Krooninen sairaus

tiivistelmä

Berberin, uutettu Kiinan kasviperäisten lääkeaineiden coptis chinensis, on havaittu olevan anti -tumor toimintaa. Kuitenkin taustalla mekanismeja ei ole täysin selvitetty. Nykyinen tutkimus osoitti, että berberin esti

in vitro

ja

in vivo

kasvu, muuttoliike /hyökkäystä CRC solujen kautta vaimentaen ekspressiotasot COX-2 /PGE

2, seuraavat vähentämällä fosforylaatio JAK2 ja STAT3, sekä MMP-2 /-9 ilmentymisen. Olemme edelleen selkeyttää, että lisäys COX-2 /PGE

2 lauseke kompensoida tukahduttava aktiivisuus Berberin on JAK2 /STAT3 signalointi ja JAK2 estäjä AZD1480 tukossa vaikutus COX-2 /PGE

2 MMP- 2 /-9 ilme. Yhteenvetona Berberin esti CRC invaasiota ja etäpesäkkeiden kautta alas-säätely COX-2 /PGE

2- JAK2 /STST3 signalointireitin.

Citation: Liu X, Ji Q, Ye N, Sui H, Zhou L, Zhu H, et al. (2015) Berberiini Estää Invasion ja metastaasin peräsuolen syövän solujen kautta COX-2 /PGE

2: n välittämien JAK2 /STST3 signalointireitin. PLoS ONE 10 (5): e0123478. doi: 10,1371 /journal.pone.0123478

Academic Editor: Chih-Xin Tang, Kiina Medical University, Taiwan

vastaanotettu: 10 joulukuu 2014; Hyväksytty: 18 helmikuu 2015; Julkaistu: 08 toukokuu 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Natural Science Foundation of China (81303103, 81473478, 81303102), Science and Technology komission Shanghai kunta (13ZR1461000, 14140901402) ja Program Shanghai Municipal Education komissio (13CG47, 13YZ045). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä ihmisen maligniteettien, sijoitus kolmas syövän esiintyvyys maailmassa [1]. Tällä hetkellä leikkaus on ensisijainen valinta hoitoon CRC, mutta leikkauksen jälkeinen tuumorietäpesäke pysyy korkeana, tuloksena hyökkäyksen ja migraation CRC solujen kasvain ympäröiviin kudoksiin ja distaalinen elinten [2-3]. Näin ollen estää CRC solun etäpesäke on tärkeä strategia syövän hoidossa.

Berberin, eristetty alkaloidi perinteisen kiinalaisen lääketieteen Coptischinensis, on anti-inflammary, anti-infektiiviset vaikutuksia ja sitä on käytetty diabeteksen hoitoon ja verenpainetauti [4-6]. Viimeksi berberin havaittiin olevan anti-kasvain aktiivisuus, kautta vaikuttaa MMP-2 /-9 ilmaisun [7-8], mutta taustalla molekyylimekanismi on edelleen vaikeasti.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että yli- ilmentyminen COX-2 korreloi CRC tumorigeneesin, ei ainoastaan ​​se edistää kasvainsoluproliferaation ja estävät apoptoosin, mutta myös parantaa kasvaimen angiogeneesi, kasvainten solujen kiinnittymistä sekä muuttoliike /invaasiota [9]. Prostaglandiini E2 (PGE

2), tärkein katalysoivat tuote COX-2 arakidonihaposta, on keskeinen rooli CRC kasvainten synnyssä [10]. JAK2 /STAT3-signalointireitin on jatkuvasti aktivoitu CRC, ajan säätelemällä ekspressiotasot loppupään geenejä, kuten MMP-2 /-9 mikä lisää syöpäsolujen muuttoliike /invaasion ja tuumorietäpesäke [11-12]. Vaikka kerätyn näytön eturauhasen, keuhkosyövässä ja kolangiokarsinooma todistettava läheinen yhteydestä aktivoitu COX-2 /PGE

2 ja JAK2 /STAT3 signalointipolkujen [13-15], kuten korrelaatio ja sen merkitys CRC vielä selvittämättä . Nykyinen tutkimuksessa tutkittiin mekanismia estävää vaikutusta berberin CRC invaasio ja etäpesäkkeiden, ja paljasti merkittävän roolin JAK2 /STAT3 ja COX-2 /PGE

2 signalointi näissä prosesseissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

paksu- ja peräsuolisyövän SW620 ja LoVo solut hankittiin ATCC (Manassas, VA, USA). SW620-soluja viljeltiin L-15 väliaineessa ja LoVo-solujen F12K väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia, 100 ug /ml streptomysiiniä, 100 U /ml penisilliiniä, 37 ° C: ssa, 5% CO

2, ja korkean kosteus. Berberiini ostettiin Aldrich-Sigma (St. Louis, MO, USA), ADZ1480, joka on JAK2 estäjä, mistä Selleck (Houston, TX, USA). Sillä

in vitro

tutkimuksissa, berberine liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) ja jäädytettiin erinä -80 ° C: ssa. Sillä

in vivo

kokeissa berberine suspendoitiin veteen, johon on lisätty 0,5% natriumkarboksimetyyliselluloosa (CMC-Na) ja varastoitiin 4 ° C: ssa. Lisäksi, DMSO ja CMC-Na käytettiin ajoneuvon ohjaus meidän koko tutkimuksen. Vastaiset vasta-COX-2, s-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, MMP-2, MMP-9, β-aktiini ja HRP-vuohen anti-kani-IgG, HRP-vuohen anti-hiiri-IgG hankittiin Cell Signaling (Beverly, MA, USA).

Kliiniset tapaukset

Human kolorektaalisyöpää näytteiden ja vastaavan ei-kasvainten paksusuolikudos kerättiin aikaan kirurgisen resektion at Shuguang sairaala, Shanghai University perinteisen kiinalaisen lääketieteen. Kaikki tutkimukset, joissa ihmisen osallistujat ovat hyväksyneet eettisen komitean Shuguang sairaala, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, ja kaikki kliiniset tutkimukset on tehty periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Kaikki potilaat tarjotaan ”kirjallinen lupa” osallistua tähän tutkimukseen.

Solun luelinkykymäärityksillä

Ihmisen CRC soluja (5 x 10

3) ympättiin 96-kuoppalevylle 100 ui elatusaineet, kiinnityksen jälkeen, käsiteltiin berberin annoksilla 0, 5, 10, 20, 40 ja 80 uM. 24, 48, 72 tuntia käsittelyn jälkeen, solujen elävyys mitattiin käyttäen CCK-8 kit (Kumamoto, Japani) valmistajan ohjeita. Lyhyesti, CCK-8-reagenssia lisättiin päälle soluihin ja inkuboitiin 4 tunnin ajan, absorbanssi (OD) kvantitoitiin 490 nm: ssä viitaten aallonpituudella 630 nm. Solujen elävyys = (ODN-OD

0) /(ODC-OD

0) x 100%, OD

0: tyhjä, ODC, käsittelemätön kontrolli ODN, berberin käsitelty.

ksenografti hiirimallissa

Male BALB /C nude-hiirissä, ikä 4-6 kuukautta, punnitaan 18 ± 2 g, ostettiin SLAC Lab Animal Co., Ltd (Shanghai, Kiina lisenssinro. SCXK 2012-0002) suhteellisessa kosteudessa ja pidetään patogeenivapaissa olosuhteet tutkimuksiin. Kaikki eläin työ on suoritettu mukaisesti Institutional Animal käytön ja hoidon komitean Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, ja kaikki tutkimukseen hyväksyttiin Shanghai Medical Experimental Animal Care komission ja noudattaen Provision ja yleisen suosituksen Kiinan Experimental Animals Administration lainsäädäntö. Kuten aiemmin on kuvattu [16], CRC-soluja (1 x 10

6, 0,2 ml: ssa PBS: ssä) injektoitiin subkutaanisti kylkiin nude-hiirten aloittaa kasvaimen kasvua. Kun kasvaimet saavuttavat keskimääräinen koko oli 100 mm

3, hiiret jaettiin satunnaisesti 5 ryhmään (6 hiirtä ryhmää kohti): ryhmä 1 hiiret: kontrolli (CMC-Na); ryhmien 2, 3, 4: suun kautta letkulla berberin, 50, 100, 200 mg /kg /vrk, vastaavasti; ryhmä 5: intraperitoneaalisesti 5-FU, 50 mg /kg /2d. Elin eläinten painon ja kaksi kohtisuorassa halkaisijat (a ja b) rekisteröitiin 2 päivän välein ja kasvaimen tilavuus (TV) arvioitiin: TV = ab

2/2. Hiiret tapettiin 4 viikkoa hoidon ja tuumorit leikattiin irti ja punnittiin. Tuumorin esto laskettiin: (1-kasvaimen keskimääräinen paino käsiteltyjen hiirten /keskimääräinen kasvaimen paino verrokkihiirten) x 100%. Samaan aikaan, veri kerättiin analyysiä varten alaniinitransaminaasin (ALT), aspartaattiaminotransferaasi (ASAT), kreatiniinin (CT), ureatyppi (YK) käyttäen ELISA-pakkausta (Bogoo, Shanghai, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden.

CRC keuhkometastaasitestissä hiirimallissa

Kokeellinen keuhkometastaaseja CRC indusoitiin injektiota yhden solususpensio CRC-soluja (1 x 10

6 0,2 ml: ssa PBS: ää) lateraaliseen häntälaskimoon nude hiiret, jotka satunnaistettiin 5 hoitoryhmään, kuten on kuvattu ksenografti-tutkimukset [17]. Hiiret tapettiin 4 viikon hoidon jälkeen, elimet keuhkojen irrotettiin, vahvistetaan formaliinilla ja parafiiniin upotettuja tarkempaa analysointia.

Histologia ja immunohistokemia (IHC) B

elimet ja kasvain oli poistetaan, kiinnitetään formaliinilla, upotettu parafiiniin ja leikattiin [18]. IHC COX-2 ja p-STAT3 suoritettiin 5 um: n osia käytetään vasta-aineita, Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Kuvat analysoitiin ja ilmaistava määrällisesti kokonaisarvo optinen tiheys (IOD) varten IHC positiivisuus Image Pro-plus 6.0 ohjelmisto.

Solun maahanmuutto- ja invaasion määritykset

24 kuopan transwell levylle (8 mm huokoskoko, Corning, NY, USA) käytettiin mittaamaan kunkin solulinjan n muuttavien ja invasiivisia kyky, kuten aiemmin on kuvattu [19]. CRC solut käsiteltiin berberin 48 tuntia ennen trypsinoitiin ja ympättiin ylempään transwell kammio (2,5 x 10

4) 1% FBS elatusaineet, alemman kammion, joka sisältää 600 ui mediaa 15% FBS ja 10 ug /ml fibronektiiniä. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin siirtyi solut kiinnitettiin 95% alkoholia, värjättiin kristalliviolettivärjäys- värjäys, analysoitiin mikroskooppi (Ti-E, Nikon, Tokio, Japani). Sillä invaasiomääritys, 100 ui laimennettua matrigeeliä (100 ug /ml, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) oli aluksi lisättiin asti pohja transwell kammion, seuraava menettely oli sama kuin muuttoliike analyysi, paitsi invasiivisia solut analysoidaan sen jälkeen, kun 48 tuntia.

Western blot-analyysi

Solulyysis, proteiini uuttamalla ja Western blotting-analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [20]. Proteiininäytteet (20 ug) altistettiin 10% natriumdodekyylisulfaattia-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, siirrettiin polyvinylidenedifluoride kalvo. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitojauhetta-puskuria (10 mmol /l Tris, pH 7,5, 100 mmol /l NaCl: a, 0,1% Tween 20), ennen kuin inkuboitiin ensisijaisen ja myöhemmin, sekundaarisia vasta-aineita, ja auto valokuvataan. Tiedot on saatu Western blot kokeissa analysoitiin Bio-Rad Määrä One 1D Analyysiohjelmisto (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Luciferase Reporter Assay

Käyttämällä perustettu protokolla [ ,,,0],21], pGL3-Basic-COX-2 promoottorin ja kontrollivektorille PRL-SV40 transfektoitiin CRC soluihin. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion, erilaisten annosten berberin lisättiin solujen pinnalle vielä 48 tuntia. Sitten mittaukset tulikärpäsen ja

Renilla

lusiferaasiaktiivisuudet solulysaateista suoritettiin käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, USA). Tulokset esitettiin suhteena tulikärpäsen lusiferaasin aktiivisuuden

Renilla

lusiferaasiaktiivisuuden kunkin näytteen suoritettiin kolminkertaisesti ± SD.

ELISA

Kun hoidetaan erilaisilla pitoisuuksilla berberin 48 tuntia, CRC-solut uudelleen ympättiin 24-kuoppalevyille (5 x 10

4 0,5 ml: ssa viljelyalustaa). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin väliaine kerättiin, sentrifugoitiin (3000 rpm, 10 min), ja mitattiin PGE

2-pitoisuuden ELISA-kittiä (Bogoo, Shanghai, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden.

yli-ilmentyminen ja pudotus COX-2-geenin

CRC-solut transfektoitiin pIRES2-COX-2 tai kontrollivektorilla pIRES2 käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) sen jälkeen, kun valmistajan ohjeiden ja stabiilisti yli-ilmentävät COX-2 tai kontrollivektori solut valittiin neomysiinin kanssa (G418, 1 mg /ml). Sillä shRNA välittämä geenin pudotus, CRC-solut Lipofectamine 2000 transfektoitiin Pfu-GW-RNAi-plasmideja, jotka sisältävät COX-2-spesifisiä siRNA sekvenssit: 1: 5-GCTGAATTTAACACCCTCTAT-3, 2: 5-GCAGATGAAATACCAGTCTTT-3, tai hajotus- sekvenssi: 5-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3, ja transfektoidut solut valittiin neomysiinin. Tehokkuus geenin Knockdown määritettiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR ja western blot.

RNA ja reaaliaikainen kvantitatiivinen analyysi

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol (Takara Bio Inc., Dalian, Kiina) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen PrimeScriptTM RT-PCR: llä (Takara Bio Inc., Dalian, Kiina). Seuraavia alukkeita sekvenssit PCR-monistamiseen käytetyllä: Ihmisen COX-2-eteenpäin: 5′-GAATCATTCACCAGGCAAATTG-3 ’, ja reverse: 5′-TCTGTACTGCGGGTGGAACA-3′; TaqMan-koetin 5’-FAM-TGGCAGGGTTGCTGGTGGTAG GA-3-TAMRA -3 ’(Shine Gene, Shanghai, Kiina); GAPDH eteenpäin: 5’-CCACTCCTCCACCTTTGA C-3 ’, ja reverse: 5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′; TaqMan koetin: 5’-FAM-TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-3 ’(Shine Gene, Shanghai, Kiina). Reaaliaikainen PCR suoritettiin Applied Biosystems 7300 Järjestelmä käyttämällä Premix Ex Taq (Takara Bio Inc., Dalian, Kiina).

Tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit valmistuivat SPSS (versio 18) ohjelmistot, tiedot esitettiin tarkoittaa sekä keskihajonta (SD), ja tilastollinen vertailu suoritettiin käyttäen Studentin t-testiä, yksisuuntaista ANOVA, Mann-Whitneyn testi, tai Kruskal-Wallisin testiä.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

tulos

1.Berberin esti solujen kasvuun ja muuttoliike /invaasion CRC in vitro ja in vivo

testattiin ensin estävää vaikutusta berberin vakiintunutta ksenograftikasvaimissa ihmisen CRC solulinjojen SW260 ja LoVo hiirillä. Kuten on esitetty kuviossa 1A ja 1B, berberin indusoi kasvaimen esto on 25,83% ja 30,66% vuonna SW620 ja LoVo kasvaimia, vastaavasti. Lisäksi hiiret, joita käsiteltiin berberin ei voinut muuttaa painon ja maksan ja munuaisten toimintoja pysyi normaalina (S1 kuvio ja S1 taulukko), mikä viittaa siihen, ei yhdisteen myrkyllisyys on testattu pitoisuus. Seuraavaksi me osoittaneet, että berberin tukahdutettu

in vitro

solujen kasvua näiden kahden CRC-solulinjoissa, jossa IC50 54,41 uM SW620 ja 78,66 uM LoVo, 48 h käsittelyn jälkeen (kuvio 1 C). Me ilmoitti lisäksi berberin laski keuhkojen etäpesäkkeiden CRC solujen häntälaskimoinjektio aiheuttama hiirimallissa, vuonna lääkeannoksen riippuvalla tavalla (kuvio 1 D).

In vitro

transwell tutkimukset vahvistivat, että berberin, huumeiden pitoisuuksina 10, 20 ja 40 uM, voidaan tehokkaasti vaarantaa kykyä CRC solujen siirtyä ja hyökätä (kuvio 1 E).

. Berberin estää CRC ksenograftin kasvaimen kasvua. Implantoidaan ihon alle kasvaimien CRC SW620 ja LoVo käsiteltiin kontrolli, 5-FU, ja 3 annokset berberin varten 28 päivää. Tuumoritilavuudet eri ryhmien hiiret merkittiin muistiin ja esitetty. B. ksenograftikasvaimissa leikattiin irti hiiristä hoitaa lääkkeillä ja kesto ilmoitetaan A. C. Berberin pienenee CRC solujen elinkelpoisuuden

in vitro

. SW620 ja LoVo-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksina ja berberin 24, 48 ja 72 tuntia. Keskiarvon ± SE 5 rinnakkaista näytettiin. D. Berberin pienenee CRC keuhkosyövän etäpesäke hiirillä. Hiirillä SW620 ja LoVo keuhkosyövässä etäpesäkkeitä hoidettiin osoitetun muuttujan berberin annoksia. Ylempi paneeli: edustaja HE värjätyt leikkeet hiiren keuhkon kanssa CRC solun etäpesäke pesäkkeitä. Alempi paneeli: lukumäärät CRC keuhkometastaasitestissä pesäkkeitä ohjaus ja berberin käsiteltyihin hiiriin. E. Berberin estää maahanmuutto- ja invaasion CRC soluja. Solujen migraation ja invaasiomääritys tulokset CRC solulinjojen SW620 ja LoVo, käsiteltiin berberin tai ohjaus. Esitetyt tulokset edustavat kolmea riippumatonta koetta. Pylväät ja virhepalkit edustavat keskiarvo ± SE, ja

P

-arvo laskettiin riippumaton

t

-testi. **

P

0,01, ohjaus vs. käsitelty;

##

P

0,01, ohjaus vs. käsitelty.

2.Berberin alassäädetty ilmentymisen tasojen COX-2 ja PGE2 CRC soluissa

tutkimme seuraavaksi taustalla olevien mekanismien esto CRC solumigraation /invaasiota berberin. Aloitimme löytää että SW620 ja LoVo solujen ekspressiotasot COX-2 ja PGE

2 voitiin vähentää berberin huume annosriippuvaisesti (kuvio 2A, 2B ja 2D). Nämä tiedot vahvistivat COX-2-promoottori lusiferaasireportteri- määrityksessä, mikä osoittaa, että aktiivisuus COX-2-promoottori tukahdutettu berberin (kuvio 2C). Tukemaan hypoteesia, teimme COX-2 yli-ilmentyminen ja poistokokeita, osoittaa, että kohonneet COX-2-proteiinin up-rasti muuttavien /invasiivisia kyky CRC solujen taas COX-2-geenin pudotuspelit mukaan shRNA konstrukti saavuttaneet päinvastainen vaikutus (kuvio 2E). Lisäksi lisäämällä PGE

2, loppupään katalysoivat tuote COX-2, myös lisänneet astetta muuttoliikkeen ja hyökkäyksen CRC soluissa (kuvio 2F).

. ja B. Ote SW620 ja LoVo-soluja käsiteltiin berberin on ilmoitettuina pitoisuuksina 48 tuntia analysoitiin COX-2. C. SW620 ja LoVo-solut transfektoitiin COX-2-reportteri-konstrukti ja TK-

Renilla

rakentaa (transfektioon /kuormituksen valvonta) 24 tunnin ajan, käsitellään osoitetun annoksilla berberin vielä 48 tuntia, ja hajotettiin ja niille Firefly ja

Renilla

lusiferaasiaktiivisuus mittauksia. Palkit osoittavat kertainen induktio yli no-hoidon ohjaus (keskiarvo ± SE). D. tasot PGE

2 SW620 ja LoVo soluja käsiteltiin osoitetulla annoksia berberin 48 h mitattiin ELISA: lla (keskiarvo ± SE). CRC solumigraation ja invaasiota vaikuttavat: E. Yli-ilmentyminen tai knockdovvn COX-2-geenin; F. PGE

2. Esitetyt tulokset edustavat kolmea riippumatonta koetta. Pylväät ja virhepalkit edustavat keskiarvo ± SE, ja

P

-arvo laskettiin riippumaton

t

-testi. **

P

0,01, maahanmuuton valvonnan vs käsitelty;

##

P

0,01, invaasio vertailuryhmä vs. käsitelty.

3.Berberin esti JAK /STST3 signalointi CRC soluissa

Jotta hahmottelevat mekanismi sen estävä vaikutus CRC solumigraatio /invaasio, me kuulustelivat vaikutus berberin solun signalointireitteihin. Löysimme berberin vähensi fosforylaation tasoja JAK ja STAT3 proteiinit (pJAK2 ja pSTAT3) CRC-soluissa (kuvio 3A). Vertailun käyttäen JAK2 estäjä (AZD1480), me samalla kumosi pJAK2 ja pSTAT3, jolloin kostutettu solumigraatiota /invaasion taso CRC-soluissa (kuvio 3B ja 3C).

. Otteita SW620 ja LoVo soluja käsiteltiin berberin merkityillä pitoisuuksina 48 tuntia analysoitiin pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3 ja beeta-aktiini (kuten latauskontrollina). B. JAK estäjä AZD1480 estää JAK2 /STAT3 signalointia. Otteita SW620 ja LoVo-soluja käsiteltiin AZD1480 (5 uM) analysoitiin ilmentymisen pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3 ja beeta-aktiini. C. AZD1480 estää maahanmuutto- ja invaasion CRC soluja. Esitetyt tulokset edustavat kolmea riippumatonta koetta. Pylväät ja virhepalkit edustavat keskiarvo ± SE, ja

P

-arvo laskettiin riippumaton

t

-testi. **

P

0,01, maahanmuuton valvonnan vs käsitelty;

##

P

0,01, invaasio vertailuryhmä vs. käsitelty.

4.Elevated ekspressiotasot COX-2 ja pSTAT3 korreloivat kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden primaarisissa ihmisen CRC

immunohistokemiallinen (IHC) analyysi ensisijaisen CRC näytteiden esitetty, että ekspressiotasot COX-2 ja pSTAT3 olivat merkittävästi korkeammat CRC kudoksissa verrattuna viereisen normaaleissa kudoksissa (kuvio 4A ja taulukko 1). Kuten voidaan nähdä taulukoissa 2 ja 3, oli vahva korrelaatio läsnä COX-2 tai pSTAT3 kanssa erottelua laajuudesta ja metastaasit, ja Duke pystytysympäristöä. COX-2 ja pSTAT3 positiivisuus on IHC ei korreloinut potilaan iän, sukupuolen ja kasvaimen koko. Selviytyminen oli merkitsevästi pidempi COX-2-low ilmentävien potilaista ja COX-2-ylhäiset, mutta ei yhdistyksen välillä pSTAT3 tasojen ja potilaiden elinaika (kuvio 4B).

. Esimerkkejä CRC Tuumorinäytteet värjätty COX-2 ja pSTAT3 on esitetty. B. ekspressiotasot COX-2 ja pSTAT3 eivät korreloi CRC potilaiden eloonjäämisen.

5.COX-2 /PGE2 säännellyn JAK2 /STAT3 signalointi CRC-soluissa

seuraava yli-ilmentynyt COX-2-proteiinin CRC SW620 ja LoVo-soluihin transfektion, ja on todettu, kohonneeseen pJAK2 ja pSTAT3, ja vähentynyttä ilmentymistä MMP-2, MMP-9, joka ovat kopiointia säädellään alavirtaan JAK2 /STAT3 signalointia; sen sijaan shRNA konstrukti välittämä COX-2-geenin pudotus oli päinvastainen vaikutus (kuvio 5A ja 5B). Lisäämällä PGE

2-ligandin CRC solujen merkittävästi aktivoi JAK2 /STAT3 signaloinnin ja MMP-2 /-9 (kuvio 5C ja 5D). Näiden tietojen perusteella, me arveltu, että aktivoitu COX-2 /PGE

2 akseli parannettu JAK2 /STAT3-signalointireitin, sääteli ilmaisua MMP-2 /-9, mikä lisää metastaattisen potentiaalin CRC soluja.

. ja B. Ote SW620 ja LoVo-soluja transfektoitiin COX-2-ekspression tai shRNA konstrukti analysoitiin pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP-2, MMP-9 ja beeta-aktiini. C. ja D. Otteita SW620 ja LoVo soluja käsiteltiin PGE

2 osoitti kestoja analysoitiin pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP-2, MMP-9 ja beeta-aktiini.

6.Berberin esti CRC soluinvaasiota ja etäpesäkkeiden kautta tukahduttaa COX-2 /PGE2 /JAK2 /STST3 signalointi akseli

meidän data osoittaa berberin estämällä COX-2 /PGE

2 ilmaisun ja JAK2 /STAT3 signalointi sekä COX-2 /PGE

2 säädellään JAK2 /STAT3 koulutusjakson, me arveltu, että mekanismi berberin n estävä vaikutus CRC invasiivisuus ja metastaattista potentiaalia oli sen kielteinen vaikutus signalointi akselilla COX-2 /PGE

2-JAK2 /STAT3. Testata tätä teoriaa meidän, käsittelimme CRC soluihin käyttäen JAK2 estäjä AZD1480, ja löysi MMP-2 /-9 oli ”irrotetaan” mistä COX-2 ja PGE

2, eli ei yli-ilmentyminen COX-2 eikä lisäksi ligandin PGE

2 voi lisätä proteiinin MMP-2 /-9 (kuvio 6A ja 6C). Käänteisesti, jossa AZD1480 esto JAK2 /STAT3 signalointi, berberin ollut vaikutusta MMP-2 /-9 ekspressiotasot (kuvio 6B ja 6D).

. ja B. Ote SW620-soluissa, joita käsiteltiin AZD1480 2 h, transfektoitiin COX-2-ekspressiorakenteeseen 24 h, käsiteltiin berberin (40 uM) 48 tunnin ajan, analysoitiin pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP -2, MMP-9 ja beeta-aktiini. C. ja D. otteet SW620-soluissa, joita käsiteltiin AZD1480 2 tuntia, käsiteltiin berberin (40 uM) tai PGE

2 (5 uM) 48 tunnin ajan, analysoitiin pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP- 2, MMP-9 ja beeta-aktiini.

keskustelu

invasiivisuus ja etäpesäkkeiden ominaisuudet pahanlaatuisia kasvaimia, ovat tärkeimmät syyt, miksi syövän hoitomuotoja vastaan ​​CRC epäonnistuu. Siksi löytää uusia etäpesäkkeitä kohdistamisen anti-kasvain huumeet vaikuttaa realistiselta lisäämään eloonjäämisaste CRC potilaista. Käytetään yhä enemmän klinikalla, perinteinen kiinalainen lääketiede (TCM) on osoittautunut tärkeä vaihtoehto terapeuttinen vaihtoehto CRC lisäksi kirurgian ja kemoterapia [22]. With kertynyt näyttöä siitä, että TCM on erittäin tehokas syöpien, on yhä tärkeämpää, ja tarpeen tutkia mekanismeista kasvaimen vastainen toiminta TCM ja niiden osia. Berberin, eristetty alkaloidi TCM yrtti coptis chinensis, on osoitettu olevan kasvaimen vastainen teho hoidettaessa CRC, maksa-, rinta-, eturauhas- ja keuhkosyöpä [23-27]. Meidän nykyisessä tutkimuksessa, esitimme

in vitro

ja

in vivo

tietojen rajaamista berberin inhiboivan vaikutuksen CRC solujen kasvun, muuttoliike /invaasio ja etäpesäkkeiden lisäksi selvitimme korostaa mekanismi.

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että COX-2, nopeutta rajoittava entsyymi, joka katalysoi arakidonihapon PGE

2, yli-ilmentää kasvainkudoksessa useiden maligniteettien, mukaan lukien CRC. Koska alavirtavaikuttajainhibiittorit COX-2, PGE

2 edistää kasvaimen angiogeneesiä, solujen kasvua, muuttoliike /invaasio, ja immuunijärjestelmän veronkierron. Siksi PGE

2 edelleen keskeinen tekijä kasvaimen. Epidemiologiset tutkimusten mukaan pitkäaikainen, rutiini tapahtuvassa COX-2-estäjä kuten tulehduskipulääkkeiden (Tulehduskipulääkkeet lääkkeet) voivat vähentää 50% CRC esiintyvyys [28-29]. Tuloksemme osoittivat, että berberin esti ekspressiotasot COX-2 ja PGE

2 CRC-soluissa, mukaisesti dataa Singh et al löydetty melanoomasoluissa käsiteltiin berberin [30]. Näin ollen, on berberin on yhtä tehokas kuin NSAID vähentää CRC esiintymistä? Tämä on erittäin mielenkiintoinen aihe tulevaisuuden tutkimuksiin, erityisesti mekanismi, jonka berberin teosten CRC soluissa.

JAK2 /STST3 signalointireitille on jatkuvasti aktivoitu keuhko-, rinta- syöpien ja CRC [31-32 ]. Normaaleissa fysiologista tilaa, JAK2 /STAT3-signalointireitin on tilapäisesti aktivoitu. Kasvutekijöiden ja sytokiinien sitoutuvat niiden reseptoreihin solun pinnalla aktivoida JAK2, joka puolestaan ​​fosforyloi tyrosiinitähteen 705 (Tyr705) on STAT3 proteiinin aktivoimiseksi (pSTAT3). pSTAT3 muodostaa homodimeerejä tai heterodiers, translokoituu tumaan, transaktivoi ekspressiotasot sykliini D1, VEGF: n ja MMP-2 /-9-geenit [33-36], jonka proteiinin tuotteet ovat mukana säätelyyn kasvainsolujen kasvua, apoptoosin, angiogeneesin ja etäpesäke. Se oli jo osoitettu tutkimuksissa nenänielun syöpää ja diabeteksensa että berberin estetty JAK2 /STST3 signalointi [37-38], ja meidän nykyinen data on lisätty toinen todiste väittämällä estävää vaikutusta berberin on JAK2 /STAT3 aktivointi sekä ilmaus sen alavirran kohdegeenien MMP-2 /-9 CRC – tämä luultavasti on osa biologista mekanismia berberin n antituumorivaikutus.

Koska meidän tiedot ehdotetaan, että berberin vaikutti sekä COX-2 /PGE

2 ja JAK2 /STAT3 signalointireittien, me tutki tarkemmin proteiinin tasot COX-2 ja pSTAT3 perusterveydenhuollossa CRC näytteissä, ja kuulusteltiin yhteenliittymää ja sääntelyyn sidos näiden 2 tärkeitä toimijoita. Yhdenmukainen muiden tutkijoiden havainto tiiviin aktivoitu COX-2 /PGE

2 ja JAK2 /STST3 signaalireaktioteissä eturauhas-, keuhkosyövässä ja kolangiokarsinooma [13-15], huomasimme, ihmisen CRC kudoksissa, suurempi määrä COX-2 ja pSTAT3, joka korreloi merkitsevästi keskenään, ja yleinen molemmat liittyvät korkeampi kasvaimen invasiivisuus ja etäpesäkkeiden. Seuraavaksi meidän in vitro-tutkimuksissa paljastui, että COX-2 /PGE

2 säännelty CRC solumigraation /invaasion prosessia JAK2 /STAT3 signalointi, ja yli-ilmentyminen COX-2 ja PGE

2 päinvastaiseksi estävää toimintaa berberin on JAK2 /STAT3 aktivointi ja syöpäsolun liikkuvuutta. Lisäksi olemme paljasti, että AZD1480, joka on JAK2 estäjä /STAT3 aktivaatio esto [39-40], irti COX-2 /PGE

2 ja berberin vaikuttamasta ilmentymisen MMP-2 /-9. Nämä havainnot meistä valaistu COX-2 /PGE

2-JAK2 /STAT3 signalointi cascade, että lääke tavoitteeksi berberin sovittelemaan sen vaikutus CRC invasiivisuus ja etäpesäkkeiden. Yhteenvetona, berberin vähentää COX-2 /PGE

2 tasossa, puolestaan ​​vaimentaa JAK2 /STAT3 aktivaation, mikä johtaa vähentyneeseen ekspressioon alavirran kohdegeenien MMP-2 /-9, mikä vähentää invasiivisuus ja etäpesäkkeiden CRC (kuvio 7 ). Tämä raportti meistä on tarjonnut tärkeän joukon prekliinisiä tietoja tulevaisuuden laaja käyttö berberin hoidossa CRC.

PGE2, tärkein katalysoivat tuote COX-2 arakidonihaposta, voisivat sitoutua EP reseptorin solukalvon, siten aktivoimaan JAK2, jonka jälkeen phorphorylating ja STAT3, että Tyr705-sivuston. Aktivoitu p-STAT3 muodostaa homo- tai heterodimeerejä, jotka siirtävät tumaan, sitoutuvat loppupään kohdegeenin MMP-2, MMP-9, ja nopeuttaa syövän etenemiseen. Estämällä COX-2 /PGE2 välittämä JAK2 /STAT3-signalointireitin, voisi olla yksi niistä mekanismeista estävä vaikutus berberin on hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden kolorektaalisyövässä.

tukeminen Information

S1 Kuva. Berberin estää CRC solujen kasvua ja etäpesäkkeitä.

Hiirten kehon painon, ohjaus

vs

berberin ryhmä. Hoito berberin on vain vähän vaikutusta hiiren kehon painosta. Merkittävää eroa käsiteltyjen eläinten berberin annoksena 200 mg /kg per päivä ja kontrollieläimiin. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD. B. Edustavia maksa näytteitä ohjaus ja berberin hiiriä käsiteltiin ja värjäyksen HE. Esitetyt tulokset edustavat kolmea riippumatonta koetta.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0123478.s001

(TIF)

S1 Taulukko. Vaikutus berberin maksan ja munuaisten toimintoja (keskiarvo ± SD).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0123478.s002

(DOC) B