Krooninen sairaus

tiivistelmä

Fhit proteiini katoaa tai pienenee suuressa osa ihmisen kasvaimista, ja sen palauttaminen laukaisee apoptoosin ja estää kasvaimen muodostumista tai etenemistä kokeellisissa malleissa. Tässä kuvaamme tunnistamisen ehdokas Fhit-vuorovaikutuksessa proteiinien kanssa soluliman ja solukalvon lokalisointi. Näistä anneksiini 4 (ANXA4) validoitiin samanaikainen immunosaostus ja konfokaalimikroskopialla kumppanina tämän uuden Fhit proteiinia monimutkainen. Kirjoittajat raportoivat, että yliekspressio Fhit estää Annexinia A4 translokaatio välillä sytosolista solukalvon A549 keuhkosyövän soluja hoidettiin paklitakselilla. Lisäksi Paklitakselihoidon yhdistettynä Ad

FHIT

vaikuttaa synergistisesti lisäämään apoptoottinen nopeus syöpäsoluja sekä

in vitro

ja

in vivo

kokeita.

Citation: Gaudio E, Paduano F, Spizzo R, Ngankeu A, Zanesi N, Gaspari M, et al. (2013) Fhit Delocalizes anneksiini A4 solukalvossa sytosoliin ja herkistää Lung Cancer Cells paklitakseliin. PLoS ONE 8 (11): e78610. doi: 10,1371 /journal.pone.0078610

Editor: Srikumar P. Chellappan, yliopisto Catanzaro, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 14 syyskuu 2013; Julkaistu: 06 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Gaudio et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat AIRC (Associazione Italiana Ricerca Cancro) ja National Institutes of Health (NIH) avustus CA152758 (CMC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

FHIT

geeni, joka käsittää

FRA3B

, aktiivisin yleinen hauras sivusto kromosomissa 3p14.2 [1], [2] on jäsen histidiini kolmikko (HIT) proteiinien perheen, johon kuuluu joukko nukleotidin sitovien ja hydrolysoimalla proteiinit histidiinillä kolmikko motiiveja, edustettuna kaikissa organismien [3].

FHIT

koodaa tuumorisuppressoriproteiinia joiden menetys on osallisena suuri osa syövistä; Itse asiassa, sen poistaminen tai tappio ilmaisun on raportoitu pään ja kaulan [4], [5], maha [6], kohdunkaulan [7], keuhko [8], rintojen [9], [10], ja hematopoieettiset kasvaimia [11]. Rooli Fhit kasvainten synnyssä vahvistettiin hiirissä, joissa

Fhit

geneettinen ablaatio johti lisääntynyt alttius monenlaisia ​​spontaaneja kasvaimia [12], [13]. Lisäksi poistetaan joko toinen tai molemmat

Fhit

alleelien hiirillä suurempi herkkyys karsinogeeni N-nitrosomethylbenzylamine (NMBA), useimmat

Fhit

– /-

ja

Fhit

+/- hiiret kehittää forestomach kasvaimia (adenoomia, papillomas, ja invasiivisia karsinoomia) yhden annoksen NMBA verrattuna villin tyypin valvontaa [12], [14], joka kehittyi hyvin vähän. Mielenkiintoista on, että

FHIT

myös onnistuneesti käytetty terapeuttisen geenin syöpäsolulinjoissa, jossa se laukaisee apoptoosin, ja useissa prekliinisissä

FHIT

-null syöpä, mukaan lukien keuhkojen, ruokatorven, haima, rintojen ja leukemia [15] – [20]. Kuitenkin raportit koskevat mekanismit Fhit vaimentimen toiminta on harvempaa ja uudempia. Fhit koodaa diadenosine polyfosfaatin (Apna) hydrolaasi, joka pilkkoo substraatteja, kuten diadenosine

P

1,

P

3 trifosfaatti (ApppA) ja diadenosine 5 ’, 5’ ’ ’-

P

1,

P

4-tetrafosfaatti (AppppA) AMP plus muut nukleotidin [21], [22]. Kautta adenovirus- ilmentyminen

FHIT

mutanttialleelia, olemme osoittaneet, että Fhit-substraatin sitoutumisen on rajoittava tuumorisuppressiogeeneksi, kun taas sen katalyyttinen aktiivisuus ei tarvita Fhit kykenee laukaisemaan apoptoosin [23]; Lisäksi osoitimme, että erittäin konservoituneita Fhit tyrosiini 114 (Y114), jotka voidaan fosforyloida Src [24], on tarpeen käynnistää kaspaasiriippuvaisen Fhit-välitteisen apoptoosin [25]. Viime aikoina käyttämällä proteomic lähestymistapaa, tunnistimme Fhit proteiinikompleksi lukien Hsp60 ja Hsp10, joka voi välittää sekä Fhit vakautta ja sen mitokondrioiden lokalisoinnin; kun mitokondrioissa, Fhit sitoutuu ja stabiloi ferredoksiinia reduktaasin (Fdxr), mikä johtaa tuotannon modulointi reaktiivisten hapen lajien (ROS), varhainen vaihe Fhit indusoiman apoptoosin [26]. Todisteet Fhit mitokondrioiden lokalisointi johti myös siihen havaintoon, että se lisää kertyminen Ca2 + osaksi organelle, sopusoinnussa sen roolin apoptoosin sopivissa olosuhteissa [27].

Leveä subsellulaariseen jakautuminen Fhit kannusti meitä jatkaa etsintää romaani Fhit proteiinin kumppanit edelleen valaista sen osassa kasvaimen tukahduttaminen. Tässä osoitamme, että Fhit vuorovaikutuksessa anneksiini 4; tämä vuorovaikutus voi estää translokaatiota anneksiini 4 välillä sytosolista solukalvon hoidon aikana keuhkosyövän soluja paklitakselin kanssa. Tämän seurauksena eksogeeninen

FHIT

ennallistamisen

FHIT

-null syöpäsoluja vaikuttaa synergistisesti paklitakselin puhkeamisessa apoptoosin

in vitro

ja kasvaimen regressio

in vivo

. Yhdessä meidän havainnot viittaavat siihen, että Fhit palauttaminen voisi olla rooli voittamisessa lääkeresistenssin ja jotka yhdessä paklitakselin tölkki on kelvollinen lähestymistapa syövän hoidossa.

Tulokset

eristäminen Fhit proteiinikomplekseille solusta kalvot

Aiemmissa proteomic lähestymistapa, me eristettiin liukoinen Fhit proteiinikompleksin A549 syöpäsolujen [26]. Käyttäen hieman muunnettua lähestymistapaa, jonka tarkoituksena on tunnistaa Fhit-vuorovaikutuksessa proteiinien solukalvojen, käytimme rekombinantti-adenoviruksen kuljettaa

FHIT

cDNA muokattu sen 3 ’päättyy sekvenssin, joka koodaa histidiini-kuusi epitooppimerkin ( Ad

FHIT-

His6), kuten aiemmin on kuvattu [26]. Lyhyesti, A549 keuhkosyöpä solut infektoitiin joko Ad

FHIT

(käytettiin kontrollina) tai Ad

FHIT-

His6 klo MOI50 ja käsiteltiin ditiobis [sukkinimidyylipro-] (DSP), risti -liitosalue joka kulkee kalvot ja korjauksia proteiineja monimutkaisissa elävissä soluissa. Solut hajotettiin ja kalvon rikastettu fraktio eristettiin; Fhit-His6 rekombinanttiproteiini yhdessä sen ehdokkaan proteiini kumppanit eristettiin nikkeli helmiä innokas varten His6 epitooppimerkin. Puhdistetut proteiinit käsiteltiin ditiotreitolia (DTT) pilkkomiseksi DSP ja erottaa monimutkainen, ja pilkottiin trypsiinillä; proteiini komponentit tunnistettiin neste- /kromatografisesti tandem massaspektrometria (LC-MS /MS). Sen jälkeen proteiini tunnistamiseen tietokantahaku, tarkastus LC-MS /MS-tulokset tehtiin arvioimaan yksinoikeudella läsnäolo massan huippujen kuuluvien ehdokas kumppani proteiineja näytteissä infektoitujen solujen Ad

FHIT-

His6. Tunnistettujen proteiinien on lueteltu taulukossa 1.

Fhit proteiini on vuorovaikutuksessa anneksiini 4

Aiemmin osoitettiin, että ei ole Fhit proteiinin syöpäsoluissa johti vastustuskyky paklitakseli [28] ; Anneksiini 4, proteiinia sekä plasman ja sytoplasman lokalisointi, on raportoitu olevan yli-ilmentynyt useissa syöpäsolujen; erityisesti on osoitettu, että anneksiini 4 yli-ilmentyminen myötävaikuttaa syöpäsolujen resistenttejä paklitakselia [29]. Siten valottaa mekanismeja lääkeresistenssin

FHIT

-minus syöpäsoluja, päätimme keskittyä anneksiini 4 joukossa juuri tunnistettu ehdokas Fhit kumppaneita. Anneksiini 4 kuuluu super-perheen läheistä sukua kalsiumia ja kalvoon sitovat proteiinit, jotka osallistuvat erilaisiin solun funktioihin, mukaan lukien rakkula ihmiskauppa, solunjakautumisen, apoptoosin, kalsium- signalointi ja kasvun säätelyssä. On ehdotettu, että joitakin muutoksia anneksiini ilmaisun aikana tuumorigeneesiä voivat aiheuttaa resistenssin kemoterapeuttiset aineet, ja että yksittäiset annexins voi osoittautua terapeuttisina kohteina [30] – [35]. Anneksiini 4 (ANX4) -geeni koodaa proteiinia (eli ANX4 tai A4) lähes yksinomaan ilmaistaan ​​epiteelisoluissa [31] ja yli-ilmentyy aikana paklitakselihoidolla ja paklitakselin kestävä solulinjoissa; transfektointi ANX4 cDNA 293-T-solut johti kolminkertainen paklitakselin vastus [29], [36]. Välinen korrelaatio läsnä Annexinia 1 (ANX1) ja MDR (multi lääkeresistenssin) proteiinien rintasyövän soluissa, mikäli ensimmäinen suora näyttöä roolin anneksiini monilääkeresistenssin [37].

arvioimiseksi Fhit ja anneksiini 4 vuorovaikutusta, teimme samanaikainen immunosaostus kokeessa käyttäen proteiinia lysaatit valmistettiin, kuten on kuvattu edellä (kuvio 1, A ja B). Fhit ja anneksiini 4 rinnakkaispaikantumisen tutkittiin konfokaalimikroskopialla. Kuten kuviossa 1E, sekä Fhit ja anneksiini 4 pääosin esittävät sytoplasmisen subsellulaaristen rinnakkaispaikantumisen.

. A549 keuhkosyövän solut infektoitiin Ad

FHIT

-wild tyyppiä tai Ad

FHIT-

His6 at MOI50; 48 h infektion jälkeen, solut käsiteltiin DSP ja hajotettiin Mem-PER Eukaryotic Membrane Protein Extraction Kit antaa yhteensä lysaatit rikastettu membraanifraktio. Yhteensä lysaatit immunosaostettiin nikkeli helmiä. Immunosaosteita analysoitiin immunoblottauksella (IB) anti-Fhit ja anti-anneksiini A4 vasta-aineita. B. A549-soluja transfektoitiin ohimenevästi ilmentymisplasmidilla, joka koodaa nisäkkään

Annexin4-

V5 (8 ug). 48 h transfektion jälkeen, solut käsiteltiin DSP: n ja kokonais-lysaatit immunosaostettiin (IP) anti-V5-vasta-ainetta. Immunopresipitaatit seulottiin immunoblottauksella (IB), jossa anti-Fhit ja anti-anneksiini 4-vasta-aineita. CD. HEK293-solut pilkata tretated tai tretaed paklitakseliin 24 tuntia (800 nM) ja hajotettiin. Kokonaisproteiinista lysaatit Immunoprecipited IgG, Fhit ja anneksiini 4-vasta-aineita, kuten on osoitettu. Havaitsemiseksi endogeenisen anneksiini 4 ja Fhit suoritettiin ilman DSP ristisitojaa.

Kuten kuviossa 1A ja 1B, Fhit ja anneksiini 4 vuorovaikutusta havaittiin pääasiallisesti soluliman otteita. Olemme edelleen suorittaa yhteistyössä immuunisaostuskokeissa endogeenisten Fhit ja anneksiini 4 proteiineja HEK293-soluissa ja osoitimme näiden välinen vuorovaikutus proteiinien myös ilman DSP ristiliittäjää, tai ilman paklitakselin (kuviot 1C ja 1D). Immuunisakkautuksen suoritetaan Fhit vasta-seurasi immunoblottaus suoritettiin anneksiini 4 antiseerumi oli selvästi viittaavia Fhit-anneksiini 4 endogeeninen monimutkainen ehjä cells.The suoraan tapa maaohjelmien välillä endogeenisten proteiinien olivat selvästi osoitus vuorovaikutuksen (IP : Fhit, ja IB: anneksiini 4). Valitettavasti, koska teknisten vaikeuksien vuoksi yhteistyössä kulkeutumista IgG ja Fhit proteiinia, päinvastainen lähestymistapa, joka on immuunisaostuksessa endogeenisen Annexinia 4-proteiinia, jota seuraa Fhit havaitseminen oli unsuccessuful.

Fhit yliekspressio estää anneksiini 4 translokaatio kohteesta sytosolista solukalvon

Fhit ja anneksiini 4-proteiinin ilmentymistä arvioitiin paneelia syöpäsolulinjoissa (kuvio S1), Fhit ilmentyminen menetetään useimmissa solulinjoissa tutkittiin. Irtoa valot merkitys Fhit-anneksiini 4 proteiinikompleksi, suoritimme meidän kokeita kaksi niistä, A549 ja Calu-2, joka vähäisiä tai ei Fhit ilme, vastaavasti. Määrittelemiseksi paremmin solunosasijainti on Fhit-anneksiini 4-proteiinin monimutkainen, suoritimme solun fraktioinnin kokeissa. Kuten kuvioissa 2A ja 2C, pohjapinta anneksiini 4 jaetaan sekä sytosoliin ja solukalvon. Treatment of A549 ja Calu-2 keuhkosyövän soluja paklitakselin indusoiman sytosolisen ehtyminen anneksiini 4, joka koki ilmeisesti täysin translokaatio sisäpuolelle solukalvon. Fhit yli-ilmentyminen estää anneksiini 4 translokaatio päässä sytosolista solukalvon jälkeen havaittiin Paklitakselihoidon. Osoittaa, että vaikutukset ovat nimenomaan ohjaa Fhit-anneksiini 4 vuorovaikutusta, joka on samanlainen koe suoritettiin ottaen huomioon solunosasijaintia anneksiini 1 ja MDR (multi-drug resistance protein), jotka molemmat osallistuvat vastustuskyky kemoterapia [37] , [38]. Kuten kuvioissa 2B ja 2D, ei anneksiini minä eikä MDR subsellulaarisista lokalisoinneissa vaikutti Fhit yli-ilmentymisen. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että Fhit proteiini nimenomaan häiritsee anneksiini 4 translokaatio välillä sytosolista solukalvon, havaittiin paklitakselia saaneilla A549 ja Calu-2-soluissa.

A-C. A549 ja Calu-2 keuhkosyöpään solut infektoitiin Ad

GFP

tai Ad

FHIT

at MOI50; 48 tuntia myöhemmin, solut valehoidettujen tai hoidettiin paklitakselilla (800 nM) vielä 24 tuntia. Proteiinit sytosolisia ja kalvon fraktiot erotettiin polyakryyliamidigeelillä, siirrettiin nitroselluloosasuodattimelle ja tutkittiin anneksiini 4 vasta-ainetta. GAPDH ja E-kadheriinin käytettiin normalisoimaan Proteiinilisäyksen sytosolin ja solukalvon proteiineja, vastaavasti. B-D. A549 ja Calu-2 keuhkosyöpään solut infektoitiin Ad

GFP

tai Ad

FHIT

-wild-tyyppinen; 48 tuntia myöhemmin solut käsiteltiin paklitakselia (800 nM) vielä 24 tuntia. Proteiinit sytosolisia ja kalvon fraktiot erotettiin polyakryyliamidigeelillä, siirrettiin nitroselluloosasuodattimelle ja tutkittiin anneksiini 1 ja MDR (multi-drug resistance protein) vasta-aineita. GAPDH ja E-kadheriinin käytettiin normalisoimaan Proteiinilisäyksen sytosolin ja solukalvon proteiineja, vastaavasti.

anneksiini 4 ehtyminen yhdistettynä Fhit yli-ilmentymisen ja paklitakselihoidolla synergistisesti indusoi esto ja laukaisee apoptoosin keuhkosyöpään solujen

tutkimiseksi rooli Fhit-välitteisen lohko anneksiini 4 translokaation päässä sytosolista solukalvon mekanismiin lääkeresistenssin, teimme solujen kasvun käyrät eri olosuhteissa. Kuten on esitetty kuviossa 3A ja 3B A549 ja Calu-2 keuhkosyövän soluja, solumäärä laskettiin Ad

FHIT-

infektoiduissa soluissa kontrolleihin verrattuna; hieman voimakkaampaa solujen kasvun inhibitio havaittiin soluissa, joita käsiteltiin paklitakselia. Lopuksi, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [26], havaitsimme synergiavaikutusta proliferaationopeus eston A549 hoidettiin paklitakselilla plus Ad

FHIT

. Eräässä edustavassa kokeessa kuviossa 3C, Virtaussytometriaa käytettiin tutkimaan solusyklin häiriöiden A549-soluja infektoitiin Ad

FHIT

, jossa (800 nM 24 h) tai ilman sitä paklitakselihoidolla; A549-soluja infektoitiin Ad

FHIT

osoitti sub-G1 huippu oli havaittavissa (13%), mikä on yhdenmukaista aiempien havaintojen [26]; samanlainen vaikutus jälkeen saatiin 800 nmol Paklitakselihoidon. Synergistinen vaikutus havaittiin, kun yhdistämällä Ad

FHIT

ja paklitakselihoidolla (25% osa-G1 murto).

A-B. A549 ja Calu-2-solut valeinfektoitiin, Ad

GFP

tai Ad

FHIT

infektoituja soluja MOI10 24 tuntia, sitten käsiteltiin kanssa tai ilman 800 nM paklitakselin vielä 6 h ja laskettiin . Pylväsdiagrammit osoittavat keskiarvo ± SEM arvot kolmesta eri kokeita (* P 0,05). Chou-Talalay Methos levitettiin laskea luonteen yhdistelmien (CI 1, synergia). C. A549-solut olivat joko mock-tai infektoitiin Ad

GFP

tai Ad

FHIT

, tai jätetään hoitamatta tai niitä käsiteltiin 800 nM paklitakselia, ja sitten analysoitiin virtaussytometrillä.

Nämä tiedot viittaavat siihen, että palauttaminen Fhit toiminnon Fhit-negatiivinen pahanlaatuisia soluja, yhdessä paklitakselin kanssa, voisi edustaa mahdollinen uusi lähestymistapa hoidettaessa potilaita, keuhkosyöpä. Itse asiassa alentamalla herkkyys lääkkeen annon anneksiini 4 välittämän solunsalpaajaresistentti kasvaimia, Fhit palauttaminen voisi edustaa kiehtova lähestymistapa saada paremmin potilaiden lopputulokseen.

Voit selvittää vuorovaikutusta Fhit ja anneksiini 4 voisi olla rooli on Fhit välittämiä solun kasvun esto ja apoptoosin, anneksiini 4 hiljennettiin pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t), joiden tarkoituksena on estää anneksiini 4 proteiinin ilmentymisen. Kuten on esitetty kuviossa 4A, anneksiini 4-proteiinin ekspressiotasot olivat merkittävästi vähentää, kun anneksiini 4 siRNA: iden transfektion, puuttuessa tai läsnä paklitakseli. Yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten [36], mock-transfektoituja soluja ja soluja, jotka on transfektoitu salattu siRNA osoitti anneksiini 4-proteiinin säätelyä jälkeen Paklitakselihoidon kontrolleihin verrattuna, kun taas mitään muutoksia ei havaittu A549 anneksiini 4-köyhdytettyä näytteet joko poissa tai läsnä ollessa paklitakseli. Yhdistelmä paklitakselihoidolla anneksiini 4 ehtyminen oli synergistinen vaikutus soluproliferaatioon esto, jossa solujen määrä on merkittävästi pienempi verrattuna paklitakselihoidon tai anneksiini 4-erityisiä siRNA yksinään (kuvio 4B). Ei vaikutusta proliferaatioon havaittiin transfektion jälkeen salattu siRNA. Testasimme myös A549-solujen lisääntymisen korko jälkeen anneksiini 4 hiljentäminen tai infektion Ad-

FHIT

at MOI25 tai yhdistetyt hoidot (kuvio 4C). Anneksiini 4 ehtyminen ja Fhit yli-ilmentyminen aiheutti merkittävä väheneminen solujen määrä verrattuna kontrolleihin; edelleen dramaattinen väheneminen solujen määrä havaittiin lisäämällä paklitakseli, mikä osoittaa synergistisen vaikutuksen.

. A549-solut olivat valetransfektoiduista tai transfektoitu anneksiini 4 siRNA: ita (50 nM) tai salattu siRNA: ita (50 nM) 72 tuntia. Solut lysaatit immunoblotattiin anneksiini 4 ja GAPDH vasta-aineita. B. A549-solut valetransfektoidut tai transfektoitu anneksiini 4 siRNA (50 nM) tai salattu siRNA (50 nM), tartunnan Ad

FHIT

at MOI25 72 tuntia, ja sitten jätetään hoitamatta tai hoidettiin paklitakselilla ( 800 nM). Ensin soluja laskettiin 12 tuntia paklitakselin jälkeen hoidon. Pylväsdiagrammit osoittavat keskiarvo ± SEM arvot 3 kokeita (* P 0,05). Chou-Talalay Methos levitettiin laskea luonteen yhdistelmien (CI 1, synergia). C. A549-solut valetransfektoidut tai transfektoitu anneksiini 4 siRNA (50 nM) tai salattu siRNA (50 nM) 72 tuntia, sitten käsittelemättömän tai hoidettiin paklitakselilla. Ensin soluja laskettiin 12 tuntia paklitakselin jälkeen hoidon. Pylväsdiagrammit osoittavat keskiarvo ± SEM arvot 3 kokeita (* P 0,05). Chou-Talalay Methos levitettiin laskea luonteen yhdistelmien (CI 1, synergia). D. A549-soluja, käsiteltiin kuten on kuvattu B ja C, analysoitiin TUNEL-määrityksellä.

TUNEL-määritys vahvisti, että kaikki osa-G1 väestön kuvattu kuviossa 3C ovat pääasiassa koostuu apoptoottisten solujen (kuvio 4D). Lisäksi myös vaikutukset soluproliferaatioon esto oli rinnastettiin tulokset TUNEL määritys; Itse asiassa, apoptoosin saavutti korkeimman määrin anneksiini 4-köyhdytettyä soluissa tartunnan Ad

FHIT

ja hoidettiin paklitakselilla (kuvio 4D).

Fhit /anneksiini 4 vuorovaikutus ja paklitakseli indusoi kasvainten pienenemistä prekliinisessä malli keuhkosyöpään

vaikutusten tutkiminen Fhit /Annexinia A4 vuorovaikutus

in vivo

tai ilman paklitakselia prekliinisessä mallissa keuhkosyöpään, teimme kokeen 11 ryhmiin -hiiriä (n = 5 hiirtä /ryhmä). Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) klo Ohio State University hyväksyi tutkimuksen. Kolme ryhmää injektoitiin subkutaanisti 1 x 10

7 A549-soluja. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet 15 mm, hiiret olivat valehoidettujen, käsiteltiin DMSO: lla tai käsitelty yhdellä laskimonsisäisesti 40 mg /kg paklitakselia; Hiiriä tarkkailtiin säännöllisesti. Kolme päivää myöhemmin hiiret tapettiin ja kasvaimet tutkittiin painon mukaan. Kasvaimet hiiristä hoidettiin paklitakselilla osoitti 50%: n vähennys verrattuna kontrolleihin. Tämä lyhyt ajankohta pystyimme suurentaa vaikutuksia sekä yksittäisten tretaments ja niiden yhdistelmä, kuten pidempi ajankohtina vaikutusten Fhit hoito katetaan paklitakseli. Kaksi ryhmää hiiriä injektoitiin 1 x 10

7 A549-soluja pre-infektio Ad

GFP

tai Ad

FHIT

on MOI50, ja kaksi ryhmää injektoitiin 1 x 10

7 A549-soluja esi-infektio Ad

FHIT

alhaisella infektiokertoimella (MOI5); viimeksi mainittujen ryhmien käsiteltiin myös paklitakselin, kuten edellä on kuvattu. Kasvaimen paino osoitti 83%: n vähennys verrattuna kontrolleihin hiirillä ruiskutetaan Ad

FHIT

MOI50 ennalta tartunnan saaneiden solujen versus 27% vähennys hiirillä ruiskutetaan Ad

FHIT

MOI5; Kiinnostavaa, Mainoksen

FHIT

MOI5 ksenografteissa hoidettiin paklitakselilla osoittivat kasvaimen regressio 7% kontrollien tuumoreiden, mikä osoittaa synergistisen vaikutuksen Fhit ja paklitakseli.

Päätä paneeli, kaksi ryhmää hiiriä ruiskutetaan anneksiini 4-köyhdytettyä soluja (joista yksi oli käsitelty paklitakseli, kuten edellä on kuvattu), ja kaksi ryhmää, jossa anneksiini 4-köyhdytettyä soluja pre-infektio Ad

FHIT

MOI5 (yksi hoidettiin paklitakselilla). Anneksiini 4-köyhdytettyä solut osoittivat vähäistä, mutta ei merkittävää kasvaimen vähennys kontrolleihin verrattuna, kun taas suurempi väheneminen havaittiin anneksiini 4-köyhdytettyä ksenografteissa hoidettiin paklitakselilla vs. ksenografteissa hoidettiin paklitakselilla yksinään (70% ja 50%, tässä järjestyksessä). Lopuksi, käytännössä mitään kasvaimia ei havaittu hiirillä ksenografteissa kanssa tippuu alas anneksiini 4 pre-tartunnan Ad

FHIT

MOI5 ja paklitakseli. Näiden kokeiden tulokset on esitetty kuviossa 5A ja 5B. Yhdessä nämä tiedot korostavat, että Fhit /anneksiini 4 vuorovaikutus

in vivo

ja korosta arvo yhdistetyn Fhit geeniterapian ja kemoterapia prekliinisissä syöpää malleissa.

. Nude-hiiriin injektoitiin subkutaanisti 1 x 10

7 A549-soluja. Eräät ryhmät (n = 5 hiirtä /ryhmä) injektoitiin pilkata käsiteltyjen solujen, toiset, jotka on transfektoitu anneksiini 4 siRNA tai tartunnan Ad

FHIT

(MOI5 tai MOI50) tai molempien yhdistelminä. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet 15 mm, hiiret olivat valehoidettujen, käsiteltiin DMSO: lla tai käsitelty yhdellä laskimonsisäisesti 40 mg /kg paklitakselia; Hiiriä tarkkailtiin säännöllisesti. Kolmen vuorokauden kuluttua PTX, hiiret tapettiin ja kasvaimet tutkittiin painon mukaan. Pylväsdiagrammit osoittavat keskiarvo ± SEM arvoja 5 hiirtä (* P 0,05). Chou-Talalay Methos levitettiin laskea luonteen yhdistelmien (CI 1, synergia). B. Tuumoritilavuudet ilmoitetaan ajan.

Keskustelu

Menetys Fhit ilmaisun aikana tuumorigeneesin on raportoitu useimpien ihmisen syövän. Sen tehtävä pahanlaatuisia sairauksia on korostaa se, että Fhit menetys on varhainen tapahtuma kasvaimissa, kuten raportoitu keuhkojen syövän esiasteita. Myös onnistunut

FHIT

geeniterapia sarjassa kokeellisissa malleissa ihmisen syövän tekee Fhit proteiini hyvä ehdokas etsittäessä innovatiivisten hoitomuotojen [1]. Huolimatta pyrkimyksistä selventää miten Fhit proteiini toimii, jossa määritellään erityisiä mekanismeja, joiden kautta Fhit moduloi apoptoottinen ja muut tuumorisuppressoriproteiinia toimintoja on ollut haastavaa. Tämä johtui pääasiassa siitä, että vielä muutama vuosi sitten, Fhit ollut vahvistetun proteiinin kumppanit tunnistaa tavanomaisilla selvityksiä, joilla eristämiseen proteiini-proteiini-kompleksit. Olemme raportoineet eristäminen Fhit-vuorovaikutuksessa proteiinien jonka proteomiikka lähestymistapa [26]; tutkimuksessa johti eristäminen ja luonnehdinta liukoista Fhit proteiinia sisältävän kompleksin Hsp10 /Hsp60 ja ferredoksiinia reduktaasi (Fdxr) muiden mitokondrioiden proteiineista. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että Hsp10 /Hsp60-kompleksi mukana translokaatio Fhit proteiinin mitokondrioita, jossa sen vuorovaikutus Fdxr oli mukana modulaatioon reaktiivisten hapen lajien, aikaisintaan vaihe Fhit-välitteistä apoptoosia. Tämä lähestymistapa, jonka tarkoituksena on tunnistaminen proteiinikompleksien, ehdotti seurantatutkimuksissa tunnistaa muita Fhit interactors ja niiden toiminnallinen signaalien kulkureiteillä. In subsellulaarifraktiointikokeet tutkimuksissa, Fhit proteiini havaittiin kaikissa solun osastoissa mutta tuma [26]. Niinpä eristetty novel Fhit proteiinikomplekseina A549 proteiinilysaattien rikastettu solukalvojen. Tämä lähestymistapa tuotti luettelo ehdokkaan Fhit kumppaneita, joista osa havaittiin myös edellisessä analyysissä [26]. Näistä uusia ehdokkaita, anneksiini A4 (ANXA4) oli raportoitu rooli lääkeresistenssin, ja sen ekspressio lisääntyi kloonien resistenttejä paklitakselia [36], lääkkeen yleisesti käytetty syöpäpotilaiden hoidossa. Kuten osoitimme aiemmin, että Fhit osallistuu itsekin voittamiseen paklitakselin vastus [26], [27], päätimme tutkia tätä mahdollista korrelaatiota tarkemmin.

vuorovaikutus Fhit ja vastaus kemoterapiaa on aikaisemmin tutkittu Andriani et al [41]. Erityisesti, Fhit ilmentyminen johti alentunut herkkyys etoposidi, doksorubisiini, ja topotekaania. Tämä ominaisuus liittyy Fhit aiheuttama downregulation DNA topoisomeraasien I ja II. Sen sijaan, Fhit ilmentyminen tuotti hieman lisääntynyt herkkyys sisplatiinia, kuten on esitetty pesäkkeitä muodostavien määrityksiä [41].

inaktivointi sekä FHIT ja TP53 geenien havaitaan usein ensisijainen ei-pienisoluisen keuhkosyövän ( NSCLC) ja solulinjojen ja voivat vaikuttaa resistenssin apoptoottisille ärsykkeille aikaansaama erilaisia ​​anti-kasvain huumeet [42]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että Paklitakselihoidon indusoi sekä anneksiini A4 ylössäätöä ja muuttaminen sen solunsisäisen jakelu; Itse asiassa, seuraavissa paklitakselihoidolla, anneksiini A4 siirtyy sytosolin solukalvoon. Mielenkiintoista, Fhit yli-ilmentymisen Fhit-negatiivinen keuhko- syöpäsoluja estää anneksiini A4 translokaatio välillä sytosolin solukalvoon; Lisäksi samanaikainen hoito A549 syöpäsolujen Ad

FHIT

ja paklitakseli on paljon tehokkaampi liipaisu apoptoosin syöpäsoluissa verrattuna kontrolleihin; samanlaiset tulokset saatiin kanssa paklitakseli antamisessa anneksiini A4-köyhdytettyä A549-solut. Nämä tiedot viittaavat siihen, että molemmat anneksiini A4 yli-ilmentymisen ja sen solukalvon solunosasijaintia paklitakselin kestävä syöpäsolut ei ole sivustakatsojavaikutus vaan osallistuu aktiivisesti mekanismeihin lääkeresistenssin; lisätutkimuksia funktion anneksiini A4 solukalvojen saattavat valottaa monimutkaisia ​​mekanismeja lääkeresistenssin syöpäpotilailla. Nämä

in vitro

osumaa lisätukea prekliinisessä mallissa keuhkosyöpään; Itse asiassa molemmat

FHIT

geeniterapian ja anneksiini A4 ehtyminen toiminut synergisesti paklitakselin asiakkuutta kasvainregressio hiirillä verrokkeihin verrattuna; tämä yhdistelmä voi olla hyödyllinen etua hoidettaessa keuhkosyöpää potilailla. Lopuksi aiemmat ja tuore tutkimus korostaa Fhit menetys, yhteinen piirre ihmisen syövässä, markkerina huonon ennusteen syöpäpotilailla, mikä viittaa siihen, että Fhit-syöpäkasvain ovat alttiita lääkeresistenssin kehittymisen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Hiiriä seurattiin ja eläinkokeet harjoitettuun hoitokäytännön määritettyihin animal Facility The Ohio State University. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals Ohio State University. Protokolla hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) klo Ohio State University (IACUC protokolla numero: 2010A00000146; hyväksymispäivä 15.8.2011). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Soluviljely ja transfektio kokeissa

A549-soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä 5% CO

2 sopivassa kasvatusväliaineessa lisäyksin lisätään suositellaan. HEK-293-soluja käytettiin sukupolven ja vahvistus rekombinanttiadenovirusten [18]. Transfektiot anneksiini 4 pientä häiritseviä RNA: ita (Smart allas, Dharmacon) suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Immunoblottausmääritys ja fraktioitumisanalyysin

Yhteensä proteiinit uutettiin Nonidet P40 (NP-40 ) lyysipuskuria; soluliman ja plasmamembrane proteiinit eristettiin käyttäen FractionPREP-solufraktioinnin järjestelmä (BioVision). Yhteensä lysaatit rikastettua solukalvon proteiineja, käytetään sekä massaspektrometrilla ja immunosaostukset analyysien, saatiin käyttämällä Mem-PER Eukaryotic Membrane Protein Extraction Kit (Pierce).

Immunoblottausta, proteiinit (50 ug) erotettiin polyakryyliamidi- geelit ja siirrettiin nitroselluloosasuodattimelle kalvoja. Kalvot blokattiin 5% rasvatonta maitoa, inkuboitiin ensisijainen anti-anneksiini 4, GAPDH, ja E-kadheriinin vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology), havaitsee sopivan sekundäärisen vasta-aineita ja paljasti tehostetulla kemiluminesenssin (ECL; Amersham Inc .).

Protein Vuorovaikutusanalyysi

Co-immuunisaostuskokeissa, tai ilman ditiobis [sukkinimidyylipro-] (DSP), cross-linkkerin Pierce, tehtiin inkuboimalla 1 mg kokonaisproteiinia proteiinia lysaatit (joka sisältää rikastettua solukalvon osa) joko NIN-TA agaroosi magneettisen nikkeli-helmiä (Qiagen) tai anti-V5-vasta-ainetta, joka oli konjugoitu Sepharose helmiä, yön yli 4 ° C: ssa; pesun jälkeen, helmiä keitettiin 1 x SDS-näytepuskuria, ja proteiinit erotettiin 4-20% polyakryyliamidigeeleillä (Bio-Rad).

Immunofluoresenssi

A549-solut, esi-tartunnan Ad

FHIT

, fiksoitiin PFA 4% (paraformaldeyde) 10 minuuttia, läpäiseviksi 4 min Tritonin 0,05% ja analysoitiin konfokaalimikroskopialla. Endogeeninen Anneksiini 4 havaittiin ensisijaisen vasta-aineen BD; sekundaarinen vasta-aine (594 nm) oli Molecular Probes.

In vitro kasvuvauhti arviointi

A549-soluja ympättiin 1 x 10

5 solua kohti 60-mm lautasen ja meinfektoiduissa tai tartunnan Ad

GFP

tai Ad

FHIT

at MOI (Infection) 50 ja käsiteltiin 800 nM paklitakselia. Solut seurataan ja laskettiin kaksikymmentäneljä tunnin välein infektion jälkeen. Paklitakseli (LC-Laboratories) liuotettiin DMSO: iin 1 mM kantaliuos.

Generation yhdistelmä- adenovirusvektoreiden

adenovirukset kuljettaa

FHIT

tai

FHIT-

His6 cDNA (Ad

FHIT

ja Ad

FHIT-

His6, vastaavasti) transkriptionaalisen säätelyn alaisena sytomegaloviruksen promoottorin luotiin homologisella rekombinaatiolla HEK-293-soluissa, kuten aiemmin on kuvattu [26] . Ad

GFP

vektori käytettiin kontrollina.

Proteiinidigestio

Immunosaostettu proteiini kompleksit pilkottiin sekvenssointilaatua trypsiinillä Promega käyttäen Multiscreen Solvinert -suodatinlevyt Milliporesta (Bedford ).