Krooninen sairaus

tiivistelmä

Dickkopf-1 (DKK1) on inhibiittori Wnt /β-kateniinin signalointireitin. Kuitenkin rooli DKK1 etenemisessä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ei ole täysin ymmärretty. Tässä tutkimuksessa RT-PCR: llä ja Western blot käytettiin ekspression tutkimiseksi DKK1 paneelissa kymmenen ihmisen NSCLC solulinjojen ja NSCLC kudoksissa. DKK1 ilmentymistä erittäin transaktivoi valtaosassa näistä syöpälinjojen. Ilmentyminen DKK1 oli säädelty sekä mRNA ja proteiini tasoilla NSCLC kudoksissa verrattuna viereisen normaalin keuhkojen kudoksia. Immunohistokemia ja immunof- paljasti, että DKK1 on jakautunut pääasiassa sytoplasmassa sekä syöpäkudosten ja solulinjoissa. DKK1 proteiinin ilmentyminen arvioitiin myös parafiinileikkeillä 102 potilasta NSCLC immunohistokemiallisesti, ja 65 (63,73%) kasvaimet olivat DKK1 positiivisia. Suhteellinen analyysi osoitti merkittävää suhdetta DKK1 positiivisen ilmaisun ja imusolmuke etäpesäke (

P

0,05). Potilaat, joilla DKK1-positiivisia kasvaimia oli huonompi DFS kuin ne, joilla on negatiivinen ESCC (5 vuoden DFS; 15,4% vs. 27%, P = 0,007). Tutkimaan edelleen biologisten vaikutusten DKK1 in NSCLC soluissa, me yliekspressoitujen DKK1 NSCLC 95C solussa käyttämällä eukarioottiekspressiovektoriin pCMV-Tab-2b ja suorittivat knockdovvn DKK1 in LTEP-a-2 Kennon lyhyt hiusneula-RNA-ekspressiovektoriin pSilencer 5.1. DKK1 ei ollut mitään vaikutusta proliferaatioon, mutta tuntui rooli muuttoliikkeen ja hyökkäyksen valmiudet. Yliekspressio DKK1 edistää muuttavien ja invasiivisia aktiivisuus 95C, kun taas DKK1 Knockdown johti tukahduttaminen muuttoliikkeen ja invaasion potentiaalit LTEP-a-2 cell. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että DKK1 voi olla ratkaiseva säädin etenemistä NSCLC. DKK1 voisi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde NSCLC.

Citation: Li S, Qin X, Guo X, Cui A, hän Y, Wei S, et al. (2013) Dickkopf-1 Is onkogeeninen ja Osallisena invasiivinen kasvu Non pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (12): e84944. doi: 10,1371 /journal.pone.0084944

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 19 marraskuu 2013; Julkaistu: 31 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Non pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on yksi yleisimpiä pahanlaatuisia kasvaimia ja esiintyminen lisääntyy [1-4]. Huolimatta kehitys varhainen havaitseminen ja parannuksia hoidossa, pitkäaikainen eloonjääminen NSCLC edelleen epätyydyttävä. Kasvaimen uusiutuminen ja etäpesäke ovat tärkeimmät vaikuttavat tekijät ennusteeseen. Biomarkkerit, jotka voivat ennustaa uusiutumisen riskiä ja etäpesäke ovat erittäin kiireellinen. Sen vuoksi on välttämätöntä tunnistaa uusia kohteita, jotka osallistuvat kasvaimen etenemiseen ja suunnittelu asianmukaisen hoidon strategioita pienisoluista keuhkosyöpää.

Dickkopf-1 (DKK1) on erittyvä proteiini osallistuu Wnt-signalointireitin toimii estäjänä. Tavanomaisessa Wnt /β-kateniinin, Wnt-1-proteiini sitoutuu frizzled reseptorin (Fz) ja LDL-reseptoriin liittyvä proteiini-5/6 (LRP5: stä /6), liipaisu signaalit leviämisen kautta β-kateniinin [ ,,,0],5,6]. DKK1 sitoutuu LRP5: stä /6 ja lohkojen vuorovaikutus Wnt-1, jolloin β-kateniinin hajoamiseen ja hidastuminen leviämisen [7-10]. Ilmaisu ja roolit DKK1 on erilainen eri syövissä, nykyiset tutkimukset ovat raportoineet, että yliekspressio DKK1 on monissa pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien rintasyöpä, keuhkosyöpä, ruokatorven karsinoomat ja maksasolusyövän (HCC) [11-15], mikä viittaa mahdolliseen onkogeenisia funktiona DKK1 [16]. Huolimatta näistä tutkimuksista, ei juurikaan ole raportoitu merkityksestä DKK1 ilmaisun NSCLC etenemisen ja ennusteen.

Tässä tutkimuksessa ensin analysoi ilmaus paneelin ihmisen NSCLC solulinjojen ja 102 resekoitu yksilöt NSCLC, ja tutki korrelaatio DKK1 ilmaisun ja clinicapathological tekijöistä. Tämän jälkeen olemme havainneet biologisista vaikutuksista DKK1 siirtolaisuudesta ja invaasio viljellyissä haimakarsinooma- soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksyi eettiset komiteat Toisen sairaalan Hebein Medical University ja Tianjin Rinta Hospital.All osallistujat, jos niiden kirjallinen suostumus osallistua tähän tutkimukseen.

solun viljellyt ja transfektio

keuhkojen andenocarcinoma A549 ja keuhkojen suuri solulinjaa NCI-H460 hankittiin ATCC. Keuhkojen andenocarcinoma solulinjat SPC-A-1, LTEP-a-2, GLC82 A2 ja PC-9; keuhkojen squamous solulinjoja YTMLC-9 ja keuhkojen suurten solulinjoissa 95C, 95D ovat lahjakkaita Tianjin keuhkosyövän instituutin [14]. Soluja viljeltiin RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS, GIBCO), 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmassa, joka sisälsi 5% CO

2.

Solut viljeltiin 80% konfluenssiin ja transfektoitiin rekombinaatio- eukaryoottinen vektori ja tyhjän vektorin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA) valmistajan suosituksen mukaan.

Potilasnäytteet

tässä tutkimuksessa 102 potilaan formaliinikiinnitetyt NSCLC kudos- näytteitä käytettiin immunohistokemiaan värjäystä, jotka on saatu toisen sairaalan Hebei Medical University. Kymmenen potilasta tuore kudoksiin, myös ensisijainen NSCLC ja sovitettu viereisten normaaleissa kudoksissa saatiin Tianjin Chest Hospital. Kaikki kudokset varastoitiin nestetyppeen ennen käyttöä. Kudosnäytteet jauhetaan nestetypessä eristää kokonais-RNA: ta ja proteiinia.

plasmidikonstruktion

eukarioottiekspressiovektoriin pCMV-Tag-2b (Invetrogen) rekonstruoitiin ilmaista DKK1. 815 emäsparia pitkä DKK1 järjestyksessä (NM: 012242,2) ja

Eco RI

ja

BamHI

restriktioentsyymikohdat monistettiin genomisesta DNA: sta. Alukesekvenssit olivat: Eteenpäin 5′-TGGATCCATGATGGCTCTGGGCGCAGCGGGAG-3 ’, Reverse: 5′-CGAATTCTTAGTGTCTCTGACAAGTGTGAAGCCTAGAAG-3’. PCR-monistettu tuote subkloonattiin pCMV-Tag-2b vektori. Rekombinanttivektorin nimettiin pCMV-Tag-2b-DKK1. Pudotus konstruoitiin käyttäen eukaryoottiekspressiovektoriin pSilencer 5,1 (Ambion). Kohdesekvenssi on DKK1 geeni 5′-AATAAGTACCAGACCATTGAC-3 ’, ja saatu vektori nimettiin pSilencer-DKK1. Negatiivinen kontrolli sekvenssi oli 5’-CTACCGTTGTTATAGGTG-3 ’. Negatiivinen kontrolli siRNA plasmidi (pSilencer-NC) koodaa siRNA, jolla ei ole merkittävää sekvenssin samankaltaisuutta ihmisen geenin sekvenssejä. Kaikki rakentaminen sekvenssit suunniteltiin mukaan Ambion online siRNA Target Finder. Sekvenssin analyysi suoritettiin tarkistaa tuloksena vektorit.

Western blotting

Western blot suoritettiin ekspression havaitsemiseksi DKK1 vuonna toistoleikattiin NSCLC yksilöiden ja NSCLC solulinjoissa. Jäädytetyt NSCLC näytteet jauhetaan nestemäisessä typessä; solulinjoja viljeltiin 80% konfluenssiin ja korjattu. Kudosnäytteitä ja solut lyysattiin RIPA-lyysipuskuria (fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, joka sisälsi 1% Triton X-100 ja 1 nM PMSF) 4 ° C: ssa 30 minuuttia ja sentrifugoitiin 12,000rpm 15 minuuttia. Proteiini kvantifioitiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce, Rockford, IL). Yhtä suuret määrät proteiinia, ladattiin ja elektroforeesi 10% SDS-PAGE-geeli, joka sitten siirrettiin nitroselluloosalle (NC) kalvo. Kaivoa inkuboitiin 60 min PBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Tween-20 ja 5% rasvatonta maitoa estämään ei-spesifinen sitoutuminen; tätä seurasi inkubointi 4 ° C: ssa anti-ihmisen DKK1 kanin polyklonaalinen vasta-aine (elinikä, WA, USA, 1: 500 laimennosta). Membraani pestiin kolme kertaa 10 minuutin ajan PBS: ssä, jossa oli 0,1% Tween-20, ja inkuboitiin sitten 1 h HRP-konjugoitua naudan anti-kani (1: 5000 laimennosta) sekundaarisella vasta-aineella (Boster Biological Technology, Wuhan, Kiina) huoneen lämpötila. Immumoreactive Sitten proteiinit havaittiin käyttämällä ECL alustan seuraavan valmistajan suosituksesta. β-aktiini käytettiin endogeenisen proteiinin normalisointi. IPP kuva-analyysi-ohjelmisto käytettiin kvantifiointiin.

RT-PCR ja reaaliaikainen PCR

analyysi DKK1 ilmentymisen NSCLC soluissa, kokonais-RNA eristettiin Trizol. Yhtä suuri kuin mRNA: n kutakin näytettä käänteisesti cDNA: ksi käyttämällä satunnaista aluketta. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina, PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen seuraavia alukkeita: DKK1, Forward 5′-CAACGCTATCAAGAACCTGC-3 ’, Reverse 5′-GATCTTGGACCAGAAGTGTC-3′; GAPDH, eteenpäin 5’-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3 ’, Reverse 5′-TGGXGTGTGAACCACGAGAA-3’. PCR optimoitiin syklien määrä varmistaa tuotteen intensiteetti on lineaarisella vaiheessa monistuksen jälkeen PCR-tuotteet analysoitiin sitten elektroforeesilla 2% agaroosigeelissä.

Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen SYBR

® Green (Code DRR041A, Takara) kanssa kokonaistilavuudessa 30 ui yli kaksivaiheista sykliä käyttämällä seuraavia lämpötila-protokolla: 10 s 95 ° C, minkä jälkeen 42 sykliä 95 ° C 15 s ja 55 ° C: ssa 30 s. Reaktiot pantiin 96-kuoppaisen levyn (ABI) käyttäen esikuumennettu reaaliaikaisen väline (ABI 7500HT). Suhteellinen ekspressiotasot kvantitoitiin ja analysoitiin käyttäen Bio-Rad iCycler iQ-ohjelmisto. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin analysoida suhteellisen geeniekspressioiden ja kukin näyte testattiin kolmena kappaleena. Ct-arvoja käytettiin laskettaessa mRNA: n tasoja. Määrä kohdegeenin ilmentymisen (2-Ct) normalisoitiin käyttäen endogeenista GAPDH viittaus, määrä kohdegeenin kontrollinäytteessä asetettiin kalibraattori 1,0. Alukesekvensseissä käytetään reaaliaikaista PCR taulukossa S1.

Proliferaatiomääritys

MTT-määritystä käytettiin analysoimiseksi solujen lisääntymistä. 24 tunnin jälkeen transfektion solut ympättiin 96-kuoppaiseen levyyn 5,0 x 10

3 solua /ml ja viljeltiin 24 h, 48 h, 72 h, ja 96 tunnin vastaavasti. Kullakin ajanhetkellä, 10 ui MTT-reagenssi (5 mg /ml, Sigma) lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja inkuboitiin 4 tuntia 37 ° C: ssa. 200 ui DMSO: ta (Invitrogen) lisättiin liuottamaan formatsaanikiteet 30 minuuttia sen jälkeen, kun hylätään supernatantti. Spektrometriaa absorbanssi mitattiin aallonpituudella 490 nm mikrolevylukijalla (Spectra Max M5, MD, USA). Sen varmistamiseksi, että tulokset kunkin näytteen testattiin kolmena kappaleena ja kaikki kokeet suoritettiin kolme kertaa.

Haavojen paraneminen määritys

Siirtyminen kyky määritettiin käyttäen haavan paranemista määrityksessä. Vastaavia soluja maljattiin 12-kuoppaisille levyille ilman antibiootteja. 24 tunnin jälkeen transfektion solut haavoittuneen steriilillä muovinen 100 ui mikropipetin kärki, ja kelluvan roskia pestiin PBS: llä ja viljeltiin seerumittomassa elatusaineessa. Leveys haavan mitattiin eri ajankohtina. 3-4 eri paikoissa visualisoitiin ja valokuvattiin vaiheittain kontrastin käänteismikroskooppi (40 × tavoite, TE2000-E, Nikon, Japani).

Boyden kammion määritys

Boyden kammion määritystä käytettiin tutkia soluinvaasiota ominaisuus. Solut transfektoitiin lipofectmine 2000. 16 tunnin jälkeen solut käsiteltiin trypsiinillä ja suspendoitiin uudelleen. 5,0 x 10

4 solut 300 ui RPMI-1640-väliaine laitettiin ylempään osastoon (huokoskoko 8 pm, BD Biosciences). Alakammioissa täytettiin 500 ulilla täydellistä elatusainetta, jossa oli 10% FBS: ää. Kun oli inkuboitu 48 h 37 ° C: ssa, solut yläpinnan suodattimen poistettiin pumpulipuikolla. Vaeltavien solujen alapinnan insertit kiinnitettiin ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja pestiin kahdesti PBS: llä. Värjätyt solut visualisoitiin sitten mikroskoopilla ja solujen määrä laskettiin viidellä satunnaisesti aloilla (suurennoksia 100 x). Boyden chamber tehtiin kahtena kahdessa erillisessä kokeessa.

immunohistokemia ja immunof-

tutkimiseksi tilan DKK1 proteiinin kliinistä NSCLC näytteistä, jotka oli upotettu parafiiniblokit, IHC värjäys suoritettiin mukaisesti seuraavasti. Parafiinisektioista poistettiin parafiini ksyleenillä ja niihin lisätään arvostellaan etanolia ratkaisuihin. Endogeenisen peroksidaasin blokattiin 3% H

2O

2 15 minuuttia huoneenlämpötilassa, ja sitten leikkeet kuumennettiin 0,01 M sitraattia (pH = 6,0) 95 ° C: ssa 15 minuuttia mikroaaltouunissa antigeenin haku . Inkuboinnin jälkeen anti-DKK1 kanin polyklonaalista vasta-ainetta (ab22827, Abcam Inc, Cambridge, MA, laimennus 1: 200), 2 tuntia huoneenlämmössä, negatiivisten kontrollien ilman primaarista vasta-ainetta. Leikkeitä inkuboitiin HRP-leimatun anti-kanin IgG sekundääristä vasta-ainetta. Intensiteetti DKK1 värjäytyminen arvioitiin käyttäen seuraavia perusteita [12,14]: vahva positiivinen (2+), tummanruskea värjäystä 50% kasvainsolujen sytoplasmassa; heikko positiivinen (1+), mitä tahansa vähäisen ruskean värjäyksen kasvainsoluissa; poissa (pisteytettiin 0), jotka ovat immunoreaktiivisia ja DKK1 10% tai vähemmän kasvainsoluja. Tulokset arvioitiin kahdella patologit tietämättä kliinis tiedot.

TE13-soluja viljeltiin lasipeitinlevyille, joka kiinnitettiin sitten 4% paraformaldehydillä ja permeabilisoitiin 0,2% Triton X-100 PBS: ssä 10 minuuttia huoneen lämpötila. Tämän jälkeen soluja blokattiin 3% BSA: ssa 30 minuuttia huoneenlämpötilassa, ja sitten niitä inkuboitiin primääristen vasta-aineiden laimennettu PBS: ään, joka sisälsi 3% BSA: lla 60 min ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen PBS: llä, solut värjättiin FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology) ja 30 min 37 ° C: ssa. Lopuksi peitelaseja pestiin PBS: llä ja tumat asennettu DAPI ja visualisoidaan konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 10.0 ohjelmistolla. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. Studentin t-testiä ja yksisuuntaista varianssianalyysiä käytettiin. Väliset suhteet ryhmitelty muuttujia analysoitiin käyttäen chi-neliö testi. Eloonjäämiskäyrät tuotettiin menetelmällä, jonka on kuvannut Kaplan ja Meier. Erot käyrät arvioidaan käyttämällä log-rank testejä. P-arvot 0,05 pidettiin merkittävänä. Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolmena kappaleena [15].

Tulokset

DKK1 ilmentyminen viljellyissä ihmisen NSCLC solulinjoissa

ilmentymistä DKK1 leimasi useissa ihmisen NSCLC solulinjat. DKK1 proteiini oli havaittavissa kaikissa solulinjoissa (kuvio 1). Suurempi ekspressio havaittiin LTEP-a-2 ja GLC-82 solulinjat. Alempi ilmentymistä havaittiin A2 ja 95C syöpäsolun linjat. DKK1 mRNA-ekspressiota tutkittiin myös käyttämällä RT-PCR-tulokset olivat yhdenmukaisia ​​tuloksia Western blot (kuvio 1 B). Sijainti solussa on DKK1 ilmaisun NSCLC solulinjassa määriteltiin immunofluoresenssivärjäyksellä. Tulokset osoittivat, että DKK1 ilmentyminen oli enimmäkseen jaettu sytoplasmassa, jossa rakeinen (kuvio 1 C).

(A) ilmentyminen DKK1 mRNA tasolla (RT-PCR: 28 monistussykliä). GAPDH mRNA käytettiin sisäisenä kontrollina. (B) ilmentäminen DKK1 proteiinien tasolla. β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. (C) solunosasijaintia endogeenisen DKK1 proteiinin NSCLC solussa. DKK1, värjättiin rodamiini B, oli sytoplasmassa solun esiintyvät hienojakoinen materiaali. Solun tumassa esiintyi sininen fluoresenssi värjättiin DAPI (suurennus 100 x).

DKK1 Expression NSCLC kudoksissa

ekspression tutkimiseksi DKK1 proteiinin NSCLC, 102 pienisoluista keuhkosyöpää parafiinileikkeillä arvioitiin immunohistokemiallisella analyysillä. Näiden, 46 (45,1%) osoitti, vahva positiivinen DKK1 ilmaisun pääasiassa sytoplasmassa kasvainsolujen, tummanruskea rakeinen jakeluun. 19 (18.63%) näytteistä oli heikko positiivinen ilme kanssa vaaleankeltainen hiukkasia. kun taas loput 37 (36,27%) olivat negatiivisia. Yhteenlaskettu määrä positiivista värjäytymistä oli 63,73%. Sitä vastoin yksikään normaalin epiteelin osoitti merkittävää tason immunohistokemiallisella värjäyksellä (kuvio 2A). Olemme edelleen analysoineet korrelaatio DKK1 ilmaisun ja kliinis parametrit; On mielenkiintoista huomata, että positiiviset ilmaisut Dkk1 lähinnä mukana imusolmukkeiden etäpesäkkeiden (taulukko 1). Yhteenlaskettu 5-vuoden tautivapaan elinajan (5 vuoden DFS) määrä potilaita, joilla DKK1-negatiivinen oli 27%, kun taas potilailla, joilla DKK1-positiivisia kasvaimia osoitti köyhempi DFS kuin ne, joilla on syöpäkasvain (5 vuoden DFS; 15,4% vs. 27%, P = 0,007) (Kuva S1). Nämä tulokset osoittavat, että Dkk1 yliekspressio on yleinen tapahtuma ihmisen NSCLC, joilla saattaa olla mahdollinen suhde etäpesäkkeiden NSCLC.

(A) Expression immunohistokemiallisella värjäyksellä. DKK1 vahva positiivinen ekspressio keuhkosyöpä esittää värjäytymistä pääasiassa sytoplasmassa kasvaimen solut (suurennus 100 x). Edustavia DKK1 heikko positiivinen keuhkosyöpä vaalean keltainen hiukkasia kasvainsoluissa (suurennus 100 x). DKK1 negatiivinen keuhkosyövän solu osoittaa lähes mitään huomattavaa värjäytymistä tuumorisolujen (suurennus 100 x). Normaali keuhkokudoksen ilman värjäystä. (B) ekspressio DKK1 mRNA NSCLC kudoksissa ja vastaaviin normaaleihin keuhkojen kudoksia. (C) ilmentäminen DKK1 proteiinin NSCLC kudoksissa ja vastaaviin normaaleihin keuhkojen kudoksia. N, normaali kudos; T, Tuumorikudos. Positiivinen ilmauksia DKK1 lähinnä mukana imusolmukkeiden etäpesäke.

Parametrit

n

DKK1 ilmaisu

χ

2

P

value

Positive(%)

Negative(%)

Age(years) 606439(60.9%)25(39.1%)0.5780.2940 ≥603826 (68,4%) 12 (31,6%) GenderMale8151 (63,0%) 30 (37,0%) 0.0990.4820 Female2114 (66,7%) 7 (33,3%) DifferentiationWell3221 (65,6%) 11 (34,4%) 0.0640.8003

*

Moderate4327 (62,8%) 16 (37,2%) Poor2717 (63,0%) 10 (37,0%) TT1117 (63,6%) 4 (36,4%) 0.12130.7276

**

T23623(63.9%)13(36.1%)T31824(66.7%)12(33.3%)T41911(57.9%)8(42.1%)N(Metastasis)Positive(N1+N2)5447(87.0%)7(13.0%)26.9760.0000 Negatiivinen (N0) 4818 (37,5%) 30 (62,5%) Taulukko 1. korrelaatio DKK1 ja eri kliinispatologiset parametrit

*

No ryhmä vs. kohtalainen;

**

T3 vs. T4.

CSV Lataa CSV

vieressä havaittu ilmentymistä DKK1 kirurgisesti toistoleikattiin NSCLC kudosten ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin. Niistä 10 tapausta NSCLC, 7 verrokkeja ilmen- tymisen lisääntymisen ilmentymistä DKK1 mRNA syöpäkudoksessa verrattuna vastaavassa normaalissa kudoksessa (kuvio 2B). Western blot tulokset osoittivat samaa taipumuksen DKK1 proteiinin taso (kuvio 2C).

vaikutus DKK1 ilmentymisen vaikutus muuttoliikettä ja hyökkäyksen 95C

Voit testata biologisen roolin DKK1 NSCLC solussa, me tutki seurauksena yli-ilmentymisen DKK1 solun muuttoliikettä ja invaasiota valmiudet 95C solulinja, joka itse asiassa on hyvin alhainen endogeenisen DKK1. Eukaryoottiekspressiovektoriin pCMV-Tag-2b-DKK1 rakennettiin yli-ilmentää geenin DKK1. Merkittävä tasojen nousu sekä DKK1 proteiinin mRNA havaittiin 95C solulinjassa transfektoitu pCMV-Tag-2b-DKK1 verrattuna sokeakoekuoppaa ja negatiivisen kontrollin (Kuva 3.). Sen jälkeen, MTT-analyysi paljasti, että yli-ilmentyminen DKK1 ei muuttanut solujen lisääntymistä kyky (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin siirtyminen kyky edistettiin haavan paranemista määritys (Kuva 3. B, C). Boyden kammion käytettiin testaamaan invasiivisuus, 95C solu transfektoitiin joko pCMV-Tag-2b-DKK1 tai pCMV-Tag-2b, ja tyhjä kontrolliryhmä lisättiin transfektioreagenssin ilman plasmidia. 18 h jälkeen transfektion jälkeen solut siirrostettiin uudelleen päälle insertin. Solut, jotka tunkeutuivat muurin läpi ja saavutti toisella puolella kammion insertin kirjattiin 48 tunnin kuluttua inkubaation. Boyden kammion tulokset osoittivat, että solut, jotka mennyt kalvon läpi, on pCMV-Tag-2b-DKK1 ryhmässä oli suurempi kuin muissa ryhmissä (kuvio 3 D). Nämä havainnot osoittivat, että yli-ilmentyminen DKK1 voi merkittävästi edistää hyökkäys kyky 95C solujen (kuvio 3. E).

(A) RT-PCR: llä ja Western blot -analyysi DKK1 ilmaisun. DKK1 taso 95C transfektoitu pCMV-Tag-2b-DKK1 on huomattavasti korkeampi kuin pCMV-Tag-2b ja tyhjä kontrolliryhmään. (B) toinen haavoittunut ja parantavaa 95C soluja. (C) mittaus vaellusetäisyydet (*

P

0,05). (D) hyökkäys kyky 95C transfektoitu pCMV-Tag-2b-DKK1 oli merkittävästi parannettu. (E) määrä liikkuvien solujen kautta Matrigel päällystetty suodattimia oli tilastotieto analysoitiin. Määritykset tehtiin kolmena rinnakkaisena (*

P

0,01).

knockdovvn endogeenisen DKK1 siRNA vähentynyt muuttoliike ja hyökkäyksen LTEP-a-2

Analysoimme vaikutukset DKK1 Knockdown siirtolaisuudesta ja hyökkäyksen LTEP-a-2 solulinja . Voit selvittää Knockdown tehoa shRNA The DKK1expression tasolla LTEP-a-2 solulinjoissa tutkittiin sekä RT-PCR ja Western blot. Erityiset siRNA vähentää tehokkaasti endogeenisen ilmentymisen DKK1 soluissa, jotka transfektoitiin pSilencer-DKK1 verrattuna soluihin, jotka oli transfektoitu pSilencer-NC-vektoriin (kuvio 4 A).

(A) RT- PCR: llä ja Western blot -analyysi DKK1 ilmaisun. DKK1 tasolla LTEP-a-2 solu on transfektoitu pSilencer-DKK1 on merkittävästi pienempi kuin vuonna pSilencer-NC ja tyhjä kontrolliryhmään. (B) haavoittunut ja parantava LTEP-a-2-soluissa. (C) mittaus vaellusetäisyydet (*

P

0,05). (D) hyökkäyksen kykyä LTEP-a-2 transfektoitu pSilencer-DKK1 merkittävästi tukahdutettu. (E) määrä liikkuvien solujen kautta Matrigel päällystetty suodattimia oli tilastotieto analysoitiin. Määritykset tehtiin kolmena rinnakkaisena (*

P

0,01).

pudotus endogeenisen DKK1 siRNA ei vaikuttanut LTEP-a-2 lisääntymistä (tietoja ei ole esitetty), mutta merkittävästi tukahdutettu siirtymisen kyky haavan paranemista määrityksessä. Siirtymisen nopeus pSilencer-DKK1 solujen haavan paranemiseen oli merkittävästi pienempi 48 tunnin kuluttua transfektion kuin pSilencer-NC ja tyhjä kontrolliryhmässä (Kuva 4. B, C). Kun viljellään Boyden kammiossa, solujen lukumäärä, jotka kulkeutuivat kautta Matrigel päällystetty huokoiset suodattimet väheni merkittävästi DKK1 Knockdown pSilencer-DKK1 soluissa verrattuna pSilencer-NC ja tyhjä kontrolliryhmässä (Kuva 4. D, E).

yli-ilmentyminen DKK1 muuttaa liittyvien geenien ilmentymistä

tutkia mekanismi DKK1 keuhkosyövän etenemisen, reaaliaikaisen PCR suoritettiin havaita vaikutus DKK1 ilmentymisen vaikutus ilmentymisen suhteellisen osallistuvien geenien karsinogeneesissä. Yliekspressio DKK1 ei muuttanut ilmentymistä solusyklin related protein cyclinD1 ja apoptoosiin liittyvien proteiinien Bcl-2 ja Box. Akt-1 liittyy signalointireitin oli minimaalisesti voimistussäädellään 95C transfektoitu pCMV-Tag2b-DKK1. Ilmentyminen MMP2 ja VEGFC että 95C transfektoitu pCMV-Tag2b-DKK1 nostettiin 7,78-kertaiseksi ja 2,13-kertainen verrattuna ohjaus 95C-soluissa (taulukko S2).

Keskustelu

perhe ihmisen DKK proteiinien koostuu DKK1, DKK-2, DKK-3, DKK-4 ja ainutlaatuinen DKK3 liittyvä proteiini, jota kutsutaan Soggy [17]. DKK1, joka koodaa eritettyä proteiinia, on antagonisti Wnt /β-kateniinin signalointia, joka liittyy kasvaimen etenemistä [13,18-22]. DKK1 ilmaistaan ​​lukuisissa ihmisen syövissä; se voisi olla erilaiset biologiset roolit kasvainsoluissa riippuen solutyypistä mukana. DKK1 esiintyminen lisääntyy joitakin erilaisia ​​ihmisen kasvaimista lukien NSCLC, maksasyövän, haimasyövän [12,14,19,23]. Näytti siltä, ​​että DKK1 saattaisi olla ratkaiseva rooleja etenemisen aikana tämäntyyppisiä kasvaimia, mutta biologiset vaikutukset DKK1 in NSCLC ei ole selvitetty. Tässä tutkimuksessa olemme vahvistaneet, että DKK1 ilmaistaan ​​paneelin NSCLC solulinjoissa. Immunoflouresence osoitti, että DKK1 subsellulaarinen sijainti ilmentyminen oli enimmäkseen jaettu sytoplasmassa NSCLC-soluja. IHC tutkimus DKK1 ilmaisun 102 NSCLC yksilöt ilmeni, että positiivinen ilmaus DKK1 korreloi imusolmukkeiden etäpesäke; se saattaa olla ennustaja syövän etäpesäkkeiden. Osalta ennustetta, positiivinen ilmaus DKK1 proteiinin korreloivat synkkä 5 vuoden pysyvyys. DKK1 ylössäädellään NSCLC kudoksissa verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin. Joten on mahdollista, että DKK1 on mukana etenemistä NSCLC.

DKK1 on erittyvä proteiini, joka sisältää signaalipeptidin sekvenssin ja kaksi kysteiinirikkaan aloilla ja toimii negatiivisena säätäjänä Wnt signaloinnin [6, 7]. Lisäksi, DKK1 raportoitiin olevan alavirran kohde β-kateniinin /T-solu-tekijä ja osallistuu negatiivisen takaisinkytkentäsilmukan Wnt signalointi koolonkarsinoomasoluissa [24,25]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että yli-ilmentyminen DKK1 oli yhteydessä huonoon ennusteeseen [14,19,21], kun tiedetään vähän toiminta DKK1 in NSCLC. Lisätutkimuksia biologisista vaikutuksista DKK1 vuonna ivtro ensinnäkin me varmistaneet, että yliekspressio DKK1 edistää muuttoliikkeen ja hyökkäyksen ihmisen NSCLC solulinjassa 95C. Samaan aikaan yli-ilmentyminen DKK1 voimistunut ilmentyminen etäpesäkkeiden liittyviä proteiineja, mutta yksityiskohtaista mekanismia tarvitse olla lisätutkimuksia. Lisäksi käytetään eukaryoottiekspressio- of DKK1 shRNA, osoitimme, että knockdovvn DKK1 estää migraation ja invaasion NSCLC solulinjan LTEP-a-2.Edellä tulokset osoittavat, että DKK1 saattaa olla positiivinen rooli etenemistä NSCLC, mutta mekanismista invaasion tarvitsee lisätutkimusta.

Kuitenkin jotkut tutkimukset ovat raportoineet, että DKK1 tukahduttaa solujen kasvua ja muuttoliike [16,26], mikä viittaa siihen, että saattaa olla muita rooleja DKK1 että Wnt /β-kateniinin signalointi. DKK1 voisi olla erilaiset biologiset roolit eri tyyppisiä syöpäsoluja. Retrospektiivinen analyysi DKK1 ilmaisun osoittivat, että DKK1 muutettiin aikana PCa etenemisen [27]. Toistaiseksi vain harvat ole raportoitu koskien roolit DKK1 NSCLC keskittyneet lähinnä diagnoosi ja prognoosi arvot [12,21,28-30]. Rooli DKK1 NSCLC, sen mekanismi toiminta ja kliinisten näkökohtien tarvitsevat lisätutkimuksia.

Yhteenvetona vaikka yksityiskohtainen toiminta DKK1 NSCLC etenemistä ei ole hyvin selvitetty, tulokset viittaavat siihen potentiaalia roolit DKK1 edistämisessä muuttoliike ja invasiivisen kasvun NSCLC solulinjoissa, ja että se voisi toimia uusi terapeuttinen kohde NSCLC.

tukeminen Information

Kuva S1.

Tautivapaa elinaika käyrä luokiteltu DKK1 ilmaisun kaikkien potilaiden piirretty Kaplan-Meier menetelmiä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0084944.s001

(TIF) B Taulukko S1.

alukkeet sekvenssi, jota käytetään real-time PCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0084944.s002

(DOC) B Taulukko S2.

Differenciál geenien ilmentymistä 95C, jotka on transfektoitu pCMV-Tag2b-DKK1 suhteessa 95C transfektoitiin pCMV-Tag2b.

doi: 10,1371 /journal.pone.0084944.s003

(DOC) B