ryhmien hypoksian (

p

0,01) , kun taas mitään eroja HIF-1α mRNA ja proteiini havaittiin (

p

0,05).

(A, B) Quantitative real-time PCR havaittu HIF-1αor MDR1 mRNA: n ekspression LoVo yksikerroksia (hypoksia) ja LVV-HIF-1α miR (A) tai LVV-MDR1 miR (B) vakaasti transdusoiduilla. Käsittelemättömien yksittäiskerroksina normoksia käytettiin normoxic ohjaus. 18sRNA tasot käytettiin sisäisen valvonnan ja taitekohdan muutokset laskettiin delta-delta Ct menetelmällä. Kokeet suoritettiin kolmena biologisten rinnakkaisnäytettä ja PCR kullekin geenille tehtiin kaksoiskappaleet (**

p

0,01). (C-F) Western blot havaittu HIF-1α: n ja P-gp-proteiinin ilmentymisen LoVo monolayers (hypoksia), jossa LVV-HIF-1α miR (C) tai LVV-MDR1 miR (E) transdusoitu stabiilisti. Käsittelemättömien yksittäiskerroksina normoksia käytettiin normoxic ohjaus. (D, F) vertailu ekspressiotasoja (keskiarvo ± SD, n = 3) ja HIF-1α ja MDR1-proteiinin kunkin ryhmän (**

p

0,01).

sitoutuminen HIF-1α, että MDR1 geenipromoottorin

hyödynnetään sitten siru määrityksessä arvioimaan LoVo MCS (sekä normoksia ja hypoksia) onko HIF-1α sidottu promoottorialueen MDR1-geenin. Saostuksen jälkeen solulysaattien tietyn anti-HIF-1α vasta-aineen MDR1-geenin promoottori ja VEGF-geenin promoottorin (vakiintunut HIF-1 kohdegeenin) monistettiin PCR: llä alukkeita. Tulokset (kuvio 6) osoitti, että HIF-1α sitoutui MDR1 geenin promoottori LoVo MCS paitsi hypoksinen olosuhteissa, mutta myös normoxic olosuhteissa.

sitoutumisen HIF-1α on MDR1 ja VEGF-geenin promoottorit mitattiin siru. PCR analyysi MDR1-geenin promoottorialue suoritettiin immunosaostus näytteistä (IP) anti-HIF-1α-vasta ja puhdistetulla kokonaispanos DNA LoVo MCS (normoksia ja hypoksiaa). VEGF-geenin promoottori (vakiintunut HIF-1 kohdegeenin) käytettiin positiivisena kontrollina. Immunosaostus ei-spesifistä lgG: tä suoritettiin negatiivisena kontrollina. Näyte edustaa lineaarisen vahvistuksen koko panos DNA: ta käytettiin lisäämisen valvonta.

Potilaat, joilla HIF-1α (+) /P-gp (+) ovat vastustuskykyisempiä Kemoterapia

Meidän edellinen tutkimus on osoittanut, että HIF-1α ja MDR1 /P-gp: n ekspressiotasot korreloivat kasvaimen kudoksissa paksusuolen syöpä [12]. Sen määrittämiseksi, onko ilmentymisen HIF-1α ja MDR1 /P-gp paksusuolen syövän potilaille vaihtelee, sekä siihen liittyvä herkkyys kemoterapia, immunohistokemiallisia tekniikoita käytettiin havaitsemaan ilmentymisen HIF-1α: n ja P-gp kasvainkudoksessa 120 potilasta, joilla on edennyt paksusuolen syöpä, joka sai 5-FU-kemoterapiaan. Olemme havainneet, että 73 120 tapausta (60,8%) ilmaistuna sekä HIF-1α: n ja P-gp, ja tämä HIF-1α (+) /P-gp: n (+) potilasryhmässä oli resistenttejä kemoterapialle kuin oli HIF-1α ( -) /P-gp (-) väestö (

p

= 0,001, OR 5,647, 95% CI 1,920-+16,606) (taulukko 1).

keskustelu

Meidän edellinen tutkimus osoitti, että HIF-1α-proteiinin ilmentyminen korreloi P-gp ilmentymisen paksusuolen syöpä kudoksiin ja koolonsyöpäsolulinjaa, ja HIF-1α ja MDR1 mRNA: t todettiin olevan huomattavasti suurempi samassa soluissa hypoksisissa olosuhteissa kuin alle happiolosuhteissa [12]. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että HIF-1α voi vaikuttaa suoraan ilmentymistä MDR1 /P-gp hypoksinen mikroympäristössä ja sitten välittää kemoterapian resistenssin, ei ainoastaan ​​viljellyissä yksisolukerrosten mutta myös monisoluisten sferoideja, ja HIF-1α: n inhibointi voi kääntää monilääke vastus kautta downregulation MDR1 /P-gp. Paljon näyttöä on osoittanut, että hypoksinen mikroympäristön on edistänyt ja ylläpitoon syöpien [17]. Lisäksi syöpäsoluja hypoksinen olosuhteissa näyttää enemmän vastustuskykyä antineoplastisia lääkkeitä [18], [19]. Jotkut tutkimukset, jotka ovat yrittäneet selittää ilmiön ovat havainneet, että solut hypoksinen olosuhteissa yleensä jakaa hitaammin kuin normoxic olosuhteissa tekee hoitoja, jotka kohdistuvat nopeasti lisääntyviä soluja tehottomampi [17]. Samaan aikaan tutkimus osoitti, että hypoksia voivat aiheuttaa useita geenejä, mukaan lukien MDR1 /P-gp, monisoluisista pallosia [16]. Tutkimuksessamme havaitsimme, että HIF-1α sidottu MDR1 geenin promoottori LoVo MCS paitsi hypoksinen olosuhteissa, mutta myös normoxic olosuhteissa.

muodostanut LoVo MCS malli matkia hypoksinen microenvironment kasvainten in vivo. Kemoterapia herkkyys ja apoptoottista muutokset LoVo MCS ADR, videonauhurin, 5-FU, ja CPT-11 tutkittiin normoksia ja hypoksia. Tulokset osoittivat, että kemoterapia herkkyydet ja apoptoosin LoVo MCS vastauksena neljään lääkkeet olivat kaikki laski eriasteisina hypoksinen olosuhteissa. Neljästä sytotoksisten lääkkeiden, 5-FU: n ja CPT-11 ovat yleisimmin käytetty paksusuolisyövän, kun taas vastustuskyky ADR ja videonauhuri ajatellaan liittyvän läheisesti MDR1 /P-gp: n [20]. Hiljentäminen HIF-1α-geenin palautti herkkyydet LoVo MCS ADR, videonauhurin, ja 5-FU ja indusoi merkittävän lisäämisen apoptoottisen taso kunkin vastaavan lääkkeen (

P

0,01). Nämä tulokset osoittavat, että lääkeaineen vastus LoVo MCS voidaan kumota yhdistelmä LVV-HIF-1α miR järjestelmä ja edellä huumeita. Tämä havainto on yhtäpitävä aikaisempia havaintoja, estämällä HIF-1α voi parantaa herkkyyttä kemoterapeuttisten aineiden syöpäsolut kuten fibrosarkoomaa, mahasyövän, ja rintasyöpä [21] – [23]. Koska Unruh

et

al.

[24] todettiin, että antiproliferatiivinen tehokkuus karboplatiinin ja etoposidin merkittävästi parantaa inaktivoimiseksi HIF-1α hiiren alkion fibroblasteissa, osuus HIF-1α ja lääkeresistenssi on havaittu erilaisten neoplastisten solujen viime vuosina [21], [25] – [29]. Kuitenkin saatavilla olevat tiedot suhteesta HIF-1α ja chemoresistance syöpäsolujen ovat ristiriitaisia. Esimerkiksi jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että inaktivointi HIF-1α in normoksia ei ole vaikutusta lääkevasteita neuroblastoomakasvaimissa ja keuhkojen adenokarsinoomasolua [30], [31]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös vaatineet vastuskuumennettavaan välittävä vaikutus HIF-1α, ainakin joissakin ihmisen syövissä [4]. Lisäksi löysimme oli suuntaus kohti suurempaa herkkyyttä jälkeen HIF-1α tai MDR1 esto, mutta kemoterapian herkkyys CPT-11 eivät olleet merkittävästi erilaiset, että LoVo MCS ryhmiä. Tulos osoitti, että mekanismi chemoresistance CPT-11 eivät riipu P-gp vaan meni läpi toisen reitin, kuten CPT-11 aineenvaihduntatuote SN-38 [32] – [34].

mekanismi, jolla HIF-1α vaikuttaa MDR on monimutkainen ja jäi epäselväksi. HIF-1α voi välittää MDR säätelemällä lääkevuoto-, muuttamalla solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen, estämällä DNA-vaurioita, tai uudelleenohjelmointi aineenvaihduntaan. Yhtenä tärkeimmistä jäsenistä ABC transporter perhe, MDR1 /P-gp vähentää solunsisäisiä pitoisuuksia sytotoksisten lääkkeiden aktiivisesti pumppaamalla huumeet pois soluista ja siten suojella syöpäsolujen niiden antituumorivaikutukset [35]. MDR1 on kohdegeenin HIF-1. Viime vuosina osuus HIF-1-välitteisen P-gp: n ilmaisun hypoksian indusoiman lääkeresistenssi on havaittu monissa kasvainsoluissa, kuten mahasyövän, gliooma, ja rintasyöpä [14], [21], [26 ], [36]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että ilmaus HIF-1α ja P-gp oli merkittävästi parannettu LoVo MCS hoidon jälkeen hypoksian. HIF-1α inhibition transfektoimalla soluja tietyn siRNA varten HIF-1α merkittävästi vähentynyt ilmentyminen MDR1 /P-gp: n mRNA: n ja proteiinin sekä LoVo yksisolukerroksista ja LoVo MCS. Lisäksi HIF-1α sitoutui MDR1 geenin promoottori suoraan. Olemme todenneet, että HIF-1α aktivointi voi suoraan indusoida MDR1 /P-gp: n ja sitten johtaa MDR.

Voit selvittää, onko ilmentymisen HIF-1α ja MDR1 /P-gp paksusuolen syöpäpotilaiden poikkeaa sekä siihen liittyvä herkkyys kemoterapia, immunohistokemiaa käytettiin ekspression havaitsemiseksi HIF-1α: n ja P-gp kasvainkudoksessa 120 potilailla, joilla on pitkälle edennyt paksusuolisyöpä, jotka saivat 5-FU-kemoterapiaan. Olemme havainneet, että 73 120 tapausta (60,8%) ilmaistuna sekä HIF-1α: n ja P-gp, ja tämä HIF-1α (+) /P-gp: n (+) potilasryhmässä oli resistenttejä kemoterapialle kuin oli HIF-1α ( -) /P-gp (-) väestöstä. Siksi HIF-1α /MDR1 voi olla lupaava kohde paksusuolessa syövän hoitoon, ja käänteinen paksusuolensyöpä MDR voidaan saavuttaa, kun HIF-1α /MDR1 ilmentyminen nimenomaan estetty. Ehdotamme, että ilmaus HIF-1α ja MDR1 /P-gp voidaan käyttää ennakoivaa markkerina kemoterapia vastarinnan paksusuolensyöpä.

Yhteenvetona me raportoimme että HIF-1α-salpaaja vähentää MDR paksusuolen syöpä solut, jotka on liitetty downregulation MDR1 /P-gp. Tuloksemme saattaa olla laaja kliininen vaikutuksia paksusuolen potilaalla on HIF-1α (+) /P-gp (+) ilmentyminen malleja, ja yhdistelmä hoitoja, joilla pyritään moduloiva HIF-1α ilmentyminen yhteistuumin tavanomaisen kemoterapian hoito voi antaa strategia voittaa kasvain vastus.