Krooninen sairaus

tiivistelmä

Oncocytic kasvaimet on tunnusomaista kertyminen morfologisesti epänormaali mitokondrioita niiden soluissa, mikä viittaa siihen, rooli epänormaali mitokondrioiden biogenesis in oncocytic solutransformaatio. Tiedetään vain vähän syy dysmorphology kertyneestä mitokondrioita. Proteiinit säätelevät morfologiaa mitokondrioita, The ”mitokondriot-muotoiluun” proteiinit, voivat moduloida niiden koko ja lukumäärä; kuitenkaan ei tiedetä tähän mennessä mahdollisesta osallistumisesta mitokondrioiden dynamiikan oncocytic solutransformaatiota kasvaimissa. Tavoitteena oli arvioida tilan mitokondrioiden morfologia ja sen rooli oncocytic solutransformaatio. Siksi arvioitiin ekspressiokuviota tärkeimmät mitokondrioiden fuusion ja fission proteiinien sarjan kilpirauhasen kasvain näytteet, sekä kilpirauhasen tuumorisolulinjoja, ja ilman oncocytic solujen ominaisuuksia. Ilmaisu mitokondrioiden fuusio (OPA1, Mfn1 ja Mfn2) ja fissiotuotteiden (Drp1 ja Fis1) proteiinien arvioitiin immunohistokemiallisesti (IHC) sarjassa 88 ihmisen kilpirauhasen kasvaimet.

In vitro

tutkimuksissa, vertailun helpottamiseksi ja syventää tutkimuksen, suoritettiin käyttäen TPC1 – papillaarinen kilpirauhassyövän solulinjaa-ja XTC.UC1, joka on oncocytic follikulaarisen kilpirauhassyövän-solulinjaa. Sekä IHC ja

in vitro

proteiini-analyysit osoittivat yleinen kasvu tasot ”mitokondrioiden-muotoiluun” proteiinien oncocytic kilpirauhasen kasvaimia. Lisäksi yli-ilmentyminen pro-fission proteiini Drp1 havaittiin liittyvän pahanlaatuisen oncocytic kilpirauhasen kasvaimet. Mielenkiintoista, geneettinen ja farmakologinen lukkiutuvat Drp1 toiminta on saattanut vaikuttaa kilpirauhasen syöpäsolut maahanmuuton /invaasio kyky, ominaisuus kasvaimen pahanlaatuisuuden. Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että epätasapainoinen mitokondrioiden dynamiikka luonnehtivat pahanlaatuinen ominaisuudet kilpirauhasen oncocytic kasvaimet, ja osallistua hankinnan vaeltavat fenotyypin.

Citation: Ferreira-da-Silva, Valacca C, Rios E, Pópulo H, Soares P, Sobrinho-Simões M, et al. (2015) Mitokondrioiden Dynamics Protein Drp1 yliekspressoituu Oncocytic Kilpirauhasen kasvaimet ja Säätelee Cancer Cell Migration. PLoS ONE 10 (3): e0122308. doi: 10,1371 /journal.pone.0122308

Academic Editor: Marc Liesa, Boston University School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 01 lokakuu 2014; Hyväksytty: 19 helmikuu 2015; Julkaistu: 30 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Ferreira-da-Silva et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli osittain tuettu hanke PIC /IC /83037/2007 (VM), hanke MFAG-12120 päässä AIRC ja GR-2011- 02351643 Italian terveysministeriön (SC). Lisärahoitusta saatiin hankkeen microenvironment, aineenvaihdunta ja syöpää sijoitettu IPATIMUP ja osittain tukee Programa Operacional Regional do Norte (ON.2-O Novo Norte), alle Quadro de Referencia Estratégico Nacional (QREN), ja sen kautta fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (EAKR). IPATIMUP on Associate laboratorio Portugalin tiede-, teknologia- ja korkeakoulutusministeri ja osittain jota Portugalin Foundation for Science and Technology (FCT). Tutkimus oli myös FCT kautta PhD apurahan AFS (Ref .: SFRH /BD /39104/2007).

Kilpailevat edut: mukana kirjoittamassa Luca Scorrano ei enää PLoS One toimitusneuvosto jäsen, vuodesta hän on eronnut ennen kirjoittajien jättämisestä. Siten mitään muuttaa tekijöiden noudattaminen PLoS One Pääkirjoitus politiikan ja kriteerit.

Johdanto

Syöpäsolut tiedetään tehdään muutos perusinsuliininsa metaboliareitit, prosessi kuvataan usein ”

Warburg vaikutus

”, jolloin jopa korkeassa happijännite ne tuottavat suurimman osan ATP glykolyysilla [1]. Tämä muutos aineenvaihdunnassa on raportoitu liitettävä muutosta mitokondrion morfologia ja koko, vaikka molekyyli- yksityiskohtia mukana morfologiset muutokset liittyvät Warburg vaikutus pysyvät selittämätön, myös koska tiedetään hyvin vähän siitä, miten mitokondrion morfologiaan säännellään [2,3 ]. Viime vuosina tunnistaminen tärkeimmistä osista mitokondrion dynamiikka kone, kasvava ryhmä proteiineja, jotka muun solun toimintoja säätelevät mitokondrioiden fuusio ja fissio. Mitokondrioiden dynamiikka toimintahäiriöitä on vähitellen paljastettiin useilla patologioiden, erityisesti neurodegeneratiivisten sairauksien ja syövän [4].

erityisen ryhmän muodostavat harvinaista kasvaimia on raportoitu lähes jokainen elin, jolla on korkeampi taajuus kilpirauhasen ja munuaisen [5,6]. Tällaiset kasvaimet ovat solujen selvä erittäin eosinofiilinen, rakeinen ja turvoksissa solulimassa, suuret ytimet ja näkyvästi nucleoli [7,8,9,10]. Elektronimikroskoopilla on osoittanut, että tämä turvoksissa ulkonäkö johtuu epänormaali kertyminen mitokondrioiden näyttämään epänormaali morfologia [11,12,13]. Nämä kasvaimet kuvataan oncocytic-, oxyphilic-, eosinofiilinen, ”Hürthle-solu (kun viitataan kilpirauhasen) kasvaimet” tai ”oncocytomas”. Jotta Yksinkertaisuuden vuoksi me nimitämme heidät ”oncocytomas” tai ”oncocytic kasvaimet” [10]. Tämänhetkisessä kliinisessä käytännössä Diagnoosin että oncocytic solun variantteja papillaarisen kilpirauhaskarsinoomaa (PTC) ja follikulaarinen kilpirauhasen karsinooma (FTC) sisältävät ydin- ominaisuudet, merkkejä Kapselipolysakkaridiantigeenin ja /tai verisuonten invaasio jotka ovat yhteisiä ei-oncocytic solukasvaimia samanlaista, sekä mitokondrioiden leviämisen tyypillistä oncocytic kasvaimet [5,6,7]. Itse asiassa tämä ajatus, että oncocytic muutos tapahtuu päälle ”perinteisten” kasvaimia tukena samanlainen geneettinen korjauksilla oncocytic karsinoomien ja niiden ei-oncocytic kollegansa, joka näyttää vertailukelpoista esiintyvyys eri geneettisen poikkeavuudet, kuten RET /PTC uudelleenjärjestelyt ja BRAFV600E mutaatiot [6,14,15,16,17,18]. Vaikka ensimmäinen suositukset huomioon kaikki oncocytic kilpirauhasen kasvaimet pahanlaatuisiksi myöhemmin tutkimukset ovat osoittaneet, että niin kauan kuin asiat oikein stratifioitiin niiden kliinis-patologisia piirteitä-, kuten potilaiden ikä, lavastus kasvainten ja kirurgiset procedure- ennusteen potilaiden jossa oncocytic solujen PTC ja FTC varianttien on samanlainen kuin potilailla, joilla on vastaavien tavanomaisten, ei-oncocytic karsinoomien [3,5,17,19].

tärkeimmät erot oncocytic ja ei-oncocytic kasvaimia oleskella taajuus vaihtelut löytyy mitokondriaalisen DNA (mtDNA) ja tuman DNA geenit koodaavat mitokondrion proteiineja [2,5,20,21]. Näiden suuri 5kb poistetaan, usein kutsutaan ”yhteinen poistaminen”, joka eliminoi useita mtDNA geenien ja häiritsee mtDNA replikaatioon ja transkriptioon, havaitaan usein oncocytic kilpirauhasen kasvaimet ja liittyy kasvuun mitokondrion massa [20, 22,23,24].

tiedot kirjaa viittaavat siihen, että mutaatiot oksidatiivinen fosforylaatio (OXPHOS) geenejä, nimittäin Complex I geenit, voi johtaa OXPHOS järjestelmän heikentynyt ja voi johtaa kertyminen epänormaali mitokondrioita [ ,,,0],20,25]. Käyttämällä bioinformatiikan välineitä, olemme hiljattain osoittaneet, että korkeat patogeenisuus mtDNA mutaatioita, nimittäin geenit Complex I johtaa oncocytic fenotyyppiin [21].

variantit translokaasin of Inner mitokondrion kalvon 44 homologi (TIMM44) että on osa mitokondrion proteiinin tuonti järjestelmä on myös kuvattu familiaalinen muodot oncocytic kilpirauhasen kasvaimet; Tämä viittaa siihen, että vapauttaminen mitokondrioiden tuonti koneita ja näin ollen myös mitokondrioiden toimintaa liittyvät epänormaaleihin mitokondrioiden biogeneesin [26].

Silmiinpistävä piirre kertynyt mitokondrioiden oncocytic kasvaimet on niiden epänormaali ultrastruktuuri ja morfologia. Tämä osoittaa sääntelyn purkamista myös proteiineja, jotka ohjaavat mitokondrioiden dynamiikkoineen ”mitokondriot-muotoiluun” proteiinit, prosessi riippuvainen mitokondrion fuusio ja fissio ja erottamattomasti mitokondrioiden biogeneesin, jakelu, signalointi ja apoptoosin [27,28,29]. Mielenkiintoista, epätasapaino mitokondriot fenotyypin kohti pirstoutumista orchestrates vaeltavia kykyä soluissa, joissa maahanmuutto on ratkaiseva fysiologinen, kuten T-lymfosyyttien ja kasvainsolujen metastaattisen solut [30,31]. Todellakin, jotta liikkuvuus olisi mahdollista, mitokondriot on hajanainen suosia niiden relocalization ja rekrytointi erityisiä subsellulaariseen alueille. Siinä tapauksessa, kasvainsolujen suora korrelaatio välillä on osoitettu metastaattista astetta ja Drp1 riippuvainen pirstoutuminen mitokondrioiden rintasyövän [31]. Mitokondrioiden fissio edellyttää sytosolin Dynamin liittyvä proteiini 1 (Drp1) ja sen mitokondrioiden reseptorit fissio 1 (Fis1), mitokondrioiden fissio tekijä (MFF) ja mitokondrio Division (Mid) 49 ja 51. Sitä vastoin ulkokalvon mitofusin (MFN) 1 ja 2 ja sisäkalvon Dynamin kaltainen proteiini optiikka surkastuminen 1 (OPA1), välittävät mitokondrioiden fuusio [32,33]. Huolimatta tunnetut mitokondrioiden morfologisten muutosten havaittiin oncocytic kasvaimet, tietoa tasoa ja rooli näiden mitokondrioiden-muotoiluun proteiineihin niukka. Siksi lähtivät tutkimaan jos mitokondrioiden dynamiikka on muuttunut oncocytic kilpirauhasen kasvaimet. Tuloksemme osoittavat, että mitokondrioiden fissio proteiinit Drp1 ja Fis1 ovat yliekspressoituvat oncocytic kasvaimet, ja että Drp1 ekspressiotasoja korreloi oncocytic kasvain pahanlaatuisen

ex vivo

ja muuttoa kyky sellaisen oncocytic kilpirauhasen tuumorisolulinja

in vitro

. Mielenkiintoista, geneettinen ja farmakologinen lukkiutuvat Drp1 vähentää kulkeutumista oncocytic kasvainsolulinjaa, joka tarjoaa uusia terapeuttisia lähestymistapa haitallisten metastaattisen oncocytic kasvaimia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Tämä tutkimus suoritettiin alle kansallisen eettisen ja säätelevä laki käyttöön biologisia näytteitä. Materiaalia käytetään tässä tutkimuksessa tulee ”Banco de Tecidos e Tumores” (kasvaimet ja kudokset Bank) ja Hospital de São João, Porto, joka kerää kaikki näytteet kirjallisesta tietoisen suostumuksen potilaiden tai heidän huoltajiensa siinä tapauksessa, että alaikäisille. Saada näistä näytteistä Tutkijoiden on esittää hankkeen eettisen komitean Hospital de São João hyväksyttäväksi. Meidän hanke on hyväksytty.

Patient valinta

sarja 88 kilpirauhasen kasvaimia noudetaan tiedostoja Patologian osasto of Hospital S. João (HSJ), Porto. Kilpirauhasen näytteet saatiin potilailta, joilla ikävaihtelu 15-83 vuotta ikää. Histologia Kaikkien Tuumorinäytteissä tarkistettiin itsenäisesti kahdella patologit (ER ja MSS) ja lopullinen Luokitus vastaa WHO: n kriteerien [34]. Diagnoosi kilpirauhasen kasvaimet olivat seuraavat: follikulaarinen kilpirauhasen adenooma (FA, n = 19, 12 oncocytic ja 7 ei-oncocytic), follikulaarinen kilpirauhasen karsinooma (FTC, n = 7, 1 oncocytic ja 6 ei-oncocytic), follikulaarinen variantti papillaarisen kilpirauhaskarsinoomaa (FVPTC, n = 30, 8 oncocytic ja 22 ei-oncocytic), tavanomainen papillaarinen kilpirauhasen karsinooma (CPTC, n = 32, 9 oncocytic ja 23 ei-oncocytic).

Koska lyhyen seuranta tapauksista mukana tässä sarjassa ja siitä johtuvat rajoitettu määrä kuolemaan tapahtumia, eloonjäämiseen ei analysoitu. Tämä tutkimus suoritettiin alle kansallisen eettisen ja säätelevä laki käyttöön biologisia näytteitä.

Tissue Microarray (TMA) B

edustaja erilaisia ​​alueita vaurioiden huolellisesti valittu hematoksyliinillä ja eosiinilla värjättyjen osat ja merkittiin yksittäisiin parafiinilohkoihin. Kaksi kudoksen ytimet (3 mm halkaisijaltaan kussakin) hankittiin kaikki valitut näytteet ja ne tarkasti talletetaan kahtena TMA vastaanottajan parafiiniblokit käyttäen kudosta array väline (Beecher Instruments, Silver Spring, MD), kuten on kuvattu muualla [35]. Kussakin kudoksessa microarray lohkon alueita ei-neoplastisten kilpirauhasen kudoksessa myös kontrolleina. Useiden 3 um: n leikkeitä leikattiin TMA lohkot ja siirretään ultrafrost dioja.

immunohistokemiallinen analyysi

immunohistokemiallinen analyysi (IHC) tehtiin 3 um formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut leikkeet. Kohdat poistettiin parafiini ja rehydratoitiin sarjassa pienenee etanolipitoisuus ratkaisuja. Parafiini yksittäinen näytteet sekä TMA kohdat sovellettiin lämmön aiheuttamalle antigeeni haku joko 10mM pH 6 sitraattipuskurissa (natriumsitraatti) tai 1 mM pH 8 etyleenidiamiinitetraetikkahappoa puskuria (EDTA) (LabVision Corporation, Fremont, CA, USA), joka mikroaaltouuni asetettu 300watts 10 minuuttia.

Kun haku ratkaisuja oli jäähtynyt, kudokset joutuivat 10 minuuttia estämällä endogeenisen peroksidaasin aktiivisuuden ja ei-spesifisen sitoutumisen kanssa 3% H

2O

2 ja suuresta määrästä Ultra V Block-reagenssilla (Thermo Scientific /Lab Vision, Fremont, USA) riippuen käytetyn ilmaisinjärjestelmän.

sitten leikkeitä inkuboitiin kosteutetussa kammiossa seuraavien ensisijaisen vasta-aineita ja sen mukaisesti jossa valmistajan ohjeiden: kanin polyklonaalinen vasta-aine on spesifinen Fis1 (1: 100) ref. ALX-210-907 Alexis Biochemicals, nyt Enzo Life Sciences (Farmingdale, New York, USA), hiiren monoklonaalisella vasta-aineella, joka on spesifinen Drp1 (1: 100) ref. 611112 ja hiiren monoklonaalinen vasta-aine, joka on spesifinen OPA1 (1: 100) ref. 612607, niin BD Biosciences (Franklin Lakes, New Jersey, USA), kanin polyklonaalinen spesifinen Mfn1 (1: 250) ref. sc-50330 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, USA), hiiren monoklonaalisella vasta-aineella, joka on spesifinen Mfn2 (1: 400) ref. 9927-M03 alkaen Abnova, (Jhongli City, Taiwan). Kontrollina mitokondrion sisällön hiiren polyklonaalinen vasta-aine, joka on spesifinen SDHA (1: 2000) ref. MS203, mistä Mitosciences, nyt Abcam (Cambridge, UK) käytettiin. Aiemmin testattu positiiviset kontrollit kilpirauhasen, rinta- ja lihasten olivat mukana kaikki vasta-aineet sarjassa. Negatiiviset kontrollit tehtiin korvaamalla ensisijainen vasta-nonimmune hiiren seerumia.

immunohistokemia tekniikka suoritettiin käyttäen leimattua streptavidiini-biotiini immunoperok- tunnistusjärjestelmä (Thermo Scientific /Lab Vision, Fremont, USA) tai Envision G /2 System /AP (K5355, Dako, Tanska) mukaan valmistajan ohjeiden.

MFN1 ja SDHA immunohistokemiallinen värjäys kehitettiin DAB (3,3′-diaminobentsidiini) alustaan. Jäljellä vasta Immunovärjäyksen suoritettiin tai Envision G /2 System /AP (K5355, Dako, Tanska), ja näytteet kehitetty pysyvä punainen kromogeenilla.

Immunovärjäys sokeasti semi-kvantitatiivisesti arvioida kaksi tarkkailijaa (VM ja AFS) tuntematta mitään kliinisiä tietoja tapauksista; IHC pisteet saatiin läpi summa värjäytymisen intensiteetti (0- poissa, 1- heikko, 2- kohtalainen, 3- voimakas), jonka laajentaminen värjätään kasvainsolujen (1-0 25%, 2-25 50% , 3-50 75%, 4- 75%). Arviointi prosenttiosuus immunoreaktiivisten solujen kaikki vasta-aineet tehtiin laskemalla 300 kasvainsolujen satunnaisessa aloilla. Kaikissa poikkeavia tapauksissa päästiin. Kuten mitokondrioiden merkki, ja keinona arvioida määrää mitokondrioissa SDHA ekspressiotasot saatiin käytettäväksi ja käytettiin normalisoimaan tuloksemme. Joka näyte, vertasimme proteiinien ekspression kohteisiin, sekä normaali- että kasvainkudoksessa, vastaan ​​SDHA värjäystä. Siten jokaisessa tapauksessa pystyimme arvioimaan yksittäisen ja täsmällisesti muutoksia proteiinin ekspression tutkimuksessa riippumatta määrästä mitokondrioissa merkitty SDHA ilmaisua.

Solulinjat

kilpirauhassyöpä solulinjoissa: TPC1 (ystävällisesti Dumont JE ja Mareel M-National Cancer Center Research Institute, Tokio, Japani), PTC-solulinjaa, ja XTC.UC1 (päässä Wong MG ja Savagner F- Leikkaus Service, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, Kalifornia), solulinja on saatu oncocytic variantti follikkelien karsinooma, käytettiin tässä tutkimuksessa. Molemmat solulinjat oli aiemmin tunnettu molekyylitasolla ja genotyyppisten taso [36,37]. TPC1 soluja viljeltiin RPMI Glutamaxilla täydennetty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS), 1% (v /v) Pen Strep ja 0,5% (v /v), fungitsonia (kaikki GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, USA); XTC.UC1 ylläpidettiin DMEM /F12 (GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, USA), johon oli lisätty 10% (v /v) FBS: ää, insuliinia 10 ug /ml, TSH on 10mU /ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA ), 1% Pen Strep (v /v) ja 0,5% (v /v) fungitsonia. Molemmat solulinjat autentikointia DNA-analyysi, jotka on saatu PowerPlex 16 (Promega, Madison, USA), mukaan DNA saatavilla American Type Culture Collection ja Health Science Research Resource Bank.

konstruktiot ja transfektiot

sytoplasmista GFP (ctGFP), mitochondrially kohdennetut dsRED (mtRFP), mitochondrially kohdennetut YFP (mtYFP) ja pcDNA3.1-HA-K38A-DRP1 plasmidit aiemmin kuvattu ja oli lahja T. Pozzan (Venetian Institute of Molecular Medicine, Padova, Italia) [33]. Tyhjät pcDNA3.1 saatiin BD-Clontech ja pcDNA3.1-HA-K38A-DRP1 plasmidi sukupolven aiemmin kuvattu [33]. XTC.UC1 solulinjat transfektoitiin ohimenevästi elektroporaatiolla käyttäen Neon transfektio System (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). In Kotransfektioita kokeissa 1.5μg Merkittyjen operaattorin (ctGFP in siirtokuoppaan kokeilut) plus 3 ug of pcDNA 3.1 tai pcDNA3.1-HA-K38A-DRP1 kohden käytettiin 2.0×10

6 solua. Erityinen yhdistelmä transfektoitujen plasmidien kussakin kokeessa on osoitettu kuviossa legendoja. 24 tunnin kuluttua transfektoidut solut lajiteltiin FACS ja käytettiin kokeisiin 24 tunnin kuluttua.

Kvantitatiivinen PCR

cDNA valmistamiseksi, 1 ng kokonais-RNA: ta käänteiskopioitiin käyttäen RevertAid ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi kit ( Fermentasilta, Burlington, ON, Kanada). Käänteistranskriptio tuotteet monistettiin kaikkien edellä mainittujen geenien qPCR käyttäen TaqMan PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Tietojen analysointi

Actin

ja

hCyclophilin

käytettiin endogeenisen valvonta (data näytetään vain aktiini). Tiedot ilmaistaan ​​suhteellisena ilmentymisen kunkin yksittäisen geenin normalisoitu vastaavan valvonnan.

ABI PRISM 7500 Fast Sequence Detection System (Applied Biosystems) käytettiin havaitsemaan monistuksen tasolla, ja on ohjelmoitu ensimmäinen askel 2 min 50 ° C: ssa, 10 min 95 ° C: ssa, jota seurasi 45 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C 1 min. 50 ng cDNA kutakin näytettä käytettiin ja kaikki siihen liitetyt tehtiin kolmena kappaleena. Suhteellinen kvantifiointi kohdegeenien määritettiin käyttäen ΔΔCT menetelmää, joka oli aiemmin validoitu Livak n lineaarinen regressio Menetelmä (slope¼0.0696) (Sequence Detector User Bulletin 2; Applied Biosystems).

Solunosafraktiointi ja immunoblottaus

Solunosafraktiointi suoritettiin, kuten on kuvattu Frezza

et ai

. [38]. Mitokondrioiden ja sytosolisia fraktioita saatiin ja blotattiin hiiren monoklonaalisella vasta-aineella anti-TOM20 (1: 5000) ref. FL-145 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, USA) ja vuohen polyklonaalinen vasta-aine anti-Actin (1: 2000) ref sc1616 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, USA). Solut lyysattiin RIPA-puskuriin, kun läsnä on fosfataasin ja proteaasi-inhibiittorit. Vastaavia määriä kokonaisproteiinia erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle (GE Healthcare, Little Chalfont, Englanti). Olemme käytetään ensisijaisena vasta, jo nyt viitannut immunohistokemia jaksossa (kaikki laimennoksella 1: 1000). Proteiinin havaitsemiseen, piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) ja luminesenssi järjestelmän (Perkin-Elmer, Foster City, USA) käytettiin. Kalvot uudelleen tutkittiin hiiren monoklonaalisella vasta-aineella anti-TOM20 (1: 5000) ref. FL-145 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, USA) hallinnasta Proteiinilisäyksen. Proteiinin ekspressio kvantitoitiin käyttäen Bio-Rad Määrä One 1-D analyysi ohjelmisto.

elektronimikroskopialla

Solut valmistettiin käyttäen tavanomaista elektronimikroskoopilla kiinnitys menettelyä ja kuvat otettiin käyttäen Technai 20 ( FEI, Eindhoven, Alankomaat). Erot mitokondrioissa kooltaan solulinjoja laskettiin koko mitokondrioiden pinta-ala. Vähintään 15 mitokondrioita mitattiin solua kohti ja vähintään 5 erilaista solua kohti näytteen satunnaisesti käytettiin koon mittaus. Kaikki kokeet tehtiin kolmena kappaleena.

Mitokondrioiden verkko kuvantamisen

määrällisesti rakenteellinen mitokondrion verkon pirstoutumista, soluja kasvatettiin lasipohjaisella ruokia, transfektoitu mitokondrioiden kohdennettuja keltaista ja punaista fluoresoivaa proteiinia, mtYFP ja mtRFP vastaavasti, ja 24 tunnin jälkeen kiinnitettiin jääkylmällä 3,7% formaldehydiä 30 minuutin ajan. Solut, jotka ilmentävät mtRFP oli kuvattu kanssa Zeiss 510 META konfokaali laserkeilauksen mikroskoopin avulla Plan-Apochromat 100 /1.46NA tavoite, jossa on 2x digitaalinen zoom (viritys 561 nm, emissio tallennetaan edellä 575nm. Jokaisesta solulinjasta tai tila ainakin 25 satunnaisesti valitut solut kuvattiin ja määrällisesti käyttäen sen mitokondrioiden verkkoon. 100X Plan-Apochromat (1.46NA) tavoite ja 2x zoom käytettiin kuvan yhden soluihin. Digitaaliset kuvat prosessoitiin käyttäen ImageJ 1,47 (US National Institutes of Health-NIH, Bethesda, MD, USA).

Scratch-haavan määritys

Solut kasvatettiin lähes 90% konfluenssiin 6 kuoppalevyillä. Under aseptisesti olosuhteissa ohut ”haava” otettiin käyttöön raaputtamalla 10 ui pipetillä kärki ja irrottaa solut huuhdeltiin PBS: llä. käyttämällä vaihekontrasti perustaa ja 40x yhteensä suurennos kuvia otettiin joka 5. minuutti yhteensä 15 tuntia. Viisi eri mittausta per kenttä tehtiin käyttämällä otetut kuvat 0, 3, 6 , 9, 12 ja 15 tuntia käyttäen ImageJ ohjelmistoa. Tarkempia tietoja tätä menetelmää on aiemmin julkaistu [39]. Kuvat prosessoitiin ImageJ ohjelmiston.

Migration /invaasion määritykset

Väliaikaisesti transfektoidut TPC-1 ja XTC.UC1 solut suspendoitiin uudelleen seerumittomaan RPMI ja DMEM /F12: lla, jossa on 0,1 % FBS ja kylvetään ylempi kamari siirtokuoppaan 12-kuoppalevylle (Corning Costar). Transvvell- levyt esipäällystetty 5 ug /ml fibronektiiniä (F2006-1MG, Sigma Aldrich), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 4 tuntia. Sitten levyjä huuhdeltiin PBS1x pH: ssa 7,4, ennen kuin lisätään 100,000 solua per kuoppa. Alakammioissa täytettiin vastaavassa elatusalustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. 12 tunnin kuluttua määrityspuskuria, Transvvell- kalvot leikattiin, ylösalaisin ja värjättiin DAPI lasilevyllä. Ytimet näkyvissä on alaspäin membraanin laskettiin. Vähintään 5 eri alojen laskettiin kunkin kuvan ja kolminkertaisessa tehtiin kullekin koeasetelmassa. Mdivi1 estäjää käytettiin 50 uM perustuu aikaisempien julkaistujen tietojen ja ilman havaittavia toksisia tai stressi solujen muutoksia [40]. Ei eroja ei havaittu soluissa, joita käsiteltiin Mdivi1 ajasta nolla tai esikäsitelty 1 tunti ennen alkua määrityksen.

Tilastollinen analyysi

tilastollinen analyysi IHC tulosten suoritettiin STAT VIEW -J 5,0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC). Suhde keskimääräinen ekspressiotaso (pisteet) ja immunohistokemiallisella markkereita ja histopatologia eri tapauksia arvioitiin ANOVA; Tulokset katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun p-arvo 0,05. Tarvittaessa monivertailu korjauksia tehtiin käyttämällä jälkikäteen Bonferronin /Dunn testi ja, kun ohjelma merkintä, vertailtiin ainoastaan ​​pidettiin merkittävinä, kun p-arvo 0,0018.

Jokainen

in vitro

analyysi suoritettiin vähintään kolmena kappaleena ja keskimääräinen näin saatua käytettiin riippumatonta Studentin t-testiä. Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE, joka ilmoitetaan legendoja luvut.

Tulokset

Mfn2, OPA1, Drp1 ja Fis1 ovat yliekspressoituvat oncocytic kasvaimet ja Drp1 yliekspressio on pahanlaatuista oncocytic kasvaimet

niin kutsuttu ”mitokondriot-muotoilu” proteiinit ovat keskeisiä säätelijöitä mitokondrioiden muoto ja niiden dynamiikkaa. Mitokondrioiden verkko todellakin määritellään hyvin säännelty tasapaino fuusio- ja fissio prosesseja, riippuen solun fysiologiset tarpeet. Joukossa useita solun prosesseja ja patofysiologisia olosuhteissa mitokondriot-muotoiluun proteiinit myös toimia homeostaasin soluelimiin koko ja lukumäärä [4,28,29,32]. Kun oncocytic kasvaimet eroavat ei-ococytic niitä epänormaali kertyminen mitokondrioita, joilla on muuttunut morfologia solun sytoplasmassa, me arveltu, että mitokondrioiden dynamiikka saattaisi olla rooli fenotyyppiset ja fysiologiset oncocytic määritelmä [11,12,13] . Niinpä olemme suorittaneet histologinen analyysi tärkeimmistä ”mitokondrioiden muotoiluun” proteiini tasoilla useaan histologista ihmisen kilpirauhanen kasvainnäytteestä. Kuvassa 1 on esitetty edustava immuunivärjäystä micrographs että ”mitokondrioiden muotoiluun” proteiinit havaittiin eri histologisia tyyppejä kilpirauhasen kasvainten, mukaan lukien 1 oncocytic follikulaarisen kilpirauhassyövän (FTC), 6 ei-oncocytic FTC, 8 oncocytic follikulaarinen variantti papillaarisen kilpirauhaskarsinoomaa (FVPTC) , 22 ei-oncocytic FVPTC, 9 oncocytic tavanomainen papillaarinen kilpirauhassyövän (CPTC), 23 ei-oncocytic CPTC, 12 oncocytic follikulaarinen kilpirauhasen adenooma (FA) ja 7 ei-oncocytic FA. IHC micrographs edustaja hyvänlaatuinen oncocytic leesiosta (oFA), pahanlaatuinen oncocytic leesio (oPTC) ja ei oncocytic vaurio (jäljempänä noFVPTC), The histotypes on tärkein etu tässä työssä, on esitetty kuvassa 1A, 1B ja 1C. Koska ilmaus ”mitokondrioiden muotoilussa” proteiinien viereisestä normaalista parenkyymissä oli nolla, tai havaittavissa vain alle pisteet 2, me jätetty pois histogrammit ekspressiotasot näiden proteiinien normaaliin kudokseen. Lukuun ottamatta Mfn1, olemme tunnistaneet ekspression lisääntymisen tasot muiden proteiinien tutkittu, että oncocytic kasvaimet

vs

. ei-oncocytic ykkösiä ja kaikki neljä histo-tyyppiä analysoidaan (FVPTC, FTC, CPTC ja FA) (kuviot 1 ja 2A).

edustaja micrographs osoittavat immunovärjäystä Mfn1, Mfn2, OPA1, Drp1 ja Fis1 vasta normaalissa kilpirauhaskudokseen (NT) ja kasvainkudoksen olevan oncocytic follikulaarinen adenooma-oFA) (A), joka on oncocytic papillaarinen kilpirauhassyövän-oPTC (B) ja ei-oncocytic follikulaarinen variantti papillaarisen kilpirauhaskarsinoomaa-noFVPTV (C), jonka yhteensä suurennos 300x. Antava musta arrowheads tarkoittavat stained mitattiin kasvaimen alueilla lisääntynyt gradation välillä noFVPTV, jotta oFA ja lopulta OFTC. ”# Mfn1-Mitofusin 1, Mfn2-Mitofusin 2, OPA1-Optiikka surkastuminen 1, Drp1-Dynamin liittyvä proteiini 1, Fis1-mitokondrioiden fissio 1-proteiinia.

immunovärjäyksen Mfn1, Mfn2, OPA1, Drp1 ja Fis1 arvioitiin, ottaen huomioon kaikki kilpirauhasen kasvaimet (A ja B), oncocytic kilpirauhasen kasvaimet yksin (C) tai ei -oncocytic kilpirauhasen kasvaimet yksinään (D). Keskimääräinen antigeenin ilmentymisen laskettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Tulokset näytetään keskimääräisenä pisteet ± SEM. * P 0,05 (pariton t-testi). # Mfn1-Mitofusin 1, Mfn2-Mitofusin 2, OPA1-Optiikka surkastuminen 1, Drp1-Dynamin liittyvä proteiini 1, Fis1-mitokondrioiden fission 1-proteiinia.

Mfn2 ja pro-fissio Drp1 merkittävästi yliekspressoituvat pahanlaatuiset oncocytomas

syvempi analyysi histologisten näytteiden ihmisen kilpirauhasen kasvaimet, Mfn1 oli ainoa mitokondrioiden muotoiluun proteiini näyttää mitään merkittävää eroa ekspressiotasoja, riippumatta fenotyypin tai kasvaimen tyyppejä verrattuna (kuvio 2A-2D). Kokonaiskasvu oli tasot muut proteiinit analysoitiin, riippumatta niiden pro-fuusio tai pro-fission rooli, olivat kaikki merkitsevästi korkeammat oncocytic kasvaimissa verrattuna ei-oncocytic niitä (4,2 ± 0,2

vs

. 2.9 ± 0,2, p 0,0001 Mfn2; 3,3 ± 0,3

vs

. 2.3 ± 0,2, p = 0,01 OPA1; 4,7 ± 0,2

vs

. 3,0 ± 0,2, p 0,0001 Drp1; 4,9 ± 0,1

vs

. 3,5 ± 0,2, p 0,0001 Fis1), kuten on esitetty IHC määrän kuvion 2A (kuvio 2A). Sen sijaan ei ollut merkittävää eroa mihinkään näistä proteiineista, kun vertasimme pahanlaatuinen

vs

. hyvänlaatuiset kasvaimet erottelematta ja ryhmittelyä näytteet oncocytic tai ei-oncocytic (3,5 ± 0,2

vs

. 3,0 ± 0,3, p = 0,31 Mfn2; 2,8 ± 0,2

vs

. 2.3 ± 0,4, p = 0,28 OPA1; 3,8 ± 0,2

vs

. 3,5 ± 0,4, p = 0,48 Drp1; 4,1 ± 0,1

vs

. 3,9 ± 0,34, p = 0,71 ja Fis1) (kuvio 2B). Siksi vaikuttaa siltä, ​​että muuttaminen koneiden vastaavien mitokondrioiden morfologia on ehdottomasti sukua oncocytic fenotyyppi, pikemminkin kuin yleistä kasvaimen aggressiivisuus. Lisäksi sisällä ei-oncocytic kasvaimia ei ole eroja ekspressiotasot mitokondrioiden dynamiikka-proteiinien välillä ei havaittu hyvänlaatuisia ja pahanlaatuisia kasvaimia (kuvio 2D). Kuitenkin, jos ajatellaan vakavuusasteen kasvain, vain sisällä oncocytic fenotyyppi, mielenkiintoisesti havaitsemme, että Mfn2 ja Drp1 ovat huomattavasti runsaampaa karsinoomia verrattuna hyvänlaatuinen kollegansa ”adenoomia (4,5 ± 0,2

vs

. 3,4 ± 0,4, p = 0,012 varten Mfn2 ja 5,1 ± 0,2

vs

. 4,0 ± 0,5, p = 0,038 varten Drp1 (kuvio 2C). Huomattavaa on, että nämä erot eivät liity eroihin mitokondrioiden numero ( S1 Kuva). Tämä viittaa siihen, että sisällä oncocytic kasvaimet, mitokondrio dynamiikka ottaa roolin määrittelyssä kasvaimen pahanlaatuisuuden ja aggressiivisuus.

Drp1 aktiivisesti kertyy mitokondrioita ja epätasapainon mitokondrioiden verkon kohti fissio

sen selventämiseksi ja tutkia perusteellisesti rooli mitokondrion dynamiikkaa muutokselle oncocytic kasvaimet, vaihdoimme

in vitro

kokeita kaksi kilpirauhassyöpä solulinjoissa: XTC.UC1, joka on ainoa oncocytic solulinja käytettävissä, jossa syöpä johtaminen, ja TPC1, ei-oncocytic kilpirauhasen solulinjaa, käytettiin vertailutarkoituksiin. Ensin arvioitiin kahdessa solulinjassa ilmentymistason saman fuusio- /fission proteiinit tutkittiin ihmisen kasvainnäytteissä.

western blot-analyysi, olemme havainneet, että oncocytic solulinjassa, sama suuntaus Virhe palkit edustavat SEM.