Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja Tavoitteet

Lisääntyvä tutkimusten mukaan maksasolusyövän (HCC) saattaa olla peräisin erillisten alaryhmästä kutsutaan syövän kantasolut (CSCS), jotka ovat vastuussa rajoitettu tehoa tavanomaisen lääkityksen. Olemme aiemmin osoittaneet, että granuliiniproteiinia-epithelin esiaste (GEP), pluripotenssissa kasvutekijä, on yliaktiivista HCC mutta ei viereisen ei-kasvain, ja että GEP on potentiaalinen terapeuttinen kohde HCC. Täällä me tunnettu sen ekspressiokuviota ja kantasolujen ominaisuuksia sikiön ja syöpä- maksa.

Methods

Proteiinin ilmentymistä GEP sikiön ja aikuisen maksa tutkittiin ihmisen ja hiiren malleja immunohistokemiallisella värjäyksellä ja virtaussytometrialla. Maksasyövän solulinjoja, eristää perustuen niiden GEP ja /tai ATP-riippuvainen sitova kasetti (ABC) lääke transporter ABCB5 lauseke, arvioitiin maksan CSC ominaisuuksien suhteen pesäkkeiden muodostumisen, chemoresistance ja kasvainten muodostumiseen.

Tulokset

osoittaneet, että BTV oli maksan onkofetaalinen proteiini, joka ilmaistaan ​​fetaalimaksat, mutta ei normaalissa aikuisen maksa. Tärkeää on, GEP + fetaalimaksasoluilla yhteistyössä ilmaisi alkion kantasolujen (ES) soluja koskevia molekyylejä kuten β-kateniinin, Oct4, Nanog, Sox2 ja DLK1, sekä myös maksan CSC-markkereita CD133, EpCAM ja ABCB5. Fenotyyppiset luonnehdinta HCC kliinisissä näytteissä ja solulinjoissa ilmeni, että GEP + syöpäsolut koekspressoi nämä kantasolujen merkkiaineita samoin kuin GEP + sikiön maksasoluissa. Lisäksi GEP osoitettiin säätelemään ES-solujen liittyviä molekyylejä β-kateniinin, Oct4, Nanog, ja Sox2. Isolated GEP

korkea syöpäsolut osoittivat parannettu pesäkkeenmuodostus kyky ja chemoresistance verrattuna GEP

alhainen kollegansa. Co-ilmentymä GEP ja ABCB5 paremmin määritellyt CSC väestön tiiviimmän tuumorigeenisia kyky immuunipuutteisilla hiirillä.

Johtopäätökset

havainnot osoittavat, että BTV on maksan onkofetaalinen sääte- ES soluja koskevia signalointimolekyylien . Co-ilmentymä GEP ja ABCB5 rikastuttaa alapopulaatio tiiviimpää CSC ominaisuuksia. Nykyinen tieto antaa uusia käsityksen terapeuttinen strategia.

Citation: Cheung PFY, Cheng CKC, Wong NCL, Ho JCY, Yip CW, Lui VCH, et al. (2011) Granulin-Epithelin esiaste Onko onkofetaalinen Protein määritteleminen Maksan syövän kantasoluja. PLoS ONE 6 (12): e28246. doi: 10,1371 /journal.pone.0028246

Editor: Young Nyun Park, Yonsei University College of Medicine, Korean tasavallan

vastaanotettu: 02 kesäkuu 2011; Hyväksytty 4 marraskuuta 2011; Julkaistu: 16 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Cheung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain Sun CY Research Foundation for Maksa ja Haiman Surgery, National Natural Science Foundation of China ja Hong Kong Research Grants neuvosto (N_HKU 709/07, HKU7 /CRG /09), siemen rahoitusohjelman ja Small projektivarat ohjelma University of Hong Kong. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC), kolmanneksi yleisin syy syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa, on erittäin pahanlaatuinen sairaus, ei ole tehokasta hoitoa tällä hetkellä [1]. Vaikka molekyylitason mekanismeja HCC synnyssä edelleen suureksi osaksi tuntemattomia, HCC pidetään heterogeeninen tauti johtuu sen useiden molekyyliprofiilien ja monipuolinen kliinisiin tuloksiin [2]. Epäyhtenäisyys HCC ja puute sopiva biomarkkerit ovat estäneet potilaan ennusteen ja hoidon.

Jo vuosia tuumorisolun heterogeenisyys on selitetty klonaalisen evoluutiomalli [3]. Kuitenkin viime aikoina osoittavat, että kasvaimia hierarkkisesti järjestetty selvä alapopulaatio kutsutaan syövän kantasolut (CSCS) makaa kärkeen hierarkian. Nämä solut eivät ole vastuussa vain kasvaimen aloittamista ja etenemistä, mutta myös jolla kantasolujen ominaisuuksia, kuten Itseuudistumisen, erilaistuminen kapasiteetti ja chemoresistance [4]. Vaikka olemassa oleviin hoitomuotoihin voi aluksi poistaa suurin väestö kasvain, kantasolujen ominaisuuksia CSCS jotta ne voivat selviytyä ja asuttaa kasvain, jolloin sairaus on uusiutunut [5].

käsite CSCS on dokumentoitu erilaisissa maligniteetit, mukaan lukien rintojen [6], paksusuolen [7] ja maksan syöpien [8], [9]. Huolimatta viimeaikaisista edistysaskeleet maksan CSC tunnistamiseen, tarkka alkuperä näiden solujen edelleen suurelta osin tuntemattomia. Kasvaimen kehittymisen ja embryogeneesi tiedetään paljon yhteisiä ominaisuuksia kuten solu plastisuus, dynaaminen soluliikkuvuus [10] ja lähentää signalointipolkujen, mikä viittaa välistä mahdollista yhteyttä alkion ja syöpäsolujen [11]. Mielenkiintoista, käsite CSC on huomattavasti samanlainen ”alkion loput” teoria, jota ehdotettiin perustuu histologiseen yhtäläisyyksiä alkion ja syöpä- kudoksiin, mikä viittaa siihen, että aikuisen kudoksista sisältävät alkion jäänteitä, jotka normaalisti olla lepotilassa, mutta voidaan aktivoida muuttua syöväksi [12]. Siksi tunnistaminen avainmolekyyli että taustalla yhdenmukaistuvat alkion kantasolujen (ES-solut) ja kasvaimen solut voivat aiheuttaa uusia terapeuttisia strategioita tukahduttaa pahanlaatuisiin normaalien kantasoluja, tai hävittää CSCS.

Granulin-epithelin esiaste (GEP, myös nimeltään progranulin, proepithelin, acrogranin, tai PC-kasvutekijä) on pluripotentti kasvua säätelevä tekijä sikiön kehitykseen [13], kudosten korjaamiseen [14] ja tuumorigeneesiä erilaisissa syövissä [15]. Todettiin säännellä kehityshäiriöitä tapahtumia, kuten kavitaatiota preimplantaation hiiren alkioiden [16] ja mieserityisyyttä aivot erilaistumista hypotalamuksen vastasyntyneillä rotilla [17]. Aikaisemmin olemme osoittaneet GEP yli-ilmentyminen useimmissa ihmisen HCC yksilöiden [18], [19] ja sen säätelijänä HCC solujen lisääntymistä, invaasiota ja tuumorigeenisyystesti [19]. Lisäksi neutralointi GEP voisi estää kasvun perustettu HCC [20]. Huolimatta huomattavaa kiinnostusta sen dual roolit alkionkehityksen ja tuumorigeneesiprosessin tiedot sen ekspressiokuviota ja biologisten tehtävien maksa on edelleen niukasti.

Tässä tutkimuksessa raportoimme ensimmäistä kertaa, että BTV on maksan onkofetaalinen proteiini, joka säätelee ilmentymistä kantasolun liittyvien molekyylejä β-kateniinin, Oct4, Nanog ja Sox2. Funktionaaliset tutkimukset vahvistivat, että GEP ilmentävien solujen hallussaan suurempi kyky pesäkkeiden muodostumiseen ja chemoresistance. Lisäksi syöpäsolut koekspressoivat GEP ja ATP-riippuvainen sitovia kasetti (ABC) B5 osoitti parannettu tuumorigeenisia kyky immuunipuutteisilla hiirillä. Meidän havainnot ovat elintärkeitä paitsi ymmärrystä sikiön maksan kehityksen, mutta myös rakentamiseen erityisiä hoitoja kohdistaminen GEP ja ABCB5 hävittämiseksi solunsalpaajaresistentti CSCS HCC potilailla.

Materiaalit ja menetelmät

Cell määritykset

Ihmisen maksan syöpäsolulinjoilla, Hep3B ja HepG2, hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja niitä viljeltiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [19], [20]; kun Huh7 hankittiin Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japani) ja ylläpidetään Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (Invitrogen, Carlsbad, CA). Vakaa transfektantteja varten GEP yli-ilmentymisen ja tukahduttaminen on kuvattu [19]. GEP tukkeumia Hep3B suoritettiin inkuboimalla soluja kanssa tai ilman 50 ug /ml anti-GEP monoklonaalinen vasta-aine A23 (kotitekoinen, aiemmin kuvattu [20] tai hiiri-IgG-isotyypin kontrollivasta-aineen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 24 h.

Kliiniset näytteet

tutkimusprotokolla hyväksyi Institutional Review Board of University of Hong Kong /Hospital Authority Hong Kong West Cluster (HKU /HA HKW IRB). Kuudella potilaalla tehtiin parantavaan osittainen hepatektomia tai maksansiirtoa HCC Queen Mary sairaalassa, Hong Kong, rekrytoitiin kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen tutkimukseen. potilaat oli diagnosoitu primääri HCC ja vahvistanut patologisten tutkimusten. ikä potilaiden vaihteli 42-67 vuotta, joiden keski-ikä 60 vuotta. oli 4 miestä ja 2 naista, ja kaikki olivat hepatiitti B-viruksen kantajia. koko kasvainten vaihteli 3,5-19,5 cm, keskikokoa 8.3 cm. Erityisesti kukin yksilö on rajallinen määrä soluja (pieni tutkimus näyte varmistetaan, ettei häiriöitä patologinen tutkimus) ja näin ollen riitä täydellistä paneeli kantasolujen merkki ilmentymisanalyysiä. Ilmaisu tiedot kunkin merkin esitteli keskimääräinen dataa vähintään neljä näytettä. Normaali maksa näyte saatiin Elinluovuttaja aikana elinsiirron ja luovuttajan ollut taustalla maksasairaus ja oli negatiivinen hepatiitti B serologisissa testeissä. Sikiön maksassa näyte saatiin hakeminen arkistoitu formaliinilla parafiiniin upotettuja kudosnäytekappaleessa otettu rutiinikäytössä patologinen tutkimisen abortus jälkeen spontaani keskenmeno 10 viikon 6 päivää. Etiikka hyväksynnän käyttää arkistoitujen sikiökudoksissa tunnistettiin tietokannasta on saatu Institutional Review Board of University of Hong Kong /Hospital Authority Hong Kong West Cluster (HKU /HA HKW IRB).

Hiiri yksilöt

maksa aikuisen, vastasyntyneiden ja sikiön ICR kerättiin ja tutkimussuunnitelman hyväksyi valiokunnan elävien eläinten käyttö opetuksessa ja tutkimuksessa yliopistossa Hong Kong (hyväksyntä viitenumero CULATR 1968 -09). Eristämiseksi hiiren hepatosyyttien, maksa, jauhettiin ja pilkottiin tyypin IV kollagenaasi (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Suodatuksen jälkeen ja lyysi punasolujen, solut laskettiin ja immunofluoresenssivärjäyksen ja virtaussytometria-analyysi (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA). Eristetyt solut alkion maksasta värjättiin anti-AFP-vasta-ainetta (R 80% minimaalisella solukuolema ( 10%).

Doksorubisiini keskittymisen ja apoptoosin

Soluja inkuboitiin kanssa tai ilman 0,5 ug /ml doksorubisiinia 24 tunnin ajan. Solunsisäinen doksorubisiinin kertyminen analysoitiin virtaussytometrialla klo FL2 spektri; kun apoptoosia määritettiin anneksiini V-FITC: tä (FL1) ja propidiumjodidia (PI) (FL2) värjäystä ja virtaussytometrinen analyysi.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Juuri eristetyt solut ympättiin tiheys 1000 solua /kuoppa, ja annettiin kasvaa 10 päivää. Pesäkemuodostusta arvioitiin kolorimetrisellä määrityksellä käyttäen kristalliviolettia (Sigma Aldrich).

In vivo

tuumorigeenisyyden kokeissa

BALB /c kateenkorvattomia nude-hiirissä on 5 viikkoa vanhoja, käytettiin testata

in vivo

Tuumorigeenisuustutkimuksissa soluihin. Tutkimuksen protokolla hyväksyi valiokunnan elävien eläinten käyttö opetuksessa ja tutkimuksessa yliopistossa Hong Kong. Eri määrä soluja istutettiin ihonalaisesti selkäpuoli rungon kunkin eläimen. Hiiret tapettiin välillä 8 ja 16 viikon kuluttua injektion, jossa kasvaimet kerättiin jatkotutkimuksiin. Ne hiiret injektoitiin HCC-soluissa, mutta ilman merkkejä kasvaintaakkaa olivat yleensä päättyy 5 kuukaudeksi solujen injektion.

Tilastolliset analyysit

Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvoina ± keskihajonta (SD) alkaen vähintään kolmen erillisen kokeen. Erot ryhmien välillä arvioitiin Studentin t-testiä. Todennäköisyys (p) 0,05 katsottiin merkittävästi erilaiset. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen tilasto-ohjelmalla GraphPad Prism for Windows, versio 3.00 (GraphPad Software, CA, USA).

Tulokset

BTV on maksan onkofetaalinen proteiini

Aiemmin , GEP mRNA raportoitu alkion hiiren maksan [13], mutta onko GEP kääntyy proteiiniin ja sen aika päälle- /off aikana maksan kehitys on edelleen tuntematon. Koska sikiön maksassa on runsaasti Veren kantasolut lisäksi sikiön maksasoluissa, meidän täytyy tunnistaa solutyyppi (t) ilmennetään GEP. Täällä kuvattiin ensimmäisen kerran proteiinin ekspressiokuviota GEP ihmisen ja hiiren maksa. Immunohistokemiallisella värjäyksellä, GEP-proteiinia ei havaittu hiiren ja ihmisen sikiön maksa, kun taas aikuisen maksa oli vailla GEP ilmentävien hepatosyyteissä (kuvio 1A).

(A) immunohistokemiallinen analyysi, joka osoittaa GEP proteiinin fetaalimaksat hiiren ( alkion päivä 17.5) ja ihmisen (10 viikkoa 6 päivää), mutta ei aikuisilla maksa (suurennus x 400). (B) virtausytometrisiä analyyseja, jotka kuvaavat ilmaus GEP ja maksan kantasolujen merkkiaineiden hiiren alkion hepatosyyteissä. Koekspressio GEP ja maksan kantasolujen merkkiaineita CD133, EpCAM, DLK1 ja β-kateniinin suoritettiin neljän värin virtaussytometria, portittamisella AFP + ja /tai albumiini + hepatosyyttien Alkion maksa. Solut koekspressoivan vastaaviin markkereita näkyy oikeassa yläkulmassa quadrant dot tontteja. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona solujen prosenttiosuus + SD.

hiirimallissa, jotta voidaan erottaa GEP ilmaisua erityisesti hepatosyyteissä, analyysi GEP tason suoritettiin kolmesti värin virtaussytometria, portittamisella AFP + ja /tai albumiini + varten hepatosyyttien lainkaan kehitysvaiheessa. Sisällyttäminen AFP + ja /tai albumiini + soluja kaikissa kehitysvaiheissa olisi paremmin maksasolujen väestön maksassa, koska osuus AFP + solujen ja albumiini + solut olivat erilaisia ​​alkion, vastasyntyneiden ja aikuisten maksa (kuva S1). GEP ilme nousi vähitellen alkiopäivänä E11.5 (14,8% + 6,9%) ja E17.5 (30,8 + 9,2%). Heti syntymän jälkeen, GEP taso laski jyrkästi päivästä 1 (4,4 + 1,5%) ja päivä7 (1,2 + 0,4%), ja siitä tuli lähes havaitsematon aikuisen hiiren maksasta (0,9 + 0,4%) (Kuva S1). Yhdessä aikaisempia havaintoja, GEP ilmaistu useimmissa HCC yksilöitä, mutta ei viereisen ei-kasvain maksan kudoksissa [18], [19], me vahvisti, että BTV oli maksan onkofetaalinen proteiinia.

luonnehtivat kantasolujen allekirjoitus GEP + sikiön maksasoluissa, selvitimme koekspressio GEP ja useiden maksan kantasolujen tai kantasolujen liittyviä markkereita kuten CD133, EpCAM, DLK1 ja β-kateniinin [21], [22], [23] , [24] ja alkion maksasta (kuvio 1 B). Hepatoblasteja olisi sarjanumero muuttuu pitkin kehitysvaiheisiin ja aiheuttaa maksasolujen ja kolangiosyytit. Tällä alkion päivänä 11,5 (E11.5), ilmauksia CD133, EpCAM, DLK1 ja β-kateniinin olivat korkealla hepatoblasteja ja suurin osa GEP-positiivisten solujen koekspressoivat kaikkia näitä maksan kantasoluja markkereita. Tällä E13.5, ilmauksia CD133 ja EpCAM alkoi laskea ja useimmat CD133 + tai EpCAM + solujen havaittiin co-express GEP. Sillä DLK1 ja β-kateniinin, niiden ekspressiotasot pysyi korkeana E13.5 ja suurin osa GEP-ilmentävien solujen olivat myös positiivisia sekä markkereita. Tällä E17.5, ilmaukset CD133, EpCAM, DLK1 ja β-kateniinin laski matalalle tasolle, kun taas GEP ilmentyminen saavutti huippunsa tässä vaiheessa. Ero ilmaisun suuntausten välillä GEP ja näiden kantasolujen markkereita voitaisiin katsoa johtuvan kasvutekijä ominaisuuksia GEP. Kun tarvitaan lisätutkimuksia sen selvittämiseksi taustalla oleva mekanismi ekspressiomalli GEP, koekspressio GEP nämä maksan kantasoluja tai kantasolujen liittyviä markkereita viittaa kantasolujen fenotyyppiä GEP-ilmentävien solujen.

GEP ilmentyminen hiiren hepatosyyttien tutkittiin meidän kotitekoinen anti-GEP-vasta A23. Spesifisyys A23 tutkittiin western blot (kuvio S2 ja tulos osoitti, että se voi tunnistaa hiiren GEP yksittäisinä bändi hiiren alkion maksan proteiini ote. Lisäksi GEP ilmentymiskuvio kuten esitetään Western blot oli yhdenmukainen virtaus cytometry tietoja, jotka GEP proteiini taso nousi E11.5 ja E13.5 on E17.5, joka tarjoaa yhdenmukaiset tiedot vastaamaan GEP ilmaisua alkion maksa.

fenotyyppinen karakterisointi GEP ilmentävien solujen HCC

paremmin luonnehtivat jos GEP ilmentävien solujen oli kantasolujen ominaisuuksia HCC, selvitimme koekspressio GEP ja paneelin kantasolujen merkkiaineiden avulla virtaussytometria ihmisen HCC solulinjoissa Hep3B ja Huh7. tussit tutki kuuluu hematopoieettinen esiaste solupinnan CD31, CD34, CD117, maksan esiaste solunpintamarkkeria CD123, kantasolujen pinnan markkereita CD24, CD29, maksan CSC pintamarkkerit CD44, CD90, CD133, EpCAM, ES soluja koskevia molekyylejä β-kateniinin, Oct4, Nanog ja Sox2, ABC huumeiden kuljettajat ABCC1 ja ABCB5. Huomaa, että ABC huumeiden kuljettajat olivat mukana myös siksi, sekä normaali- että syövän kantasolut ilmaistuna korkeamman tason ABC lääkkeiden kantaja, edistää suurempi resistenssi kemoterapia-aineiden kuin erilaistuneita soluja [4], [21]. Niistä markkereita tutkitaan, GEP + solut osoitettiin ensisijaisesti yhteistyössä express kanssa β-kateniinin, Oct4, Nanog, Sox2, CD133 ja EpCAM verrattuna GEP- solujen sekä HCC solulinjoissa Hep3B (kuva S3) ja Huh7 (kuva S4 ). Meidän havainnot siksi ehdottanut kantasolun ominaisuus GEP ilmentävien solujen sekä alkion ja syöpä- maksasoluissa.

GEP säätelee ilmentymistä kantasolujen merkkiaineiden

moduloitu GEP ekspressiotasot Hep3B soluissa transfektiolla lähestymistapaa ja tutkia, jos proteiini tasot kantasolujen merkkiaineita olisi muutettava. Tulokset osoittivat, että säätely ylöspäin GEP tasolla parantaa samalla kun tukahduttaminen GEP supistui ilmentymistä β-kateniinin, Oct4, Nanog, Sox2 ja ABCB5 (taulukko 1). Modulaation GEP tasossa ei muuttanut ilmaus maksan kantasolujen solunpintamarkkereiden CD133 ja EpCAM. Syynä voi johtua siitä, että suurin osa Hep3B solut olivat positiivisia CD133 ja EpCAM (yli 95%), jolloin muutos yhden molekyylin (esim. GEP) ei ehkä pysty siirtämään väestöstä. Vaikka GEP on aikaisemmin raportoinut ryhmämme säännellä ABCB5 välittäjäksi chemoresistance HCC-soluissa [25], positiivinen korrelaatio GEP ja β-kateniinin, Oct4, Sox2 ja Nanog ehdotti, että GEP voisi säätelemään näiden ES-solujen liittyvä signalointimolekyylien säilyttää pluripotenttisuuden kantasolujen.

edelleen vahvistaa sääntelyn roolin GEP ilmenemistä näiden signalointimolekyylien, GEP tukos anti-GEP monoklonaalinen vasta-aine A23 suoritettiin Hep3B soluissa ( Taulukko 2). A23 havaittiin vähentävän merkitsevästi endogeenisen GEP tasoja Hep3B soluissa. GEP tukos myös merkittävästi tukahdutti ilmaus β-kateniinin, Oct4, Nanog ja Sox2, mikä vahvistaa säätelevän roolin GEP ilmenemistä näiden kantasolujen liittyviä molekyylejä.

GEP ilmentävien solujen hallussaan CSC ominaisuudet

in vitro

paremmin karakterisoimiseksi kantasolujen ominaisuuksia GEP ilmentävien solujen, GEP

korkea ja GEP

alhainen osapopulaatioiden eristettiin ihmisen maksasyövän solulinjoja Hep3B, HepG2 ja Huh7, ja tutkittiin niiden ilmentyminen kantasolujen merkkiaineiden avulla virtaussytometrialla. Solut lajitellaan perustuu pinnalla ilmentymistä GEP, mutta ei sen solunsisäistä ekspressiota, koska läpäiseväksi ei ollut mahdollista pitää solujen kannattavaa myöhemmin funktionaalisissa määrityksissä. Sen jälkeen solujen eristykseen, 2 miljoonaa kunkin lajiteltu populaatio kerättiin arvioida solujen elävyyden trypaanisini värjäys ja puhtaus virtaussytometrialla käyttämällä erilaista anti-GEP-ainetta, joka tunnustettu erillisiä epitooppeja niistä käytetyt vasta solujen lajitteluun. Puhtaus GEP

korkea ja GEP

alhainen osapopulaatioiden olivat noin 80%: sta 90%: lla, mistä kertoo post-lajittelu analyysi (kuvio 2A). GEP

korkea solujen havaittiin ilmentävän korkeampi ES-solujen liittyvien molekyylejä p-kateniinin, Oct4, Nanog, Sox2 ja ABC huumeiden kuljettaja ABCB5 kuin GEP

alhainen kollegansa kolmessa HCC solulinjoista (kuvio 2B) . Maksan CSC pintamerkkiaine CD133, korkeampi pinnan ilmentyminen GEP

korkea soluja kuin GEP

alhainen vastine löydettiin HepG2 ja Huh7, mutta ei Hep3B, mikä johtui todennäköisesti erittäin korkeatasoista CD133 ( 95 %) konstitutiivisesti ilmaistaan ​​Hep3B-soluissa (tietoja ei ole esitetty). Sillä EpCAM, suurempi pinta ilmentyminen havaittiin GEP

korkea kuin GEP

alhainen väestön Huh7, mutta ei Hep3B ja HepG2, jossa suurin osa soluista ( 95%) havaittiin ilmentävän EpCAM. Tiedot on siis yhdenmukainen aiempien havaintojen että GEP ilmentävien solujen liittyy kantasolujen merkki ilmaisuja verrattuna GEP negatiiviset solut.

(A) GEP ilmentymistä lajittelemattomina Hep3B, HepG2 ja Huh7 soluja, ja juuri eristetty GEP

korkea, ja GEP

alhainen osapopulaatioiden jälkeen solujen lajittelun. Solut lajiteltiin perustuvat pinnalla ilmentymistä GEP, mutta ei sen solunsisäisen ilmentymisen, pitääkseen solujen kannattavaa myöhemmin funktionaalisia määrityksiä. Sen jälkeen, kun solujen eristykseen, 2000000 kutakin järjestetty väestöstä kerättiin arvioida solujen elinkelpoisuuden trypan blue -värjäyksellä ja puhtaus järjestetty alapopulaatioiden virtaussytometrialla käyttäen eri anti-GEP-vasta-ainetta (tunnistamaan erillisiä epitooppeja verrattuna vasta-aineita, joita käytetään solujen lajittelu ). Data esitetään keskimääräisinä prosenttiosuuksina GEP + solujen ± SD. (B) Proteiinin ekspressiotasoja kantasolujen merkkiaineiden β-kateniinin, Oct4, Nanog, Sox2 ja ABCB5 lajitelluissa alapopulaatioiden mitattiin solunsisäinen värjäys ja virtaussytometrinen analyysi. Data ilmaistaan ​​keskiarvona positiivisten solujen prosenttiosuuden ± SD. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001 verrattuna GEP

alhainen soluja. (C) Pesäkkeenmuodostusta hyötysuhteet GEP

korkea osapopulaatioiden olivat korkeammat kuin niiden GEP

alhainen ja lajittelemattoman Hep3B ja HepG2-soluissa. (D, E) Altistuksen jälkeen doksorubisiiniin (0,5 ug /ml 24 h), GEP

korkea osapopulaatioiden säilytetään huomattavasti vähemmän doksorubisiini ja vähemmän apoptoosia kuin GEP

alhainen ja lajittelemattoman Hep3B ja HepG2-soluissa. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001 verrattuna lajittelemattoman valvontaa.

Voit selvittää GEP ilmentäviä soluja rikastettiin CSCS vertasimme Tuumorigeenisuustutkimuksissa ja kantasolujen ominaisuuksia GEP

korkea solujen virkaveljiensä

in vitro

in Hep3B ja HepG2-soluissa, jotka edustavat korkean ja matalan GEP-ilmentäviä solulinjoja, vastaavasti. Kyky muodostaa klooneja solut arvioitiin pesäkemuodostusta. GEP

korkea Hep3B solut pystyivät muodostamaan merkittävästi enemmän pesäkkeitä verrattuna GEP

alhainen solujen ja lajittelemattoman valvontaa. Samanlaisia ​​havainto osoitettiin riippumaton maksan syöpäsolun HepG2 (kuvio 2C).

Jotta voidaan tutkia roolia GEP vuonna chemoresistance, soluja inkuboitiin doksorubisiinin ja arvioitiin solunsisäisen lääkkeen kertymisestä ja solujen apoptoosin. GEP

korkea alapopulaatioiden, sekä Hep3B ja HepG2-soluissa, oli merkittävästi pienempi doksorubisiiniin sisäänoton (kuvio 2D) ja apoptoosia (kuvio 2E) verrattuna lajittelemattomien valvonta; vaikka GEP

alhainen osapopulaatioiden osoittivat lisääntynyttä doksorubisiini ottoa ja solujen apoptoosin verrattuna lajittelemattoman väestölle.

GEP

highABCB5 + solujen osoittaa korkeampi pesäkkeenmuodostus kyky ja chemoresistance

mukaan CSC hypoteesin, CSCS edustavat vain harvoissa väestö kasvain [4]. Tämä tarkoittaa, että GEP

korkea alaryhmässä on edelleen heterogeeninen, ja mahdollisesti koostuu subsets kanssa ero tuumorigeenisiä potentiaaleja. Siksi pyrimme edelleen leikellä GEP

korkea väestön lisäksi ilmensivät markkeri.

Hep3B-soluja, suurin osa ABCB5 +-soluista ilmensi GEP, mutta vain osa GEP + solut olivat ABCB5 + (kuvio 3A, vasen paneeli). Lisäksi olemme osoittaneet äskettäin, että ABCB5 säännelty maksasyöpä kantasolujen merkkiaineita CD133 ja EpCAM [21]. Siksi arveltu, että GEP yhdistettynä ABCB5 voisi määritellä tarkemmin maksan CSC väestöstä.

(A) GEP ja ABCB5 ilmaisun lajittelemattomina Hep3B soluissa, ja vasta eristettyä GEP

highABCB5 +, GEP

highABCB5- ja GEP

lowABCB5- osapopulaatioiden. Solut lajiteltiin perustuvat pinnalla ilmentymistä GEP ja ABCB5. Sen jälkeen, kun solujen eristykseen, 2000000 kutakin järjestetty alaryhmän kerättiin puhtauden arvioimiseksi virtaussytometrialla käyttämällä erilaisia ​​anti-GEP ja anti-ABCB5 vasta-aineita, jotka tunnistivat epitooppeja eroavat vasta-aineista, joita käytetään solujen lajittelua. Huomaa, että useimmat ABCB5 + solut myös GEP +, mikä ei ollut GEP

lowABCB5 + soluja (vasen paneeli). Keskimääräiset solujen ± SD esitetään kussakin kvadrantissa. (B) Pesäkkeenmuodostusta hyötysuhteet GEP

highABCB5 + subpopulaatio olivat korkeammat kuin GEP

highABCB5-, GEP

lowABCB5- ja lajittelemattoman soluja. (C, D) altistuksen jälkeen doksorubisiinin (0,5 ug /ml 24 h), GEP

highABCB5 + solut säilyvät merkittävästi vähemmän doksorubisiinin ja vähemmän apoptoosia kuin muut alapopulaatioita. *

P

0,05, **

P

0,01 verrattuna lajittelemattomien valvontaa; #

P

0,05, # #

P

0,01, # # #

P

0,001 ryhmien välillä merkitään vaakarivillä.

eristetty GEP

highABCB5 +, GEP

highABCB5- ja GEP

lowABCB5- soluja Hep3B. Solut lajitellaan perustuu pinnalla ilmenemisen GEP ja ABCB5, mutta ei niiden solunsisäistä ekspressiota, koska läpäiseväksi ei ollut mahdollista pitää solujen kannattavaa myöhemmin funktionaalisissa määrityksissä. Sen jälkeen solujen eristykseen, lajiteltu osapopulaatioiden arvioitiin solujen elinkelpoisuus trypaanisini värjäys ja puhtaus virtaussytometrialla käyttämällä erilaisia ​​anti-GEP tai anti-ABCB5 vasta-aineiden tunnustettu erillisiä epitooppeja niistä käytetyt vasta solujen lajitteluun. Vähintään 80% puhtaus saatiin kustakin alaryhmästä (kuvio 3A) ja niiden tuumorigeenisia potentiaalit tutkittiin sekä

in vitro

ja

in vivo

.

GEP

highABCB5 + solut osoittivat induktio eniten pesäkkeiden, kun taas GEP

highABCB5- solut osoittivat väli- kyky muodostaa pesäkkeitä, mutta silti huomattavasti korkeampi kuin lajittelemattoman kontrolli. Tärkeää on, GEP

lowABCB5- subpopulaatio oli lähes kykene muodostamaan pesäkkeitä (kuvio 3B).

Kun altistuminen doksorubisiini, GEP

highABCB5 + solut osoittivat merkitsevästi alhaisempi doksorubisiinin oton ja solujen apoptoosin verrattuna GEP

highABCB5- soluja, ja lajittelemattoman valvontaa. Päinvastoin, GEP

lowABCB5- solut olivat erittäin herkkiä doksorubisiinin kannalta lääkeaineen kertymistä ja apoptoosia (kuvio 3C ja D) B

GEP

highABCB5 + solut ovat tuumorigeenisemmiksi

in vivo

Kasvain kehitys kokeellisesti GEP

highABCB5 + ja GEP

lowABCB5- osapopulaatioiden eristetty Hep3B soluista tehtiin immuunipuutteisilla nude-hiirissä. Kaikki hiiret injektoitiin GEP

highABCB5 + solujen kehittynyt kasvaimia. Hiiret injektoitiin 1 x 10

6 kahden positiiviset solut muodostivat kasvaimia 2-4 viikkoa ymppäyksen jälkeen. Päinvastoin vain 2/10 hiiriä, joihin injektoitiin GEP

lowABCB5- soluja tuotetaan suhteellisen pieniä kasvaimia ja tarvitaan pidempi latenssi (12 viikkoa) (kuvio 4A ja B).

(A) Nude-hiiriä injektoitiin ihonalaisesti jossa GEP

highABCB5 + ja GEP

lowABCB5- soluja 8 viikon kuluttua. Oikeassa paneelissa näkyy ihonalainen kasvaimia johdettu 2,5 x 10

5 GEP

highABCB5 + ja 1 x 10

6 GEP

lowABCB5- soluja viikolla 16. (B) tuumorigeenisyystesti GEP

highABCB5 + ja GEP

lowABCB5- soluja.