Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Käytimme intensiivinen moderni proteomiikka lähestymistavat tunnistaa ennustavan proteiineja munasarjasyöpä. Tunnistamme säädelty proteiinien sekä seerumin ja vatsaontelonesteessä. Arvioidaan yleistä suorituskykyä lähestymistavan me seurata käyttäytymistä 20 validoitu merkkiaineiden poikki näistä kokeista.

Menetelmät

Massaspektrometria pohjainen määrällinen proteomiikka laajojen proteiinia fraktiointi käytettiin vertaamaan seerumin naisten serous munasarjasyöpä terveille naisille ja naisille, joilla on hyvänlaatuinen munasarjojen kasvaimia. Kvantifiointi saavutettiin isotooppisesti merkintöjä kysteiini aminohappoa. Label-vapaa massaspektrometriaa käytettiin vertaamaan peritoneaalinestettä otettu naisten vakavien munasarjasyöpä ja ne, joilla hyvänlaatuisia kasvaimia. Kaikki tiedot yhdistettiin ja selityksin perusteella, onko proteiinit on aiemmin validoitu käyttäen vasta-aineisiin perustuvia määrityksiä.

Havainnot

Valitsimme 54 määrällisesti seerumin proteiineihin ja 358 peritoneaalinestettä proteiineja, joiden tapaus-verrokki eroja ylittänyt ennalta määritetyn kynnyksen. Seitsemäntoista proteiinit määrällisesti että niiden materiaalit ja 14 ovat solunulkoinen. 19 validoitu merkkiaineiden tunnistettiin kaikki löytyivät syövän vatsaontelonesteessä ja osajoukko 7 kvantitoitiin seerumissa, yksi näistä proteiineista, IGFBP1, vasta validoitu täällä.

Johtopäätös

Proteome profilointia sovelletaan oireenmukaista munasarjasyöpä tapauksissa tunnistaa suuri määrä sääteli seerumin proteiineihin, joista monet ovat tai on vahvistanut immunomäärityksiä. Määrä tällä hetkellä tiedossa validoitu markkereita on korkein peritoneaalinesteeseen, mutta ne muodostavat suuremman prosenttiosuuden proteiineja havaittiin sekä seerumin ja peritoneaalinestettä, mikä viittaa siihen, että 10 lisämerkkiaineille tässä ryhmässä voi olla korkea laatu ehdokkaita.

Citation: Amon LM, Law W, Fitzgibbon MP, Gross JA, O’Briant K, Peterson A, et al. (2010) Integrative proteomiikan analyysi Seerumin ja peritoneaalisille Nesteet auttaa tunnistamaan proteiineja, joita säädellään ylöspäin Serum naisten kanssa munasarjasyöpä. PLoS ONE 5 (6): e11137. doi: 10,1371 /journal.pone.0011137

Editor: Sudhansu Kumar Dey, Cincinnati Lasten Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 maaliskuu 2010; Hyväksytty: 26 toukokuu 2010; Julkaistu: 15 kesäkuu 2010

Copyright: © 2010 Amon et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke on rahoitettu osittain liittovaltion varoja National Cancer Institute, National Institutes of Health, alle lupanumeroita U01 CA111273, P50 CA83636, sopimus nro HHSN261200800001E ja Kanarian Foundation. Pohjimmiltaan tämä julkaisu ei välttämättä edusta tai politiikan Department of Health and Human Services, eikä mainita kaupan nimiä, kaupallisia tuotteita, tai organisaatioiden merkitse, Yhdysvaltain hallituksen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä (OC) on johtava syy kärsimystä ja kuolemaa naisten Yhdysvalloissa ja diagnosoinnissa se ennalta etäpesäkkeitä voi merkittävästi vähentää kuolleisuutta. Vaikka OC osuus on vain 4% kaikista syövän diagnoosit naisilla (National Cancer Institute. https://www.cancer.gov) se on kaikkein vaarallisin kaikista gynecologic syövistä. Kuten moniin syöpiin, naisen selviytymisen [1] OC liittyy vahvasti sen vaiheessa diagnoosin. Vakavien munasarjasyöpä (SOC) on yleisin ja tappava histologia; Yli 70% kaikista OC tapauksista diagnosoidaan etäpesäkkeitä.

varhainen havaitseminen strategioita OC parhaillaan arvioitavana ovat tyypillisesti mukana yhdistämällä yhden tai useamman veripohjaisten markkereita (tyypillisesti markkeri CA 125) keinona viittaavat naiset uudistettuun kuvantamismodaliteetin kuten transvaginal sonography. Käytettäessä merkkiainetta ensilinjan näytön, suorituskyky koko seulonta strategiaa rajoittaa suorituskyky tämän merkin ja ratkaisevan tärkeä ominaisuusmääre varhaishavaintojärjestelmä markkeri on läpimenoaika, eli kuinka aikaisin tautiprosessissa merkki nostaa. Vaikka alustavat tulokset viittaavat siihen, että saavutetaan positiivinen ennustearvo kynnyksen 10% [2] on mahdollista käyttää peräkkäisiä multimodaalisen lähestymistavan mallintamisnäkökulmaan [3] – [6] ja prekliinisen validointitutkimuksissa profilointi CA 125 ja muita merkkiaineita [7 ] viittaavat siihen, että läpimenoaika on saatu CA 125 voi olla riittämätön mielekkäästi vähentää kuolleisuutta suuri osa naisista.

Monet markkereita muu kuin CA 125 on tunnistettu ja validoitu riippumattomia tutkimuksia käyttäen näytteitä kerätään aika kliininen diagnoosi [8] – [18]. Me viitata näihin markkereita ”validoitu ennakoivaa proteiineja”, jolla tarkoitetaan proteiineja vahvistaa käyttäen immunomäärityksiä useita itsenäisiä näytteitä ja siksi ryhmänä, ovat todennäköisesti pääosin totta positiivisia. Viime aikoina monet näistä merkeistä on arvioitu saatujen näytteiden ennen diagnoosia ja ehdottaa, että voimme odottaa muutaman proteiinin validoitu oireista tautia myös nostaa oireiden esiintyminen [7]. On selvää, varhaisen havaitsemisen SOC vaatii tunnistamista uudentyyppisten markkereita, mahdollisesti plasman tai seerumin proteomic lähestymistapoja.

Yksi tavoite Tutkimuksemme kuuluu tunnistetaan ylimääräisiä markkereita käyttäen seerumia proteomiikka. Kuitenkin toteutettavuus löytää ero proteiinien seerumin ja plasman on kiistanalainen eikä laajalti onnistunut, ja niin toissijainen päämäärä tutkimuksen tarkoituksena on vahvistaa yleistä seerumin proteomiin kokeellinen työnkulun käyttämällä useita markkereita kuin kulta standardit. Tässä käsikirjoitus kuvaamme joukon proteomic kokeita, kuulustella monimutkaisia ​​seoksia ihmisen OC biomateriaalien. Kokeet oli kaksi tarkoitusta; ensimmäinen oli tunnistaa aiemmin tunnistamattomia proteiineja, jotka saattavat olla muita ehdokkaita ennustavaa markkereita. Toinen oli validoida seerumin proteomiikka lähestymistapa seuraamalla käyttäytyminen tunnetaan validoitu ennustavan proteiineja sen toteamiseksi, että alusta on joka löytää markkereita. Varhainen plasma ja seerumi Proteome löytö ponnisteluja, useimmiten luottaen seldi tai MALDI menetelmillä [19] – [26], ovat pitkälti epäonnistuneet tässä suhteessa. Uudemmat lähestymistavat käyttäen tandem MS yhdistettynä intensiivisen fraktiointiin [27] – [29] voisi olla sopivampi seerumin ja plasman biomarkkereiden löytö, koska ne on osoitettu proteiinien tunnistamiseksi haimasyövän [30], jotka on myöhemmin vahvistettu. Kuitenkin, koska onnistumisen löytö lähestymistapa varmasti riippuu tautitiedoista niin paljon kuin tekniikka, ennen panostusta kehittääkseen vasta uusien merkkiaineita, ensin halusi vahvistaa, että lähestymistapa pystyy tuottamaan toistettavissa olevia tuloksia.

Olemme kuulusteltiin sekä kiertävän nesteen, seerumi, ja nesteen proksimaalisesti kasvain, vesivatsanestettä tai peritoneaalinestettä kontrollista, joilla on hyvänlaatuinen vakavien kasvaimia (BST). Teimme kaksi eri kokeita seerumi: Ensimmäisessä kokeessa verrattiin seerumin ryhmiin metastaattisen SOC potilaat ryhmiin terveisiin oireettomia vapaaehtoisille; Toisessa kokeessa verrattiin seerumin ryhmiin eri joukko metastaattisen SOC potilaiden seerumin ryhmiin naisten BST. Sillä proksimaalinen nesteen kokeissa vertasimme altaat vesivatsanestesupernatan- peräisin metastaattisen SOC potilaita altaat peritoneaalinesteeseen sairastavista potilaista BST. Kaikissa kokeissa näytteet Hyväksytty iän, varastoinnin kesto, hormonikorvaushoito käyttöä ja aika kokoelma ennen leikkausta (case /ohjaus vertailun). Yhdistämällä nämä tietomääriä ja tunnistaa proteiineja, jotka näyttävät olevan säädelty SOC sekä seerumin ja nesteen proksimaalisesti kasvain, toivomme rikastuttaa mahdollisia ehdokaslistan syöpään-markkereita.

Tulokset

Lisäykset proteiinien perustuvat olemassa oleviin tietoihin resurssien

luettelo 21 proteiinien aiemmin osoitettu olevan säädelty plasmassa tai seerumissa SOC verrattuna terveisiin ELISA määritykset koottiin tutkimalla OC biomarkkereiden kirjallisuus. Havaitsimme näitä proteiineja sekä yksi ylimääräinen proteiini, IGFBP1, löydettiin ja validoitu tässä työssä totta positiivisesta kontrollista. Neljä oikeita positiivisia proteiineja ei havaittu kummassakaan plasmasta tai peritoneaalinestettä: MUC16 [31] – [33], TNFRSF6B [14], VTCN1 [14], [17] (alias CA 125, DcR3, B7-H4, vastaavasti ) ja VEGF [16]. Taulukossa 1 luetellaan 19 oikeita positiivisia proteiineja, jotka tunnistettiin plasmassa tai peritoneaalinestettä [14], [16], [17], [31] – [33]. Kaikki heistä havaittiin ja kvantitoitiin peritoneaalinesteeseen, ja 7 havaittiin plasmasta mitään positiivista kontrolliraskauksiin yksinomaan plasmassa.

Serum vertailuja

Seerumi proteomiikka kokeissa (kuvattu alla) verrattuna metastaattinen vakavien munasarjasyöpä (SOC) joko terveitä oireeton (HA) naiset tai naisten hyvänlaatuisia vakavien kasvaimia (BST). Taulukossa 2 esitetään kokonaismäärä määrällisesti proteiinien kunkin seerumin kokeessa. Yli 360-proteiinit kvantitoitiin jokaisessa kokeessa ja yhteensä 470 proteiinit kvantitoitiin ainakin jompaankumpaan kokeen. Kutistuvat nämä proteiinit geenin symboli johtaa hieman pienempi yhteensä johtuen eri isoformeja määritetty samasta geenistä. Kuviossa 1, yhdistyksen välillä log2 suhdeluvut kaikki mitattavissa proteiinien geeni symboli kaksi seerumin kokeissa on piirretty (vaaka- ja pystysuora akseli heijastavat SOC versus HA ja SOC vs. BST, vastaavasti). Huomaa, että kaikki suhteet on suunnattu niin, että positiivinen arvo merkitsee proteiinipitoisuus on korkeampi SOC. Proteiinit, joita ei havaittu yhdessä kokeessa edustaa pseudo suhde ”1” (log2 = 0) koetta varten.

Green kohdat edustavat proteiineja säädellään ylöspäin molemmissa kokeissa. Blue pistettä edustavat proteiineja säädellään ylöspäin yhdessä kokeessa ja ei havaittu muissa. * Benchmark merkki validoitu ELISA-määritys; ** New merkki validoitu ELISA-määrityksellä.

Kuva 1 paljastaa lupaava malli, joka voidaan odottaa vuonna kokeilu, joka vertaa kahta monimutkaisia ​​seoksia ja jossa jotkut ero proteiinit noudatetaan: useimmat proteiinit pudota lähellä alkuperää ja vaihtelevat korreloimatonta tavalla koska mitään systemaattista muutokset tapahtuvat, mutta monet niistä oikeassa yläkulmassa quadrant suuntaus pois irtotavarana. Varten luonteenomaiset tuloksemme, merkitsemme proteiinia kuin säädelty jos sen konsensus suhde täyttää tai ylittää 2-kertainen muutos (eli log 2 (SOC /HA) + log 2 (SOC /BST) ≥1 osoittamien rivi kuviossa 1). Kaikki 54 proteiinit täytä tätä kriteeriä näkyvät vihreinä, jos havaitaan molemmissa vertailuissa tai sininen jos havaitaan vain yhdessä. Nämä proteiinit ovat myös lueteltu taulukossa S1 (in lisätiedot).

Nämä proteiinit, jotka vastaavat meidän ”benchmark” proteiineja taulukosta 1 on merkitty tähdellä. Yhteensä seitsemän benchmark proteiinien havaittiin seerumin joista kuusi että aiemmin validoitu sekä yksi ylimääräinen merkki, IGFBP1, merkitty Kahdella asteriskilla jota validoitu täällä perustuu näissä kokeissa. Kaikki seitsemän havaitut benchmark proteiinit olivat ajan säätelee meidän kriteerit. Havaitut rikastus (7 7) on erittäin merkitsevä (p-arvo = 1e-6), jotka osoittavat, että meidän seerumin proteomiikka analyysi löytää korkea yhteensopivuutta validoituja määrityksiä.

peritoneaalinestettä kokeita

peritoneaalinestettä kokeissa verrataan käyttäen tarra-vapaa menetelmä, jonka avulla voimme määritellä kaikki havaitut proteiinit, paitsi ne, jotka sisältävät isotooppileimatussa kysteiini aminohappoa. Romahduksen jälkeen geenitekniikan symboli, 2950 proteiinit havaitaan molemmissa kokeissa. Vertailu log2 (peptidi spektrin lukemaa) välillä SOC BST on piirretty kuviossa 2. Yksinkertaisuuden proteiineja spektrin count = 0 yhdessä nestettä, mutta havaitaan muuta nestettä asetetaan 0,5. Määrittelemme proteiinia säädellään ylöspäin, jos se on SOC peptidi laskea vähintään kaksi kertaa suurempi kuin vastaava BST peptidin määrä. Vuodesta 2950 tunnistettu proteiinien geeni symboli, 358 valitaan mahdollisesti sääteli perustuu tämän kriteerin (katso taulukko S1). Proteiineja, jotka havaittiin myös säädelty seerumissa kokeet näkyvät punaisella. Olemme myös merkitä ne proteiinit ilmoittamat Kuk

et al

[34], joka arvioitiin SOC vesivatsanestesupernatan-. Meidän kokeissa 73 Kuk ehdokkaiden havaitaan, merkitty sinisellä kuvassa 2, ja jaetaan suuresti SOC ja BST laskee vain 37 sääteli. Kuk

et al

ei arvioinut materiaalia BST. Kuten seerumissa kokeissa löysimme merkittävän rikastamisen validoitu biomarkkereiden keskuudessa säädelty proteiineja vesivatsanestesupernatan-. Niistä 19 benchmark proteiinit kummassakaan peritoneaalinestettä (merkitty kuvassa 2), kaikki paitsi kaksi, MIF ja MSLN, oli säädelty (p-arvo = 2e-16). Huomaa, että MIF ylössäätöä on mahdollisesti liittyy näytteen toteaminen bias [9]. Tiedot täällä ovat yhdenmukaisia ​​päätelmien Kuk

et al.

Että syöpä vesivatsanestesupernatan- voi olla arvokas resurssi tunnistamiseksi biomarker ehdokkaita, vaikka meidän tulokset BST viittaavat siihen, että monet heistä eivät ole syöpä erityinen.

Red kohdat säädelty SOC seerumissa. Blue pisteet ovat proteiineja havaittiin munasarjasyövän vesivatsanestesupernatan- by Kuk et al [34]. Benchmark proteiinit leimataan. Pisteet yllä vihreä katkoviiva pidetään säädelty peritoneaalinesteeseen.

vertailu seerumissa vs. peritoneaalinesteeseen

Jos haluat vertailla kahta erilaista nestettä, konsensus log2 suhde molemmille seerumin kokeet funktiona log2 suhde SOC vesivatsanestesupernatan- yli BST peritoneaalinesteessä, kuten on esitetty kuviossa 3. koska vain proteiineja havaittiin sekä materiaaleja voidaan piirtää, tämä vertailu sisältää vain ne 358-proteiinit havaittiin sekä seerumin ja vatsaontelonesteessä. Yhteensä 17 näiden proteiinien nimettiin säädelty kummassakin. Yleistä vastaavuutta kaikkien proteiinien, mitattuna korrelaation suhteet, ei ole vahva, mutta tämä ei ole odottamatonta, koska useimmat proteiinit eivät muutu kahden lähteen välillä ja niiden kokeellisen lähteitä vaihtelun tulisi hallita. Vain keskuudessa proteiineja, jotka järjestelmällisesti vaihtelevat tapaus ja valvonnan pitäisi löydämme aloista. 17 proteiineja, jotka ovat ajan säännelty kummassakin kokeessa (lueteltu taulukossa 3 ja merkitty sinisellä kuvassa 3) on hyvin rikastettu validoidussa biomarkkereita taulukossa 1. Kaikki seitsemän havaittujen benchmark proteiinit mitattiin molemmissa kokeissa havaittiin sääteli (p-arvo = 2e-16). Kuitenkin suurin hyöty vietämme käyttämällä päällekkäisyys kahden kokeen on huomattavasti enemmän prosenttiosuutta validoitu merkkiaineiden kaikkien sääteli markkereita. Seerumin, 15% sääteli proteiinit olivat benchmark proteiineja ja vesivatsanestesupernatan- ehdokaslistan, 5% oli vertailuarvo proteiineja. Jos käytämme päällekkäisyys näiden kahden kokeiden osuus ehdokas proteiinien validoitu benchmark lista nousee 7 ulos 17 (41%).

Proteiinit säädellään ylöspäin molemmat nesteet ovat väriltään sininen. * Benchmark merkki validoitu ELISA-määritys; ** New merkki validoitu ELISA-määrityksellä.

Lisäksi kokeelliset tiedot, taulukko 3 sisältää myös huomautusta kahdelle GO luokkia, solunulkoinen alue ja tulehdus- tai vastauksena haavoittaen jossa ”kyllä” osoittaa proteiini selityksin kyseistä termiä joko lehtiä tai vanhempi solmu. ”Solunulkoinen alue” termi tarkoittaa, että proteiini sijaitsee ulkopuolella solukalvon ja voi erittyä vereen. Niistä 17-proteiineja, 14 (82%) niistä, on merkitty solunulkoisen verrattuna 17% kaikista proteiineista havaittu kokeissa. Tämä epäsuhta tukee oletusta, että yhdistämällä tietoja kiertävä ja proksimaalisesta nesteiden voisimme todennäköisemmin löytää proteiiniin biomarkkerit erittyy tai vapautuu kasvain sijaan aiheutuvat muualla isäntä. Olemme myös GO termejä tulehdukseen liittyvien tässä taulukossa sulkea pois proteiineja, jotka eivät välttämättä ole syöpää erityinen. Ainoastaan ​​kaksi 17 päällekkäisyys proteiinien tiedetään olevan mukana tulehduksessa.

ELISA validointi IGFBP1

validointi tilan kaikki 17 ehdokasta proteiinit on esitetty taulukossa 3. Kaupalliset ELISA määritykset ovat saatavilla 8 ja 17 proteiinien. Näistä kuusi oli validoitu aiemmissa tutkimuksissa (katso taulukko 1). Loput kaksi valkuaista tässä tutkimuksessa, MMP-9 ja IGFBP1, tutkittiin tässä tutkimuksessa.

Validointi suoritettiin kolmessa vaiheessa. Ensimmäisessä vaiheessa, markkereita testattiin sarja seoksia eri suhteissa yhdistettyjen seerumien OC potilaiden ja seerumiseos HA säätimet suodatuksen näytesarja (50 ° C, 9 HA valvonta) kappaleessa Menetelmät kuvatulla tavalla. Molemmat proteiinit oli korkeat pitoisuudet korkealla OC allas, mutta vain IGFBP1 todettiin pitoisuudesta riippuvuus suhde munasarjasyöpä seerumeista hallita. Molemmat proteiinit testattiin vastaan ​​yksittäisten näytteiden suodatus sarja (12 OC, 12 HA valvonta) kuvatut menetelmät. IGFBP1 tasot olivat merkittävästi korkeampia syövän seerumissa (p-arvo = 0,0097), kun taas MMP-9 tasot eivät olleet (p-arvo = 0,20). Kolmas joukko näytteitä, jotka oli rajoitettu serous munasarjasyöpään tapauksissa (44 SOC, 78 HA valvonta) käytettiin vahvistamaan korkeus IGFBP1. Tässä tietokokonaisuus, merkitys asian hallita ero kasvoi 5.0e-4 ja ROC-käyrä oli AUC 0,860. ROC käyrä näiden näytteiden kuvassa 4 osoittaa kykyä IGFBP1 luokitella OC vs. HA ja BST valvonta, joka osoittaa tuloksia sopusoinnussa käyttäytyminen proteomiikan kokeita.

SOC vs HA näkyy mustana ja SOC vs BST sinisellä.

keskustelu

proteomiikan profilointi seerumia tai plasmaa löytää syöpä biomarkkereita ei ole vielä tavannut laajalti osoittama menestys [19] – [26], jossa proteiinit olivat validoitu riippumattomia näytteitä tai käyttää riippumattomia alustoja. Yksi merkittävä poikkeus on haimasyöpä tutkimuksen avulla hiirimallissa ja syvällistä jakotislaamalla proteiineille [30]. Tässä käsikirjoitus on käytetty samanlaista lähestymistapaa tandem MS Proteomiikan profiloinnin seerumin yhdistettynä profiloinnissa peritoneaalinesteeseen kuin proksimaalisen kasvain nestettä. Olemme tuottaneet lyhyt luettelo 17 biomarkkereiden löytyy jopa säänneltyä sekä seerumin ja proksimaaliseen nestettä – jotka sisältävät 7 proteiinit, jotka on validoitu käyttämällä olemassa olevia ELISA-määritykset, mukaan lukien uusi SOC biomarkkereiden (IGFBP1). Loput 10 merkkiä tässä ryhmässä voi edustaa laadukkaita ehdokkaita.

Menestyksemme tunnistamisessa monissa validoitu markkereita saattanut aiheuttaa useita toimintoja kokeellisessa suunnittelussa. Näyte bias poistettiin huolellisesti näytteiden keräämistä ja tiukasti vastaavia tapauksia kontrolleihin. Sen lisäksi matching iän, rodun ja suvussa OC, verrokit myös Hyväksytty hormonikorvaushoidon käyttö ja päivien ennen leikkausta verta piirtää. HRT on osoitettu dramaattisesti vaikuttaa tasoja monien seerumin proteiineihin [35], [36]. Thorpe

et al

[37] osoitti, että verta leikkauspäivänä liittyy korkeus useiden seerumin proteiineihin. Tämä bias vältettiin tässä huolellisella näyte matching case /ohjaus kokoelma kunnossa. Toinen tärkeä näkökohta tässä analyysissä oli käytössä laaja näytteen fraktiointi ennen MS. Tämä muotoilu, joka on osoitettu saada herkkyyksiä 10 ng /ml pitoisuus [35], [36], annetaan lisää syvyyttä proteomista kattavuus tandem MS tunnistaa potentiaalisesti merkittäviä muutoksia.

Tärkeä osa suunnittelua seerumin kokeissa oli käytössä kolme erilaista aiheista: munasarjasyöpä potilaat, terveet oireeton vapaaehtoisilla ja potilailla, joilla on hyvänlaatuisia kasvaimia. Proteiinit säädellään ylöspäin SOC suhteessa HA mutta ei suhteessa BST eivät todennäköisesti syöpää erityinen ja eliminoitiin huomioon. Sama päti proteiinien sääteli suhteessa BST mutta ei HA. Käyttämällä vain SOC vs BST Vertailun olisimme löytäneet 5 out of 7 määrällisesti validoitu merkkiaineita vastakohtana 7 ulos 7 (TIMP1 ja SLPI poistuisivat).

Yhdistämällä seerumi tietoja tietojen proteomic profilointi vatsakalvon vesivatsanestesupernatan- pystyimme tunnistamaan proteiinien ryhmään on suuri osa meidän oikeita positiivisia proteiinit; poistamalla proteiinit ei löytynyt myös peritoneaalinesteeseen vähentäneet mahdollisia ehdokkaita 54-17 säilyttäen kaikki seitsemän benchmark proteiinien määrällisesti seerumissa. Tämä tulos tukee oletusta, että proteiinit tunnistettu nestettä proksimaalisesti kasvain ja myös kiertävän nesteen tunnistaa tehokkaita biomarkkereita. Kuk

et al

[34] osoitti, että vesivatsanestesupernatan- peräisin munasarjasyöpäpotilaalle sisälsi suuren määrän laadukkaita markkereita, ja tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​näiden havaintojen. Kuitenkin, koska määrä benchmark proteiineja löytyy peritoneaalinesteeseen on suurempi kuin seerumissa, ei voi tehdä väitettä, että enemmän markkereita voidaan tunnistaa edellyttämällä havaintoja sekä seerumin ja proksimaalisen nestettä. Todellakin meidän tiedot ja että tästä Kuk

et al.

Mukaan vesivatsanestesupernatan- proteomiikka tiedot voivat sisältää enemmän laadukkaita merkkejä. Tulosten perusteella näyttää vain, että vaatimus proteiineja, joita on noudatettava molemmissa näytteissä voi johtaa suurempi osa laadukasta markkereita. Tämä hypoteesi ei voida vahvistaa, kuitenkin ilman systemaattisesti arvioida todellinen negatiivinen markkereita sekä tosi positiivisia. Lisäksi ei tunnistaa kaikki tiedossa markkereita ei osoita, että merkki ei ole laadukkaita tai että prosessi on välttämättä vika. Esimerkiksi alustamme ei pysty tunnistamaan CA 125 tai kolme muuta merkkiaineiden me aluksi valitaan vertailukohtana proteiineja, mahdollisesti johtuen herkkyydestä rajoitusten massaspektrometrialla. Ottaen kuitenkin huomioon, että alusta pystyy määrittämään nykyisten validoitu markkereita, voisi löytää vastaavuutta näiden alustojen välillä rauhoittavaa, jonka löysimme täältä.

Niiden yhteenlaskettu dataa neljällä eri fraktiointimenetelmiä Kruk

et al .

tunnistettu 445 proteiineja koko joukko huomattavasti pienempi kuin tuhansien proteiinien ryhmien me havaittu kokeissa. Tämä ero johtuu osittain niiden keskittyä subproteome proteiinien alle 100 kDa meidän setti sisältää 490 proteiineja suurempi kuin 100 kDa. Mutta käyttö intensiivinen fraktioinnin voi muodostavat loput eroja. Näistä eroista huolimatta johtopäätökset niiden tutkimus ovat hyvin pitkälti meidän havainnot; levittämisen jälkeen jotkut data mining tekniikoita, he vähensivät ehdokaslistan 77 proteiineja (mukaan lukien 25 tiedossa OC markkereita), joista 73 havaittiin tutkimuksessamme. Kuten ilmenee kuviosta 2, suhteellinen runsaus on Kuk proteiineista ovat joitakin, jotka ovat jopa sekä alas; vain puolet näistä ovat jopa kaksi-kertaisesti suhteessa hyvänlaatuisia vatsaontelonesteessä. Niistä 19 benchmark proteiinit havaittiin joko altaan peritoneaalinesteeseen, 17 on spektrin laskee kaksi kertaa suurempi SOC kuin BST. Tämä viittaa siihen, että vaikka Kuk

et al

paikkansa niiden väitettä, jonka vesivatsanestesupernatan- on runsaasti potentiaalia markkereita, työmme ehdottaa, että sisällyttäminen valvonnan materiaali voi olla hyödyllistä vähentää vääriä positiivisia. Yksi vahvuuksista Tässä tutkimuksessa käytössä suhteellinen runsaus SOC BST löytää proteiinien spesifisiä pahanlaatuinen sairaus.

Kysymys sekoittavia tulehdusproteiineja (äskettäin käsitelty Checlinska

et al

[38]) minimoituu monin tavoin tutkimuksessamme. Ensiksi, meidän ehtyminen ja fraktiointimenetelmiä laitedokumentteja proteiineihin pelkän erittäin runsas ne, jotka sisältävät usein monet proteiinit liittyvät tulehdukseen. Lisäksi meidän vertailuja syövän ja hyvänlaatuinen sairaus suodattaa pois monia proteiineja, jotka nostavat johtuu läsnäolo hyvänlaatuinen kasvain; tulehdusproteiineja yhteinen molemmille olosuhteet eliminoidaan. Lisäksi, koska olemme kohdistamista eritettyjen proteiinien etsimällä päällekkäisyyksiä proteiinien proksimaalisen nestettä ja ne seerumissa, voimme vähentää mahdollisuutta tarkkailla seerumin proteiinien maksassa kuin tulehdusreaktio. Silti Taulukko 3 sisältää kaksi proteiinia (ORM1, SERPINA3) ulos 17 biomarkkereiden ehdokkaiden jotka ovat rooleja tulehdus. Vaikka olemme parantanut osuus biomarkkerit liittyvät tulehdukseen edelliseen profilointi kokeiluja [39], [40], emme voi kokonaan poistaa kaikki häiritsevien tekijöiden ja on luotettava huomautusta, kun käytettävissä on edistetty suodatusta.

tässä työssä olemme myös havainneet ja validoitu uusi biomarkkereiden oireenmukaiseen vakavien munasarjasyöpä, insuliini kasvutekijää sitovan proteiinin 1. kuten IGFBP2, IGFBP1 kuuluu insuliinin kaltaisen kasvutekijää sitovan proteiinin perheen ja sitoo sekä insuliinin kaltaiset kasvutekijät, IGF1 ja IGF2. Kuten muut IGFBP IGFBP1 ilmentyy paikallista kudoksissa, mukaan lukien munasarja-, ja on läsnä normaalissa plasmassa. Seerumin IGFBP1 on merkittävästi vähentynyt postmenopausaalisilla naisilla ottaen hormonikorvaushoito [35]. Vaikka kohonnut seerumin IGFBP2 on osoitettu useissa syövissä, mukaan lukien munasarjojen [10], tämä on ensimmäinen näyttö siitä, että IGFBP1 taso kasvaa seerumissa tai plasmassa potilailla, joilla on munasarjasyöpä. Eräs toinen tutkimus osoitti kohonneet IGFBP1 (ja IGFBP2) plasmassa potilailla, joilla on pään ja kaulan alueen syövät [41].

Lopuksi myös huomata, että joukossa 17 markkereita osoitettu olevan säädelty seerumissa ja askiittinesteestä SOC, kaikki vaan kolme erittyy proteiineja. Vaikka se on rutiininomaisesti väitti, että eritettyjä proteiineja pitäisi parempana ehdokkaina koska ne saattavat erittää vereen, tämä väite ei useinkaan tueta empiirisesti. Tuloksemme antaa vahvan tuen tälle yleisesti hyväksytty hypoteesi.

Kuten johdannossa tämän käsikirjoituksen, vaikka useat seerumin biomarkkereita munasarjasyöpä on löydetty ja validoitu, kaikki markkereita ovat osoittaneet huono suorituskyky pre -diagnostic näytteitä. Tässä tutkimuksessa, ryhdyimme luoda valmiudet proteomic profilointi seerumin löytää munasarjasyöpään biomarkkereita, kun sitä käytetään yhdessä muiden profilointia proksimaalisen nestettä. Kun osoitti tämän lähestymistavan onnistumisen, voimme nyt luottavaisin soveltaa näitä menetelmiä haastavampaa oireita edeltäviä näytteitä.

Materiaalit ja menetelmät

Rekrytointi ja kokoelma ihmisen verta ja peritoneaalinestettä varten löytö

Kaikki tutkimusta tämän tutkimuksen nimenomaan harjoitettuun Fred Hutchinson Cancer Research Centerissä Institutional Review Board hyväksyttyjen käytäntöjen, IR # 6045 ja IR # 6094. Kaikki ihmisen näytteet olivat peräisin henkilöillä, jotka kunhan kirjallinen suostumus. Tiedot analysoitiin anonyymisti.

Serum naisten vakavien munasarjasyöpä (SOC), hyvänlaatuiset vakavien kasvaimet (BST), ja terveistä oireeton (HA) valvonta käytettiin meidän proteomic löytö ja validointi kokeita. Näytteiden kerääminen protokollat ​​on aiemmin kuvattu yksityiskohtaisesti muualla [32], [37]. Lyhyesti, seerumi ja peritoneaalinesteessä naisilta kanssa SOC ja BST kerättiin ennen leikkausta ja kemoterapian osana munasarjasyövän erikoistunut tutkimus- Excellence (SPORE) rahoittaa National Cancer Institute. Diagnoosi SOC ja BST vahvistettiin keskeinen patologia tarkastelu. Ikä ja hormonikorvaushoidon (HRT) sovitetun HA valvonta rekrytoitiin munasarjasyöpäsolu seulontaohjelman, jossa kaikki potilaat ovat oireettomia valvontaa. Kaikki seeruminäytteet, riippumatta kokoelman lähteen, prosessoitiin samalla menettelyllä; veri kerättiin 10cc Vacutainer seerumin Separator Putket (SST), ja annettiin seistä 30 minuuttia 4 tuntia huoneen lämpötilassa. Putkia sentrifugoitiin 1200 x g 10 minuutin ajan, sitten jakaa useiksi 1-ml eriä seerumia, ja niitä säilytettiin -80 astetta. Ennen käyttöä, kukin 1 ml: n injektiopullon seerumia sulatettiin jäällä, jakaa useiksi 110 mikrolitran subaliquots, ja säilytettiin sitten -80 astetta.

peritoneaalinesteessä kerättiin steriiliin tyhjiö säiliössä, leikkaussalissa kirurgisella henkilökunta. Käytä steriiliä 1cc ruiskulla, 20000 yksikköä hepariinia (Pulloissa on 10000 yksikköä cc) lisättiin kuhunkin litra nestettä estämään veritulppien muodostumista. Laboratorio, neste siirrettiin kartiomaiseen sentrifugiputkiin (50cc tai 250cc riippuen nesteen tilavuus) ja sentrifugoitiin tasapainoinen sentrifugoidaan 2000 rpm 5 minuutin pelletoimiseksi solukomponentin. Solutonta supernatanttia siirrettiin yksi 50cc kartioputkeen ja viisi 1,5 ml mikrosentrifugiputkille Säilytys -80 pakastin asteeseen.

valinta yksilöitä löytö kokeita

Only postmenopausaalisilla naisilla, joilla on keskimääräinen munasarjasyövän riski tai rintasyövän sisällytettiin (keskimääräinen riski merkitsee merkittävää suvussa rinta- tai munasarjasyövän ja ei ole aikaisempaa syövän diagnoosia) löytö kokeissa. Ensimmäinen Seerumin löytö kokeilu verrattuna naisiin, joilla myöhään SOC HA valvontaa ja toinen verrattuna naisiin, joilla BST. SOC altaat koko 4 (terveisiin kontrolleihin) ja nro 5 (BST) valittiin tiukasti sovitettu valvonnan iän (+/- 2 vuotta), näyte varastointiaika (+/- 1 vuosi) ja HRT [35 ]. Lisäksi koska kokoelma ympäristö on tunnettu vaikutus seerumin proteomiin [37], tapauksissa ja verrokit vastasivat myös sen perusteella, onko verinäytteen tapahtui leikkauspäivänä (SOC vs. BST tarkastukset) vai ovatko ne kerättiin kolme päivää tai enemmän ennen leikkausta (SOC vs. HA valvonta). Sillä peritoneaalinestettä kokeissa pooli koko 10 SOC näytteitä verrattiin poolin kokoa 4 BST näytteitä. Allas koko BST on pienempi, sillä vaikka suuri osa SOC potilaista kehittyy askites, muutama BST potilaat vertailukelpoisia vesivatsanestesupernatan-.

valinta seeruminäytteistä validointitarkoituksiin kokeita

Kokeet validoimiseksi proteiinit tehtiin kaksi markkereita kolme aiemmin kuvattu [32], [33] sarjaa seeruminäytteitä. Nämä sarjat kuului kaksi suodatusta sarjaa. Ensimmäinen koostui yhdistettyä näytettä 50 OC potilaista (tapaus pool) sarjalaimennettu seerumia 9 HA valvonta (ohjaus pool). Toinen koostui Yksittäisten näytteiden 12 OC potilaista ja 12 HA valvontaa. Kolmas suurempi joukko yksittäisiä näytteitä käytettiin varmistamaan proteiineja, jotka osoittivat merkittävää nousua toisen sarjan. Digestio suoritettiin yön yli 37 ° C: ssa.