Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kemoterapia ja /tai sädehoitoa käytetään laajasti syövän hoitomuotoja, mutta antituumorivaikutukset ne tuottavat voidaan parantaa, kun se yhdistetään immunoterapian. Kemoterapian tappaa kasvainsoluja, mutta se myös vapauttaa tuumoriantigeenin ja mahdollistaa rajat esitys kasvaimen antigeeni käynnistää antigeenispesifisen soluvälitteinen immuunivaste. Edistää CD4 + auttaja-T-solujen immuunivaste voidaan parantaa rajat esitys vasta kasvaimen antigeeni-kemoterapian jälkeen. Yleiseurooppalaisen HLA-DR-sitova epitooppi (PADRE-peptidi) pystyy tuottamaan antigeenispesifisten CD4 + T-solut, jotka sitovat eri MHC-luokan II molekyylejä, joilla on korkea affiniteetti ja on laajalti käytetty yhdessä rokotteiden parantamaan tehoa lisäämällä CD4 + T-soluvasteita . Tässä me tutkimme, kasvaimeen injektion PADRE ja adjuvanttia CpG osaksi HPV16 E7-ilmentävät TC-1 kasvainten seuraavat sisplatiini-kemoterapian voisi johtaa voimakas kasvainten vastainen vaikutus ja antigeeni-soluvälitteinen immuunivaste. Havaitsimme, että hoito kaikkien kolmen aineilla tuotetun voimakkaimmista antituumorivaikutukset verrattuna pairwise yhdistelmiä. Lisäksi sisplatiinihoidolle, CpG ja PADRE pystyi kontrolloimaan kasvaimia kaukainen sivuston, mikä osoittaa, että lähestymistapamme pystyy aiheuttamaan rajat esitys kasvain antigeenin. Sisplatiinin, CpG ja PADRE myös parannettu sukupolven PADRE-spesifisten CD4 + T-solujen ja E7-spesifisten CD8 + T-solujen ja vähensi MDSCs kasvaimen loci. Hoito-ohjelma Tässä esitetty edustaa yleinen lähestymistapa syövän valvontaa.

Citation: Song L, Yang MC, Knoff J, Wu TC, Hung CF (2014) Cancer immunoterapia Käyttävät Innovatiivinen strategiaan vahvistaa CD4 + T Cell Ohje kasvaimen mikroympäristössä. PLoS ONE 9 (12): e115711. doi: 10,1371 /journal.pone.0115711

Editor: Thorbald van Hall, Leiden University Medical Center, Alankomaat

vastaanotettu: 19 maaliskuu 2014; Hyväksytty: 27 marraskuu 2014; Julkaistu: 22 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Song et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Institutes of Health /National Cancer Institute Kohdunkaulan syöpä SPORE P50CA098252 ja 2R01CA114425-06 avustuksia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kemoterapia ja /tai sädehoitoa käytetään laajasti syövän hoitomuotoja. Sekä kemoterapiaa ja sädehoitoa on osoitettu muuttaa kasvaimen mikroympäris- sopivaan ympäristössä myöhempää immunoterapeuttisten rokotusten [1], [2]. Olemme aikaisemmin käytetty sisplatiinin kemoterapiaa prime kasvain microenvironment varten rokottaminen rekombinanttiproteiinin, ja totesi, että tämä hoito indusoi voimakkaita antituumorivaikutuksia ja antigeenispesifisen soluvälitteinen immuunivaste [1]. Ei ainoastaan ​​sisplatiini tappaa kasvainsoluja, mutta myös se vapauttaa tuumoriantigeenin ja mahdollistaa rajat esitys kasvaimen antigeeni käynnistää antigeenispesifisen soluvälitteinen immuunivaste. Kuitenkin kasvaimen kasvua estävän vaikutuksia, joita kemoterapiaa voidaan parantaa, kun se yhdistetään immunoterapioiden.

strategia parantaa rajat esittely kasvaimen antigeeni kemoterapian jälkeen on edistää CD4 + auttaja-T-solujen immuunivastetta. Aine, joka kykenee synnyttämään antigeenispesifisten CD4 + T-solut, jotka sitovat eri MHC-luokan II molekyyleihin, joilla on korkea affiniteetti on yleiseurooppalainen HLA-DR-sitova epitooppi (PADRE-peptidi) [3]. PADRE-peptidi on laajalti käytetty yhdessä rokotteiden parantamaan tehoa lisäämällä CD4 + T-soluvasteiden [4] – [7]. Näin ollen, kasvaimeen anto PADRE mahdollisesti voi luoda PADRE-specific CD4 + T-auttajasolujen edelleen parantaa rajat esitys tuottaa kasvaimen antigeenispesifisten CD8 + T-soluja. Työ- immunostimulatorisen adjuvantin kanssa PADRE-peptidi voidaan edelleen parantaa kasvaimen antigeeni-spesifinen CD8 + T-soluja.

toll-like-reseptori 9 (TLR9) agonisti CpG on yleisesti käytetty lisäaine, joka on osoitettu stimuloivan CD8 + T cell cross-imevä edistämällä tyypin I interferonin tuotanto [8], [9]. CpG on myös osoitettu olevan kasvaintenvastaista vaikutusta, kun injektoitiin suoraan kasvaimen [10] – [12]. Lisäksi CpG on osoitettu estävän immunosuppressiivisen aktiivisuuden MDSCs tuumoria kantavissa hiirissä [13]. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että immunostimulatorista toiminta CpG voidaan käyttää parantamaan rajat esittely kasvaimen antigeeni tuottaa kasvaimen antigeenispesifisten CD8 + T-soluvälitteinen immuunivaste.

Nykyisessä tutkimuksessa olemme arveltu, että sisplatiini käsittely ja sen jälkeen CpG adjuvanttia ja PADRE peptidin antaminen lisäisi rajat esittely kasvain antigeenin, mikä voimakas antituumorivaikutukset. Tämän testaamiseksi käytimme hiirillä HPV16 E7-ilmentävien TC-1 kasvaimia ja käsiteltiin niitä erilaisilla yhdistelmillä sisplatiinin seurasi kasvaimensisäistä injektiona CpG ja PADRE peptidi. Huomasimme, että hoito kaikkien kolmen aineilla tuotetun voimakkain antituumorivaikutukset. Lisäksi sisplatiinihoidolle, CpG ja PADRE pystyi kontrolloimaan kasvaimia kaukainen sivuston, mikä osoittaa, että lähestymistapamme kykeni indusoimaan rajat esitys kasvain antigeenin. Olemme havainneet, että sisplatiinin, CpG ja PADRE parannettu sukupolven PADRE-spesifisten CD4 + T-solut sekä E7-spesifisten CD8 + T-soluja. Sisplatiinin, CpG ja PADRE myös vähensi MDSCs kasvaimen loci, prosessi todettu välittyvän Fas-FasL apoptoosireitin. Hoito-ohjelman esitetty tässä on uusi sovellus yhdistelmä immunoterapioiden, joka indusoi voimakkaan antituumorivaikutuksen immuunivasteita ilman tietoa immunodominanttien kasvaimen antigeenejä, jolloin lähestymistapa mahdollisesti laajalti sovellettavissa.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

Kaikki eläinkokeiden tässä tutkimuksessa käytetyt suoritettiin protokollien mukaisesti hyväksytty tämän erityisen tutkimuksen ja suositusten mukaisesti oikeasta käytöstä ja hoidosta laboratorioeläinten Johns Hopkins University animal Care ja käyttö komitea. Kaikki solulinjat perustettiin ja ylläpidetään hyväksyttyjen käytäntöjen. Hiiret tapettiin varten tämän tutkimuksen avulla CO

2 mukaisesti eläimen protokollaa. Mitä ihmisen päätepisteen standardeja, hiiret osoittaa vakavaa kärsimystä tai kasvaimia, jotka ylittivät 20 mm halkaisijaltaan tapettiin CO

2 mukaisesti eläimen protokollan.

Koe-eläimet

Kuudesta kahdeksaan -week-vuotias nainen C57BL /6-hiiret saatiin National Cancer Institute, Frederick Animal Production Area (Frederick, MD). Hiiriä pidettiin onkologian eläimen laitoksen Johns Hopkins Hospital (Baltimore, MD).

Solut

TC-1 tuumorimallissa tuotettiin laboratoriossamme transformoimalla ensisijainen keuhkojen epiteelisolujen C57BL /6-hiiristä, joilla on aktiivinen Ras yhdessä HPV16 E6- ja E7-onkogeenit sekä tuotanto- ja huolto alla hyväksyttyjen käytäntöjen tämän solulinjan on kuvattu aiemmin [14]. Soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, 10% natriumpyruvaattia, 10% ei-välttämättömiä aminohappoja, ja 100 pg /ml streptomysiiniä: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2 /95% ilmaa 37 ° C: ssa. E7-spesifisten CD8 + T-solut syntyvät pernasolujen E7-rokotetuista hiiristä ja stimuloitiin säteilytetyillä TC-1-soluja ja 10 IU interleukiini-2 (IL-2) joka viikko. PADRE-specific CD4 + T-solut syntyvät C57BL /6-hiiristä, jotka oli immunisoitu pcDNA3-Ii-PADRE geenin ase. Soluja stimuloitiin säteilytetyillä PADRE peptidilisätty DC: n ja IL-2 (10 IU) viikoittain [15].

peptidi, vasta-aineet ja reagenssit

PADRE-peptidi (Pan HLA-DR reaktiivisen epitoopin , AKFVAAWTLKAAA), ja H2-D

b-rajoitettu HPV16 E7aa49-57 peptidi (RAHYNIVTF) syntetisoitiin Beckman Coulter, jonka puhtaus oli 90%.

FITC, PE ja APC-konjugoitu anti-hiiri- CD8a (klooni 53.6.7), FITC-konjugoitu anti -hiiri IFN-γ: n (klooni XMG1.2), FITC ja PE-konjugoitu anti-hiiri-CD4 (klooni RM4-5), APC-konjugoitu anti-hiiri-CD11b (klooni M1 /70), PE-konjugoitu anti-hiiri-Ly6G (klooni 1A8), PE-konjugoitu anti-hiiri-CD154 (CD40L, klooni MR1), Functional anti-hiiri-CD95 (Fas, klooni Jo2) agonistisia vasta-aineita, ja FITC anneksiini V Apoptosis Detection Kit, hankittiin BD Pharmingen (San Diego, CA). PE-konjugoitu CD178 (Fas-L, klooni MFL3), PE-konjugoitu anti-hiiri-CD95 (Fas, klooni 15A7), FITC-konjugoitu anti-hiiri-CD40 (cloneHM40-3), funktionaalinen anti-hiiri-CD40-agonistin (klooni 1C10) ja anti-hiiri-CD154 (CD40L, klooni MR1) vasta-aineet ostettiin eBioscience (San Diego, CA). PE-konjugoitu, HPV16 E7aa49-57 peptidi ja RAHYNIVTF ladattu H2-D

b tetrameerejä saatiin National Institute of Allergy and Infectious Diseases tetrameerin Facility (Atlanta, GA). Fas /Fas L antagonisti Kp7-6 ostettiin EMD Chemicals (San Diego, CA).

In vivo

kasvain Hoitokokeissa ja vasta-ehtyminen

Kasvain Hoitokokeissa suoritettiin kahdesti itsenäisesti. Päivänä 0, 1 x 10

5 TC-1-kasvainsoluja siirrostettiin ihonalaisesti C57BL /6-hiiret (5 ryhmää kohti). Neljä päivää myöhemmin, tuumoreita kantavaa hiirtä käsiteltiin sisplatiinin (5 mg /kg) tai PBS intraperitoneaalisesti. Päivänä 5 hiiret immunisoitiin kasvaimen joko PBS-kontrollin, 20 ug PADRE-peptidi, 10 ug: aan CpG, tai yhdistelmä kahden jälkimmäisen. Kaikki käsittelyt toistettiin 3 kertaa 7 päivän välein. Kasvaimen kasvua seurattiin silmämääräisesti, tunnustelu, ja digitaalinen jarrusatulat (Scienceware) kahdesti viikossa. Hiiret tapettiin, kun halkaisija kasvaimen saavutti 20 mm.

systeemistä antituumorivaikutuksen arviointia, hiiret (5 ryhmää kohti) altistettiin subkutaanisesti 1 x 10

5 TC-1 kasvain solujen oikeaan kylkeen . Viisi päivää myöhemmin, 3 x 10

4 TC-1-kasvainsoluja siirrostettiin ihonalaisesti vasempaan kylkeen. Kasvain hiiriä joko oli käsitelty PBS: llä ohjattu tai tehtiin kolmoishoidon (sisplatiini 5 mg /kg IP yhdistettiin 20 ug: PADRE-peptidiä ja 10 ug: aan CpG kasvaimensisäisiä injektiona) kolme kertaa 5 päivän välein. CD8 + T-solujen poistamista ryhmästä, 100 ug anti-hiiri-CD8-vasta-ainetta (klooni 2,43) toimitettiin hiirille vatsaonteloon päivinä 3, 4, 5 jälkeen kasvaimen haaste. Sen jälkeen, 150 ug /hiiri anti-hiiri-CD8-vasta-ainetta annettiin viikossa säilyttää yli 90% CD8 + T-solujen vähenemistä.

valmistaminen yksisoluiset suspensiot TC-1 ihonalainen kasvain

kasvaimen kudokset varovasti leikeltiin hiiristä. Kiinteä aine kasvainten sitten jauhettiin 1-2 mm: n paloiksi ja inkuboitiin seerumivapaassa RPMI 1640-alustassa, joka sisälsi 0,05 mg /ml kollagenaasia I, 0,05 mg /ml kollagenaasia IV, 0,025 mg /ml hyaluronidaasia IV, 0,25 mg /ml DNaasi I: (molemmat Roche, Indianapolis, IN), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa 60 minuutin ajan, kuten aikaisemmin on kuvattu [16].

Solun pinnan värjäytyminen, solunsisäisen sytokiinin värjäystä ja virtaussytometria analyysi

tetrameerivärjäyksellä, yksisoluiset keskeytetty pernasolujen tai kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä värjättiin puhdistetulla anti-hiiri CD16 /32 (Fc lohko, BD Pharmingen, San Diego, CA) ensin, ja sitten anti-hiiri-CD8-FITC: llä, PE-konjugoitu HPV16 E7 aa49-57 (RAHYNIVTF) peptidi-ladattu H2-D

b tetrameerin 4 ° C: ssa. Solut värjättiin 7-AAD ennen virtaussytometria-analyysi jättää kuolleita soluja.

havaitsemiseksi HPV16 E7-spesifisten CD8 + T-soluvasteiden ja PADRE-spesifisten CD4 + T-solujen IFN-γ solunsisäistä värjäystä, PBMC: t, yksisoluiset keskeytetään pernasolujen tai kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä stimuloitiin joko HPV16 E7aa49-57 tai PADRE-peptidin (1 ug /ml) läsnä ollessa Golgiplug (BD Pharmingen, San Diego, CA) 37 ° C: ssa yön yli. Stimuloitujen Sitten solut pestiin kerran FACScan puskurilla ja värjättiin PE-konjugoidulla monoklonaalisella rotan anti-hiiri CD8a tai anti-hiiri-CD4. Solut altistettiin solunsisäisen sytokiinin värjäystä käyttämällä Cytofix /Cytoperm mukainen pakkaus valmistajan ohjeiden (BD Pharmingen, San Diego, CA). Solunsisäisen IFN-γ värjättiin FITC-konjugoidulla rotan anti-hiiren IFN-γ. Virtaussytometria-analyysi suoritettiin käyttäen FACSalibur kanssa CellQuest-ohjelmaa. Kaikki analyysit suoritettiin Flowjo ohjelmisto (Puu tähti).

eristäminen myelooisen johdettujen vaimennin solujen tuumoreita kantavaa hiirtä ja tukahduttamiseksi T-soluproliferaation

CD11 + Ly6G

Hi MDSCs olivat eristetty yhden solun pernasolujen suspensioita TC-1 kasvain C57BL /6-hiirissä käyttäen CD11 + Ly6G eristäminen sarjat ja LS sarakkeet magneettierotus mukaan valmistajan ohjeiden (Miltenyi Biotec). Puhtaus ei ollut alle 95%.

In vitro

MDSC apoptoosin arviointi

Puhdistetut MDSCs inkuboitiin 37 ° C: ssa tai viljeltiin yhdessä PADRE-spesifisten CD4 + T soluihin 01:01 suhde jopa 24 tuntia 96-kuoppaisilla levyillä. Solut värjättiin sitten APC anti-hiiri-CD11, PE anti-hiiri-Ly6G, FITC-anti-hiiri-anneksiini V-vasta-aineita ja 7-AAD (FITC anneksiini V Apoptosis Detection Kit, BD Pharmingen, San Diego, CA), ja tutkittiin virtaussytometrialla. MDSCs ensin eroteltiin CD11 + ja Ly6G

Hi, ja sitten taajuus apoptoosin mitattiin anneksiini V + ja 7-AAD.

arvioimiseksi vasta-aiheuttama MDSC apoptoosin, eristetty MDSC viljeltiin 12 tuntia anti-Fas-agonistinen vasta-aine (2 ug /ml, BD Pharmingen, klooni Jo2, San Diego, CA), tai isotyyppi-mAb. In vitro estää määrityksen, eristetty MDSCs viljeltiin yhdessä PADRE- CD4 + T-solun 01:01 annos, inkuboitiin sitten isotyypin mAb tai Fas-Fas-L-antagonisti (Kp7-6, Calbiochem) 24 tuntia.

tilastollinen

Kaikki tiedot esitetään tässä tutkimuksessa ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE toisin mainita. Vertailut yksittäisten datapisteiden solunsisäiseen sytokiinien värjäyksen virtaussytometrialla analysointia ja kasvainten hoidossa tehtiin käyttämällä kaksisuuntaisella Studentin t-testiä Graph Prism 6.0. Vuonna kasvain Hoitokokeissa pääasiallinen tulos korko oli kestoltaan kunnes hiiret tapettiin. Tapahtuma aika jakaumat eri hiiriä verrattiin käyttäen Kaplan-Meier menetelmällä ja log-rank-testi Graph Prism 6.0. Kaikki p-arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

hoito TC-1 kasvainta kantavien hiirten sisplatiinin, CpG ja PADRE-peptidi muodostaa voimakkaita antituumorivaikutukset

TC-1 tuumoreita kantavaa hiirtä käytettiin tutkimaan antituumorivaikutukset erilaisia ​​hoitoja yhdistämällä vatsaonteloon sisplatiini-kemoterapian, tuumorinsisäinen injektio PADRE-peptidin ja /tai kasvaimeen injektiolla CpG. C57BL /6-hiiret altistettiin 1 x 10

5 TC-1-kasvainsolua päivänä 0, ja on jaettu viiteen hoitoryhmään. Hiiret ryhmässä 1 oli käsittelemättömiä, kuin ryhmässä 2 oli sisplatiinia seurasi kasvaimensisäisiä CpG, ne ryhmässä 3 oli sisplatiinia seurasi kasvaimensisäisiä PADRE peptidi, kuin ryhmässä 4 käsiteltiin kasvaimensisäisenä CpG ja PADRE, ja ne ryhmässä 5 hoidettiin sisplatiinilla seurasi kasvaimensisäisenä CpG ja PADRE (Fig. 1A). Kuten on esitetty kuviossa. 1B, sisplatiinihoidolle seurasi kasvaimensisäisenä CpG ja PADRE vähensi kasvaimen vertailuryhmän ja hoidon CpG ja PADRE vain. Lisäksi sisplatiinihoidolle seurasi kasvaimensisäisenä CpG ja PADRE merkittävästi parantunut eloonjääminen verrattuna kaikkiin muihin hoitoryhmiin (Fig. 1 C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että yhdistelmä sisplatiinin, CpG ja PADRE on merkittävä tuumorin vastaista vaikutusta vastaan ​​TC-1 kasvaimia.

C57BL /6-hiiriä (5 hiirtä /ryhmä) annettiin ihonalaisesti TC-1 kasvainsoluja ja käsiteltiin eri yhdistelmiä sisplatiinin, CpG ja PADRE peptidi. A. Kaavakuva hoitoyhdistelmien. B. Plot kasvaimen kasvun kinetiikkaan. C. Kaplan-Meier selviytymisen juoni. (*

p

0,05, ***

p

0,001, ***

p

0,0001).

hoito sisplatiinin, CpG ja PADRE peptidi saa aikaan vahvoja systeemisiä antituumorivaikutukset

Koska sisplatiinihoidolle, CpG ja PADRE syntyy voimakkaimpia antituumorivaikutukset (Fig. 1), me seuraavaksi tutkittava, onko hoito kaikkien kolmen aineilla voisi tuottavat antituumorivaikutukset toissijaiseen kasvain. C57BL /6-hiiriä subkutaanisesti altistettiin TC-1 kasvainsoluja oikeaan kylkeen päivinä 0, ja sitten taas läpi vasemmalta laidalta päivänä 5. Ryhmä hiiriä käsiteltiin sitten anti-CD8-vasta päivinä 3-5 ja sitten viikoittain heikentävistä CD8 + T-soluja. Hiiriä käsiteltiin, kuten on esitetty kuviossa. 2A, sisplatiinin injektiona vatsaonteloon ja CpG- ja PADRE injektoitiin kasvaimen ensisijainen kasvain oikeaan kylkeen. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, tilavuus primaarikasvaimen laski merkittävästi hiirissä, joita käsiteltiin sisplatiinin, CpG ja PADRE verrattuna hoitamattomiin hiiriin. Lisäksi tilavuuden toisen kasvain vasempaan kylkeen väheni myös merkittävästi hiirillä, joille kaikki kolme aineita verrattuna käsittelemättömiin hiiriin (Fig. 2C). CD8 + T-solujen vähentynyt merkittävästi terapeuttista vaikutusta sisplatiinin, CpG ja PADRE hoito sekä ensisijainen ja toissijainen kasvaimia, mikä osoittaa, että CD8 + T-solut ovat tärkeitä hoidon tehokkuutta (Fig. 2B ja C). Kuva. 2D osoittaa, että sisplatiinin, CpG ja PADRE pidentää merkittävästi selviytymisen TC-1 kasvainta kantavissa hiirissä verrattuna CD8 + T-solut on poistettu hiirillä ja käsittelemättömät hiiret. Samoin, CD4 + T-solujen merkittävästi heikentänyt antituumorivaikutukset kolminkertainen hoito (S1A kuvio.). Lisäksi infuusio PADRE-spesifisten CD4 + -T-soluja kasvaimen kantavien hiirten merkittävästi parannettu antituumorivaikutus (S1B kuvio.). Nämä tulokset osoittavat, että CD4 + T-solut ovat tärkeitä myös havaittu terapeuttinen vaikutus. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että hoito sisplatiinilla seurasi CpG ja PADRE synnyttää voimakkaita systeemisiä antituumorivaikutuksen immuunivasteen, joka kykenee vaikuttamaan vastaan ​​kasvaimia kaukaisiin kohtiin.

C57BL /6-hiirten (5 hiirtä /ryhmä) altistettiin peräkkäin TC-1 kasvainsoluja päivänä 0 (oikea kylki) ja päivä 5 (vasen kylki), ja sitten olivat joko käsittelemättömiä tai sisplatiinia yhdessä kasvaimeen injektion CpG ja PADRE peptidi primaarikasvaimen. CD8 + T-solujen poistamista ryhmästä, hiiriä käsiteltiin kuten edellä, kanssa adition 100 ug anti-hiiri-CD8-vasta-ainetta (klooni 2,43) ruiskutettiin intraperitoneaalisesti päivinä 3, 4 ja 5 sen jälkeen, kun kasvaimen haaste, ja sen jälkeen 150 ug per viikko myöhemmin. A. Kaavakuva hoito. B. sirontakuvaajaan primaarituumorin kasvukinetiikat. C. sirontakuvaajaan toissijaisten kasvainten kasvua kinetiikka. D. Kaplan-Meier selviytymisen juoni. (***

p

0,001, ****

p

0,0001).

hoito sisplatiinin, CpG ja PADRE tehostaa systeemisiä PADRE erityisiä CD4 + T-soluvasteita in TC-1 on kasvain

Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus hoidon eri yhdistelmiä sisplatiinin, CpG ja PADRE systeemisen CD4 + T-solujen immuunivastetta. TC-1 tuumoreita kantavaa hiirtä käsiteltiin eri yhdistelmiä sisplatiinin, CpG ja PADRE-peptidin, kuten on esitetty kuviossa. 1A ja PBMC: t analysoitiin virtaussytometrialla 1 viikko sen jälkeen, kun viimeinen antigeenien läsnäolon IFN-γ erittävät PADRE-spesifisten CD4 + T-soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 3A ja B, jolla on kasvain sisplatiinia seurasi CpG ja PADRE syntyy eniten PADRE-specific IFN-γ + CD4 + T-solut systeemisesti verrattuna kaikkiin muihin hoitoryhmiin. Tämä osoittaa, että käsittely sisplatiinin, CpG ja PADRE pystyy tuottamaan voimakkaita PADRE-spesifisten CD4 + -T-soluvasteita TC-1 kasvainta kantavien hiirten.

C57BL /6-hiiriä (5 hiirtä /ryhmä) annettiin ihonalaisesti TC-1 kasvainsoluja ja joita käsitellään myöhemmin erilaisilla yhdistelmillä sisplatiinin, CpG ja PADRE peptidi kuten. PBMC analysoitiin 1 viikon kuluttua viimeisestä antigeenin toimitusta. Läsnäolon PADRE-spesifisten CD4 + T-solut PBMC-analysoitiin solunsisäisen sytokiinin värjäystä IFN-γ: n ja CD4 + värjäyksessä, mitä seurasi virtaussytometria-analyysi. A. Edustavia virtaussytometrillä käyrästö, joka kuvaa taajuuden IFN-γ-erittävien CD4 + T-soluja verenkierrossa jälkeen pulssitettu PADRE-peptidi. B. Pylväsgrafiikka kvantifiointiin datan (keskiarvo ± SE).

hoito sisplatiinin, CpG ja PADRE indusoi paikallista kasvaimen antigeenispesifisten CD8 + T-solujen vasteita TC-1 on kasvain

TC-1 tuumoreita kantavaa hiirtä käsiteltiin eri yhdistelmiä sisplatiinin, CpG ja PADRE-peptidin, kuten on esitetty kuviossa. 1A. Kasvain-tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) kerättiin analyysiä varten 12 päivää sen jälkeen, kun viimeinen antigeenin toimitusta. Läsnäolon PADRE-spesifisten CD4 + T-solujen ja E7-spesifisten CD8 + T-solujen joukossa TIL karakterisoitiin käyttäen intrasellulaarista sytokiinin värjäystä IFN-γ sekä CD4- ja CD8-värjäys ja analysoitiin virtaussytometrialla. Kuten on esitetty kuviossa. 4A ja C, hiiret sisplatiinia seurasi CpG ja PADRE syntyy prosentuaalisesti eniten PADRE-spesifisten CD4 + T-solujen joukossa kasvainta infiltroituneen CD4 + T-soluja verrattuna kaikkiin muihin hoitoryhmissä. Lisäksi hiiret, joita käsiteltiin sisplatiinin, CpG ja PADRE tuotti eniten E7-spesifisten CD8 + T-solujen kasvainsolujen parissa verrattuna kaikkiin muihin hoitoryhmiin (Fig. 4B ja D). On tärkeää huomata, että TIL kerätään sisällä kasvaimen mikroympäris- on aktivoidussa tilassa, jossa T-solujen reseptorit ovat hintoihin. Näin ollen, värjäys näkyy kaltevuus, joka perustuu eri tasoilla TCR internalisaation. Tämä ulkonäkö eroaa värjäyskuvion yleensä todetaan arvioinnissa antigeenispesifisten T-solujen verenkiertoon, jossa erilliset väestö olisi noudatettava. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että hoito sisplatiinilla, CpG ja PADRE voi johtaa cross-esittely kasvaimen antigeeni, E7, mikä parantaa kasvaimen antigeeni-spesifinen CD8 + T-soluvälitteinen immuunivasteita kasvainta loci.

C57BL /6-hiiret (5 ryhmää kohti) altistettiin subkutaanisesti TC-1 kasvainsoluja ja käsiteltiin eri yhdistelmiä sisplatiinin, CpG ja PADRE-peptidin, kuten on ilmoitettu. 12 päivää sen jälkeen, kun viimeinen antigeenien, kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä kerättiin analysoida immuunijärjestelmän solujen osajoukkoja. A. Edustavia virtaussytometria-analyysi, joka esittää taajuuden PADRE-specific IFN-γ-erittävien CD4 + T-solujen joukossa koko kasvaimeen infiltroivien CD4 + T-soluja. B. Pylväsdiagrammi kvantifiointiin tietojen A. (keskiarvo ± keskivirhe). C. Edustavia virtaussytometria-analyysi kuvaa absoluuttisen määrän E7 tetrameeri-sitova CD8 + T-solujen 5 x 10

5 yksisoluiset suspension valmistettu kasvaimia. D. Pylväsdiagrammi kvantifiointiin tietojen C. (keskiarvo ± SE).

hoito sisplatiinin, CpG ja PADRE pienenee myelooinen johdettu vaimentimen solujen kasvain loci

edelleen tutkia vaikutukset sisplatiinin, CpG ja PADRE hoito, olemme analysoineet immunosuppressiivisen myeloidinen johdettu suppressorisolut (MDSCs) joukossa tuumoriin tunkeutumisatmosfäärin-lymfosyyttien käsitellyn TC-1 tuumoreita kantavaa hiirtä. Välillä 30 ja 35 päivää sen jälkeen, kun kasvaimen haaste, kasvaimet kerättiin ja analysoitiin virtaussytometrialla, kuten on esitetty kuviossa. 5A. Kuva. Kuvio 5B esittää, että kasvaimia hiirien sisplatiinia, CpG ja PADRE oli merkitsevästi alhaisempi CD11 + Ly6G

Hi MDSCs kasvaimen loci verrattuna kaikkiin muihin hoitoryhmiin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että hoito sisplatiinin, CpG ja PADRE herättää antituumorivaikutukset ainakin osittain vähentämällä väestö MDSCs kasvaimen mikroympäristössä.

C57BL /6-hiiret (5 ryhmää kohti) altistettiin subkutaanisesti TC 1 kasvainsoluja ja käsiteltiin erilaisilla yhdistelmillä sisplatiinin, CpG ja PADRE peptidi. 30-35 päivän kuluttua kasvaimen haaste, kun kasvaimen halkaisija yli 10 mm, kasvaimeen infiltroituvat solut kerättiin analysoida läsnäolon CD11 + Ly6G

hi MDSCs. A. Edustavia ääriviivapiirrokset kuvaa taajuutta CD11 + Ly6G

hi MDSCs kerta-solususpensio valmistettiin kasvain. B. Pylväsdiagrammi kvantifiointiin datan A (keskiarvo ± SE) (*

p

0,05, ***

p

0,0001).

PADRE-CD4 + T-solujen indusoi MDSC apoptoosia Fas ja Fas-ligandin polku

Havaitsimme, että sisplatiinihoidolle seurasi CpG ja PADRE vähensi MDSCs kasvaimen loci. Aikaisemmin on osoitettu, että MDSCs näihin Fas- ja käyvät läpi Fas-FasL-välitteistä apoptoosia, jos se havaitsee T-solu, joka ilmentää FasL [17]. Siksi me tunnettu vaikutus aktivoidun PADRE-spesifisten CD4 + -T-solut MDSCs kannalta apoptoottisen aktiivisuuden ja totesi, että MDSCs inkuboitiin PADRE-spesifisten CD4 + T-soluja oli merkittävästi suurempi ekspressio anneksiini V verrattuna niitä inkuboitiin kontrolli, joka osoittaa, että aktivoidaan CD4 + T-solut kykenevät indusoimaan apoptoosin MDSCs (Fig. 6). Lisäksi havaitsimme, että MDSCs viljeltiin yhdessä PADRE-spesifisten CD4 + T-soluja yhdessä Fas-FasL-antagonisti Kp7-6 merkittävästi vähentynyt taajuus apoptoosin kontrolliin verrattuna (Fig. 7). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että PADRE-spesifisten CD4 + -T-solujen apoptoosin indusoimiseksi MDSCs kautta Fas-FasL-riippuvaisen reitin, osoittaa, että MDSC tappaminen voi tapahtua ei-antigeenispesifisiä reitin.

Puhdistettu pernan CD11 + Ly6G

Hi MDSCs inkuboitiin PADRE-spesifisten CD4 + T-solujen tai keskipitkällä ohjaus 24 tuntia. A. Edustavia virtaussytometrillä tontteja kuvaa taajuutta CD11 + Ly6G

Hi anneksiini V + MDSCs. B. Pylväsgrafiikka kvantifiointiin data A (keskiarvo ± keskivirhe) (****

p

0,0001).

. Expression of Fas MDSCs läsnä ollessa ja puuttuessa PADRE-spesifisten CD4 + T-soluja. B. Pylväsgrafiikka määrällisesti tietojen A (keskiarvo ± keskivirhe). C. Puhdistettu pernan Ly6G

Hi MDSCs inkuboitiin 12 tuntia Fas agonistin vasta-aineella (Jo2) tai merkityksetön kontrolli IgG, ja CD11 + Ly6G

Hi-solut analysoitiin taajuuden apoptoosin (anneksiini V + ja 7-AAD -). D. MDSCs olivat viljeltiin yhdessä PADRE-spesifisten CD4 + T-soluja 24 tunnin ajan yhdessä merkityksetön kontrolli-IgG: n tai Fas-FasL-antagonisti Kp7-6. CD11 b + Ly6G

Hi-solut analysoitiin taajuuden apoptoosin, tunnettu siitä, että anneksiini V + ja 7-AAD-. Edustavia virtaussytometrillä pistekuvioita kuvaa taajuutta CD11 + Ly6G

Hi anneksiini V + MDSCs. E. Pylväsgrafiikka määrällisesti tietojen D (keskiarvo ± SE) (***

p

0,001, ***

p

0,0001).

keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että sisplatiini ja sen jälkeen kasvaimeen injektio voimakas adjuvantti, CpG, ja Pan HLA-DR-reaktiivinen epitooppi, PADRE-peptidi, tuottaa voimakas antigeeniä soluvälitteinen immuunivaste ja antituumorivaikutukset. Huomattavaa on, että sisplatiinihoidolle, CpG ja PADRE syntyy systeemisiä antituumorivaikutuksia ja pystyi kontrolloimaan kasvaimia kaukaisiin kohtiin. Lisäksi meidän vähensi väestön MDSCs kasvaimen loci, mikä vähentää immunosuppressio kasvaimen mikroympäristössä. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että sisplatiini, CpG ja PADRE parantaa rajat esittely kasvaimen antigeeni tuottaa kasvaimen antigeenispesifisten CD8 + T-soluvälitteinen immuunivaste. Yhdistelmä kemoterapiaa, adjuvanttia ja immunogeeninen peptidi esitetään tässä edustaa yleinen lähestymistapa kasvaimen valvontaa.

On huomioitava, että nykyinen kolmen yhdistelmähoito lähestymistapa ei sisällä käyttöön E7 antigeenin rokottamalla. Kuitenkin, sukupolven E7-spesifisten CD8 + T-solujen on havaittu (Fig. 4B). Me syystä, että havaittu E7-spesifisten CD8 + T-solujen vaste aikaansaama rajat esittely E7 antigeenejä vapautuu kasvain seuraavista sisplatiinin aiheuttaman apoptoosin antigeeniä esittelevät solut. Tyypin 1 interferonin tuotantoa seuraavat CpG hoitoa myös lujittaa rajat esityksen.

Tässä huomaamme, että PADRE-spesifisten CD4 + T-solut pystyvät tappamaan MDSCs kautta Fas-FasL vuorovaikutus. Sen lisäksi, että PADRE-spesifisten CD4 + T-solut voisivat tappaa MDSCs kasvaimen mikroympäristössä, mikä tahansa muu aktivoituneet T-solut voidaan myös teoriassa tappaa MDSCs. Itse asiassa olemme hiljattain osoittaneet, että E7-spesifisten CD8 + T-solujen ja OT-1-T-solut kykenevät indusoimaan apoptoosin MDSCs sisplatiinikäsittelyn jälkeen, CpG ja GP33 peptidi (Wu et ai, henkilökohtainen tiedonanto). Kun se on aktivoitu, CD4 + ja CD8 + T-solut vapauttavat asiaankuuluvien sytokiinien, kuten IL-2, mikä johtaa säätelyä Fas ilmaisun MDSCs. FasL ilmaistaan ​​aktivoitujen T-solujen itsensä. Tämän seurauksena, kun aktivoitunut T-solu havaitsee MDSC, MDSC kokee Fas-FasL-välitteistä apoptoosia [17]. Poistaminen immunosuppressiivisten MDSCs kasvain mikroympäristön myötävaikuttaa kasvaimen valvontaa.

Nykyinen tutkimus toimii alustana, joka voidaan soveltaa moniin eri syöpiä sairastavien potilaiden. Ainutlaatuinen piirre PADRE peptidi on, että epitooppi se koostuu on spesifinen monien MHC luokan II molekyylejä, ja on siksi sovellettavissa lukuisat yksityishenkilöt. Lisäksi oletamme, että tämä lähestymistapa ei vaadi tunnistamista kasvain antigeenin. Ensimmäisen kierroksen käsittely voi indusoida kasvainsolun tappamisen ja vapautumista tuumoriantigeenin kasvaimeen mikroympäris- sekä sukupolven PADRE-spesifisten CD4 + T-solut (Fig. 3). Jälkeen myöhemmissä hoidon jälkeen vapautumista tuumoriantigeenin johtaa cross-priming ja sukupolven vasta kasvaimen antigeeni-spesifisten CD8 + T-solut, jotka myös pystyvät tappamaan kasvainsoluja (Fig. 4). Johtuvan tästä mekanismista, se ei ole tarpeen tietää immunodominantille kasvaimen antigeenejä, jolloin lähestymistapa mahdollisesti hyvin sovellettavissa.

Koska nykyinen lähestymistapa edellyttää kasvaimensisäistä injektion terapeuttisten aineiden, se on kaikkein sovellettavissa helposti kasvaimia, kuten pään ja kaula, iho ja kohdunkaulan kasvaimet. Kuitenkin, lähestymistä voidaan rajoittaa, kun kyseessä on saavuttamattomissa kasvaimia, asia, joka on käsiteltävä, jotta voidaan edelleen laajentaa tätä käsitettä kliiniseen käännös. Tämä voidaan ratkaista muuttamalla PADRE peptidi sisältää kasvaimeen ohjautuva tai kasvain ympäristössä kohdistaminen Aptameerien. Esimerkiksi CD13-ligandin on osoitettu olevan kyvyttömiä tuottamaan antigeeninen peptidi kasvaimen loci [18], [19] ja saada antigeenispesifisen tuumorinvastaista vastetta [1]. Lisäksi olemme osoittaneet, että Mesothelin ja NKG2D voidaan käyttää kasvaimen homing moduulit kimeerisiä proteiineja, tuottaa terapeuttisten proteiinien kasvaimen loci [20], [21]. Tulevaisuuden tutkimukset perusteltua laajentaa sovellettavuutta nykyisen lähestymistavan saavuttamattomissa kasvaimia.

Lähestymistapa esitetään tässä voi olla ihanteellinen ehdokas kliinisiin käännös. Todellakin PADRE ja CpG on testattu erilaisissa kliinisissä tutkimuksissa ja todettu turvalliseksi. PADRE on testattu formulaation ennaltaehkäisevän sytomegalovirus (CMV) -rokote (NCT00722839) [22].