Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aiemmissa tutkimuksissa parasporin-2Aa1, joka eristettiin alun perin

Bacillus thuringiensis

kanta A1547, osoitettiin olevan sytotoksinen määrätyiltä ihmisen syöpäsoluja, mutta vaikutusmekanismit ei ole tutkittu. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että proteinaasi K aktivoitu parasporin-2Aa1 proteiini, joka on eristetty uusi

B

.

thuringiensis

rasitusta, 4R2, oli nimenomaan solumyrkyllinen endometriumin, paksusuoli, maksa, kohdunkaulan, rinta- ja eturauhassyöpää. Se ei osoittanut toksisuutta normaaleja soluja. Käsittelemällä proteinaasi K-aktivoitu parasporin-2Aa1, morfologisia muutoksia havaittiin ja western blot-analyysi paljasti lohkaisu poly (ADP-riboosi) polymeraasin pilkkoutuminen, kaspaasi-3, ja kaspaasi-9 syöpäsolulinjoissa yksinomaan, osoittaa ohjelmoidun solukuoleman, apoptoosin. Virtaussytometria analyysit, käyttäen propidiumjodidia ja anneksiini V, sekä caspases 3/7 määritys vahvisti apoptoosin. Lisäksi analyysit suoritettiin tutkimaan eloonjäämisreittejä, kuten AKT, XIAP, ERK1 /2 ja PAR-4, tunnettu apoptoosin indusoija. Nämä tulokset osoittavat, että parasporin-2Aa1 on selektiivinen sytotoksinen proteiini, joka indusoi apoptoosia erilaisissa ihmisen syöpäsolulinjoissa erilaisista kudoksista.

Citation: Brasseur K, Auger P, Asselin E, Parent S, Côté JC, Sirois M (2015) Parasporin-2: n New

Bacillus thuringiensis

4R2 Strain indusoi Kaspaasit aktivointi ja apoptoosi ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 10 (8): e0135106. doi: 10,1371 /journal.pone.0135106

Editor: Ferenc Gallyas, Jr., University of Pecs Medical School, Unkari

vastaanotettu: 09 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 16 heinäkuu 2015; Julkaistu: 11 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Brasseur et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä tutkimuksen rahoittivat sisäisen UQTR tutkimusryhmä. Kevin Brasseur oli haltija jatko apurahan Kanadan Institutes of Health Research (CIHR). Eric Asselin on haltija Kanadan tutkimuksen tuolin molekyyli gynekologiset-onkologian. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Bacillus thuringiensis

on gram-positiivinen bakteeri, joka tuottaa kiteisen parasporal sulkeumia itiöiden muodostuksen aikana. Nämä sulkeumat on valmistettu proteiinien δ-endotoksiinit. Ne luokitellaan kahteen perheitä, kiteen (Cry) ja sytolyyttinen (Cyt) koodaamien proteiinien

itkeä

ja

istua

geenit, vastaavasti [1,2]. Huuto proteiineja on tutkittu laajasti vuodesta 1970: n, koska niiden tiettyjä hyönteisiä toimintaa vastaan ​​perhoset, kaksisiipisten ja kovakuoriaisia ​​[3]. Nielemisen jonka altis hyönteinen, The parasporal sulkeumat liuotetaan emäksinen hyönteisen keskisuolen, Cry protoxins vapautetaan ja sitten käsitellään keskisuolen proteaasit saatiin aktivoitu toksiiniproteiinit. Nämä sitoutuvat tiettyihin reseptoreihin sijaitsevat kalvon epiteelin suolen solujen, joka johtaa huokosten muodostumiseen ja lopulta hyönteisten kuolema [1,4].

onnistunut kehittäminen ja käyttö

B

.

thuringiensis

-pohjainen muotoiluja valvontaa tuhohyönteisten on johtanut eristämiseen tuhansien uusien kantojen ja satoja Cry proteiinien on nyt ominaista eri laajuudessa [5]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että ei hyönteisiä Cry proteiineja jakaantuu laajemmin kuin hyönteismyrkkynä Cry proteiineja [6]. Tämä johti tutkimukseen mahdollisesti uusia biologisia vaikutuksia päässä hyönteismyrkkynä Cry proteiineja. Sen jälkeen suuri seulonta, jotkut hyönteismyrkkynä ja ei-hemolyyttinen Cry proteiineja osoitti sytotoksinen vaikutus ihmisen syöpäsoluja ja nämä uudet

B

.

thuringiensis

myrkkyjä kutsuttiin parasporins [7,8]. Tähän mennessä kuusi perheiden parasporins, PS1 -PS6, on identifioitu [9]. Jokainen parasporin perhe esittelee erityinen kirjo ja vaikutusmekanismi vastaan ​​ihmisen syöpäsoluja.

Parasporin-2Aa1 (PS2Aa1, myös luokiteltu Cry46Aa1) tuottama

B

.

thuringiensis

serovariantti

Dakota

kanta A1547 on tutkittu intensiivisesti sen myrkkyvaikutuksen syöpäsoluissa [9-11]. Kun aktivoidaan proteinaasi K, PS2Aa1 on vähintään 400- kertaisesti enemmän myrkyllisiä ihmisen syövän HepG2 (ihmisen maksasolujen syöpä) kuin normaalin ihmisen solulinjassa HC (ihmisen normaali maksasolujen) ja ihmisen syövän solulinja HeLa (ihmisen kohdun kaulan syöpä) [12]. HepG2-solut, monomeerisen toksiini näyttää sitoutuvan tuntematon reseptoriproteiinin sijaitsee lipidilautan [13]. Kun liittyvät reseptoriin, PS2Aa1 oligomerizes läpäiseviksi kalvo, joka johtaa huokosten muodostumiseen [11,12]. Glykosyylifosfatidyyli (GPI) ankkuroitunut proteiini näyttää olevan osallisena tehokkaan sytosidinen toiminnan PS2Aa1 [13]. Huokosten muodostumista johtaa muutoksiin tukirankaproteiinin rakenteiden pirstoutuminen soluelimiin, korjauksilla solumorfologian kuten solujen turvotusta ja lopulta solun hajoamiseen [11]. Moodin solukuoleman näyttää olevan ei-apoptoottiset mutta tätä olettamusta ei ole vahvistettu [11-13]. Siten ylimääräinen luonnehdinta solunsisäisten tapahtumien mukana aikana induced- PS2Aa1 solukuolema oli pakko vahvistaa, onko apoptoosin oli mukana.

Tässä olevassa tutkimuksessa, ylimääräinen

B

.

thuringiensis

kannan nimeltään

Bt

4R2, jotka sisältävät geenin, joka koodaa Cry46Aa1 proteiinia (PS2Aa1) on tutkittu tunnistamaan mekanismeja sytosidaalisia-riippuvaisten solu- kuoleman induktion. Olemme havainneet, että PS2Aa1 oli hyvin sytotoksinen monille syöpäsolut

in vitro

. Edelleen tutkia mekanismia käyttäen valittu syöpäsolujen eri kudoksesta (HepG2-hepatosyyttien syöpä, PC-3-eturauhassyövän ja MCF-7-rintasyöpä) olemme havainneet, että apoptoosin solukuolemaa esiintyy kautta kaspaasien ja poly (ADP-riboosi) polymeraasin (PARP) pilkkominen. Olemme myös havainneet, että PS2Aa1 osoittaa hyvin alhainen myrkyllisyys normaaleille solulinjojen (menettää tavallisesti-144, HIESC, HIEEC ja MCF-10A).

edelleen tukevat oletusta apoptoosin induktion tunnistaminen eri selviytymisreittiin esto lukien AKT , XIAP, ERK1 /2 ja induktio tuumorisuppressorigeenin PAR-4-hoidon jälkeen PS2Aa1. Olemme myös selville, että estämällä PI3K /AKT-reitin yhdessä toksiinin kasvaa, on synerginen tavalla, tehokkuus PS2Aa1 apoptoosin syöpäsoluissa. Siten PS2Aa1 näyttää olevan solun tappaminen erotteleva toksiini apoptoosin säätelyyn erilaisissa ihmisen syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Bakteerikanta ja elatusaineet

B

.

thuringiensis

serovariantti

Dakota

-kanta 4R2 käytettiin tässä tutkimuksessa. Se saatiin

Bacillus

Genetic Stock Center (Ohio State University, Columbus, OH, USA). Bakteeri-soluja kasvatettiin 30 ° C: ssa ravintoaineagarilla Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) pH: ssa 7,1.

Solut ja viljelyolosuhteet

Ihmisen maksasolujen syövän HepG2 (HB-8065), ihmisen eturauhassyövän solulinja PC-3 (CRL-1435), ihmisen epiteeli- kolorektaalisen adenokarsinooman solulinjan Caco-2 (HTB-37), ihmisen epiteeli- kohdunkaulan adenokarsinoomasolulinja HeLa (CCL-2), ihmisen kohdun endometrium adenokarsinoomasolulinja Hec-1A (HTB-112), ihmisen kohdun endometrium adenokarsinoomasolulinja KLE (CRL-1622), ihmisen rinta- adenokarsinooma MDA-MB231 (HTB-26), ihmisen rintasyövän MCF-7 (HTB -22), ihmisen ei-tuumorigeenisiä epiteelisolujen MCF-10A (CRL-10317), ihmisen epiteelisolujen munasarjan adenokarsinooman OVCAR-3 (HTB-161) ja ihmisen epiteelisolujen munasarjan adenokarsinooman solulinjaa SKOV-3 (HTB-77) saatiin American Type Culture Collection (ATCC). Ihmisen kuolematon ei-tuumorigeeniset munasarjojen pinnan epiteelisolujen linja menettää tavallisesti-144 luovutti ystävällisesti Dr. David Hunstman (British Columbia Cancer Research Center, Vancouver, BC, Kanada). Ihmisen kuolematon endometriumin strooman solujen HIESC ja ihmisen kuolematon kohdun limakalvon epiteelisolujen HIEEC olivat ystävällinen lahja ja tuottanut Dr. Michel Fortier (Centre Hospitalier de l’Université Laval, Quebec City, QC, Kanada) [14]. Ihmisen munasarjakarsinoomasolut A2780 ystävällisesti tri G. Peter Raaphorst (Ottawa Regional Cancer Center, Ottawa, ON, Kanada). Ihmisen kohdun limakalvon Adenokarsinoomasolulinja Ishikawa luovutti ystävällisesti Dr. Samuel Chogran (Université de Montréal, Montreal, QC, Kanada). HepG2, PC-3, HIEEC ja HIESC solulinjoja pidettiin yllä RPMI 1640 väliaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja 50 ug /ml gentamysiiniä. MCF-7 ja OVCAR-3-solulinjoja ylläpidettiin RPMI 1640 -elatusaineessa, joka sisälsi 10% naudan kasvua seerumia ja 50 ug /ml gentamysiiniä. MDA-MB-231-solulinja pidettiin RPMI 1640 -elatusaineessa, joka sisälsi 5% naudan kasvua seerumia ja 50 ug /ml gentamysiiniä. Hec-1A-solulinja pidettiin McCoyn elatusaineessa, joka sisälsi 5% naudan kasvua seerumia ja 50 ug /ml gentamysiiniä. SKOV-3-solulinjaa ylläpidettiin McCoyn elatusaineessa, joka sisälsi 10% naudan kasvua seerumia ja 50 ug /ml gentamysiiniä. HeLa, Ishikawa ja A2780 solulinjoja pidettiin yllä DMEM-F12 -alustassa, joka sisälsi 2% naudan kasvua seerumia ja 50 ug /ml gentamysiiniä. MCF-10A-solulinjaa ylläpidettiin DMEM-F12 -alustassa, joka sisälsi 5% sikiön kasvun seerumia, 20 ng /ml EGF: ää, 0,5 mg /ml hydrokortisonia, 100 ng /ml koleratoksiinia, 10 ug /ml insuliinia ja 1X penisilliini-streptomysiiniä. KLE solulinjaa ylläpidettiin DMEM-F12-elatusainetta ilman HEPES, joka sisälsi 10% naudan kasvua seerumia ja 50 ug /ml gentamysiiniä. Caco-2-solulinjaa ylläpidettiin DMEM-F12-elatusainetta, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja 50 ug /ml gentamysiiniä. Menettää tavallisesti-144-solulinjaa ylläpidettiin MCDB105, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja 50 ug /ml gentamysiiniä. Kaikki solut pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2.

Yhteensä DNA eristys

Yhteensä DNA

B

.

thuringiensis

4R2 eristettiin 5 ml yön yli kasvustoa QIAmp DNA veren mini (Qiagen, Toronto, ON, Kanada), mukaan valmistajan ohjeiden bakteerien DNA: n eristämiseksi.

PCR-monistus

alukkeet tässä tutkimuksessa käytetyt suunniteltiin laboratoriossamme päässä

cry

46Aa1 geenin nukleotidisekvenssin. Alukkeet PCR-amplifikaatiota varten olivat seuraavat:

Bt

4R2-2F: 5’TAACCGGAGGGCTTCAAG -3 ’(sense) ja

Bt

4R2-1R: 5’TAATTCCCCCATTTTGGG -3′ (antisense ). PCR suoritettiin Applied Biosystems 2720 -lämpösyklilaitteella (Life Technologies, Ottawa, ON, Kanada). PCR-reaktiot suoritettiin 50 ui tilavuudessa, joka sisälsi 200 uM kutakin deoksinukleosiditrifosfaattia (dNTP: t), 1X PCR-puskuria, 0,5μM kunkin alukkeita, 100 ng DNA: ta ja 1,25 yksikköä Taq-DNA-polymeraasia. Kaikki PCR reagenssit olivat New England Biolabs (Ottawa, ON, Kanada). PCR suoritettiin ensimmäinen denaturaatiovaiheen 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 30 sykliä 94 ° C: ssa 45 s, 50 ° C: ssa 30 s, 72 ° C 2 min ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 7 min. PCR-tuotteet olivat kooltaan erotetaan 1% agaroosigeelillä ja visualisoitiin käyttäen SYBR-Safe (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) värjäys, kun UV-läpivalaisulla.

DNA: n sekvensointi

Amplikonit puhdistettiin käyttämällä Mini Eluoidaan PCR Purification Kit Qiagen. Puhdistettu PCR-reaktiot eroteltiin 3130XL Genetics Analyser (Applied Biosystems) Ibis Plate-forme d’Analyysit Génomiques (PAG) de l’Université Laval (Quebec City, QC, Kanada). Molemmat juosteet DNA-sekvenssin, sekvensoitiin: Tällä 940pb sekvenssiä verrattiin käyttämällä Blast-N työkalu (National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nim.nih.gov).

valmistus aktivoitua parasporal proteiinien

Bacillus thuringiensis

-kanta 4R2 viljeltiin ravinteiden agarmaljoille, inkuboitiin 4 päivän ajan 30 ° C: ssa, kunnes solujen hajoamista. Solut kerättiin maljoilta ja pestiin kahdesti steriilillä tislatulla vedellä. Pelletti, joka sisälsi itiöitä-kide proteins- liuotettiin 500 ui liuotuspuskuria, joka sisälsi 56 mM Na

2CO

3 (pH: 11,4) ja 11 mM ditiotreitolia (DTT), 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Liukenematon materiaali pelletoitiin sentrifugoimalla 13 200 rpm 2 minuutin ajan ja supernatantti johdettiin 0, 22μm kalvosuodatin. 250 ui suodos siirrettiin steriiliin 1,5mL sentrifugiputkeen ja pH säädettiin arvoon 8 1 M Tris-HCl (pH 4,98).

liuotetaan proteiinit pilkottiin joko proteinaasi K: n (lopullinen konsentraatio at 185μg /ml) tai trypsiiniä (lopullinen pitoisuus 300 ug /ml) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), lisättiin (lopullinen pitoisuus 1 mM) lopettaa proteolyyttistä käsittelyä. Vahvista läsnäolo parasporal proteiinien SDS-PAGE-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu muualla [15] käyttäen 4% -vertailugeeliä ja 12% -erotusgeeliä. Elektroforeesin jälkeen geeli värjättiin 0, 1% Coomassie Blue R-250 (Sigma-Aldrich). Proteiinipitoisuus määritettiin Bio-Rad DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Kanada).

määritys sytotoksisuuden

antiproliferatiivinen

B

.

thuringiensis

4R2 toksiiniproteiinit arvioitiin käyttäen MTT-määritystä [16,17]. Lyhyesti, ympättiin 180 pl normaalien ja syöpäsolujen jousitus (varten HIESC, 14 000, menettää tavallisesti-144, 12 000, HIEEC, 15 000, Ishikawa, 16 000, HeLa, 16 000, KLE, 14 000; heh- 1A, 12 000, Caco-2, 20 000, PC-3, 16 000, HepG2, 20 000, A2780, 16 000, OVCAR-3, 20 000 SKOV-3, 14 000, MCF-7, 16 000; MDA-MB231, 12 000 ja MCF-10A, 8000) keskipitkällä käyttäen 96-kuoppaisille levyille. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 24 tuntia. Tuoretta liukoiseksi ja aktivoitu

B

.

thuringiensis

4R2 toksiiniproteiinit (proteinaasi K tai trypsiiniä) in liuotuspuskuria laimennettiin tuoreeseen elatusaineeseen, ja 100 ui alikvootit, jotka sisältävät Kasvavat konsentraatiot toksiinin proteiinien (0 ug /ml 20 ug /ml) lisättiin, ja levyjä inkuboitiin vielä 24 tuntia. Lopullinen konsentraatio liuotuspuskuria (56 mM Na2CO3, 11 mM DTT: tä, 100 ug /ml proteinaasi K: n (tai 30 mg /ml trypsiiniä) ja 1 mM PMSF) elatusaineissa oli 8%, ja pidettiin vakiona kaikissa kokeessa. 24 tunnin jälkeen, 10 ui 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) (5 mg /ml PBS: ssa) lisättiin kuoppiin. Neljä tuntia myöhemmin 100 pl liukenemisen liuosta (10% natriumdodekyylisulfaattia (SDS) 0,01 M HCI) lisättiin, ja levyjä inkuboitiin yli yön (37 ° C, 5% CO

2). Optinen tiheys luettiin käyttämällä Fluostar optimia BMG (BMG Labtech Inc., Durham, NC, USA) 565nm. Lukemat saadut käsitellyt solut verrattiin mittausten säätökenno levyt kiinnitetään hoitopäivänä; ja prosentuaalinen solujen kasvun inhibitio laskettiin kullekin toksiini-proteiinia (proteinaasi K aktivoida tai trypsiinillä aktivoituna). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Kokeet katsotaan olevan voimassa, kun vaihtelukerroin määrätylle olosuhteiden ja samassa kokeessa oli 10%.

Light mikroskopia havainto

havainto morfologisia muutoksia, normaali (HIESC) ja syöpäsolujen (PC-3, MCF-7 ja HepG2) havaittiin 24 tunnin kuluttua hoidon proteinaasi K aktivoitu toksiiniproteiinit 1 ug /ml (MCF-7) tai 2 ug /ml (HIESC, PC-3 ja HepG2). 10X ja 20X suurennuksilla käytettiin Olympus (malli BX60) valomikroskoopilla (Carsen Group, Markham, ON, Kanada).

Vasta-aineet ja reagenssit

Na

2CO

3, DTT: tä, 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi, HCl, SDS, PMSF, Tris-HCI: a ja proteinaasi K olivat kaikki Sigma-Aldrich. Kaikki ensisijainen vasta saatiin Cell Signaling Technology (Bervely, MA, USA) lukuun ottamatta β-aktiini (Sigma-Aldrich). Sekundaarinen vasta-aine, HRP-konjugoitua vuohen anti-kani-oli ostoksen Bio-Rad Laboratories. Anneksiini V /PI apoptoosin kit ostettiin Invitrogen. MEK ½ estäjä, U0126, saatiin Cell Signaling Technology ja PI3K-estäjä, Wortmanniini, saatiin Sigma-Aldrich.

Western blot

PS2Aa1 käsitellyt solut pestiin PBS: llä, ja ne toimitetaan lyysi kylmään RIPA puskuriin, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (Complete Roche Applied Science, Laval, QC, Kanada) ja fosfataasinestäjällä (PhosSTOP Roche Applied Science), mitä seurasi kolme jäädytys-sulatus-jaksolla. Yhtä suuret määrät solulysaateista, määritettiin käyttäen Bio-Rad DC-proteiinimääritys, erotettiin polyakryyliamidigeeleillä (10-14%) ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Bio-Rad). Membraanit blokattiin 5% maitoa, PBS 1 X, 0,06% Tween 20: ssa 1 h huoneen lämpötilassa, koetettiin primaarisen vasta-aineen, pestiin PBS: ssä 1X, 0,06% Tween 20: tä, ja niitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Bio-Rad ). Detection suoritettiin käyttäen SuperSignal West Femto alustan (Thermo Fisher Scientific, Nepean, ON, Kanada), kuten valmistaja on kuvannut käyttäen UVP kuvantamiseen järjestelmiä.

Measurement anneksiini V /PI-solujen

FITC anneksiini V /Dead solukuoleman Kit (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, käsiteltyjen solujen kerättiin, pestiin PBS: llä ja laimennettiin 1 x anneksiini Sidonta-puskuria (100 ui). Kustakin näytteestä 5 ui anneksiini V ja 2 ui propidiumjodidia (PI) lisättiin solususpensioon ja inkuboitiin 15 minuuttia huoneen lämpötilassa. Lisäksi 100 ui anneksiini sitoutumisen puskuria lisättiin jokaiseen näytteeseen, yhteensä 200 ui. Näytteet analysoitiin (10 000 tapahtumaa) käyttäen Beckman Coulter virtaussytometrillä Cytomics FC500. Analyysit suoritettiin käyttäen CXP Analyysiohjelmisto (Beckman Coulter, Mississauga, ON, Kanada).

Caspase 3-7 määritys

mittaamiseksi tietyn kaspaasi 3 ja 7, luminesoiva määritys kit nimeltään Caspase-Glo 3/7 määritystä (Promega, Madison, WI, USA)) käytettiin. Tämä määritys tarjoaa proluminescent kaspaasi-3/7 substraattia, joka sisältää sekvenssin (DEVD) spesifinen kaspaasi 3 ja 7. Jos kaspaasien 3 ja /tai 7 ovat aktiivisia, substraatti katkeaa, ja aminoluciferin emittoituu. Lyhyesti, ympättiin 180 pl normaalia ja syöpäsolujen suspensiossa (ja HIESC, 14 000, PC-3, 16 000, HepG2, 20 000 ja MCF-7, 16 000) väliaineessa. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 24 tuntia. Tuoretta liukoiseksi ja aktivoitu

B

.

thuringiensis

4R2 toksiiniproteiinit (proteinaasi K) in liuotuspuskuria laimennettiin tuoreeseen elatusaineeseen. Sitten 100 ui alikvootit, jotka sisältävät toksiinin kanssa tai ilman inhibiittorit, lisättiin, ja levyjä inkuboitiin vielä 24 tuntia. Lopullinen konsentraatio liuotuspuskuria (56 mM Na2CO3, 11 mM DTT: tä, 100 ug /ml proteinaasi K: ta ja 1 mM PMSF) elatusaineissa oli 8%, ja pidettiin vakiona kaikissa kokeessa. 24 tunnin jälkeen, 100 ui ja kaspaasi-Glo 3/7 reagenssia lisättiin kuoppiin. Yksi tunti myöhemmin optinen tiheys luettiin käyttämällä Fluostar Optima BMG (BMG Labtech Inc., Durham, NC, USA). Lukemat saadut käsitellyt solut verrattiin mittausten ohjaus soluista käyttäen kertaisesta. Jokainen kokeet suoritettiin kahtena.

Tilastolliset analyysit

Tiedot suoritettiin joko yksisuuntainen varianssianalyysi tai Studentin t-testiä (PRISM ohjelmistoversio 5.00, GraphPad, San Diego, CA ). Erot koeryhmien välillä, kun käytetään yksisuuntaista varianssianalyysiä, määritettiin Tukey testin. Tilastollinen merkitsevyys hyväksyttiin, kun p 0,05.

Tulokset

karakterisointi B. thuringiensis 4R2 sytotoksista kide proteiinin

SDS-PAGE-analyysi liuotetun kiteen proteiinien paljasti suuren vyöhykkeen arviolta 37 kDa, mikä vastaa natiivi muoto Cry46Aa1 proteiinin (kuvio 1). PCR-kokeissa Cry46Aa1 spesifisiä alukkeita, joka on 940bp vahvistus saatiin tuote. Analyysit nukleotidisekvenssin käyttäen BLAST työkaluja paljasti, että nukleotidisekvenssi oli 100% homologinen proteinaasi K aktivoitu Cry46Aa1 nukleotidisekvenssi (NCBI-hakunumero AB099515.1). Tämän ansiosta nukleotidisekvenssiidentiteetti, 37 kDa kide proteiineja

B

.

thuringiensis

4R2 nimettiin PS2Aa1.

(A) Kaista 1: molekyylipainomarkkeri; kaista 2: liuotettua pro-PS2Aa1. (B) nukleotidit sekvenssi

cry

46Aa1 geenifragmentti jälkeen saatu vahvistus kanssa Bt4R2-2F ja Bt4R2-1R alukeparia.

sytotoksisuus PS2Aa1 syövän ja normaaleissa soluissa

Trypsiini (jota käytettiin verrokkina hoito) ja proteinaasi K aktivoitu kide proteiineja

B

.

thuringiensis

4R2 (PS2Aa1) tutkittiin sytotoksisuus normaaleja ja syövän ihmisen soluissa käyttäen MTT-määritys 24 tunnin jälkeen (kuvio 2). Ei sytosidaalisia aktiivisuutta ei havaittu trypsiinikäsittelyn jälkeen liuotetun crystal proteiinien tahansa solujen linjat. Solujen joukossa testattu, proteinaasi K aktivoitu kide proteiinit olivat erittäin sytotoksisia HepG2, MCF-7, KLE, Hec-1A, MDA-MB231 ja PC-3-soluja samalla maltillisesti sytotoksisia Caco-2-soluihin. Mitään merkittävää sytotoksista aktiivisuutta havaittiin A2780, OVCAR-3, SKOV-3 ja HeLa syöpäsolun linjat. Mikään normaalin solulinjojen (IOSE-144, HIEEC, HIESC ja MCF-10A) osoitti sytotoksisia vaikutuksia. Sytotoksisuus kiteen proteiineihin oli annoksesta riippuvaa ja tutkittiin käyttämällä sarja- proteiineja laimennoksia. Perustuen niiden korkea herkkyys PS2Aa1, HepG2, PC-3 ja MCF-7 syövän solulinjat valittiin edelleen kokeilujen. HIESC soluja käytettiin normaalia solulinja mallia edelleen tutkia vaikutuksia PS2Aa1 ei-syöpäsoluihin.

Normaalit ihmisen viljellyissä soluissa (A) ja syövän viljellyissä ihmisen soluissa (B) (2 X 10

4 solua) esi-inkuboitiin 37 ° C: ssa 20 tuntia; toksiini käsitellään trypsiinillä (○) tai proteinaasi K (●), lisättiin (lopulliset konsentraatiot, 0.3μg /ml 20 ug /ml), inkuboitiin edelleen 24 tuntia. Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen MTT: n.

morfologiset muutokset syöpäsolujen aiheuttama PS2Aa1

edelleen vaikutuksen tutkimiseksi PS2Aa1, pitoisuudet 1 ug /ml 2 ug /ml käytettiin perustuvat edellisestä solujen elinkykyä kokeessa. Seuraavat käsittely PS2Aa1 proteinaasi K aktivoitu proteiinien HepG2 (2 ug /ml), PC-3 (2 ug /ml) ja MCF-7 (1 ug /ml) solujen morfologiset ominaisuudet käsiteltyjen solujen havaittiin valomikroskoopilla (kuvio 3) . Cell kutistuminen, ominaisuus apoptoottisen solukuoleman [18], havaittiin vain HepG2, MCF-7 ja PC-3-syöpäsoluja. Ei kuitenkaan morfologisia muutoksia havaittiin HIESC; vahvistetaan ei-sytotoksisuutta PS2Aa1 normaaleissa soluissa, kuten aiemmin on havaittu MTT kokeilu. Ei nekroosi morfologiset muutokset, kuten solun turvotusta tai kupliminen havaittu [18].

PC-3 (A), MCF-7 (B), HepG2 (C) ja HIESC (D) soluja käsiteltiin 1 ug /ml tai 2 ug /ml

B

.

thuringiensis

4R2 toksiiniproteiinit 24 tuntia. 24 tunnin kuluttua solut havaittiin valomikroskoopilla suurennoksella 10X ja 20X. Esitetyt tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

PS2Aa1 indusoi solukuoleman apoptoottiset mekanismit

Vahvista aiemmat havainnot koskevat morfologiset muutokset liittyvät apoptoosin esiintyvien syöpäsolujen suoritimme anneksiini V /propidiumjodidi (PI) värjäys analyysi käsiteltyjen solujen. Anneksiini V: on kyky värjätä fosfatidyyliseriinin ulomman seloste solukalvon ja sen läsnäolo ulomman seloste sijaan sisemmän pakkausselosteessa on ainutlaatuinen ominaisuus apoptoosin [19]. Tulokset osoittivat, että 6h ja 24 hoidon jälkeen, PS2Aa1 indusoi korkeatasoisen apoptoosin kaikissa kolmessa syöpäsolulinjoissa (kuvio 4A-4C) ja hyvin vähän normaalin kohdun limakalvon syövän solulinja HIESC (kuvio 4D) Tämä on suorassa suhteessa MTT määrityksen tulokset (kuvio 2). Useimmat syövän solut osoittivat korkean tason apoptoosin jälkeen 6h hoidon osoittaa korkea hyötysuhde PS2Aa1 apoptoosin.

PC-3 (A), MCF-7 (B), HepG2 (C) ja HIESC (D ) soluja käsiteltiin

B

.

thuringiensis

4R2 toksiiniproteiinit (1 ug /ml (B) tai 2 ug /ml (A, C, D)) 24 tuntia. Anneksiini V: ja PI-värjäyksen havaittiin FACS-analyysillä. Tulokset ovat keskiarvo ± SEM Kolmen riippumattoman kokeen. * P 0,05 verrattuna vastaaviin valehoidettujen soluissa.

Koska PS2Aa1 indusoi hyvin myrkyllistä ja monet solut ovat PI positiivisia vasta 24, päätimme suorittaa kaspaasi-3/7 määritys tarkistaa jos PS2Aa1 erityisesti aktivoi kaspaaseja -3 ja -7 apoptoosin indusoimiseksi (kuvio 5). 24 tunnin kuluttua hoidon PS2Aa1 kasvoi merkittävästi aktiivisuutta sekä caspases -3 ja -7 PC-3 ja HEPG2 syöpäsolulinjoissa (kuvio 5A ja 5C). MCF-7 syövän solulinja on kaspaasi-3 puutteellinen ja ottaen tämä puute, vain kaspaasi-7 voidaan mitata tässä määrityksessä tässä solulinjassa [20]. Merkittävä lisäys kaspaasiaktiivisuus voidaan havaita MCF-7 syövän solulinja, joka osoittaa, että indusoiman apoptoosin kompensoidaan kaspaasi-7, osallisena vaikutusmekanismi PS2Aa1 (kuvio 5B). Alhainen solukuoleman aiemmin havaittu normaalissa solulinjassa HIESC anneksiini V /PI virtaussytometrialla ja näin ollen mitään merkittävää kasvua kaspaasi-3/7-aktiivisuus voidaan mitata kaspaasi määritys HIESC (kuvio 5D).

PC-3 (A), MCF-7 (B), HepG2 (C) ja HIESC (D) soluja käsiteltiin

B

.

thuringiensis

4R2 toksiiniproteiinit (2 ug /ml) 24 tuntia. Taso caspases-3/7 mitattiin käyttämällä kaspaasi-Glo 3/7 määrityksessä. MCF-7 (B) solut ovat kaspaasi-3 puutteellisia ja vain kaspaasi-7 voidaan mitata. * P 0,05 ** P 0,01 verrattuna vastaaviin valehoidettujen soluissa.

tutkimiseksi edelleen apoptoosin, myös mitattuna eri apoptoosin markkereita Western blot -analyysillä, kuten lohkaista kaspaasi-3, 8, -9 ja halkaistut PARP. Tulokset osoittavat, että jo 6h hoidon PS2Aa1, kaspaasi-3-pilkkoutumisen /aktivaation havaittiin sekä PC-3 ja HEPG2 syöpäsolujen (kuvio 6A ja 6C, MCF-7 on kaspaasi-3: negatiivinen). Kun se on aktivoitu, kaspaasi-3 on efektori kaspaasi ja voi tehdä proteolyyttisen eri proteiineihin, kuten korjaus- proteiinin PARP, sitten johtaa apoptoottisen solukuoleman. Kuitenkin kaspaasi-3 vaatii initiaattorin caspases joko sisäinen tai ulkoinen tie katkeavan /aktivoida [21,22]. Western blot-analyysi, mittasimme pilkottiin kaspaasi-8 (ulkoinen tie) ja pilkottiin kaspaasi-9 (sisäinen reitti) ja totesi, että vain kaspaasi-9 pilkkoutumisen /aktivaation oli läsnä kaikissa kolmessa syöpäsolulinjoissa (kuvio 6A-6C), kun taas kaspaasi-8 pilkkoutumisen /aktivoitumisen ei havaittu (tuloksia ei esitetty). Korrelaatio caspases pilkkominen, PS2Aa1 myös indusoi PARP pilkkominen /hajoamista kaikissa kolmessa syöpäsolulinjoissa (kuvio 6A-6C). Halkaistut PARP ja halkaistut kaspaasi-3-proteiinin tasot ovat alhaiset jälkeen 24 hoidon toksiinia HepG2 tasyöpäsolulinja (kuvio 6C). Tämä johtuu todennäköisesti siitä, useimmat solut olivat kuolleet jälkeen 6h ( 75%). 24 tunnin kuluttua hoidon, lähes kaikki HepG2 solut olivat kelluva ja kuolleet ( 92%). Proteiinit olivat luultavasti kaikki huonontuneen koska proteaasien toiminnan myöhään apoptoosin johtaa massiivinen proteiinia ja solujen tuhoutumisen [23]. Tätä tukee lisäksi MTT data (kuvio 2B) ja anneksiini V /PI virtaussytometria (kuvio 4C ja 4H), jotka osoittavat, että lähes 100% soluista ovat kuolleet tässä pitoisuudessa 24 tunnin kuluttua hoidon selvitti tilanteen havaittu. On myös huomattava, että mikään näistä merkkiaineiden apoptoosin havaittiin normaalissa solulinjassa HIESC (kuvio 6D), joka ilmaisee, että mitään apoptoosi esiintyy käyttäen suurinta annosta PS2Aa1 (2 ug /ml) aiemmin käytetty syöpäsolun linjat. Western blot bändejä näkyy normaalissa solulinjassa HIESC ovat perustason eri markkereita, havaittavissa ainoastaan ​​sen jälkeen, kun suuri alttius paljastaa sopiva proteiinivyöhykkeet (kuvio 6D). Tämä on yhdenmukaiset ilman apoptoosin ja kaspaasien-3/7 aktiivisuutta havaittu edellisessä kokeita normaalin solulinjan HIESC (kuviot 4 ja 5).

PC-3 (A), MCF-7 ( B), HepG2 (C) ja HIESC (D) soluja käsiteltiin

B

.

thuringiensis

4R2 toksiiniproteiinit (1-2μg /ml) 6 tuntia ja 24 tuntia. Tasot apoptoosin tietyn lohkaista proteiinien kaspaasi-3, kaspaasi-9 ja PARP määritettiin käsitellyistä soluista käyttämällä Western blot -analyysiä. MCF-7 (B) solut ovat kaspaasi-3 puutteellisia. p-Actin käytettiin latauskontrollina. Esitetyt tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

asetus eri selviytymisen ja kuoleman väyliä vastauksena PS2Aa1

Kaikki edellisen kokeet osoittavat, että PS2Aa1 toksiini voi aiheuttaa solukuoleman syöpäsoluissa läpi apoptoosin induktion. Tutkiakseen mahdollista osallistumista muun pelastusveneen /kuolema reittejä, suoritimme lisää kokeita PC3 syöpäsolujen käyttäen western blot analyysiä. Ensin tutkittiin AKT selviytymisreittiin tunnetaan myös tärkeä selviytymismekanismi syöpäsoluja. Proteiineja AKT polku muuttuu usein syövän ja korkea eloonjäämisen signaalin nämä mutaatiot ovat usein vastuussa vastus syöpäsolujen Therapeutics hoitoja ja mahdottomuus apoptoosin [24-28]. Tuloksemme osoittivat korkeaa laskua fosforyloitua (aktiivinen muoto) AKT seriinin 473. Yhteensä AKT taso väheni myös viittaa siihen, että se on myös osittain vastuussa väheneminen p-AKT tasolla. XIAP, estäjä kaspaasi ja ubikitiinipromoottori ligaasia PTEN (negatiivinen säätelijä AKT-fosforylaation) väheni myös (kuvio 7A) [29]. ERK1 /2, proteiineja MAPK-reitin, vaatii aktivoinnin /fosforylaatio indusoida apoptoosia syöpäsoluissa sisplatiinikäsittelyn jälkeen tai muiden apoptoosia ärsykkeille [30-32]. Kuten havaitaan sisplatiinin hoitoja, PS2Aa1 indusoi kasvua ERK1 /2 fosforylaation 24 hoidon jälkeen kun koko ERK taso majaili vakaana (kuvio 7B). Tämä viittaa siihen, että ERK aktivaatio vaaditaan apoptoosin induktion. Lopuksi olemme äskettäin löydetty uusi mekanismi liittyy tuumorisuppressorigeenin PAR-4, joka pilkkoo kaspaasi-3, kun apoptoosin vaikutuksesta ja pystyy aiheuttamaan apoptoosin, kun lohkaistaan ​​[33,34]. Koska PS2Aa1 kyky aktivoida apoptoosin mekanismeja, me epäilivät PAR-4 pilkkominen voisi olla mukana apoptoosin käsittelemällä toksiinia. Mielenkiintoista, pilkotun fragmentti noin 25 kDa ilmestyi heti 6h hoidon jälkeen PS2Aa1 täysin korrelaatio hypoteesia (kuvio 7C). Läsnä ollessa katkaistun PAR-4-fragmentti, normaalisti läsnä vain syöpäsoluissa, joissa apoptoosi, vahvistaa käsitystä, että PS2Aa1 indusoi apoptoosin syöpäsoluissa.

PC-3 syövän soluja käsiteltiin Bt 4R2 toksiinia proteiinit (2 ug /ml) 6 tuntia ja 24 tuntia. (A) PI3K /AKT-reitin proteiinit (B) ERK ja (C) PAR-4-proteiinin tasot määritettiin käsitellyistä soluista käyttämällä Western blot -analyysiä. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.