Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

poikkeava sääntely phosphatidylinositide 3-kinaasien (PI3-K) /Akt, AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) ja nisäkkään rapamysiinin kohde (m-TOR ) signaalireaktioteissä syöpä on saanut merkittävää kiinnostusta tukahduttaminen näistä reiteistä syövän hoitoon. Kofeiinihapon (CA) on raportoitu olevan tärkeä anti-inflammatorisia vaikutuksia. Kuitenkin molekyylitason mekanismit, joilla CA johdannaiset, myös kofeiinihappoa fenetyyliesteri (KAP) ja kofeiinihappoa fenyylipropyyliesterituotetta (CAPPE), aiheuttavat inhiboivia vaikutuksia proliferaatioon ihmisen paksusuolen syövän (CRC) soluja on vielä selvittämättä.

Menetelmät /Principal havainnot

CAPE ja CAPPE arvioitiin niiden kyky muokata näitä signalointipolkujen ja tukahduttaa leviämisen CRC-solujen sekä

in vitro

ja

in vivo

. Anti-syöpä vaikutuksia näillä CA johdannaisten mitattiin käyttämällä proliferaatiomäärityksillä, solusyklin analyysi, Western blotting-määritys, reportterigeenimäärityksessä ja immunohistokemiallinen (IHC) värjäys määritykset sekä

in vitro

ja

in vivo

. Tämä tutkimus osoittaa, että CAPE ja CAPPE näytteille annosriippuvaisen inhibition leviämisen ja eloonjäämisen CRC solujen indusoimalla G

0 /G

1 solusyklin pysähtymiseen ja vahvistukseksi apoptoottisten reittien. Kulutus CAPE ja CAPPE estivät merkittävästi kasvua peräsuolen kasvainten hiiren ksenograftimallissa. Mekanismit toiminta sisältyi modulaatio PI3-K /Akt, AMPK ja m-TOR signa- sekä

in vitro

ja

in vivo

. Yhteenvetona tulokset osoittavat uusi syöpälääkkeen mekanismit CA johdannaisten kasvua vastaan ​​ihmisen CRC solujen.

Johtopäätökset

CA johdannaiset ovat tehokkaita syöpälääkkeitä, jotka lisäävät AMPK aktivointia ja edistää apoptoosia ihmisen CRC soluissa. Rakenne CA johdannaisia ​​voidaan käyttää järkevän suunnittelun uusille estäjiä, jotka kohdistuvat ihmisen CRC soluja.

Citation: Chiang E-PI, Tsai SY, Kuo YH, Pai MH, Chiu HL, Rodriguez RL, et al. (2014) kofeiinihappoa johdannaiset estävät kasvu Colon Cancer: osallisuus PI3-K /Akt ja AMPK signalointireitteihin. PLoS ONE 9 (6): e99631. doi: 10,1371 /journal.pone.0099631

Editor: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan

vastaanotettu: 3. heinäkuuta 2013. Hyväksytty: 16 toukokuu 2014; Julkaistu: 24 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Chiang et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä aine perustuu työhön tuettu, osittain opetusministeriö, Taiwan, ROC alle ATU suunnitelma, National Science neuvosto avustusta, alle sopimukset NSC-100-2320-B-039-003, 100-2628-B005-002-MY4, 101-2320-B-039-054-MY3, 101-2320- B-005-006-MY3, 102-2911-I-005 -301, 101-2811-B-039-024, Department of Health Grant alle Sopimukset DOH 102-TD-B-111-004 ja DOH-102- TD-C-111-005 ja China Medical University (CMU) avustusta sopimukset CMU101- Award -10, CMU100-ASIA-11, CMU101-ASIA-3, ja CMU101-S-25. Kaikki mielipiteet, havainnot, päätelmät tai suositukset ilmaistu tässä julkaisussa ovat samat kuin tekijä (t) ja eivät välttämättä heijasta opetus-, National Science Council, Department of Health, National Chung Hsing University, Taipei Medical University , Asia University, University of California Davis ja China Medical University. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi johtavista syistä ja syövän kuolleisuus monissa maissa [1], [2]. Yhdysvalloissa yksin, noin 50000 kuolemantapausta ovat syynä tähän syöpään vuosittain [1], [2]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että mutaatiot phosphatidylinositide 3-kinaasi (PI3-K) /Akt ja mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) /solunulkoisen-signaali-säänneltyjen kinaasi (ERK) molekyylit havainnoidaan yleisesti erityyppisiä syöpiä [3] [4]. Esimerkiksi onkogeenisiä aktivointi PI3-K /Akt molekyylit parantaa solujen lisääntymistä lisäämällä sykliini D1 tasolla [5], [6]. On hyvin tunnettua, että poikkeava ekspressio sykliini D1 ja Cdk4 proteiineja on mukana leviämisen CRC-solujen [7]. Suppressio PI3-K /Akt ja MAPK /ERK signalointireittien johtaa saartoon solujen lisääntymistä ja osoittaa, kuinka tärkeää näiden signa- valvonnassa sekä solusyklin etenemisen ja solujen kasvua aikana syövän kehityksen [4], [8] . Siksi PI3-K /Akt ja MAPK /ERK signalointireitteihin pelata hallitseva rooli määritettäessä kohtalo kasvaimen kasvua. Pahanlaatuisia syöpäsoluja irrota primaarikasvaimen ja vaeltavat ympäri rakenteellisten esteiden, kuten tyvikalvoissa ja ympäröivän strooman soluväliaineen (ECM) [9]. Tuumorin invaasio ja metastaasi molemmat edellyttävät ekspression lisääntymisen matriksin metalloproteinaasien (MMP: t) ja hajoaminen ECM [9], [10]. MMP ovat sinkki riippuva endopeptidaasit pystyy hajottamaan ECM osia [11]. Entsyymit, kuten MMP-9 hajota ECM ja luoda mikroympäristön, joka ylläpitää kasvaimen kehittymisen [10], [11].

AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) on polttoaine-sensing molekyylin, joka toimii säätelijä energiatase [12]. AMPK: n on osoitettu ilmentyvän nisäkässoluissa ja olla mukana energian homeostaasissa [13]. Lisääntynyt adenosiinimonofosfaatin (AMP) /adenosiinitrifosfaatti (ATP) suhteen, mikä lasku solun energia-tilassa, johtaa aktivointi AMPK-proteiinin fosforylaatio [14]. Korotti AMPK aktivaation ajatellaan korreloivan käänteisesti syöpäriskiä [15]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat lisäksi ehdottaneet, että aktivointi PI3-K /Akt ja MAPK /ERK molekyylejä liittyy alentunut taso fosforyloituu (aktivoitu) AMPK aikana syövän etenemisen [16], [17]. Lisätutkimukset totesi, että AMPK-agonistit ovat tehokkaita syövän hoitoon [15], [18], kun taas muut tutkimukset osoittivat, että lipogeeniset entsyymi rasvahapon nopaliinisyntaasin (FASN) säätelee energian saannin ja on keskeinen rooli syövän synnyssä [19] . Eräs tuore tutkimus kertoo, että FASN ilmentyminen korreloi kasvun ja etenemistä CRC [20]. Fosforylaatio (eli aktivaatio) Akt osoitettiin indusoida FASN ja käynnistää aggressiivinen pahanlaatuisen syövän soluihin [21]. Sen sijaan, käsittelemällä AMPK-agonisti, joka johtaa aktivaatioon AMPK, tukahdutti ilmaus FASN ja esti kasvua paksusuolen kasvaimen [22] – [24]. Lisäksi epidemiologiset tutkimukset osoittivat lisäksi, että AMPK (PRKAG2) yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) liittyy vaara ihmisen CRC [25]. Näin ollen, AMPK-välitteinen energian homeostaasin on herättänyt kiinnostusta tämän reitin keinona hoitaa ihmisen paksusuolen syövän.

Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että fenoliset happamat yhdisteet toimivat tehokkaita antioksidantteja, [26]. Niistä kofeiinihapon (CA) on ei-vitamiinin fenoliyhdisteitä löytyy pääosin vihanneksia ja hedelmiä. Lisäksi sen antioksidantti, CA kykenee anti-inflammatorisia vaikutuksia in useita erilaisia ​​solujen [27], [28]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että kofeiinihappoa fenetyyliesteri (CAPE), CA johdannainen luonnollisesti eristetyn mehiläisen propolis, aiheuttaa myös sen myönteisiä vaikutuksia kautta antioksidantti ja tulehdusta toimintaa [29], [30]. Lisäksi on osoitettu, että Kap estää leviämisen syöpäsolujen ja toimii mahdollisena solunsalpaajaksi [31], [32]. Ei ole kuitenkaan mitään raportti estäviä vaikutuksia CA johdannaisiin AMPK polku ja /tai FASN ilmentymisen etenemisen aikana CRC. Lisäksi puute yhdenmukaisia ​​tuloksia kaikkialla lukuisat tutkimukset ja epäonnistumisen määrittää vaikutusmekanismia CA johdannaiset voivat selittää vaikeuden osoittaa

in vivo

eduista CA johdannaisen lisäravinteiden vastaan ​​CRC. Tutkimme siis estäviä vaikutuksia eri CA johdannaisten ihmisen CRC-soluissa sekä

in vitro

ja

in vivo

. Tulokset osoittivat, että CA johdannaiset, kuten KAP ja kofeiinihappoa fenyylipropyyliesterituotetta (CAPPE) esti merkitsevästi solujen lisääntymisen ihmisen CRC-soluissa. CAPE ja CAPPE aiheuttama solukierron pysähtymisen läpi tukahduttaminen PI3-K /Akt ja mTOR signalointireitteihin. Lisäksi CA johdannaiset vähensi solujen ATP-tasot ja tukahdutti FASN ilme. Vaikutusmekanismia liittyi osittain täydentämistä on AMPK reitin. Tulokset Tämän tutkimuksen mukaan CA johdannaiset toimivat kemopreventiivisten aineina ihmisen CRC moduloimalla PI3-K /Akt, mTOR ja AMPK signalointireitteihin sekä

in vitro

ja

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja vasta

Ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa HCT-116 ja SW-480 ostettiin American Type Culture Collection (Walkersville, MD). Seuraavia monoklonaalisia vasta-aineita ostettiin Cell Signaling Technology, Inc .: Anti- N-kadheriinin (# 4061), PTEN (# 9559), anti-fosforylaatio PDK1 (Ser241; # 3061), yhteensä-PDK1 (# 3062), anti- -phosphorylation Akt (S473; # 4060), yhteensä-Akt (# 9272), anti-fosforylaatio GSK3α (S21; # 9327), päätyen GSK3α (4337), anti-fosforylaatio GSK3p: n (S9; # 9323), päätyen GSK3p (# 9315), anti-fosforylaatio FOXO3 (T32, # 9464), päätyen FOXO3 (# 12829), päätyen TSC1 (# 6935), päätyen TSC2 (# 3990), päätyen LKB1 (# 3047), päätyen 14-3-3 (# 8312), anti-fosforylaatio ERK 1/2 (T202 /Y204; # 9101), koko-ERK 1/2 (# 9102), anti-fosforylaatio AMPKα (T172; # 2535), päätyen AMPKα (# 5832), anti-fosforylaatio m-TOR (S2448; # 5536), yhteensä-m-TOR (2983), anti-FASN (# 3180), anti-NF-KB (p65) (# 3033), anti- -Cdk4 (# 2906), anti-p21

WAF /CIP1 (# 2947), anti-sykliini E (# 4132), anti-sykliini D1 (# 2978), anti-c-myc (# 9402) ja anti -Lamin A (nro 2032) (Danvers, MA). Anti- β-aktiini (# A2066) vasta-aine ja yhdiste C (erityinen estäjä AMPK) ostettiin Sigma (St. Louis, MO). Aktiivisen Akt (Myr-Akt1, Addgene plasmidi # 9008) ja ohjaamaan tyhjän vektorin (pcDNA3, Addgene plasmidi # 10792) saatiin Addgene. Kasvaimen nekroositekijä α (TNF-α) rekombinanttiproteiini oli peräisin R 90% käytettiin injektioita.

Eläimet, Ruokavalio ja CA Johdannaiset täydentäminen

Adult (3-4 viikon ikäisiä) BALB /C ANN -Foxn1 nude-hiiriä (19-22 g) saatiin National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Hiiriä pidettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa hyväksytyissä tiloissa National Laboratory Animal Center voimassa olevien määräysten ja standardien (eläin protokolla no. 102-142-N). Eläinten käyttö protokollan edellä lueteltujen on tarkistanut ja hyväksynyt Institutional Animal Care ja käyttö komitean China Medical University. Eläin Tutkimus suoritettiin mukaan valtakunnallinen ohjeistus ja hyväksytty eläin protokollan säilyttääkseen eläinten hyvinvointia ja parantaa kärsimystä koe-eläimissä. Aikana koko kokeen aikana, hiiriä ruokittiin standardin Lab 5010 Diet ostettu LabDiet Inc. (St. Louis, MO, USA). Standardi ruokavalio sisältää raakaa rasvaa (13,5% koko ravinnon energia), proteiinia (27,5%) ja hiilihydraattia (59%), eikä sillä ollut havaittavaa CA johdannaisia, kuten toimittaja. Hiiret, jotka oli nukutetaan hengittämistä isofluoraanilla asetettiin selälleen. Hiiret olivat ihon alle (s.c.) ruiskutettiin ihmisen paksusuolen syöpä HCT-116-solut (1 x 10

6 /0,1 ml väliainetta) oikeaan kylkeen jokaisen BALB /C ANN-Foxn1 nude mouse. Hyvin lokalisoitu bleb pidettiin merkkinä teknisesti tyydyttävällä injektiona.

Kun rokotus, hiiret jaettiin kolmeen alaryhmään (n = 6 ryhmää kohti). CA johdannaiset annettiin koe-eläimille letkuruokinnalla kerran päivässä kokonaistilavuus 0,15 ml. CAPE ja CAPPE ryhmät saivat kukin päivittäin suun kautta CA johdannaisten liuotetaan maissiöljyyn (4% p /p) 50 nmol /kg BW kerran päivässä. Kasvain Kontrolliryhmä sai maissiöljy (4% paino /paino) kerran päivässä vain. Normaaleihin hiiriin ilman kasvain- siirrostuksen käytettiin negatiivisena kontrollina. Kasvaimen tilavuus laskettiin seuraavalla kaavalla: 0,524 L1 (L2)

2, jossa L1and L2 ovat pitkän ja lyhyen akselin kasvain, vastaavasti. BW määritettiin kerran viikossa. Mitään merkittäviä eroja ravinnon tai kehon painon havaittiin tässä tutkimuksessa. Lopussa koejakson jälkeen eläimet lopetettiin CO

2 hengitettynä; kasvaimen kudokset leikattiin sitten, punnittiin ja jäädytettiin välittömästi. Nämä kasvain leikeltiin ja värjättiin Mayerin hematoxilin- eosiini (H 0,05. Erilaisia ​​symboleja (# varten CAPE_Akt, § varten CAPE_compound C, ▴ varten CAPPE_Akt, ja ▪ varten CAPPE_compound C) ovat tilastollisesti merkittävä ero verrattuna kuhunkin vastaavaan CA peptidijohdannaisen käsitellyn kontrolliryhmän kunkin annoksen alaryhmän, vastaavasti, P 0,05. (B-C) sytoplasmisia proteiineja valmistettiin Western blotting-analyysi käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita anti-fosforylaatiota Akt (S473), yhteensä-Akt, anti-fosforylaatio AMPKα (T172) ja koko-AMPKα.

(A) Ihmisen CRC SW-480-soluja viljeltiin RPMI-1640-elatusaineessa, jossa KAP ja CAPPE (pitoisuuksina 0, 5, 10, 20, 50 ja 100 uM) läsnä ollessa tai poissa ollessa yhdisteen C (10 uM) ja 24 h. Transfektiosta konstitutiivisesti aktiivisen Akt (Myr-Akt1-) ja tyhjän vektorin (pcDNA3) tehtiin ennen hoitoa CA johdannaisia. Soluproliferaatioon mitattiin MTT-määrityksellä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tiedot ovat keskiarvo ± SD (keskihajonta) kolmen erillisen kokeen. Erilaisia ​​symboleja (??? Cape ja ▵ varten CAPPE) edustaa tilastollisesti merkittävä ero verrattuna CA johdannainen -untreated kontrolliryhmässä kussakin ryhmässä vastaavasti P 0,05. Erilaisia ​​symboleja (# varten CAPE_Akt, § varten CAPE_compound C, ▴ varten CAPPE_Akt, ja ▪ varten CAPPE_compound C) ovat tilastollisesti merkittävä ero verrattuna kuhunkin vastaavaan CA peptidijohdannaisen käsitellyn kontrolliryhmän kunkin annoksen alaryhmän, vastaavasti, P 0,05. (B-C) sytoplasmisia proteiineja valmistettiin Western blotting-analyysi käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita anti-fosforylaatiota Akt (S473), yhteensä-Akt, anti-fosforylaatio AMPKα (T172) ja koko-AMPKα.

CAPE ja CAPPE kukin aiheuttama G

0 /G

1 solusyklin pysähtymisen CRC soluissa

Voit selvittää CA johdannainen välittämä solujen proliferaatio johtui pidätys tietyssä vaiheessa solusyklin vaikutukset CAPE ja CAPPE tutkittiin edelleen HCT-116 ja SW-480-soluissa. Solut käsiteltiin CAPE tai CAPPE tehtiin virtaussytometria analyysi sen jälkeen, kun heidän DNA värjättiin PI. Histogrammit virtaussytometrianalyysin tulokset on esitetty kuviossa 4A. CAPE ja CAPPE merkittävästi indusoi solusyklin pysähtyminen G

0 /G

1 vaihe annoksesta riippuvaisella tavalla (P 0,05). Pitoisuutena 50 uM, CAPE ja CAPPE huomattavasti solusyklin pidätyksen HCT-116-solujen aikana G

0 /G

1 vaihe jopa 56% ja 61%, vastaavasti, kun taas kontrolliryhmässä prosenttiosuus solujen G

0 /G

1 vaihe oli vain 34% (kuva 4B). Pitoisuutena 50 uM, CAPE ja CAPPE huomattavasti solusyklin pidätyksen SW-480-solujen aikana G

0 /G

1 vaihe jopa 44% ja 57%, vastaavasti, kun taas kontrolliryhmässä prosenttiosuus solujen G

0 /G

1 vaihe oli vain 37% (kuvio 4C). Nämä lisäykset G

0 /G

1 pidätys olivat enimmäkseen kustannuksella S ja G

2 /M vaiheessa solupopulaatioiden. CAPPE näyttää aiheuttavan G

0 /G

1 solukierron pysähtymisen tehokkaammin kuin KAP ihmisen CRC soluissa. Siten on todennäköistä, että CAPE ja CAPPE estivät solujen proliferaatiota ihmisen CRC solujen läpi solusyklin pysähtyminen G

0 /G

1 vaihe.

Ihmisen CRC solut synkronoidaan RPMI- 1640-väliaineessa, jossa oli 0,05% FBS kudosviljelymaljoilla yön yli. Mitata jakelu solusyklin, solu viljeltiin, kun läsnä tai poissa KAP ja CAPPE (0, 10, 50 ja 100 uM) viljeltiin 10% FBS RPMI-1640-väliaineessa vielä 24 tuntia. (A) mittaus solupopulaation eri solusyklivaiheista suoritettiin käyttämällä virtaussytometria-analyysi, kuten on kuvattu kohdassa Materiaalit ja menetelmät. Tiedot osoittavat (B) HCT-116 solu (C) SW-480 solupopulaation prosentteina eri solussa vaiheissa alle hoitoon CAPE tai CAPPE ihmisen CRC soluissa. Human CRC (D) HCT-116-solut (E) SW-480-soluja käsiteltiin joko KAP tai CAPPE (pitoisuuksina 0, 5, 10, 20, 50 ja 100 uM) 10% FBS RPMI-1640: ssa 24 tuntia . Nuclear proteiinit valmistettiin Western blotting-analyysi käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita sykliini D1, Cdk4, PCNA, ja lamiinivektori vasta, kuten kohdassa Materiaalit ja menetelmät. Tasot havaitsemisen edustavat määrät sykliini D1, Cdk4 ja PCNA ytimet ihmisen CRC soluja. Tulokset (keskiarvo ± SD) edustavat taittuu muutos kontrolliryhmässä, ja ne edustavat kolmea eri kokeissa. Immunoreaktiivinen nauhat ovat huomattava nuolella. Keskimääräinen integroitu tiheydet näiden proteiinien säätää sisäisen valvonnan lamiinivektori proteiini esitetään alarivissä.