Krooninen sairaus

tiivistelmä

aikana syövän etenemisessä, erityisiä genomista poikkeamia syntyy, joka voi määrittävät sairauden ja voidaan käyttää ennakoivaa tai ennustetekijöitä markkereita. Havaitseminen erityisiä geenin lisäyksiä tai deleetioita yhden veriteitse tai levittää kasvainsoluja, jotka voivat johtaa kehitystä etäpesäkkeiden on suuri kliininen merkitys, mutta teknisesti haastavaa. Tässä tutkimuksessa esittelemme menetelmä kvantitatiivinen korkean resoluution genomisen analyysin yksittäisiä soluja. Solut eristettiin pysyvänä mikroskooppisen valvonnan seurasi hifi koko genomin monistamisen ja myöhemmät analyysit hienot laatoitus array-CGH ja qPCR. Määritys sovellettiin yhden rintasyövän solujen analysoimiseksi geenivirhe keskitys terapeuttiset asiaa

EGFR

geeni. Tämä menetelmä mahdollistaa tarkan kvantitatiivisen analyysin kopioluvun vaihtelut yhden solun diagnostiikassa.

Citation: Hannemann J, Meyer-Staeckling S, Kemming D, Alpers I Joosse SA, Pospisil H, et al. (2011) Quantitative korkearesoluutioinen Perimän analyysi Yhden syöpäsoluja. PLoS ONE 6 (11): e26362. doi: 10,1371 /journal.pone.0026362

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 elokuu 2011; Hyväksytty: 25 syyskuu 2011; Julkaistu: 30 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Hannemann et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Bundesministerium Fur Bildung und Forschung (BMBF FKZ: 01ES0724, https://www.bmbf.de/de/1398.php). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

aikana syövän muodostumisen ja etenemisen, solupopulaatioiden erottuva geneettinen poikkeavuuksia syntyy jotka edustavat ainutlaatuista kliininen yhteisöjä kätkeminen erityistä terapeuttista tavoitteet [1], [2]. Hyvänä esimerkkinä on geenilokus epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (

EGFR

), joka on keskeinen toimija tuumoribiologiassa ja tärkeä kohde yksilöllisen syövän hoidossa. DNA kopioi numerot tämän yhden lokuksen merkittävästi määrittämään fenotyyppiin syöpäsolujen ja ovat indikaattoreita potilaan vaste kemoterapialle tai sädehoitoa [3]. Vasta-aineet ja pienmolekyylisalpaajia on kehitetty haittaavaa EGFR tyrosiinikinaasin aktiivisuuden erilaisissa kasvaintyypeissä [1] – [3].

Useimmat kasvaimet voidaan poistaa kokonaan kirurgian ja ovat siten käytettävissä toistuvaan näytteenottoa seurata joko hoidon vasteen tai hoidon aiheuttamat muutokset genomisen poikkeamia tai taudin etenemisen, vastaavasti. Viime aikoina nämä ratkaiseva prosesseja voidaan arvioida havaitsemiseen verivälitteisten syöpäsolujen tai levittää kasvainsoluja (DTC) luuytimessä, kun näkyvä homing elin ja tärkeä sivusto avointa etäpesäkkeiden syöpäpotilailla. Molekyyli analyysi näiden solujen voi paljastaa ainutlaatuista tietoa räätälöidä hoitoja estämään metastasointiin [4], [5].

Siksi kehitimme lähestymistavan luotettavaa korkearesoluutioinen geneettistä analyysiä eristetyt yksittäiset kasvainsolujen Käyttäen esimerkkinä

EGFR

geeni. Rikastuksen jälkeen, solut eristettiin mikromanipulaatiota ja sen jälkeen lineaarinen koko genomin monistus suoritettiin. Arvio Tämän menettelyn ovat tehneet hienoksi laatoitus array-CGH ja kvantitatiivinen PCR, jotta tarkasti määrittää amplitudi ja laajentaminen

EGFR

amplikonin yhden kasvainsoluissa.

Tulokset

Mikrohierontavaikutus ja koko genomin monistamisen yksittäisten solujen

ihmisen nisärauhassyöpä MDA-MB-468 valittiin sopiva malli menetelmän arviointia, koska se satamat

EGFR

vahvistusta ja osoittaa vahvaa EGFR yli-ilmentymisen sekä tuo näyttöön stemness /sitoutunut esisolujen fenotyyppi [6], [7]. Kuitenkin taso vahvistus vaihtelee solujen välillä. Sillä koko genomin monistamisen (WGA), ei-kiinteä tai hieman kiinteä solut kerättiin lasin pinnasta käyttämällä mikromanipulaattoria varustettu kapillaari on suunniteltu myös erityisiä vaatimuksia. Solut siirrettiin vesipitoiseen ympäröivään päälle C

18-silaani-pinnoitettu lasi keppi kuljettaa paikalla kuivattuja täydellisen soluhajotuspuskurin (katso online-menetelmät). Solulysaatti lasin stick on suoraan siirrettiin reaktioputken jo valmis kanssa näytepuskuria WGA vältetään menetys genomisen materiaalin. Menettely perustuu usean syrjäyttävä monistus käyttämällä sattumanvaraisia ​​heksameerejä ja oikoluku DNA-polymeraasin Phi29 varmistaa lineaarisen vahvistuksen [8]. Yksittäinen solu tuotti vuonna 2,04-2,96 ug PCR-monistettavan DNA (keskiarvo: 2,42 ug, SD 0,26), joka on parempi kuin tulokset aiemmin kuvattu [9].

Siirto tehokkuutta mikromanipulaatio ja uskollisuutta WGA yhden yksittäisen solun lukien

EGFR

paikoitellen noin 4,5 MB todensi kanssa Mikrosatelliittimarkkerien PCR. Mikrosatelliittimarkkereita loci on mukailtu Tidow et al. [10] ja yksityiskohtaiset tiedot palvelee lisätiedot (taulukko S1, S2). Kaikki mikrosatelliittimarkkereita loci voitiin todentaa.

kuvaus EGFR amplikonin yhden soluissa hieno laatoitus array CGH

Voit hallita lineaarisen DNA: n monistaminen sekvenssit WGA ja tutkia rakennetta

EGFR

amplikonin, olemme analysoineet alueen kätkeminen

EGFR

geenin korkean resoluution kaksivärinen hienoksi laatoitus array-CGH (Roche NimbleGen Inc., Madison, WI, USA). Mukautetun suunniteltu oligonukleotidisirujen kanssa 15 bp mediaani koetin väli kattaa genomisen sekvenssin noin 4,7 Mbp kromosomissa 7p11.2, kuten

EGFR

itse geenin, ja kaksi viite alueen kromosomissa 2 ja kromosomi 10 noin 200 kbp pituudeltaan [11]. Yleensä nämä viittaus alueet osoittavat vain vähäisiä genomista poikkeavuuksia. Korrelaatio juoni vertaamalla signaalin intensiteetin välisen hybridisaation välillä monistetun DNA: n joka on saatu yhden solun verrattuna saatu genominen DNA 500 solua osoittaa luotettavuutta valmisteen, pre-monistusta vaiheet ja array hybridisaatio (kuva 1c).

a: Array-CGH kuvaajia perimän DNA eri rinta- sinoomasolulinjoja erilaisilla

EGFR

geenin kopio numeroita. b: Array-CGH kuvaajia WGA monistettu DNA 500 MDA-MB-468 tai yhden MDA-MB-468-soluja (ostettu ATCC), tässä järjestyksessä. Alueella on

EGFR

geeni esitetään vihreänä. c: Korrelaatio kuvaaja signaalin intensiteetin sen jälkeen, kun joukko hybridisaation vertaamalla signaaleja DNA yhdestä MDA-MB-468-solun saadut signaalit DNA eristettiin 500 MDA-MB-468-soluja. Kohteet kuvattu keltaisella edustavat signaalit ulkopuolella amplikonin alueen, kun taas täplät merkitty sininen väri edustaa signaalit saadaan amplikonille kromosomi 7.

Data analyysit solulinjojen kuljettaa

EGFR

monistukset (MDA-MB-468, A431, ja BT20) paljasti amplikoni kromosomissa 7, joka koostuu pääosasta, joka sisältää koko

EGFR

geeni. Tämä keskeinen elementti on pidennetty telomeerisesti suuntaan terävällä reunus lopussa (kuvio 1 a, b), joka osoitti, että amplikoni aloitetaan selvä DNA-sekvenssin. Yksittäisestä solusta analyysi MDA-MB-468-solut näytetään eri

EGFR

kopioi numerot, tarkka amplikonin rajojen laskettiin pehmennystä toiminta Quantsmooth algoritmin [12]. Jatkaminen edelleen amplikonin havaittiin MDA-MB-468-solujen kanssa korkeimmalla kopio vahvistuksenkertojan (32 kopiota), joka osoittaa ylimääräinen sekvenssin laajennuksen sentromeerisen päällä (kuvio 1 b). Tiedot todensi kvantitatiivinen SYBR-vihreällä PCR käyttäen LINE1 toistuvat sekvenssit olennaisena vakio kopiosuojaustiedoiksi [13] (taulukko S3 ja S4). Tämä lähestymistapa mahdollistaa toistettavissa absoluuttinen DNA: n kvantifiointiin yhdessä solussa, jota ei ole toistaiseksi raportoitu.

kuvaus EGFR amplikonin yhden soluissa qPCR

Seuraava tavoite oli kehittää luotettava määritys, jotka voivat auttaa hoitopäätöksiä kliinisissä rutiinia. Tulokset hienoksi laatoitus array-CGH ovat osoittaneet, että monistettu alueet eroavat pituudeltaan riippuu tasosta vahvistus koko alueen (kuvio 1), mutta kaikissa tapauksissa

EGFR

geeni itsessään mukana. Perustuu kopiomäärä tasot määritettiin hienoksi laatoitus erilaisia ​​analyysi, me standardoitu ehdoton qPCR mittauksia varten

EGFR

eksonit 4, 7, 9, 15, ja 21 ja ei-koodaavan 5′-sekvenssi amplikoni asemassa 54485000 on SYBR vihreä määritys tarkasti kuvata

EGFR

monistuksia yhden solun (taulukko S5). PCR tehokkuus vaihteli välillä 98,07% ja 99,02% (keskiarvo: 98,78%, SD 0,36). Kaikki määritykset osoittivat johdonmukaisia ​​tuloksia kuten esitetty kuvassa 2a. Kliinisissä rutiini, jossa on yksinkertainen ja vankka määritys on toivottavaa, vähentää näiden PCR-reaktiot eksonia 7 ja 9, ja 5′-pää-sekvenssi on riittävä.

a: Kvantitatiivinen PCR-määrityksissä eri

EGFR

eksonien MDA-MB-468-kloonien b: Kalibrointikäyriin että qPCR määritykset LINE-1 ohjaus ja

EGFR

eksonit 7 ja 9, jotka osoittavat, että vahvistus hyötysuhteet valvonnan sekä näyte-DNA ovat samanlaisia. c, d: tulokset qPCR analyysin eksonin 7 ja 9 yhden syöpäsolujen syöpäpotilailla. c: Boxplots of qPCR mittausten 10 ei-kasvaimia soluja 3 eri potilailla. Mediaani mitatuista arvoista ei-kasvainsoluissa on noin 0,9 (vaakasuora viiva laatikoissa). Arvot yli 95% luotettavuusrajat 1,377 ja 1,679 pidetään voitto eksonin 7 ja 9, vastaavasti. Yksittäinen Mustat pisteet edustavat arvot mitataan tuumorisoluissa potilasnäytteistä mukaan taulukon mukaista d.

Perimän heterogeenisyys veriteitse syöpäsolujen ja DTC populaatioita yksittäisille potilaille

tutkimiseksi, onko tämä olennainen lähestymistapa kehitetty ja optimoitu käyttämällä MDA-MB-468-solujen, kuten malli sopii myös analyysien potilaan näytteitä, testasimme verinäytteitä ja luuytimen näytteitä metastasoituneen rintasyövän. Solut valmistettiin, kuten on aiemmin kuvattu [5], [14]. Sytokeratiinia ja EpCAM vasta-aineita käytetään merkkiaineina havaitsemiseksi veren välityksellä tai levittää syöpäsoluja [5]. Olemme eristetty useita yksittäisiä soluja, värjättiin vasta-aine A45B /B3, eri potilaiden näytteistä mikromanipulaatiota ja suoritetaan WGA kuten edellä on kuvattu. WGA taipuneet 1,96-2,84 ug DNA (keskiarvo: 2,36 ug, SD 0,25), joka on verrattavissa tuotto saatu yhden soluviljelmässä. WGA kontrolloitiin käyttämällä LINE1 DNA [13], joka tuotti vuonna keskimäärin 330 ng (vaihteluväli 3 ng-621 ng, SD 211) monistustuotteen ja mahdollisti laskemaan tarkasti PCR monistettavissa DNA kunkin näytteen. Jokaiselta potilaalta näytteestä analysoitiin neljä soluja qPCR eksoneille 7 ja 9 (kuvio 2), ja 5′-pään sekvenssin (tuloksia ei ole esitetty). Arvot

EGFR

mittauksia ei-kasvainsoluissa on mediaani oli noin 0,9 molemmissa qPCR määrityksissä, jonka odotetaan heijastaa normaalia kopioluku 2 (rasiakuvaajien kuvion 2c). Verrattuna näihin arvoihin, kolmasosa soluista osoitti korkeaa

EGFR

monistamisen vähintään 5-kertainen (p 0,0001), ja noin 25% näytteistä osoitti välisen vahvistuksen 2- ja 3-kertainen (p 0,001). Yksityiskohtaiset tulokset yhtenäisen solut kuvassa 2c ja 2d. Yksi näyte ei osoittanut koostumus mittausten välillä eksoneissa 7 ja 9. Tämän näytteen, suoritimme lisää qPCR mittaukset eksonit 4, 15, ja 21, jotka kaikki esittävät normaalin kopion numero kunkin lokuksen. Mikään yksittäinen kasvainsolun esitetään ”normaali” geenikopiomäärä. Syöpäsolut ilman vahvistusta EGFR geenin osoitti matalan kopioluvun arvot ( 0,7). Nämä arvot ovat melko odotetaan johtua vaihtelusta WGA menettelyssä kuin tekniset artefakteja qPCR, koska laskettu laskentapohjaa DNA useimmista näytteistä levitetään qPCR reaktion ( 40 s) riittää luotettavia mittauksia ja on välillä kalibrointikäyrien kuten esitetty LINE1 luontainen ohjaus (kuvio 2d).

keskustelu

tutkimuksen tarkoituksena oli kehittää protokolla, joka mahdollistaa määrällisen genomisen analyysin single kasvainsoluja. Primaarikasvaimen solut epiteelin alkuperä ovat heterogeenisiä. On arveltu, että vain pieni osa näistä soluista osoittaa erityinen ”kantasolu – kuten” ominaisuuksia ja saattaa aiheuttaa etäpesäkkeitä (tarkistetaan [15]). Nämä solut voidaan luonnehtia erityisiä genomista poikkeamia, jotka antaa heille kasvun etuja ja aggressiivisempi fenotyyppi. Tätä näkemystä tukevat tiedot EGFR estäjä tutkimuksista sinänsä, EGFR-mutatoitunut adenokarsinooma ovat ainutlaatuinen kliininen kokonaisuus edellyttää molekyylidiagnostiikassa terapiaan ohjeet [1]. Lisäksi sukupolven hoidon resistenttien solukloonien kätkeminen muita EGFR mutaatioita tai monistumiset hoidon aikana sekä yli-ilmentyminen ja monistaminen EGFR säätelemällä geenien, esim. ERFI1, on jo raportoitu [2], [16] Siksi genominen tutkimus yhden syöpäsolujen joko asuvat veressä tai luuytimessä voi parantaa ennustavan molekyylidiagnostiikassa. Erityisesti rintasyövän, EGFR signalointi näyttää voimistuvan basaali kaltainen kasvaimia (triple-negatiivit), etenkin solujen kantasolujen kaltaisia ​​piirteitä [6], [7], [17], [18]. Alustavat kokeelliset tiedot ovat olemassa, jotka benetits peräisin EGFR täsmähoitoihin setuksimabi tai laptinib liittyvät EGFR vahvistus tasolle [6].

Useat tutkimusryhmät ovat tutkineet mahdollisuutta analysoida yhden tuumorisolun molekyylitasolla [19] , [20]. On osoitettu, että genomin laajuinen havaitseminen aberraatioita käyttämällä BAC paneelit on mahdollista leukosyytit ja solulinjan soluihin [21]. Lisäksi tutkimukset Stoecklein ym osoitti poikkeavat toisistaan ​​ensisijaisen ja systeeminen sairaus [19] ruokatorven syöpäpotilailla, jotka silmiinpistävän osoittaa tarpeen analyysin yhden Disseminated syöpäsoluja.

Tutkimuksessamme me valitsi MDA-MB-468-solulinja mallin kehittämiseksi protokollan koska eri vakaa EGFR vahvistus tasoilla eri klooneja tämän solulinjan. Tällä nämä solut jotenkin matkia heterogeeninen

in vivo

tilannetta ja toimii hyvin tasapainoinen kontrolli määritykseen geenin kopio tasoilla. Voimme osoittaa, että monistettu DNA saatu yhdestä solusta ovat riittävän laadukkaita käytettäväksi korkean resoluution hienoksi kaakelointi erilaisia ​​analyysi. Profiilit yksittäisten solujen näyttää enemmän tausta, mutta verrattuna profiileja perimän DNA solupopulaation sama amplikonin rajoja voidaan selvästi tunnistaa. Genomin laajuinen arrayCGH analyysi antaa erinomaisen yleiskuvan genomin leveä harhautumista yhden solun sisällä, mutta määrällisesti genomisen muutosten on rajallinen. QPCR lähestymistapaa ei voida käyttää seulomaan uusia kromosomipoikkeavuuksien, mutta voimme mitata tunnetuilla, mahdollisesti kliinisesti merkittäviä vahvistusta ja poistot. Jonka käyttö qPCR tekniikan eroja geenin kopioluku on selvästi erottaa samoin tasolla genomisen DNA: n pooli soluja kuin monistetun DNA: n joka on saatu yhdestä yksittäisestä solusta. Voisimme osoittaa, että solut on saatu yksittäisen potilaan ovat heterogeenisiä koskevat niiden EGFR-geenin monistaminen. Analyysi vain yksi tai kaksi solua verinäyte voi siis johtaa tuloksiin, jotka eivät välttämättä kuvaa todellista kliinistä tilannetta. Analyysi niin monta solua kuin mahdollista on välttämätöntä tunnistaa ne solut, joita ei voida kohdistaa tietyn terapian johtuen heterogeenisuus solupopulaation. Tämä havainto, jos vahvistettu suurempi kohortin näytteitä, voisi tarjota uusia oivalluksia biologian etäpesäkkeiden ja saattavat selittää epäonnistumisen kohdennettujen hoitomuotojen merkittävä osa potilaista.

käyttö kvantitatiivinen PCR näyttää vankka ja kustannustehokas menetelmä, joka voidaan luoda rutiiniolosuhteissa. Verrattuna käytön hienoksi laatoitus-mikrosirut, jotka ovat kalliina ja vähemmän kiinteää tulkinnasta tietojen, tämä menetelmiä voitaisiin mahdollisesti käyttää kliinisessä rutiini Molekyylitutkimuksen yksittäisten solujen. Tämä menetelmä on ensimmäistä kertaa näyttää suoraviivainen lähestymistapa mitata DNA määrän spesifistä genomisen alueen yhdestä solusta.

Tällä esitämme luotettava menetelmä absoluuttinen kvantitatiivinen määritys geenin kopiota yhdessä syöpää solut oli eristetty ääreisveren tai luuytimen syöpäpotilaita. Tällä menetelmällä ei voi rajoittua tutkimaan biologiaan levittää kasvainsoluja, mutta voi myös tulla uusi väline arvioitaessa yksittäisen solun genomiikan laajasti sovellettavissa monilla kokeellisen tutkimuksen. Lisäksi tuleva kliinisiä sovelluksia voidaan harkita. Beyond tutkimus

EGFR

geeni, meidän menetelmää voidaan sovittaa arvioida muita molekyylikohteista (esim HER2 [21]), sekä analysoida syöpäsoluja muissa Sytologisten näytteissä, joissa pieni osa kasvainsolujen rajojen genomisen analyysit nykyisillä menetelmillä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Vuodesta potilaalla edellyttäen verinäytettä, kirjallinen suostumus on saatu. Luuytimestä kerättyjä näytteitä jälkeen ruumiinavaus, kirjallinen hyväksyntä antoivat perheenjäseniä. Käyttö potilastiedot, veressä ja luuytimessä hyväksyi eettinen komitea on lääkintöhallituksen Hamburg (viitenumero # 190504).

Solulinjat ja Viljely

rintasyövän solulinjat MDA -MB-468, BT-20, MCF-7 sekä karsinooma A431 saatiin American Type Culture Collection (ATCC) ja niitä viljeltiin DMEM: ssä, jossa oli 5% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, 5% CO

2. Soluja kasvatettiin 70%: sta 80%: n konfluenssiin ennen sadonkorjuuta ja siirtää dioja yhden solun poiminta.

Immunosytokemia

Soluja inkuboitiin 45 minuuttia ensisijaisen vasta-A45B /B3 (Micromet, Munich, Saksa), jota seuraa pesuvaihe ja 30 minuutin inkuboinnin kanin-anti-hiiri-silloittava aine (Z0259, Dako, Glostrup, Tanska). Detection on suoritettu monoklonaalisella hiiren APAAP kompleksi (Dako, Glostrup, Tanska) ja BCIP /NBT kromogeenisubstraattia mukaan valmistajan protokollan (BioRad, Hercules, CA, USA).

Patient näytteitä

Patient aines saatiin University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Saksa. Arkistointi luuytimen näytteitä cytospins käytettiin. Potilailla, joiden edellyttäen verinäytettä, kirjallinen suostumus on saatu. Nämä näytteet saatiin potilailta, joille suoritetaan ruumiinavaus ja joiden perheenjäsenet oli antanut kirjallisen suostumuksen ottaa luuytimen näytteitä tutkimustarkoituksiin. Tämä menettely on hyväksynyt paikallisen eettisen komitean. Potilailla, joiden edellyttäen verinäytettä, kirjallinen suostumus on saatu.

rikastustoimenpidettä veren välityksellä syöpäsolujen ja DTC

Luuydinnäytteet ja ääreisverenkierron näytteet on käsitelty jonka Ficoll- tiheysgradientti rikastuttaa mononukleaarisissa soluissa ja mahdollisesti epiteelikasvainsolut kuten aiemmin on kuvattu [12]. Pian, luuytimen näytteet saatiin ylemmän suoliluun harjusta punktiomenetelmällä ja tallennetaan hepariini-käsitelty putket. Mononukleaariset solut, mukaan lukien kasvainsolut erotettiin Ficoll-Hypaque tiheys-gradienttisentrifugoinnilla, jonka tiheys on 1,077 g /ml. 7 x 10

5-solut Cytospin lasilevyille, kuivattiin huoneen lämpötilassa ja varastoitiin -80 ° C: ssa.

siirto yksittäisten solujen

1. Silanoimalla lasi tikkuja.

lasi sauvat, joiden halkaisija on 1,9-2,3 mm, huuhdottiin yhden tunnin ajan 85 ° C: ssa liuokseen, jossa oli 10% neodisher Laboclean FT (Dr. Weigert, Hampuri, Saksa). HPLC-puhdasta vettä käytettiin kaikkiin laimennus- ja pesuvaiheet. Kuivatuksen jälkeen sauvat olivat huojuivat H

2SO

4 (98%, Merck, Darmstadt, Saksa) yhden tunnin ajan huoneenlämmössä ja huuhdeltiin vedessä. Sauvat annettiin kuivua 15 minuutin ajan 110 ° C: ssa ja sen jälkeen huojuivat 0,5% oktadekyylitrikloorisilaani oktaaniluvun osa (Fluka, Erlangen, Saksa) kaksi tuntia. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 96% etanolia yhden tunnin ajan, tähteet etanolia ja silaanin poistettiin huuhtelemalla vedellä perusteellisesti ja voimakkaasti. Sticks voidaan varastoida kuivassa ja pimeässä jopa kahdeksan viikon ajan.

2. Lyysipuskuria.

lyysipuskuria koostuu 0,25% N-lauroyylisarkosiini, 2 M guanidiinitiosyanaattia, 0,01 M natriumsitraatti, pH 7,0, ja 1% dimetyylisulfoksidia HPLC-puhdasta vettä. Puskuri steriloitiin suodattamalla 0,2 um: n PES suodattimen (VWR, Darmstadt, Saksa) ja säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti.

3. Stick valmistamiseksi.

Ennen käyttöä, DTT lisättiin lyysipuskuria lopulliseen pitoisuuteen 60 mM. Täydellinen lyysipuskuria laimennettiin 1:10 HPLC-puhdasta vettä. Toiseen päähän kunkin lasin kiinni, 0,2 ui täydellistä lyysipuskuria levitettiin ja annettiin kuivua huoneen lämpötilassa, kunnes täydellinen kuiviin. Loput suolat muodostavat nyt niin kutsutun Lysospot ”.

4. Yhden solun poiminta.

Tämän jälkeen solut kerättiin käyttämällä mikromanipulaattoria: Tällä mikroinjektori Celltram Vario ja mikromanipulaattorin TransferMan NKII (Eppendorf Instruments, Hampuri, Saksa) on varustettu mittatilaustyönä, joustava kapillaarinen customTip tyyppi III, jonka sisähalkaisija on 40 um ja viistetty pää (45 °), joka on kehitetty tiiviissä yhteistyössä Eppendorf Instruments. Solut siirrettiin lasilevyllä alla visuaalinen valvonta ydin- loisteputki DAPI-värjäystä, jotta koko tumat kiinni. Alenemisen estämiseksi materiaalin siirron aikana ja solujen hajoamista, solut sijoitetaan suoraan ulos hiussuonen silaanilla pinnoitettu lasi keppi kuljettavat Lysospot. Koska silaani pinnoite, DNA: ta sitova lasin estyy. Lisäksi suolat Lysospot konsentroidaan hyvin pienellä alueella, koska muutokset pintajännityksen vuoksi päällysteen. Täydellinen Lysospot aktivoituu, jonka resoluutio johtuu vesipitoiseen ympäröivään siirron aikana on manipuloitu solu. Solun sisältävää lasia stick siirrettiin 200 ui PCR-reaktio putkeen, joka sisälsi 9 ui näytepuskuria ja Genomiphi V2 vahvistus kit (GE Healthcare Europe, Freiburg, Saksa) ja siirrettiin -80 ° C: ssa 15 minuuttia. Sulattamisen jälkeen, 0,1 pl proteaasin liuos (Qiagen, Hilden, Saksa) lisättiin, jota seurasi inkubaatio vaihe 15 minuuttia 50 ° C: ssa proteiinin ruuansulatuksen ja lisäksi inkubaatiovaiheen, 15 minuuttia 75 ° C: ssa entsyymin deaktivoitumisen.

Whole Genome Amplification

Koko genomin monistus suoritettiin Genomiphi V2 kit (GE Healthcare Europe, Freiburg, Saksa) mukaan valmistajan protokollan seuraavin muutoksin: lasi keppi jää reaktioputken monistuksen aikana. Monistusreaktio annettiin jatkua 150 minuuttia 30 ° C: ssa kokonaistilavuudessa 20 ui. WGA Tuote puhdistettiin kanssa NucleoSEQ spin pylväät (Macherey- Nagel, Düren, Saksa) ja DNA pitoisuudet mitattiin Nanodrop1000 (Peqlab, Erlangen, Saksa).

mikrosatelliittimerkkien Detection

alleelin tilan polymorfisen toistojen tutkittiin PCR-monistuksella, jota seuraa erotus on joko 2% agaroosigeelillä tai kapillaarielektroforeesilla. Reaktiot suoritettiin kokonaistilavuudessa 10 ui olosuhteissa alla (taulukko S1) on Mastercycler gradientilla (Eppendorf Instruments, Hampuri, Saksa). Hehkutus lämpötila oli sovitettu mukaan käytetyt alukkeet on esitetty taulukossa S2. Erottaminen suoritettiin käyttäen neljän värin laser aiheuttama fluoresenssi kapillaarielektroforeesijärjestelmässä (AbiPrism 3130; Applied Biosystems, Wilmington, GE, USA) käyttäen GeneScan Standard ROX-500 fragmentti pituus arviointia. Arviointi tehtiin käyttämällä Genemapper versiota 2.03 ohjelmistokokeilusta (Applied Biosystems, Wilmington, DE, USA).

Fine Laatoitus Array Analysis

Sakko laatoitus array on suunnitellut Nimblegen (Roche NimbleGen Inc. , Madison, WI), kuten aiemmin on kuvattu [22] mukaan meidän mukautettuja parametreja (taulukko S6). Emäkset, jotka ovat osa toistuvia elementtejä on poistettu harkitaan sondirakenne. Lisäksi valitut koettimet eivät saa sisältää epäselvä nukleotidin koodeja. Muita kriteereitä: Hehkutus lämpötilassa 76 ° C, koettimen pituus 50-75 emäsparia, koetin annettiin vasta vastaamaan kerran koko genomin mukaan ihmisen genomin kokoonpano maaliskuuta 2006 (hg18), http: //genome.ucsc. edu (taulukko S6), ja koettimet mieluiten alkoi offset 15 bp. Näiden tiedot, noin 395.000 koettimia voidaan täpliksi yhden ryhmän. Rajojen amplikonien eri MDA-MB-468 solujen kloonit laskettiin tasoitusfunktion ja Quantsmooth algoritmin [12] ja validoitu sen jälkeen kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä. Tätä varten kokonaismäärä 53 SYBR green määritykset suunniteltiin reunustavat laskettua alku- ja päätepisteet jakavat samat määritelmät. Kokeet suunniteltiin monistamaan yksikössä geenisekvenssejä 50-150 emäsparin pituus varmistaa erityisiä kvantifiointiin. Kromosomi 2 ja kromosomin 10 käytettiin vakaata viittaus alueiden mukaan Naylor

et al.

[11]. Tarvittaessa lasketaan alku- ja päätepisteet korjattiin perustuu array CGH juoni ja qPCR tuloksia.

kvantitatiivinen RT-PCR

Kun määritellään, kuinka keskimääräinen geenin kopioluku

EGFR

tehtiin käyttämällä spesifisiä alukkeita kohdistamista yksikössä sarjoissa 50-150 bps sisällä eri eksonit

EGFR

geeni taulukon S3. PCR-reaktiot suoritettiin Mastercycler epgradientS Realplex4 olosuhteissa taulukossa S4in kokonaistilavuudessa 15 ui. Jokainen näyte mitattiin kolmena kappaleena. Erillinen kalibrointikäyrä muodostettiin kunkin kuin sanoa kussakin ajo käyttäen valkosolujen DNA samasta potilaasta vaihtelee 10-0,15 ng per reaktio. DNA pitoisuudet normalisoitiin viitaten jatkuva kopioluvun viite LINE1 [13]. Melting analyysit suoritettiin jokaisen ajon tarkistaa yksikössä tuotteen vahvistusta.

EGFR

geenikopiomäärä numeroa on määritetty laskemalla suhde DNA summa

EGFR

alue jaettuna DNA summa viite alueella. Normaali, diploid geenikopiomäärä on ihanteellisella heijastuu 1 (2n /2n), kolme kopiota

EGFR

geeni olisi odotettavissa noin 1,5 (3n /2n). Laskea cut-off kutsumiseen näytteen saanut, 95% luotettavuusrajat viitearvojen käytettiin (). Kaikki mittaukset ylärajan yläpuolelle oli pidetty

EGFR

geenikopiomäärä vahvistusta.

tukeminen Information

Taulukko S1.

PCR protokollan microsatellite PCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0026362.s001

(PDF) B Taulukko S2.

Yleiskatsaus sekvenssit mikrosatelliittimerkki alukkeita.

doi: 10,1371 /journal.pone.0026362.s002

(PDF) B Taulukko S3.

PCR paria varten qPCR on

EGFR

geeni.

doi: 10,1371 /journal.pone.0026362.s003

(PDF) B Taulukko S4.

PCR protokolla

EGFR

-qPCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0026362.s004

(PDF) B Taulukko S5.

PCR paria kromosomissa 7.

doi: 10,1371 /journal.pone.0026362.s005

(PDF) B Taulukko S6.

jatkumot array suunnittelu.

doi: 10,1371 /journal.pone.0026362.s006

(PDF) B

Kiitokset

Kiitämme A. Bauche ja O. Mauermann erinomaisen teknistä tukea.