Krooninen sairaus

tiivistelmä

Solun hyökkäyksen läpi tiheän kolmiulotteisen (3D) matriisi uskotaan riippuvan solujen kyky tuottaa vetovoimaa. Kvantifioimiseksi rooli solun tractions aikana invaasion 3D esitämme tekniikka mitata joustava kanta energia varastoidaan matriisin Vedon aiheuttaman muodonmuutoksia. Matriisi muodonmuutokset noin solun mitattiin seuraamalla 3D kannat fluoresoivia helmiä tiukasti upotettu matriisiin. Helmen kannat toimi solmut elementtimenetelmää tessellation. Vuodesta kannan jokaisen elementin ja tunnetun matriisi elastisuutta, me lasketaan paikallisten muodonmuutosenergia matriisissa solua ympäröivän. Käytimme tekniikka mitata deformaatioenergia on erittäin invasiivinen MDA-MB-231 rintasyöpä ja A-125 keuhkosyövän soluja kollageenigeeleissä. Tuloksia verrattiin kannan tuottama energia ei-invasiivisen MCF-7 rinta- ja A-549 keuhkokarsinoomasoluja. Kaikissa tapauksissa solut paikallisesti supistui matriisin. Invasiivinen rinta- ja keuhkosyöpä solut osoittivat merkittävästi korkeampi contractility verrattuna ei-invasiivisia soluja. Korkeampi contractility kuitenkaan ei yleisesti liittyy korkeampi invasiivisuus. Esimerkiksi ei-invasiivisia A-431 häpy karsinoomasolut olivat supistuvien solujen kaikkien testatuilla solulinjoilla. Koska yleinen ominaisuus, mutta olemme havainneet, että invasiiviset solut oletetaan pitkänomainen karan kaltainen morfologia eikä enemmän pallomainen muoto ei-invasiivisia soluja. Siten jakelu kannan energiatiheys noin invasiivisia soluja seurasi malleja monimutkaistuminen ja anisotropiaa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ei niinkään suuruus veto sukupolven mutta niiden suuntaavuus on tärkeä syöpäsoluinvaasiota.

Citation: Koch TM, Münster S, Bonakdar N, Butler JP, Fabry B (2012) 3D Traction Forces Cancer Cell Invasion. PLoS ONE 7 (3): e33476. doi: 10,1371 /journal.pone.0033476

Editor: Harry Mellor, University of Bristol, Iso-Britannia

vastaanotettu: 07 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 15 helmikuu 2012; Julkaistu: 30 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Koch et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat seuraavasti: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FA336 /2-1; National Institutes of Health – Bioengineering Research Kumppanuudet NIH-BRP: HL65960. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

solun maahanmuuton kautta sidekudoksen matriisi on tärkeä osa normaalia fysiologista toimintaa, esimerkiksi haavan paranemisen aikana, mutta on myös tunnusmerkki poikkeavaa käyttäytymistä nähdään syöpäsoluinvaasiota kautta sidekudosta. Solumigraation tasomaiseen 2D matriiseja, kuten yhteisestä muovinen kudosviljelymaljassa, on kuvattu syklinen prosessi polarisaatio, uloke muodostuminen kärjessä, veto sukupolven solujen ”acto-myosiinin koneita, ja sulkeutuminen takana altaan päässä [1]. Inertial ja viskoosi vetää voimat ovat vähäisiä, ja solujen tractions tarvitaan ainoastaan ​​niiden solujen leviämisen ja voittamiseksi integriinin välittämä liima voimia.

Solun siirtolaisuutta tiheän 3D verkosto soluväliaineen proteiinien, toisin kuin 2D muuttoliikettä, on mahdollista vain silloin, kun solu tuottaa riittävä tractions voittamiseksi steerisen esteen ympäristöstä [2]. Siirtymisen nopeus solujen 3D matriisi korreloi suurimman matriisi siirtymät, jotka ilmentävät vetovoimaa, että nämä solut kohdistavat [3]. Solut, joissa acto-myosiinin supistuminen estyy eivät pysty siirtymään läpi tiheän 3D matriisit [4]. Nämä havainnot johtavat hypoteesiin, että syöpäsolut, jotka tuottavat korkean tractions ovat invasiivisia kuin soluja pienemmillä tractions. Tässä tutkimuksessa esitetään menetelmä, jonka avulla nämä tractions voidaan mitata, ja testata tätä hypoteesia in eri invasiivisen karsinooman solulinjoissa.

2D solun tractions voidaan mitata tarkkailemalla siirtymät helmiä, jotka on upotettu tasomainen joustavaa geeli substraatti, jossa soluja viljellään. Matemaattisesti tämä on huonosti määräytyvän ongelman, johon useita lähestymistapoja on menestyksekkäästi kehitetty [5]. Varhainen lähestymistavat käänteinen suhde siirtymät ja tractions solun puoliksi äärettömän joustava halfspace käyttäen laillistaminen [6] tai Fourier [7] menetelmiä. Nuo lähestymistavat äskettäin puhdistettu tilille rajallinen paksuus elastisen alustan [8], [9], [10], parantaa spatiaalista resoluutiota [11], ja sisällyttämään veto komponentteja kohtisuorassa alustaan ​​[12].

Helmet voidaan myös dispergoida 3D soluviljelysysteemeissä arvioida solujen contractility muuton aikana [13], [14]. Tätä lähestymistapaa käyttäen 3D solu tractions ja niiden alueellista jakautumista hiljattain mitattiin ensimmäisen kerran laajentamalla ajatukset 2D veto mikroskopia kolmanteen ulottuvuuteen [15]. Tämä uusi menetelmä on teknisesti ja laskennallisesti mukana, kuitenkin, ja vaatii synteettistä polymeeriä geelin lineaarisesti elastiset ominaisuudet kuin 3D-matriisiin. Tässä esitämme menetelmän määrittää 3D supistuvuutta solujen käytännöllisesti katsoen missä tahansa biopolymeeri verkkoon standardin fluoresenssimikroskooppia. Menetelmä on laskennallisesti tehokas ja vankka vastaan ​​mittauksen melua. Sen sijaan, laskemalla 3D veto kartta solun, mitataan deformaatioenergia ja sen tiheys jakautuminen 3D soluväliaineen noin eristettyjä soluja. Tämä menetelmä antaa skalaari toimenpide koko solun kontraktiliteettiin. Lähdekoodiin kaikki tarvittavat ohjelmat suorittaa mittaukset annetaan tukeminen Information File S1.

Olemme käyttäneet tätä menetelmää verrata supistumiskyvyn useiden kasvainsolulinjojen erilaisia ​​kykyjä hyökätä tiheän kollageeniverkostoa. Osoitamme, että korkea contractility tarvitaan, mutta ei riitä hyökkäyksen läpi tiheän 3D verkko; joitakin ei-invasiivisia kasvainsolut voivat myös tuottaa korkean supistuvien voimia, mutta niiltä puuttuu kyky ohjata niitä voimia ajaa niiden liikkumiseen.

Tulokset

mittaus muodonmuutosenergian

mittaamiseksi deformaatioenergia, että solut kuluttaa muuttamaan muotoaan niiden kolmiulotteinen ympäristössä, solut joko upotettu monomeerisen kollageenin ennen polymerointia, tai viljellään kollageenin geelin pinnalle ja sen annettiin sitten spontaanisti tunkeutua osaksi kollageenia irtotavarana. Molemmissa olosuhteissa, solut leviävät ja ulottuvat huokoiseen kollageenin rakenne ja aiheuttavat vetovoimaa että geelin. Energia Näin kulutettu varastoituu joustava kanta energiaa geelit. Mittaamalla muodonmuutos kollageenigeelit, on mahdollista laskea deformaatioenergia, jos elastiset mekaaniset ominaisuudet kollageenimatriisin ovat tunnettuja.

Gel muodonmuutokset määritetään mittaamalla kantoja fluoresoivan markkerin helmiä, jotka on upotettu koko geelin. Tallennamme optinen kohdissa välein 2 um koko paksuuden läpi (~500 um) geelien (Elokuva S1). Käyttämällä ero-with-interpolointialgoritmia, voimme ratkaista helmi siirtymät Saharan pikselin resoluutio (tukeminen Information Text S1). Tarkkuus siirtymämittaukset Ø 1 pm helmiä 10 x suurennus on 22 nm xy-tasossa ja 130 nm optista akselia pitkin.

Tässä tutkimuksessa käytämme saatettua kollageenigeelien jotka muodostavat spontaanisti itsestään -assembly kollageenin kuituverkkojen (Fig. S1a). Kollageenipitoisuudella 2,4 mg /ml, nämä verkot muodostavat huokoisen rakenteen, jossa keskimääräinen huokoskoko on 1,3 um. [16] Pituudelta suuremmassa mittakaavassa kuin 10 mikrometriä, verkko morfologia voidaan pitää homogeenisena ja isotrooppinen [16]. Välinen keskimääräinen etäisyys upotettu fluoresoiva helmiä on ~24 um (Fig. S1B), joka on paljon suurempi kuin huokoskoko, niin että voimme käyttää jatkumo approksimaatio kuvaamaan mekaanisia ominaisuuksia kollageenin verkon. Saat validointi tämän lähentää nähdä tukeminen Information Teksti S1 (Fig. S8, S9). Mittaukset kartio-levy reometriä paljasti pääasiallisesti elastinen vaste kollageeniverkostoa (Fig. S1D). Kollageenigeelien esiintyy myös epälineaarinen toiminta merkittävässä kannan jäykistyminen (Fig. S1c), mutta kantojen jopa 5%, materiaalin ominaisuudet voidaan approksimoida lineaarisesti elastista käyttäytymistä leikkausmoduuli

G

of 118 Pa. Huomautamme tässä lähentämisestä keskustelu.

muodonmuutosenergia solujen kollageenigeeleissä lasketaan helmi siirtymät epämuodostuneita ja deformoitumattomat tilan geelejä. Deformoitumattomassa, voima-vapaa tila kollageeni saadaan käsittelemällä soluja 4 uM sytokalasiini D, joka häiritsee aktiinisytoskeletonin ja tukahduttaa voima sukupolvi (Elokuva S2). Palle asennot deformoitumattomat geeliä käytetään tessellating solunulkoisen microenvironment ja toimivat kulmassa solmut tetraedrielementtiverkossa elementtisuunnittelun (Fig. S3). Helmen siirtymät sitten synnyttää deformaatioenergia kussakin elementtimenetelmällä. Deformaatioenergia elementin, normalisoitu elementtitilasta, antaa kanta energiatiheys (tukeminen Information Text S1).

Tämä menetelmä johtamiseksi materiaalijännityksellä peräisin mosaiikki paikoitusase- on herkkä Mittauskohina, ja on huolehdittava tukahduttaa rahoitusosuutensa deformaatioenergia tuloksia. Tämä vaikutus johtuu siitä, että kanta energia on toisen asteen funktio siirtymän alalla. Siksi odotusarvon kohinavaikutusta on nollasta poikkeava, vaikka melu vaihtelee nollan. Virheelliset kanta energiat melulta voidaan suurelta osin välttää tunnistamalla ja poistamalla tetraedrisessa elementtejä, jotka ovat tasaisesti merkityksessä Planar lähes degeneraation (Fig. S4, S5), ja vähentämällä kokeellisesti määritetty deformaatioenergia lähtötason aiheuttama helmi siirtymä kohina (kuvio . S6 ja tukeminen Information Text S1).

Kantaa energiatiheys jaettu monimutkaisia ​​kuvioita volyymin solua ympäröivän (Fig. 1). Yleensä kanta energiatiheys on korkein lähellä solun, erityisesti lähellä solun pylväät, ja putoaa nopeasti häviävän pienelle tasolle kaikkiin suuntiin poispäin solusta. Yhteenlaskettu deformaatioenergia saadaan integroimalla kanta energiatiheys yli suuri määrä solun ympärille. Meidän menetelmä sisältää solun tilavuus itse, olettaen, että se on kimmomoduuli samanlainen soluväliaineen – me huomauttaa tähän olettamukseen keskusteluryhmässä.

Strain energiatiheys noin pitkänomaisen MDA-MB-231 rintakarsinooma solu upotettu ~400 im syvällä kollageenigeelissä. Isosurface Kannan energia näytetään leikkauksia ennustetaan koordinaatiston lentokoneita osoittamalla tavalla läpinäkyvä lentokoneita. Kanta energiatiheys on korkein lähellä solun navat ja hajoaa nopeasti kaikkiin suuntiin poispäin solusta. Integrointi kannan energiatiheys saadaan vain deformaatioenergia ja oli 3,7 PJ tässä esimerkissä. Mittakaavapalkki on 50 pm.

deformaatioenergia invasiivisia ja ei-invasiivisia karsinoomasoluja

Sen hypoteesin testaamiseksi, että invasiivisen kohdunkaulan solut tuottavat suurempia tractions verrattuna ei-invasiivisia soluja, mittasimme 3D deformaatioenergia invasiivisen soluja (A-125 keuhkojen ja MDA-MB-231 rinnan karsinoomasoluja), ja ei-invasiivisia soluja (A-549 keuhko-, MCF-7 rinta- ja A-431 ulkosynnyttimien karsinooma-soluja (ATCC -LGC-Promochem, Wesel, Saksa)). Invasiivisuus näistä solulinjoista määritettiin ymppäämällä solut paksu kollageenia geeli ja mahdollisuuden hyökätä osaksi geelejä. Kolmen päivän kuluttua, mittasimme hyökkäys profiilit tasaisempaa jakautumista solutiheyden eri geeli syvyyksissä [17]. Useimmat solut ei-invasiivisia solulinjat eivät kyenneet tunkeutumaan massaan kollageenin geelin, ja muutamia soluja, jotka eivät hyökätä pysyi lähellä pintaa (Fig. 2a). Invasiivinen solut, sen sijaan, pystyivät tunkeutumaan syvälle geelit (Fig. 2a).

a: Invasion profiilit A-125 ja A-549 keuhko-, MDA-MB-231 ja MCF-7-rinta ja A-431 häpy syöpä soluja. Solut maljattiin pinnalle kollageenigeelien ja annetaan levitä ja tunkeutua varten 3 päivää. Invaasio profiili vs. geeli syvyyksissä kuvataan kumulatiivisen todennäköisyys löytää solun alle tietyn syvyyden. Invasiivisia solut tunnusomaista niiden kyky tunkeutuneet syvälle geelit. b: Strain energia ei-invasiivisia ja invasiivisen karsinooman solut. Invasiivisia keuhko (n = 36) ja rinta (n = 33) karsinoomasolut tuottavat merkittävästi suurempi kanta energiat verrattuna ei-invasiivisia keuhko (n = 49) ja rinta (n = 31) karsinoomasoluja. Ei-invasiivisia ulkosynnyttimien karsinooma soluja (n = 35), mutta tuottaa suurin deformaatioenergia kaikista testatuissa solulinjoissa (kuvio. S10). c: Anisotropiaa solun muodon. Noninvasiiviset solut ovat merkittävästi pyöreämpiä verrattuna invasiivisia soluihin. d: anisotropia kannan energiatiheys on huomattavasti korkeampi invasiivisia verrattuna ei-invasiivisia soluja. Koska deformaatioenergia ja anisotropia arvot eri soluista seuraa log-normaalijakauma (tukeminen Information Teksti S1, Fig. S10, S11, S12), geometrinen keskiarvo ± geometrinen keskivirhe on esitetty kuvassa. b-d.

kanta energian mittaukset, solut upotettu geelit ennen polymerointia, ja eristettyjä soluja keskialueella geelin valittiin mittauksiin. Sekä invasiivisia keuhko- ja rintasyöpä soluja syntyy huomattavasti suurempi 3D tractions kuin ei-invasiivisia keuhko- ja rintasyöpä soluja, mikä näkyy selvästi korkeampi muodonmuutosenergia näiden solujen (Fig. 2b). Korkea contractility, ei kuitenkaan aina vastaa solun invasiivisuus. Huomasimme, että ei-invasiivisen A-431 häpy karsinooma solut olivat yllättävän supistuvien (Fig. 2b). Lisäksi invasiivisia keuhkosyöpä solut 4 kertaa enemmän supistuvien kuin invasiivisen -rintakarsinoomasolujen, mutta ne olivat vähemmän invasiivisia (Fig. 2a).

merkille, että invasiivinen karsinooma soluja sekä keuhkojen ja rinnan oli pitkänomainen kara-, kuten morfologia, kun taas ei-invasiiviset solut oli pyöreämpi muoto (Fig. 3a-e). Kvantitoimme solu muotoanisotropiaa suhteella maksimaalisen minimaalinen ominaisarvot toisen hetkiä solun ääriviivat. Arvo 1 vastaa muodoltaan pyöreä, ja lisäämällä arvot pitkänomainen muotoja. Invasiivinen solulinjat osoittivat merkittävästi suuremman solun muotoanisotropiaa verrattuna ei-invasiivisia soluja (Fig. 2b).

a-e: tilavuus kentät (ennustetaan XY-tasossa, normalisoitu suurimman siirtymät) ympärillä invasiivisia ja ei-invasiivisen karsinooman solut. Ei-invasiivisia soluja sopimus geelien enemmän isotrooppisesti. Invasiivinen solut tuottavat erittäin anisotrooppisen siirtymän kentät suuret siirtymät solu- navat ja alueen suhteellisen pieni siirtymien lähellä solun keskustaa. f-j: 3D tilavuus kentät samojen solujen, kuten on esitetty a-e. k-o: Kantaa energiatiheys samoihin soluihin, kuten on esitetty a-e. Suljettu isosurface Kannan energiatiheys (30% suurimmasta arvosta) on esitetty leikkauksia ennustetaan koordinaatiston lentokoneita. Kanta energiatiheys on jakautunut enemmän isotrooppinen noin noninvasiivinen solujen lähes pallomainen isosurfaces, ja jaetaan enemmän anisotrooppisesti noin invasiivisia soluja monimutkaisia ​​isosurface muotoja.

Solun muotoanisotropiaa liitteenä on anisotrooppinen jakauma solu tractions ja deformaatioenergia solun ympärille (Kuva. 2c). Kvantitoimme deformaatioenergia anisotropia jälleen suhde maksimaalinen minimaalinen ominaisarvot toisen hetkiä kannan energiatiheys noin solu. Deformaatioenergia jaettiin enemmän anisotrooppisesti noin invasiivisia soluissa, kun taas ei-invasiivisia soluja supistui geeli enemmän isotrooppinen kaikkiin suuntiin.

Lisäksi käsityksen rooliin anisotrooppisen voimajakautuman aikana kohdunkaulan soluinvaasiota voidaan saada yhdistämällä deformaatioenergia tiheyden mittaukset aikaintervallitallennuksessa. Invasiivinen MDA-MB-231 -rintakarsinoomasolujen sopeuttaa supistuvien valtioiden (Fig. 4b) yhteistuumin muuttoliikkeen geelin läpi. Time-lapse kuvia edustavan solun osoittavat, että suuntaava muutokset paikallisen kannan energiatiheys edeltää muutoksen muuttoliikkeen suuntaan (Kuva. 4g-j; ks. S15, S16 ja S17 ja Movie S4 täydellistä tietojoukon). Erottuvalla tietojoukko osoittaa nopeutus mittaus erittäin supistuvien mutta ei-invasiivisia häpy karsinoomasolulinjassa. Solun supistuvien käyttäytymistä (Fig. 4a), ei myöskään ole staattinen, vaikka vaihtelut ovat pienempiä kuin invasiiviset solut (Fig. 4b). On kuitenkin tärkeää, solu ei pysty tuottamaan anisotrooppinen jakauma tractions ja muodonmuutosenergian yli pitkiä aikoja (Fig. 4c-f; ks. S13, S14 ja Movie S3 kokonaisen tietoaineiston), ja näin ollen netto liike solu on vähäinen (tukeminen Information Text S1).

a: Aika tietenkin koko kannan energian ympärillä ei-invasiivisia häpy karsinoomasolulinjoissa (A-431) 3D-kollageenin geeli. Nolla energia viittaus mitattiin Sytokalasiini D aiheuttama jännitys release. Yhteenlaskettu deformaatioenergia vaihtelee noin ± 25% ympärillä suuren keskiarvon. b: Aika tietysti koko muodonmuutosenergian noin invasiivinen rintasyöpä- cell (MDA-MD-231) 3D-kollageenin geeli. Deformaatioenergia osoittaa suuria vaihteluja noin ± 50% keskiarvon ympärillä. c-j: aikasarja brightfield kuvia ei-invasiivisen ulkosynnyttimien karsinooma solu (A-431) (c-f) ja invasiivisia MDA-MB-231 rintakarsinooma solu (g-j), 3D-kollageenigeeliä. Päällekkäin ovat ääriviivat osoittavat suhteelliset muutokset kannan energiatiheys kahden peräkkäisen aika askelta. Sininen väri osoittaa alueilla, joissa jännitys päästetään peräkkäisten aikaa vaiheiden, ja punainen väri osoittavat alueita, joissa jännitys lisääntyy. Solu muoto on hahmoteltu valkoinen selvyyden vuoksi. Tummansininen nuolet osoittavat suunnan solun liikkeen kahden aikaan vaihetta (kts. S13, S14, S15, S16, ja S17 ja elokuvien S3 ja S4 lisätietoja).

Keskustelu

deformaatioenergia että solut kohdistavat ympäristöönsä on vankka skalaari mitta solun tractions 3D-biopolymeerimatriksiin kuten kollageenia geeli. Menetelmä on laskennallisesti tehokas; analyysi noin 10.000 helmi siirtymät kahden peräkkäisen kuvan pinot yhdessä arvioinnin tuloksena kannan energiatiheys kartta vie vain muutaman minuutin tavallisella pöytätietokoneella. Lisäksi menetelmää voidaan helposti toteuttaa mitä tahansa fluoresenssimikroskooppiin moottoroidulla z-tarkennuksen.

Menetelmä perustuu useisiin yksinkertaistavia oletuksia. Ensinnäkin, unohdamme kuituverkkoon rakenne kollageenin geelin ja kuvata sitä jatkumona. Gel muodonmuutokset otanta tehdään helmi paikoissa, ja jännityskenttää välillä helmien lasketaan tri-lineaarinen interpolointi. Tällä pituus mittakaavassa keskimäärin helmi erottaminen 24 um (Fig. S1B), tämä lähestymistapa on hyvä arvio, mutta aliarvioi todellisen muodonmuutosenergia (Fig. S7).

Toiseksi, oletamme lineaarisen materiaalin ominaisuudet ja sivuuttaa kanta jäykistyminen vasteen matriisin. Tämä johtaa aliarvioimiseen absoluuttinen muodonmuutosenergian varsinkin erittäin supistuvien solujen erittäin epälineaarinen matriisit. Tämä ei ole luontainen puute meidän menetelmä on kuitenkin. Lineaarinen jäykkyysmatriisi kollageenia voidaan helposti korvata epälineaarinen konstitutiivinen malli kollageenigeelien (tukeminen Information Text S1). Vaihtoehtoisesti lineaarinen järjestelmä kuitu- biopolymeerin verkkoja voidaan pidentää lisäämällä hydrogeelin [18].

Kolmanneksi solun mekaaniset ominaisuudet oletetaan olevan sama kuin ympäröivä kollageeni geeli, ja deformaatioenergia lasketaan koko tilavuus, eli kollageeni solua ympäröivän ja viemä itse solussa. Kuitenkin, kuten solu määrä on pieni – tyypillisesti alle 3 tetrahedral elementit – saatu virhe on merkityksetön.

luontainen rajoitus 3D veto määrityksissä on se, että solut voivat paikallisesti heikentää, syntetisoimiseksi, ja silloittamiseksi soluväliaineen ja mikä muuttaa matriisin mekaaniset ominaisuudet. Minimoida maailmanlaajuinen matriisi remontin, me sekoittaa vain pieni määrä soluja geelin kanssa ennen polymerointia. Kaikki paikalliset muutokset matriisiin mekaanisten ominaisuuksien voidaan kohtuudella olettaa rajoittuvan tilavuuteen solun ympärille on pieni verrattuna tyypilliseen geelin tilavuus suurella deformaatioenergia tiheydet.

Vaikka meidän tekniikka ei voi antaa yksityiskohtaista veto kartan päälle solun pintaan, se tarjoaa useita etuja verrattuna viime aikoina kehitetty lähestymistapoja. Jakauma kannan energiatiheys on ratkaistu riittävällä spatiaalinen resoluutio erottamaan alueet korkean ja matalan kontraktiliteettia pitkin solun muodon. Yhdessä siirtymä kenttä, tämä on riittävästi tietoa 3D solujen contractility monille biologisten kysymyksiä. Lisäksi kanta energian jakelu voidaan integroida yli matriisin tilavuus solua ympäröivän hankkia yhden, skalaari- ja biologisesti relevantti mitta solun kontraktiliteettia – koko muodonmuutosenergia. Tärkeintä on, meidän tekniikkaa voidaan käyttää mittaamaan 3D solujen contractility missään biopolymeerin verkossa. Jos biopolymeeri verkko on epälineaarinen mutta lineaarinen approksimaatio käytetään laskenta deformaatioenergia, siellä on väistämättä jonkin verran virhettä deformaatioenergia tiheydet aloilla, joilla solu venymää saavuttavat epälineaarinen järjestelmä. Tämä virhe ei ole rappeuttavat siinä mielessä, että se tapahtuu vain kerran tilallinen sijainti elementin ja ei levitä viereisiin osia (kuten on laita tractions, jotka ovat erittäin herkkiä kaukaisiin siirtymien ja matriisi epälineaarisuudet).

Tuloksemme osoittavat, että invasiivisia solut kohdistavat huomattavia voimia niiden ympäristöön. Deformaatioenergia kohdistama MDA-MB-231 rintasyöpä soluja pehmeä (118 Pa) 3D geeli oli noin 10 kertaa suurempi kuin arvot, jotka on mitattu soluja viljeltiin jäykkä (4,8 kPa) polyakryyliamidigeeleillä [17]. Tämä on yllättävää, sillä monissa solutyypeissä entistä supistuvien on jäykempi matriisit [19]. Me spekuloida, että dimensionaalisuus ympäröivä matriisi voi olla tärkeä rooli solujen kyky tuottaa vetovoimia.

Suuri supistuvien voimat eivät kuitenkaan ole riittäviä soluinvaasiota. Meidän tiedot osoittavat, että ei-invasiivisen karsinooman solut pystyvät tuottamaan erittäin korkeita kanta energioita. Tehokkaan soluinvaasiota, on tärkeää, että solu tractions käytetään tehokkaasti ohjaamalla niitä pitkin tiettyä migraatiopolun. Yhdenmukaisia ​​tämän näkemyksen, huomasimme, että solun muoto ja jakautuminen kannan energiatiheys on erittäin anisotrooppinen invasiivisia soluissa, mutta lähes isotrooppinen ei-invasiivisia soluja. Välistä yhteyttä anisotrooppinen solun muodon ja invasiivisen käyttäytymisen on kuvattu aikaisemmin soluissa sen jälkeen, kun epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon [20], ja se on arveltu, että vaikutusmekanismi invasiivisuus näissä soluissa on anisotrooppinen voiman jakautuminen [21] ja tuloksena ajallisesti ja koordinointi pullistuma, kiinnitys, veto sukupolvi, ja julkaisu [22], [23]. Havainnot esitetään tässä tukevat tätä näkemystä ja osoittavat, että on tärkeää muotoanisotropiaa ja polariteetin siirryttäessä soluissa. Meidän tekniikka tarjoaa työkalun tutkia näitä prosesseja 3D-ympäristössä.

Methods

kolmiulotteisen kollageenin määritys

rotanhäntäkollageenin (Kollageeni R, Serva, Heidelberg, Saksa ) ja naudan ihon kollageenin (kollageeni G, Biochrom, Berliini, Saksa) sekoitettiin suhteessa 01:01. Sitten lisättiin 10 tilavuus-% natriumbikarbonaattia (23 mg /ml), oranssi fluoresoiva lateksihelmet 1 um halkaisijaltaan (FluoSpheres®, Invitrogen, F8820) ja 10 til-% 10 x DMEM (Biochrom). Liuos neutraloitiin 1 N natriumhydroksidilla. Noin 2000 solua sekoitettiin 1,2 ml kollageenia liuosta ja lisätään 35 mm viljelymaljalla. Liuos polymeroitiin 37 ° C: ssa, 95%: n kosteudessa ja 5% CO

2: ssa 1 tunti. Polymeroidun kollageenigeelien paksuus oli noin 500 um.

Optiset osat

määrittää 3D-geeli muodonmuutos, me tallennetaan toistuvasti tasaisin optinen z osat (2 um välein) läpi koko geelin paksuus käyttäen moottoroitu käänteinen fluoresenssi mikroskooppi (DMI6000B, 20 × tavoite, NA = 0,4, 0,5 × video liitin, Leica Microsystems, Saksa) varustettu CCD-kameralla (ORCA ER, Hamamatsu Photonics, Saksa). Mikroskooppi lisäksi varustettu mittatilaustyönä vaiheen hautomo pitämään soluja 37 ° C: ssa, korkea kosteus ja 5% CO

2. Mittausprosessi automatisoitiin mukautettuja ohjelmistoja. Määrittää muodonmuutos kollageenigeelit, ainakin kaksi kuvapinot kirjattiin. Ensimmäinen kuva pino vastasi epämuodostunut tilaan geelin. Toinen kuva pino tallennettiin jälkeen solut käsiteltiin vähintään 10 min sytokalasiini D (4 uM) häiritä aktiinisytoskeletonille ja saada voima-vapaa, deformoitumattomat tila geelin.

3D kantoja helmiä

3D-siirtymä kunkin helmen määritettiin käyttämällä 3D-ero-with-interpolointialgoritmia levitetään kaksi kuvapinot. Palle tehtävissä ensimmäisen kuvan pino tunnistetaan yksinkertainen intensiteetin kynnystä. Subvolume 4,5 pm x 4,5 um x 14,0 um x-, y- ja z-suunnassa sen jälkeen leikattiin irti noin kunkin helmen. Aseman saman helmen toisen kuvan pino määritettiin sitten siirtämällä subvolume ensimmäisen pinon suhteessa toiseen pinoon kunnes potenssiin erot pikselien intensiteettien minimoitiin (Fig. S2). Osapikseli tarkkuus saavutettiin tri-lineaarinen interpolointi pikselin intensiteettiä. Tällä menetelmällä, 3D siirtymät helmiä voidaan mitata tarkkuudella 22 nm x- ja y-suunnassa, ja 130 nm z-suunnassa.

mittaus muodonmuutosenergian

laske jatkuva jännityskenttää erillisistä helmi tilanteet ja niiden siirtymät, käytämme elementtimenetelmällä lähentäminen geelin, jossa helmi kannat toimivat solmut lineaarisen tetrahedral elementtejä. Elementtimenetelmällä mesh saatiin Delaunay tessellation. Solmu siirtymät saadaan sitten helmi siirtymät kahden kuvapinot. Jokainen elementti oli määritetty isotrooppista lineaarisen materiaalin ominaisuudet (liukukerroin 118 Pa, suppeumaluku 0,35). Deformaatioenergia Jokaisen elementin laskettiin sitten tuote jäykkyysmatriisi kanssa uppouma komponenttien (tukeminen Information Text S1).

Noise poistaminen

deformaatioenergia laskennan syrjäytyskäyristä data on herkkä mittaukseen kohinaa, mutta se on vain additiivinen vaikutus, joka voidaan suurelta osin korjattava yksinkertaisella vähennyslaskulla. Se, missä määrin yksittäinen tetraedrielementtiverkossa elementti vaikuttaa riippuu sen tilavuudesta ja sen muoto. Mitä pienempi elementtiin ja tasaisempi muotonsa, alttiimpia se on väärä deformaatioenergia tuloksia. Muoto elementti voidaan määrällisesti sopivan muotoinen toimenpide. Täällä käytämme suhde elementtitilasta summaan sen kuutioitu reunan pituudet. Normalisoidaan, tämä arvo vaihtelee välillä 0 (vastaa maksimaalisesti degeneroituneita elementit) ja 1 (arvo säännöllisesti tetrahedron kaikki 6 reunat samanpituisia). Elementtien muotokerroin pienempi kuin 0,5 ovat suhteettoman herkkiä syrjäyttämisen melun ja niitä siksi laskenta. Aukot kannan energiatiheys kenttä ne puuttuvat osat täytetään lähimmän naapurin interpoloimalla. Deformaatioenergia virhe loput elementit voidaan laskea tiedon siirtymän virheitä ja vähennetään tulokset.

Kasvainsolulinja invaasiomääritys

Kollageeni geelit valmistettiin kuten edellä on kuvattu, mutta ilman sisällyttäminen fluoresoiva helmiä. 25000 solua siirrostettiin päälle kollageenimatriisin ja viljeltiin 72 tuntia. Tällä ajan, erot invasiivisuuden solut olivat selvästi nähtävissä. Kiinnityksen jälkeen 2,5% glutaraldehydillä PBS: ssä, ja Hoechst 33342 ytimet värjäyksen määrä tunkeutuu soluihin ja niiden hyökkäyksen suunnassa määritettiin 50 ei-päällekkäisiä näkökenttien ympäri keskellä geelejä. Tämä mittaus automatisoida mittatilaustyönä ohjelmisto, joka etsii ytimet solujen kasana tallennettujen kuvien 2 um välein koko paksuuden läpi geelien.

Cell muotoanisotropiaa

määrällisesti solu muoto käytimme analyysi toisen hetkiä 2D ennusteita solun. Jokainen solu kuvailtiin manuaalisesti suljettu monikulmio vaihe kontrastia kuvan z-asemaan suurimman terävyyden kuin määritelty Tenenbaum kaltevuus toimenpide [24]. Suljettu monikulmio sitten käyttää luomaan binaarikuvan solun,. Matriisi Toisen hetkiä voidaan sitten laskea, jossa x- ja y pikselin koordinaatit keskitetty massakeskipisteen. Cellular muotoanisotropiaa on määritelty suhde suurimman ja pienimmän ominaisarvo. Täysin pyöreä solu olisi siten käytössään anisotropia arvo on 1, ja lisäämällä arvot merkitsevät yhä anisotrooppista muotoja, kuten pitkänomainen karamaisen muotoja.

Anisotropiaa Kannan energiatiheys jakelu

Luonnehtia anisotropia kannan energiatiheys jakelu ympäri solun, laskemme toisen hetkiä kannan energiatiheys, jossa x-, y- ja z-koordinaatit on keskitetty massakeskipisteen kannan energiatiheys. Indeksi anisotropiaa kannan energiatiheys jakelu sitten määritellään suhde suurimman ja pienimmän ominaisarvon toisen hetkiä. Niinpä täysin isotrooppista jakelu kannan energiatiheys johtaisi arvon 1, ja lisäämällä arvot indeksi ovat osoitus jakaumat yhä anisotropia.

tukeminen Information

Kuva S1. Etsinnän kollageenin geelejä. a) Konfokaaliset poikkileikkaus kollageenin geelin. b) jakelu helmi-helmi etäisyydet. c) Stressi-kanta suhde kollageeniverkostoa mitattuna kartio-levy reometriä aikana kanta rampin (nopeus: 1% /s). Käyttäytyminen on suunnilleen lineaarinen kantojen alle 5%; d) Taajuusalue mitattuna kartio-levy reometriä. Amplitudi sinimuotoisia värähtelyjä oli 5%. Varastomoduuli G ’on 118 Pa taajuudella f 1 Hz.