Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Kuvaamme uusi 3D yhdessä viljelemisen malli käyttäen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat yhdistettynä keuhkojen fibroblasteja. Tämä malli mahdollistaa tutkimuksen kasvaimeen stroomavuorovaikutuksiin ja käsitellään tärkeää ottaa enemmän in vivo kuin soluviljelymalli.

Methods

Automation-yhteensopiva monen hyvin roikkuu pudota mikrotiitterilevyt käytettiin tuotantoa varten 3D-mono- ja co-viljelmissä. Näiden roikkuu putoaa kaksi ei-pienisoluisen keuhkosyövän solulinjat A549 ja Colo699 viljeltiin joko yksinään tai yhdessä viljeltyjen keuhkojen fibroblasteista. Elinkelpoisuuden kasvain pallosia vahvistettiin viiden ja kymmenen päivää käyttämällä anneksiini V /propidiumjodidivärjäys varten virtaussytometrialla. Kasvaimen fibroblasti sferoidi muodostumista leimasi pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (SEM), semi-ohuet leikkeet, fluoresenssi mikroskooppi ja immunohistokemia (IHC). Perinteisten histologia, proteiinin ilmentyminen E-kadheriinin, vimentiinistä, Ki67, fibronektiini, sytokeratiini 7 ja α-sileän lihaksen aktiini (α-SMA) tutkittiin IHC.

Tulokset

alempi elinkelpoisuus havaittiin A549 monokulttuurien verrattuna co-viljelmiä, kun taas Colo699 monokulttuureja osoitti parempaa kannattavuutta verrattuna yhteistyön kulttuureissa. Ki67 ilme vaihtelivat huomattavasti mono- ja yhteistyön kulttuureissa molemmissa tuumorisolulinjoissa. Kasvua vimentiinista ja laski E-kadheriinin ilmentyminen voidaan havaita aikana viljelyn viittaa siirtymistä kohti mesenkymaaliset fenotyyppi. Lisäksi fibroblastisolulinjassa osoitti ilmaus α-SMA vain rinnakkaisviljelemällä syöpä A549, mikä osoittaa mesenkymaalisten ja mesenkymaalisten siirtymistä entistä myofibroblastin fenotyyppiin.

Johtopäätös

Osoitamme, että menetelmä on lupaava työkalu sukupolven kasvain sferoidiviljelmiä yhteistyön kulttuureissa. Lisäksi nämä pallosia mahdollistavat tutkinnan kasvaimeen stroomavuorovaikutuksiin ja paremmin huomioon in vivo olosuhteissa syöpäsolujen niiden mikroympäristön. Meidän menetelmä omistaa mahdollisuudet edistää kehitystä syöpälääkkeiden ja tukea etsimistä biomarkkerit.

Citation: Amann A, Zwierzina M, Gamerith G, Bitsche M, Huber JM, Vogel GF, et al. (2014) innovatiivisen 3D soluviljelmässä opiskella Kasvainten – stroomavuorovaikutuksiin in Non-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 9 (3): e92511. doi: 10,1371 /journal.pone.0092511

Editor: Donald Gullberg, University of Bergen, Norja

vastaanotettu: 03 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 24 helmikuu 2014; Julkaistu: 24 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Amann et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat avulla Ph.D myöntämisen Itävallan Society of hematologian ja onkologian (OeGHO) ja edelleen taloudellisesti tukema Verein für Tumorfoschung. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Koskien Insphero (J. Kelm) ja affilation Tekijöiden työtä: tämä kirjoittaja vaikuttanut hänen pitkä kokemus 3D soluviljelmässä tämän artikkelin. Lisäksi kirjoittajat tukivat yhtiön muodossa 3D soluviljelmälevyihin niiden kokeiluja. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Koska kasvava mekanismien ymmärtämistä merkitystä Genesis syövän, me olemme kokee siirtyminen taudin tavoitteellisesti hoito. Tämän seurauksena tulevaisuus molekyyli täsmähoitoihin syövän piilee tunnistamisessa potilasryhmissä, jotka hyötyvät erityisesti hoitoja että osuma erityisiä rakenteita ilmaiseman solujen pahanlaatuista. Yksi merkittävä este kehitykselle näiden yksilöllisten hoito-, on kuitenkin rajallinen saatavuus ennustavia in vitro -malleja. Kriittinen Haasteena on kehittää soluviljelymalleissa paremmin heijastaa in vivo olosuhteissa ja tukee siten tutkinnassa ennakoivaa biomarkkereita, joilla on potentiaalia parantaa arvosta syöpälääkkeitä ja koon pienentämiseen, kustannukset ja keskeyttäneiden määrää kliinisiä tutkimuksia.

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on yksi johtavista syistä syöpäkuolemista mies- ja naispotilaiden maailmanlaajuisesti.

Vain 15% -20% heistä diagnosoidaan varhaisessa vaiheessa [1] . Ennuste on edelleen huono ja 5 vuoden pysyvyys vaihtelee noin 60% I vaiheen alle 5% vaiheessa IV kasvaimia [2].

Potilaat diagnosoitiin paikallisesti levinnyt sairaus edellyttää multimodaalisuutta hoitoa saavuttaa pitkän -term peruuttamista tai jopa parantaa samalla metastasoivaa tautia sairastavaa potilasta saavat platinapohjaista kemoterapiaa joko yksinään tai yhdessä EGFR tai alk inhibiittorit [3] – [5].

lukuisia muita molekyylitason kohdennettuja aineita on testattu kliinisissä tutkimuksissa mutta ei voitu osoittaa hyötyä potilaille koskien ilman taudin etenemistä ja kokonaiselinaika [6]. Useat näistä tutkimuksista pyritään määrittelemään biomarkkereita on mahdollinen tai retrospektiivinen tavalla, mutta vain hyvin harvat ole havaittu [7], [8].

Toistaiseksi Soluperäisissä analyyseissä tutkia solubiologian ja lääkeaineiden tehoon jonka tarkoituksena on kasvavat solut kaksiulotteinen muovipinnoille tai yksittäisten solujen suspensio [4]. Biologiaan solujen, kuitenkin, on suuri vaikutus niiden mikro-ympäristössä edellyttävät solupohjaiset määritykset, jotka heijastavat sellaisten tekijöiden, kuten soluväliaineen (ECM), solu-solu-kontaktien, solu-matriisi vuorovaikutuksia, solun polariteetti ja hapen profiilien [ ,,,0],5] – [8].

Perinteiset kaksiulotteinen (2D) soluviljelmäjärjestelmiä kasvatettu keinotekoinen muovipintojen merkittäviä rajoituksia. Esimerkiksi ne vaativat suuria kuin fysiologinen vasikan sikiön seerumia (FCS) pitoisuudet ja ajaksi ravittaviksi uudelleen vaihtamalla väliaine 2-3 päivän välein. Toisin kuin, että 3D-tekniikoita välttää muovipinnoille jolloin solut voivat muodostaa ECM ja vaativat merkittävästi vähentää FCS pitoisuuksia. Ei vain solun morfologian lisäksi myös huumeiden herkkyys syöpäsolujen 2D järjestelmät on erilainen verrattuna 3D soluviljelmissä [9], [15]. Solut viljellään muovipintojen yleensä näytteille lisääntynyt herkkyys sytotoksisten lääkkeiden, kun taas yhdisteet kohdistaminen solu – solu kiinnikkeistä, solun kypsymisen epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja stemness ominaisuuksia on usein pienentynyt teho 3D soluviljelmässä. Näin 3D soluviljelymalleissa heijastaa in vivo kasvaimen kasvua enemmän luotettavasti ja voi tarjota parempia lukea keskilämpötilat huumetestejä [9], [15], [10].

Useimmat 3D järjestelmät käyttävät solun sferoidiviljelmiä aggregaatteja ja telineen kulttuuri järjestelmät . Nämä järjestelmät tukevat 3D solujen kasvua keinotekoisesti tuotettua ekstrasellulaarista homologit (esim. Kollageeni, matrigeeliä, tukirunkoja) helpottaa soluadheesiota ja aggregaatiota. Muut 3D järjestelmät käyttävät nestemäistä päällekkäistekniikoita, kuitu meshwork valmistettu bioyhteensopivia polymeerejä, kiinteitä tai huokoisia helmiä tai matriiseina ja niiden korvikkeet ja vaativat lisäämällä keinotekoisesti ravintolisät saavuttamiseksi 3D kasvaa soluviljelmissä [16] – [19].

riippuva pudottamalla on vakiintunut soluviljelmissä tapa muodostaa pallomaisia ​​microtissues päässä kuolemattomaksi ja ensisijainen solulinjoissa [20] – [22]. Toisin kuin useimmat neste päällekkäistekniikoita, hanging drop-menetelmä mahdollistaa tarkan hallinnan alustavan solun koostumus kussakin microtissue [23], [24]. Tuottamaan multi-cell type yhdessä viljelemisen microtissues ei lisämaksuja eikä keinotekoisia tukirunkoja matkimalla soluväliaineen komponenttien (esim kollageeni matrigeeliä) ovat pakollisia.

Perustuu automaatio- ja suuren suorituskyvyn yhteensopiva riippuva pisara tekniikka loimme organotyyppisen co-kulttuuri malleja muodostuu kahdesta eri ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat yhdessä keuhkojen fibroblastit. Tämä menetelmä mahdollistaa paitsi tutkinnan kasvaimeen stroomavuorovaikutuksiin ja edustaa paremmin in vivo, kuten 3D soluviljelymalli tutkimuslääkkeestä kasvain vuorovaikutuksia, mutta voidaan toteuttaa myös jatkossa lääkekehityksen kampanjoita.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

NSCLC solulinjat A549 ja Colo699 (DSMZ, ACC107, ACC196) ja keuhkojen fibroblastisolulinjassa SV-80 (CLS, 300345) käytettiin kokeissa. 2D kulttuuri, solulinjoja viljeltiin kerroksena DMEM alhainen glukoosi (PAA, Pasching, Itävalta) lisätty 10% FCS (Sigma-Aldrich, Munchen, Saksa, Lot 010M3396) ja 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ratkaisu, 2 mM L-glutamiinia (PAA). Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2 sisältävässä ilmakehässä.

3D soluviljelmässä

tuotantoa varten 3D-mono- ja yhteisviljelmissä GravityPLUS ™ microtissue kulttuuri järjestelmä (InSphero AG, Zürich, Sveitsi) käytettiin. Levy koostuu runko 8 x 12 hyvin insertit ja oheislaitteiden kanava täynnä 2-3 ml steriiliä vettä tarjota kosteussuluksi joka vähentää haihtumista väliaineen pisaroista. Tämä runko asetetaan alhaalta lokero, joka on täytetty 5 ml: lla 0,2 x fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (PBS) (PAA), jossa oli 0,1% Triton X-100 (Sigma), jälleen haihtumisen vähentämiseksi pisaroista. Hyvin on jaettu kolmeen elementtejä, (i) sisääntulon, johon pipetinkärjet on sijoitettu suoraan pinnalle hyvin, (ii) viljelmän osaston ja (iii) mikrokanavan, joka yhdistää sisääntulon ja viljelmää osastoon. Jokaisessa hyvin on jousikuormitettu kompensoimiseksi hieman vaihtelua kärjessä korkeuksiin 96-pipetin päätä.

Kun soluja oli kasvatettu subconfluently soluviljelmässä (Falcon) ne ympättiin roikkuu laskee. Sitten solut pestiin kerran PBS: llä ja hajotettiin 1 x Accutasella (PAA) kymmenen minuutin ajan 37 ° C: ssa. Sen jälkeen digestio lopetettiin ja solut pestiin kerran 20 ml: lla soluviljelyalustaa. Sitten solut laskettiin, ja siirrostettiin 40 ui tippaa eri solujen määrä (monoviljelmiä: SV-80 ja A549: 2500 solua /40 ui, Colo699: 1250 solua /40 ui, co-viljelmät: karsinoomasolujen: fibroblasti-suhde 01:02 /40 ui). Medium vaihto suoritettiin joka neljäs päivä ja pallojen kerättiin viiden ja kymmenen päivää lataamalla 100 ui PBS (PAA) päälle microcapillaries huuhtele pois pallosia. Putoavat pisarat sisältävät palloset sitten kerättiin 96-kuoppaiselle U-pohjalevyyn (Falcon), joka on sijoitettu alapuolelle mikrokapillaarisen levy.

CFSE värjäytymistä fibroblasteissa.

fluoresoivia fibroblastien CellTrace ™ CFSE Cell Proliferation Kit (Molecular Probes, Invitrogen) käytettiin. Fibroblasteja liuotettiin ja säädettiin 1 x 106 1 ml: aan PBS /0,1% naudan seerumin albumiinia (BSA) .CFSE lisättiin saavuttamiseksi lopullisessa 10 uM. Sitten soluja inkuboitiin 10 minuuttia 37 ° C: ssa. Sen jälkeen, värjäytyminen sammutettiin viidellä tilavuudella jääkylmää soluviljelyalustassa ja inkuboitiin 5 minuuttia jäällä. Sitten solut pestiin kolme kertaa solujen elatusaineeseen. Leimattu Fibroblasteja nyt siirrostettiin co-viljelmiä karsinoomasoluja kuvatun 3D soluviljelmässä osassa.

virtaussytometrialla

Kahdeksan microtissues, kerättiin 96-kuoppaisille levyille siirrettiin 5 ml: n FACS-putket (Falcon) ja pestiin kerran 2 ml: lla PBS: ää. Sen jälkeen, microtissues liuotettiin osaksi yksittäisten solujen suspensioksi lisäämällä 300 ui Accumax (Miltenyi Biotech) per microtissue niitä inkuboidaan 20 minuuttia 37 ° C: ssa. Kymmenen minuutin kuluttua microtissues sekoitettiin ja pipetoitiin ylös ja alas, jotta saadaan Homogeeni ratkaisu. Tämä menettely toistettiin 20 minuutin kuluttua inkuboinnin. Nyt digestio pysäytettiin 2 ml: lla täydellistä solujen elatusaineessa, sitten solut sentrifugoitiin 300 g kymmenen minuuttia ja pestiin kahdesti 0,5% BSA /PBS: ssä. Sen jälkeen solut värjättiin 4 ui propidiumjodidia (PI) Värjäysliuos ja 4 ui anneksiini V APC. Värjäys suoritettiin 100 ul: aan Annexin Binding Buffer otettu anneksiini V Apoptosis Detection Kit I (Becton Dickinson) 15 minuutin ajan. Lopuksi solut analysoitiin BD FACS Calibur välittömästi. Kukin data mittaus koostui kahdeksasta yhdistetyistä microtissues, toistaen koko menettely itsenäisesti kolme kertaa.

Volume laskeminen microtissues

Kuusi microtissues mono- ja yhteistyön viljelmät arvioitiin käänteisen valo mikroskooppi (Motic AE31) päivästä lähtien kymmeneen. Viiden, seitsemän ja kymmenen päivän kahden halkaisijan (d) kunkin microtissue mitattiin ja tilavuus laskettiin kaavalla V = 4/3 * Π * r

3, jossa r = ½ * √ d1 * d2 [ ,,,0],25]. Tilavuus mittaus toistettiin kolme kertaa. Sen jälkeen keskiarvo ja keskihajonta laskettiin ja tilastollinen merkitsevyys testattiin Studentin t-testi Microsoft Excel.

immunohistokemiallinen analyysit

Näytteen valmistus.

Microtissues huuhdottiin PBS ja sitten heti kiinnitettiin upottamalla kylmään 4% paraformaldehydillä (PFA) PBS, neljä tuntia huoneenlämmössä. Microtissues huuhdeltiin sitten PBS: ään uudelleen ja upotettiin 2% agaroosi (Invitrogen). Ylimääräinen agaroosi poistettiin veitsellä, ja agaroosin lohkot sisältävä microtissues dehydratoitiin arvostellaan alkoholeja ja upotetaan parafiini (Paraplast säännöllinen, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) Microm ERGO Star Rotaatiomikrotomi (Microm, Walldorf, Saksa) käytettiin ottamaan leikesarjojen 4 um paksuus. Kolmen ja neljä sarjaa paraffinized jälkeen leikkeet asennettu mutkitteleva kuvio SuperFrost Plus dioja (Menzel-Gläser, Braunschweig, Saksa) ja kuivattiin yön yli, sitten paistettiin 60 ° C: ssa yhden tunnin ajan kiinni osat lujasti dioja. Sillä cyto-arkkitehtoninen suuntautuminen, joka kymmenes dia oli hematoksyliini /eosiini värjätty (HE) käyttäen Shandon Varistain 24-4 Slide stainer (Histocom Wien, Itävalta).

antiseerumit.

palvelimet, laimennokset , inkubaatioajat ja lähteet primaaristen vasta-aineiden sekä lämmön epitooppisup- haku (HIER) on lueteltu taulukossa 1.

Immunosytokemia

Immunosytokemia suoritettiin 4 um: n leikkeitä ja parafinoidut microtissues on Ventana Roche Discovery Immunostainer (Mannheim, Saksa) mukaan DAB-MAP keksintötutkimus tavanomaista menettelyä. Tarvittaessa antigeeni haku aloitettiin lämmön aiheuttamaa peittymisen epitooppien kun objektilasit upotettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden (lyhyt tai standardin eri inkubointia kertaa) EDTA-puskuriin (Cell Conditioning Solution CC1, Ventana). Inkuboinnin jälkeen osien kanssa primaaristen vasta-aineiden (lueteltu taulukossa 1.) 37 ° C: ssa, biotinyloitu immunoglobuliini cocktail vuohen anti-hiiri-IgG, vuohen anti-hiiri IgM, vuohen anti-kani-IgG ja proteiini lohkon (Discovery Universal Antibody , Ventana) levitettiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Havaitseminen saavutettiin käyttämällä DAB-MAP Detection Kit (Ventana) mukaisesti diaminobentsidiiniä (DAB) kehittämismenetelmä. Osiot lopulta vastavärjättiin hematoksyliinillä (Ventana) neljän minuutin ajan. Myöhemmin kohdat olivat käsin dehydratoitiin alensi alkoholin sarjassa, kirkastettiin ksyleenissä ja kansi liukastui pysyvästi Entellaniin (Merck, Darmstadt, Saksa).

Digital kuvia HE- ja immuno- dioja hankittiin AxioVision mikroskoopilla ohjelmisto liittyy AxioCam HRc värikamera ja Axioplan 2 (Zeiss, Jena, Saksa).

Ki67 positiivisuus määritettiin laskemalla Ki67 positiiviset ja negatiiviset soluytimet kolmessa eri pallosia of A540 ja Colo699 vuonna mono- ja yhteistyössä kulttuureissa edustavasti. Sen jälkeen, prosenttiosuus positiivinen solu ytimet koko solujen määrä laskettiin. Keskiarvo ja keskihajonta, ja tilastollinen merkitsevyys laskettiin edellä kuvatulla tavalla.

Fluoresenssi mikroskoopilla

Microtissues mono- ja co-viljelmät kerättiin kuten edellä on kuvattu, ja pestiin kerran PBS: llä. Sen jälkeen, kasvaimen microtissues fiksoitiin 4% PFA: ssa kahden tunnin ajan 4 ° C: ssa ja pestiin kolme kertaa PBS: llä. Nyt ne blokattiin PBS: llä, joka sisälsi 2% BSA: ta (Sigma) /0,3% Triton X-100 (Roche) yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Microtissues inkuboitiin sitten 40 minuutin ajan 50 ug /ml phalloidin Atto 633 (Sigma) huoneenlämpötilassa pimeässä. Sen jälkeen ne pestiin jälleen viisi kertaa PBS: llä ja inkuboitiin sitten viiden minuutin ajan 1,5 ug /ml DAPI (Invitrogen) huoneenlämpötilassa pimeässä. Kun oli pesty kerran PBS: llä microtissues tuotiin kohde dia loisteputki kiinnitysväliaine (Dako Glostrup, Tanska) ja analysoitiin LSM 510 Meta konfokaalimikroskoopilla (Zeiss).

pyyhkäisyelektronimikroskopialla (SEM)

Kasvaimen microtissues fiksoitiin 2,5% glutaraldehydillä (BioChemika Fluka) 0,1 M fosfaattipuskuria (pH 7,4). Kun lyhyt pesu PBS: ssä, mitä seurasi post-tallennuksesta yksi tunti 1%: isella osmiumtetroksidilla (ReagentPlus; Sigma-Aldrich), näytteet asteittain kuivattu etanolilla. Kuivaamisen (CPD 030, Bal-Tec), microtissues asennettiin alumiini tyngät kaksipuolisella teipillä, sputter-päällystetty 10 nm kulta /palladium (Au /Pd) (Bal-Tec) ja tutkittiin kentän päästöjen pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (Gemini 982, Zeiss, Göttingen, Saksa).

Semi-ohuthieitä

Kasvainten microtissues prosessoitiin standardin tekniikkaa lähetyksen elektronimikroskoopilla. Microtissues fiksoitiin Karnovsky fiksatiiviin (2,5% glutaraldehydi ja 2% paraformaldehydi 0,1 M kakodylaattipuskurissa) yön yli ja pestiin sitten kolme kertaa (kulloinkin 10 min) 0,1 M kakodylaattipuskurissa, jota seurasi kiinnitys, jossa 1% osmiumtetraoksidia 0,05 M kakodylaattipuskurissa 4 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Liiallinen osmiumtetraoksidia poistettiin huuhtelemalla microtissues kolme kertaa (kulloinkin 10 min) 0,1 M kakodylaattipuskurissa. Microtissues Sitten kuivattu etanolilla (2 x 70% etanolilla kunkin 30 minuuttia, 2 x 96% etanolia kutakin 30 minuuttia, 2 x 100% etanolia kutakin 30 minuuttia) ja asetonilla (2 x kukin 30 minuuttia) ennen inkuboinnin laimennus nestemäistä epoksihartsia (Epon keskipitkän seos: 20 ml upottaa-812, 16 ml DDSA, 8 ml NMA ja 1,2 ml BDMA; Electron Microscopy Sciences, Munich, Saksa) ja asetonia suhteessa 30%: sta 70%: ssa kolme tuntia. Microtissues oli soluttautunut seoksella Epon ja asetonia yhtä suurin osuuksin 4 ° C: ssa yön suljetuissa pulloissa. Seuraavana päivänä, neste korvattiin seoksella 70% epoksihartsia ja 30% asetonia kolme tuntia. Sen jälkeen, microtissues inkuboitiin kahdesti 100% Epon (3 tuntia ja 4 ° C: ssa yön yli). Sitten puhdasta epoksihartsia muutettiin, ja microtissues oli suodattunut Epon tyhjökammiossa 2 tuntia. Microtissues siirrettiin sitten upotuskauluksen muottiin, leimattu, ja asetettiin tyhjökammioon vielä 1 tunti. Microtissues siirrettiin inkubaatio kammioon 60 ° C: ssa 48 tunnin lisätä polymeroinnin epoksihartsia. Yhden mikrometrin leikkeitä leikattiin Leica Ultracut mikrotomi, värjättiin toluidiinisinisellä 60 ° C: ssa, ja sitten tutkittiin valomikroskoopilla.

Tulokset

Kasvainten microtissue muodostumista

Aluksi tutkimme järjestely kasvainsolujen ja fibroblastien pallosia viljelyjakson aikana. Tätä tarkoitusta varten SEM-kuvat (kuvio 1), A549 ja Colo699 mono- ja co-viljelmistä otettiin kymmenen päivän kuluttua viljelyn. Lisäksi A549 /Colo699 mono- ja yhteistyötä viljelmiä valmistettu semi-ohuita leikkeitä ja värjättiin toluidiinisinisellä (kuva 2).

SEM kuvat on otettu kymmenen päivän kuluttua: monoviljelmiä A549 ja SV80 ympättiin suhteessa 2500 solua /40 ui, kun taas Colo699 monokulttuureja viljeltiin muodossa 1250 solua /40 ui. Kaikki co-viljelmiä ympättiin karsinomasolulinjassa: fibroblastien suhde 01:02 /40 ui (A549 co-viljelmät: 2500 syöpäsolujen +5000 fibroblastit /Colo699 co-viljelmät: 1250 syöpäsoluja +2500 fibroblasteja). (A /B) A549 monokulttuureja, (C /D) A549 co-viljelmät; (E /F) Colo699 monokulttuureja, (G /H) Colo699 co-viljelmät; (I /J) SV80 monokulttuurien. Kaikki yhteistyössä kulttuureissa näkyvät yhtenäisempi ja pyöreämpi microtissue pinta verrattuna yksipuolisen viljelyn.

Semi-ohuthieitä (1 pm viipaletta) A549 /Colo699 mono- ja yhteistyötä kulttuureissa kymmenen päivän kuluttua viljelyn värjättyä kanssa toluidiini. Bar in kaikki kuvat: 20 pm. A549-solut muodostavat karu pallosia muistuttava enemmän monikerroksista kudosta ja näytteille karhea pinta. Colo699 monokulttuureja paljastaa pallomaiseksi löysä pinta. Kun fibroblastit lisätään molemmissa solulinjoissa rakentaa enemmän kompakti microtissue tavallisella pintaan.

Kuten esitetään SEM kuvia ja semithin kohdat, A549-solut muodostavat karu pallosia muistuttava enemmän monikerroksista kudosta ja näytteille karhea pinta. Viiden päivän microtissues ei ollut täysin muodostunut, mutta helposti häiriintynyt sadonkorjuun aikana menettelyssä. Sen sijaan, kun käytetään yhdessä viljelemisen nämä solut muodostavat tiukan sferoidit sileät pinnat. Vuonna semithin osat fibroblasteja voidaan havaita soluissa, jotka on tasainen morfologia pääasiassa järjestetty lähelle pintaa microtissues.

aikana viljelyn Colo699 monokulttuureja paljastaa pallomainen rakenne, jossa löysä pinta. Kun fibroblastit lisätään nämä pallosia rakentaa enemmän kompakti sferoidin tavallisella pintaan. Koska kaikki solut oli sama morfologia, mutta kasvainsoluja ja fibroblasteja ei voitu erottamaan toisistaan ​​semithin kohdissa.

Toisin syöpäsolulinjoissa, SV80 fibroblastit muodostavat pieniä tiukka näköinen sferoidit on sileä pinta, kun sitä viljellään yksin .

Koska kaikki yhteistyössä kulttuureissa osoitti tasaisempi pinta tiivis arkkitehtuuri, päätimme tutkia tämä riippuu ECM tuotantoa solujen. Kuviossa 3 osoitamme, että SV80 solut merkittävästi tuottavat fibronektiiniä viljeltynä omasta, kun taas molemmat tuumorisolun monokulttuureja olivat täysin negatiivisia fibronektiiniin. In Colo699 yhteistyössä kulttuureissa ECM on jakautunut tasaisesti koko microtissue. Kuitenkin, A549 yhteisviljelmissä fibronektiiniä pääasiassa erittävät solut, jotka rakennettu rengas rakenteen ympärille sisempi ydin microtissue.

fibronektiinin oli esillä microtissues kymmenen päivän kuluttua. (Bar A549 /SV80 monokulttuureja: 50 pm, bar kaikissa muissa microtissues: 100 m); Eritystä fibronektiini voitiin havaita microtissues sisältävät fibroblastien, kun taas kaikki kasvainsolu monokulttuurit ei fibronektiini eritystä voitu havaita.

kasvukäyrä ja vakauden kasvaimen microtissues

kolme microtissues mono – ja co-viljelmät arvioitiin valomikroskoopissa ja viiden, seitsemän ja kymmenen päivää microtissue tilavuudet laskettiin (kuvio 4A).

V: Microtissue tilavuudet laskettiin kaavalla V = 4/3 * Π * r3, jossa r = ½ * √ d1 * d2. Mean volyymit näkyvät μm3 niitä vastaavat keskihajonnat. B: Mean ja keskihajonta Ki67 positiivisuus laskettiin laskemalla Ki67 positiiviset ja negatiiviset soluytimet siitä siivuja kolmella eri pallosia edustavasti. Sen jälkeen, prosenttiosuus positiivinen solu ytimet kokosolu Cumber laskettiin. Co-viljely Molempien kasvainsolulinjojen kanssa fibroblastisolulinjassa johtanut merkittävään säätelyä (p 0,05) on Ki67 ilmentymisen kaikissa microtissues.

Ei ollut mahdollista laskea pallomainen määriä A549 microtissues koska monokulttuurien nämä solut eivät muodostaneet pyöreä tai ellipsin muotoinen sferoideina. Sama ongelma kehittynyt A549 yhteistyössä kulttuureissa vain alkoi muodostua kierroksen mitattavissa pallosia viiden päivän kuluttua. Siksi ensimmäinen A549 co-viljelyn tilavuus laskenta tehtiin päivänä seitsemän, jossa tilavuus on 63 um

3 mitattiin. Aikana kolmen päivän määrästä Tämän yhteistyön kulttuuri nousi 81 um

3.

Colo699 monokulttuureja näkyy jatkuvan kasvun volyymin 43 um

3 f 83 um

3. Sen sijaan Colo699 yhteistyössä kulttuureissa osoitti tilavuus 74 um

3 viiden päivän lasku tilavuus 39 um

3.

SV80 monokulttuureja tasaisesti tilavuus 33 pm

3 viiden päivän jälkeen 27 pm

3 kymmenen päivän kuluttua voitiin havaita.

Lopuksi microtissue määriä verrattiin toisiinsa opiskelijan t-testiä. Kymmenen päivän kuluttua merkittävä kasvu määrän voitaisiin mitata A549 yhteistyössä kulttuureissa ja Colo699 monokulttuureja verrattuna joko SV80 monokulttuureja tai Colo699 yhteistyössä kulttuureissa. Toisaalta, viiden päivän jälkeen tilavuus Colo699 yhteisviljelmissä oli huomattavasti korkeampi kuin Colo699 ja SV80 monokulttuurit (kuvio 4A).

tutkimiseksi solujen elinkykyä, anneksiini V APC ja propidiumjodidia (PI ) FACS määritys perustettiin. SV80-soluja inkuboitiin CFSE ennen kylvö, mikä elinkelpoisuus syöpäsolujen ja fibroblasteja voidaan mitata itsenäisesti syrjintää FACS-analyysit. Microtissues otettiin talteen, hajotettiin Accumax ja inkuboitiin PI ja anneksiini V APC. Analyysit tehtiin BD FACS Calibur järjestelmään. Kukin pylväs esittää keskimääräistä solujen elinkelpoisuuden 24 eri microtissues mitataan kolmen itsenäisen kulkee. Tilastollista analyysiä opiskelijan t-testiä käytettiin (kuva 5).

fibroblasteja inkuboitiin CFSE ennen aluksi kylvöön ne yhdessä kasvainsolujen roikkuu laskee. Apoptoosi mitattiin joko viiden tai kymmenen päivää. Kukin pylväs esittää keskimääräistä solujen elinkelpoisuuden 24 pallosia ja niiden vastaava keskihajonta joka mitattiin kahdessa eri ajossa (Merkittäviä eroja on merkitty *, p 0,05). Pisteblotit edustavat FACS analyysit yhdellä ajolla sisältävien A549-solujen rinnakkaisviljelemällä SV80 fibroblastien kymmenen päivän kuluttua viljelyn. V: Erityiset elinkelpoisuutta syöpäsolujen mono-ja co-kulttuureissa näkyvät. B: elinkelpoisuus yksinäinen fibroblastien mono-ja co-kulttuureissa näkyvät. C: välisen jaon fibroblasteja ja kasvainsolujen viiden ja kymmenen päivää näytetään. D: Koko microtissue elinkelpoisuus on esitetty viiden ja kymmenen päivää.

A549 monokulttuureja näkyvissä 77% elinkelpoisia soluja viiden päivän minimaalinen nousu elinkelpoisuus kymmenen päivän kuluttua 79%. Co-viljelmiä fibroblastien osoitti merkittävää kasvua elinkelpoisuutta 60% viiden päivän kuluttua 79% Kymmenen päivän kuluttua. Colo699 soluilla 93% elinkelpoisia soluja viiden päivän jälkeen, joka ei pienene elinkelpoisuutta 92% Kymmenen päivän kuluttua. Yhdessä kulttuureissa 82% elinkelpoisia soluja säilyi viiden päivän jälkeen ja 76% kymmenen päivän kuluttua. Kun elinkelpoisuus SV80 solujen analysoitiin, kasvoi hieman 65% viiden päivän kuluttua 67% Kymmenen päivän kuluttua näytettiin. Kuitenkin merkittävä lasku kannattavuuden välillä Colo699 monokulttuureja ja Colo699 yhteistyötä viljelmiä voitiin havaita (kuvio 5D).

Seuraavassa vaiheessa, elinkelpoisuutta kahden eri jakeet, kasvainsoluja ja fibroblastit analysoitiin syrjimällä heitä virtaussytometrialla. A549 syöpäsoluja yhteistyössä kulttuureissa pysyi kannattava koko inkuboimalla elinkelpoisuus 74% viiden päivän kuluttua ja 71% kymmenen päivän kuluttua. In Colo699 yhteisviljelmissä kasvu elinkelpoisuuden voitiin havaita 78% viiden ja 89% kymmenen päivän kuluttua, mikä osoittaa merkittävästi parempaa elinkelpoisuutta verrattuna A549 viljeltiin yh- syöpäsolujen kymmenen päivän kuluttua (kuva 5A).

samanlainen havainto tehtiin koskien elinkelpoisuutta fibroblastien microtissues. Kun yhteistyössä viljellään yhdessä A549 syöpäsolut, SV80 soluilla merkittävää säätelyyn ylöspäin elinkelpoisuutta 46% viiden päivän kuluttua 71% Kymmenen päivän kuluttua. Vuonna Colo699 yhteistyössä kulttuureissa elinkelpoisuutta myös kasvanut, mutta ei merkittävästi vaihdellen 70% viiden 83% Kymmenen päivän kuluttua. Samanaikaisesti merkittävä parempi kannattavuus fibroblastien kun samanaikaisesti viljellään yhdessä Colo699 solujen viiden päivän jälkeen voidaan näyttää verrattuna A540 co-viljelmät (kuvio 5B).

Lisäksi suhde fibroblastien ja kasvainsoluja co-viljelmistä analysoitiin viiden ja kymmenen päivää. Kun co-viljelmiä kasvatettiin hanging drop, syöpäsolut ja fibroblastit olivat aina siirrostettiin suhteessa 01:02 (2500 syöpäsolujen /5000 fibroblastit). Viiden päivän kuluttua sekä yhteistyössä kulttuureissa lähes tasainen jakautuminen fibroblasteja ja syöpäsolujen voitiin havaita, vaihdellen 43%: fibroblastien 57% kasvainsolujen A549 yhteistyössä kulttuureissa ja 49%: sta 51%: iin Colo699 yhteistyössä kulttuureissa. Kuitenkin kymmenen päivän kuluttua huomattavasti enemmän tuumorisoluissa kuin fibroblastit sekä yhteistyössä viljelmiä voidaan näyttää. A549 yhteistyössä kulttuureissa, 19% ja Colo699 yhteistyössä kulttuureissa 14% kaikista soluista tunnistettiin fibroblasteissa (kuvio 5C).

Solun organisaatio ja proteiinin ekspressiokuviota

Kun oli inkuboitu A549 ja Colo699 solut yksin tai yhdessä viljelemisen fibroblasteja viisi ja kymmenen päivän immunohistokemiallista analyysit suoritettiin (kuva 5-7 /taulukko 2). Vimentiinista valittiin proteiini osoittaa siirtymistä mesenkymaalisten fenotyypin epiteelisoluissa. α-SMA ilmaisu osoittaa vieläkin mesenkymaalisten fenotyypin fibroblastien ja heijastaa mesenkymaalisten ja mesenkymaalitransitioon. E-kadheriinin, joka on epiteelin solujen Adhesion Protein valittiin markkerina kiinnittyneet solut ja Ki67 kuin solujen proliferaation ja aktivaation markkeri. Kolme erilaista sferoidit analysoitiin kunkin proteiinin värjäys ja peräkkäisen viipaletta yhden sferoidiviljelmiä esitetty edustavasti here (kuva 7-9).

(A) Colo699 monokulttuureja kymmenen päivän kuluttua; (B) Colo699 yhteisviljelmissä Kymmenen päivän kuluttua; DAPI (sininen) käytettiin värjäystä solutumissa, falloidiinia Atto 633 (punainen) ilmaisee F-aktiini ja CFSE (vihreä) kuten sytoplasman tahra fibroblastien (Bar A /B: 50 pm). Fibroblasteja voitaisiin vielä havaita microtissues jälkeen viiden päivän yhteistyössä viljelyn kanssa Colo699.

IHC siivuja A549 vuonna mono- ja yhteistyössä kulttuureissa viiden ja kymmenen päivää (Bar AD: 100 um, bar in Insert: 25 pm); lisääntyminen vimentiinista ja vähenevät samanaikaisesti E-kadheriinin näkyy yhteistyössä kulttuureissa. Myös voimistumista Ki67 ilmaisun yhteistyössä kulttuureissa havaittiin.

IHC siivuja Colo699 vuonna mono- ja yhteistyössä kulttuureissa viiden ja kymmenen päivää (Bar A /C: 50 pm, baari B /D: 100 pm, baari Insert: 25 pm); Verrattuna monokulttuureja Colo699 yhteistyön kulttuureissa muodostuu paljon pienempi pallosia. Kuitenkin positiivista värjäytymistä reaktioita E-kadheriinin ja vimentiinista ovat verrattavissa monokulttuurien vuosina kymmenen päivää. Kymmenen päivän kuluttua, koska mitään eroa värjäyskuvio viidestä kymmeneen päivään havaittiin. Microtissues olivat täysin positiivisia vimentiinista ja Ki67, kun taas mitään E-kadheriinin ja α-SMA ilmentymistä havaittiin.

IHC siivuja SV80 monokulttuurien kymmenen päivän kuluttua (Bar A: 100 nm);