Krooninen sairaus

tiivistelmä

phyllanthus watsonii

Ilmava Shaw on endeeminen kasvi löytyy Malakka. Vaikka on olemassa lukuisia raportteja anti syövän ominaisuuksia muiden

phyllanthus

lajeja, julkaistu tietoja sytotoksisuutta

P. watsonii

ovat hyvin rajalliset. Tämä tutkimus toteutettiin biotestin-ohjattu fraktiointi lähestymistapa arvioida sytotoksisuuden ja apoptoosin induktio kykyä

P. watsonii

tiivisteet ja jakeet ihmisten gynekologiset (SKOV-3 ja Ca Ski) ja paksusuolen (HT-29) syöpäsoluja.

P. watsonii

uutteet osoitti vahvaa sytotoksisuutta kaikissa syöpäsoluissa tutkittu IC

50-arvot ≤ 20,0 mikrog /ml. Heksaaniuutetta on

P. watsonii

edelleen altistettiin biotestin-ohjattu fraktiointi ja tuotti 10 jakeet (PW-1 → PW-10). PW-4 → PW-8 kuvataan vahvempia sytotoksinen aktiivisuus ja se alistetaan edelleen biotestin-ohjattu fraktiointi ja johti 8 sub-jakeet (PPWH-1 → PPWH-8). PPWH-7 hallussaan suurinta sytotoksisuutta (IC

50-arvot vaihtelivat +0,66-,83 ug /ml) ja oli valikoiva syöpäsoluja tutkittu. LC-MS /MS-analyysi PPWH-7 paljasti ellagiinihappo, geraanihappoa, glochidone, betuliini, phyllanthin ja sterolin glukosidi. Merkitty morfologisia muutoksia, tikkaat näköisiä DNA ja lisäys kaspaasi-3 toiminta viittaavat apoptoosia oli selvästi havaittavissa sekä ihmisen gynecologic ja paksusuolen syövän soluja käsiteltiin

P. watsonii

etenkin PPWH-7. Tutkimus osoitti myös, että

P. watsonii

uutteet pidätettiin solusyklin eri kasvuvaiheissa in SKOV-3, Ca Ski ja HT-29-soluja. Sytotoksiset ja apoptoottista potentiaali endeeminen

P. watsonii

tutkittiin ensimmäistä kertaa biokokeella-ohjattu lähestymistapaa. Nämä tulokset osoittivat, että

P. watsonii

estää selektiivisesti kasvun SKOV-3, Ca Ski ja HT-29-solujen apoptoosin kautta induktion ja solusyklin modulaatio. Siksi

P. watsonii

on potentiaalia hyödynnettävä entistä löytämisen ja uusien anti syöpälääkkeet.

Citation: Ramasamy S, Abdul Wahab N, Zainal Abidin N, Manickam S, Zakaria Z (2012) Growth Humaani naistentautien ja koolonkarsinoomasoluissa by

phyllanthus watsonii

läpi apoptoosin. PLoS ONE 7 (4): e34793. doi: 10,1371 /journal.pone.0034793

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 syyskuu 2011; Hyväksytty: 08 maaliskuu 2012; Julkaistu: 20 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Ramasamy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat jatko Research Fund (PPP) myöntää UM 524 PS130 /2008A ja UM PS307 /2010A, rahoittama Malayan yliopisto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on pitkä historia käyttö kasvien Kaakkois-Aasian maissa, joista jotkut ovat osoittautuneet omaavan mielenkiintoisia biologisia vaikutuksia, joilla on potentiaalisia terapeuttisia sovelluksia [1]. Kasvien käyttöön lääkkeenä on johtanut eristämistä ja karakterisointia farmakologisesti aktiivisia yhdisteitä [2] ja tänään on ainakin 120 erillistä kemiallisia aineita kasveista, joita pidetään tärkeinä lääkkeitä ja lääkeaineita lääketeollisuudessa [3].

Syöpä on yksi johtavista kuolinsyistä sekä kehittyneissä että kehitysmaissa ja on edelleen merkittävä kansanterveydellinen ongelma monissa osissa maailmaa [4]. Paljon työtä on tehty kehittämään erilaisia ​​lähestymistapoja uhan vähentämiseksi syövän ja vain vaatimatonta edistystä on saavutettu vähentämisessä ja kuolleisuuden tämän kauhean taudin [5]. Mukaan maailma syövän raportti julkaistiin Kansainvälisen Agency for Research Cancer, maailmanlaajuisesti oli 12,4 miljoonaa uutta syöpätapausta vuonna 2008 (6672000 miehillä ja 5.779.000 naisilla) ja 7,6 miljoonaa syöpäkuolemaa (4293000 miehillä ja 3,3 miljoonaa naisilla) [6]. Tällä hetkellä syövän hoitoon kemoterapia-aineiden, leikkaus ja säteily eivät ole olleet täysin tehokkaita yleisyys tai alhainen eloonjäämisaste useimmat syövät [7]. Etsittäessä uusia anti syövän aineet, kasvien lähteet on yksi realistinen ja lupaavia lähestymistapoja alalla syövän kemopreventiossa ja tämä johti löydettiin monia uusia anti syöpälääkkeet, kuten vinka-alkaloidit, vinblastiini ja vinkristiini, taksoli, kamptotesiinit, ja podofyllotoksiinit [8]. Lähestymistapoja on myös otettu kohti löytää anti syöpää agentit trooppisia kasveja [2] vaihtoehtoinen syövän korjaustoimenpiteitä, koska niiden alhaisen toksisuuksia ja kustannuksia [9].

Viime vuosikymmenen aikana monet tutkimukset ovat osoittaneet, että mekanismi vaikutusmekanismia monet anti syöpälääkkeet perustuu apoptoosin, ja näin avaa uuden strategian etsimään anti syöpälääkkeiden [10]. Apoptoottisen induktio on erittäin toivottava ominaisuus hoidon strategia syövän valvontaa, minkä vuoksi on tärkeää seuloa apoptoottisen indusoijia kasveista, joko raakaöljyn uutteita tai komponenttina yhdisteiden [11]. Tällaiset tutkimukset on tehtävä arvioimalla sytotoksisuus ja apoptoottinen induktio syöpäsolulinjoissa ennen koko eläinkokeet tai kliinisten tutkimusten tehtiin.

phyllanthus watsonii

Ilmava Shaw on pieni pensas kasvaa noin 1 m korkea ja kuuluu perheeseen phyllanthaceae (kuvio 1). Lajin on kapea endeeminen ja on vain tiedetään esiintyvän Pohjois Johor Etelä Pahang (kaksi valtiota Malakka) pankit Endau River [1], [12]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että tiivisteet ja yhdisteet, jotka ovat peräisin muista

Phyllanthus

laji voi tukahduttaa kasvua erilaisten syöpien, mukaan lukien kohdunkaulan [13]; maksan [14], keuhkosyöpä [15], makrofageissa [16], kohdun, mahan [17], rinta- ja paksusuolen syövän [18]. Kuitenkin, ei ollut yksityiskohtainen tutkimus tehty arvioida sytotoksisia ja apoptoottinen vaikutus

P. watsonii

ihmisen syöpäsolulinjoissa, paitsi yksi raportti osoittaa vaikutusta vesipitoisen ja metanolin uute

P. watsonii

vastaan ​​MeWo ihon melanoomasoluja ja PC-3 eturauhasen syöpäsolujen [19]. Phytochemistry tutkimukset paljasti kahden uuden tyydyttymätöntä nor-triterpeenit (26-nor-D: A-friedoolean-14-en-3-oni ja 26-nor-D: A-friedoolean-14-en-3B-oli), lupenyl palmitaatti, friedelin, epifriedelanol, glochidone, glochidonol, lupeolin, LUP-20 (29) -en-1 beta, 3 beeta-dioli, sitosterolia ja sitosterolin-beta- (D) glukosidi in

P. watsonii

[20].

Esillä oleva tutkimus tehtiin arvioimaan sytotoksisen potentiaalin metanolia, heksaani ja etyyliasetaatti uutteet

P. watsonii

ihmisen gynekologiset ja paksusuolen syövän solulinjat. MRC-5, normaali ihmisen keuhkojen fibroblastisolulinjaa käytettiin myös spesifisyyden määrittämiseksi uutteiden syöpäsoluja. MRC-5-solut ovat yleisesti käytetty kontrollina monia vastaavia tutkimuksia [21] – [23]. Biotestin-ohjattu fraktiointi suoritettiin myös sen määrittämiseksi bioaktiiviset sekundäärimetaboliitteja kanssa sytotoksisia ominaisuuksia. Tietääksemme tämä on ensimmäinen kerta, tiivisteet ja fraktioita

P. watsonii

testataan näitä solulinjoja. Lisäksi apoptoottinen prosessi liittyy sytotoksisen vaikutuksen näissä soluissa tutkittiin myös.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki tarvittavat luvat ja luvan kokoelma materiaalit olivat jotka on saatu kuvatulla kenttätutkimukset ja asianosaisen asianmukaisesti tunnustettu. Lajit (

phyllanthus watsonii

) sijaitsee Endau Rompin National Park, joka kuuluu valtion hallituksen Johor ja hallinnoi Johor kansallispuistot Corporation (JNPC), Malesia. Lajia ei vaarannu, ja elinympäristö ole uhattuna ja se ei myöskään lueteltu liitteet CITES (kansainvälistä kauppaa koskeva yleissopimus uhanalaisten lajien luonnonvaraisen eläimistön ja kasviston).

Plant Materials

lehdet

phyllanthus watsonii

kerättiin Endau Rompin National Park, Johor (Malakka) kesäkuussa 2008. autentikointi

P. watsonii

suoritettiin vuonna kasvio on Rimba Ilmu kasvitieteellinen puutarha, Institute of Biological Sciences, University of Malaya ja voucher materiaalia (Ref. No. KLU46068) tätä tutkimusta varten talletettiin samaan herbarium.

valmistaminen Otteita

P. watsonii

kuivattuja lehtiä

P. watsonii

(PW) (2 kg) jauhettiin ja uutettiin metanolilla (MeOH) (Fisher Scientific, UK) (6 L x 3 kertaa) huoneen lämpötilassa 72 tuntia ja suodatettiin Whatman nro 1 suodatinpaperia (Whatman , Englanti). MeOH Suodos kerättiin ja ylimääräinen liuotin haihdutettiin alennetussa paineessa pyöröhaihduttimella (Buchi, Sveitsi) 40 ° C: ssa kuiviin tuottaa 160,3 g tumman vihertävän MeOH uute (PW-M). Osa MeOH uute varattu määrityksessä, kun taas jäljelle jäävä osa on edelleen ravisteltiin voimakkaasti heksaanilla (Fisher Scientific, UK), kunnes tuloksena heksaani tuli melkein värittömäksi. Heksaani liukeneva liuos suodatettiin ja yhdistettiin, minkä jälkeen se väkevöitiin alennetussa paineessa kiertohaihduttimella, jolloin saatiin 6,5 g heksaaniuutetta (PW-H). Jäljellä oleva heksaani liukenematon saatettiin liuotin-liuotin-uutto seoksella, jossa oli etyyliasetaattia (EtOAc) (Fisher Scientific, UK) ja tislattua vettä (01:01, v /v) ja sen jälkeen melko voimakkaasti sekoittaen. Tämä seos sitten peräkkäin fraktioitiin käyttäen erotussuppiloon, jossa kaksi erillistä kerrosta muodostunut. Pohjakerroksen (vesikerros) heitettiin pois, kun taas EtOAc-faasi (ylin kerros) julkaistiin puhtaaseen dekantterilasiin. Tämä suodos konsentroitiin alennetussa paineessa pyöröhaihdutinta käyttäen, jolloin saatiin 9,7 g EtOAc-uute (PW-E). Kaikissa kokeissa, uutteet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) (Sigma), kuten kantaliuosta ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Ennen analysointia, lopullinen pitoisuus kustakin näytteestä valmistettiin laimentamalla kantaliuoksesta 10% DMSO. Lopullinen DMSO-konsentraatio soluviljelmässä oli 0,5%. PW-M, PW-H ja PW-E

P. watsonii

tiin edelleen suoritettiin neutraalipunan sisäänotto- testillä menetelmien mukaisesti kuvataan myöhemmin. PW-H havaittiin olevan voimakkainta sytotoksisuutta verrattuna PW-M ja PW-E ja aiheen lisätutkimuksiin.

eliökokeessa-ohjattu fraktiointi PW-H

sytotoksisesti aktiivinen osa PW -H (6,1 g), kromatografoitiin kolonnissa (4 cm id x 40 cm pituus) oli pakattu silikageelillä 60 F254, 0,25 mm: n paksuus (Merck, Darmstadt, Saksa) (160 g). Kaltevuus askel eluutio aloitettiin 100% heksaania ja polaarisuutta eluointiliuotin korotettiin vaiheittain käyttäen asetonia (Me

2CO) (Fisher Scientific, UK) ja MeOH. Eluentteja 25 ml tilavuus kerättiin numeroitu pulloihin. Erottaminen kunkin eluenttia seurattiin ennalta päällystetty ohutkerroskromatografialla (TLC) silikageelillä 60 F254 levy käyttäen n-heksaani /asetoni (20:80, v /v) kehitysliuottimena, ja TLC vyöhykkeet havaittiin sen jälkeen, kun suihkuttamista

p

-anisaldehyde reagenssin ja kuumentamalla 105 ° C: ssa 5-10 min. Saadut eluaatit yhdistettiin mukaan samankaltainen kemiallinen koostumus havaittu TLC: llä ja ylimääräinen liuotin haihdutettiin alipaineessa käyttäen kiertohaihdutinta, jolloin saatiin yhteensä 10 fraktioiden nimetty PWH-1, PWH-2, PWH-3, … …., PWH-8, PWH-9 * ja PWH-10 * (kuvio 2). Fraktiot PWH-9 * ja PWH-10 * havaittiin sisältävän silikageeliä ja lisättiin edelleen liuotettiin kloroformiin ja suodatettiin Whatman nro 1 suodatinpaperia (Whatman, Englanti) poistamiseksi silika. Fraktiot PWH-9 ja PWH-10 saatiin poistamisen jälkeen ylimääräinen liuotin haihduttamalla kuiviin 40 ° C: ssa alipaineessa pyöröhaihduttajassa. Kaikki fraktiot alistetaan edelleen neutraalipunan sisäänotto- testillä (menettelyjä kuvataan myöhemmin), ja fraktiot, PWH-4, … .., PWH-8 osoitti, kaikkein Aktiiviset jakeet sytotoksisen aktiivisuuden.

Nämä fraktiot (PWH-4, … .., PWH-8) (581,0 mg) yhdistettiin ja puhdistettiin edelleen pylväskromatografisesti silikageelillä (2,6 cm: n sisähalkaisija x 60 cm pituus) oli pakattu silikageelillä 60 F254, 0,25 mm: n paksuus (Merck, Darmstadt, Saksa) (160 g). Eluointi aloitettiin 100% heksaania ja polaarisuutta eluointiliuotin korotettiin vaiheittain käyttäen Me

2CO ja MeOH. Eluentteja 25 ml: n tilavuus kerättiin numeroitu pulloihin. Erottaminen kunkin eluenttia seurattiin ennalta päällystetty ohutkerroskromatografialla (TLC) silikageelillä 60 F254 levy käyttäen n-heksaani /asetoni (20:80, v /v), kuten kehittävä liuotin ja TLC vyöhykkeet havaittiin ruiskutuksen jälkeen, jossa

p

-anisaldehyde reagenssin ja kuumentamalla 105 ° C: ssa 5-10 min. Saadut eluaatit yhdistettiin mukaan samankaltainen kemiallinen koostumus havaittu TLC: llä ja ylimääräinen liuotin haihdutettiin alipaineessa käyttäen kiertohaihdutinta, jolloin saatiin yhteensä 8 sub-fraktiot nimettiin PPWH-1, PPWH-2, … .. , PPWH-8. Alafraktiot tehtiin neutraalipunan sisäänotto- testillä, kuten on kuvattu myöhemmin. Liuotinsysteemi profiilin ja saanto kunkin fraktiot ja osa-jakeet tulokset ovat esitetyt taulukossa 1.

Sen jälkeen, sytotoksisesti aktiivisen uutteet (PW-M, PW-H ja PW-E) ja eniten aktiivinen osa-osa (PPWH-7) valittiin ja edelleen arvioida sen apoptoottinen vaikutus kohti gynekologisia ja paksusuolen syövän solulinjat.

LCMS-MS-analyysi

aktiivisin osa-osa, PPWH-7 analysoitiin LC-MS /MS-järjestelmä varustettu 3200 QTrap massaspektrometri (Applied Biosystem, Darmstadt, Saksa) ja Shidmazu UHPLC järjestelmä. Kromatografinen erotus suoritettiin 50 mm x 2,0 mm x 5 uM Aqua C18-pylväs (Phenomenex, Torrance, CA), eluoitiin liikkuvan faasin, joka koostuu vedestä (A) ja asetonitriili (B), joka sisältää 0,2% muurahaishappoa ja 2 mM ammoniumformiaattia. Gradienttieluutio (alkaen 10% A: 90% B, 0,01 min 10,0 minuutin aikana, pidettiin 2 minuuttia, ja takaisin 10% A 0,1 min ja uudelleen tasapainotettiin 5 min) käytetään erottamaan kiinnostavia yhdisteitä ennen massaspektrianalyysillä. Massaspektrometriin analyysi suoritettiin positiivinen ioni-tilassa (

m /z

M + H

+) havaitsemiseksi sekundaariyhdisteiden. Identiteettiä yhdisteet saatiin sovittamalla niiden molekyyli-ionit (

m /z

) saatiin LC-MS /MS vertailustandardeihin jos käytettävissä ja korrelaatio aiempiin julkaistua tietoa kemiallisia aineosia

phyllanthus

[24] – [30].

Cell Culture

ihmisen solulinjat SKOV-3 (munasarjasyövän solulinja), Ca Ski (epidermaalinen karsinooma kohdunkaula solulinja), HT -29 (koolonisyöpäsolulinja) ja MRC-5 (normaali keuhko fibroblastisolulinja) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC), USA. SKOV-3-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM) (Sigma, UK), kun taas HT-29, Ca Ski ja MRC-5-soluja viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa (Sigma, UK) ja DMEM-elatusainetta (Sigma, Iso-Britannia ), vastaavasti. Kaikki alustat täydennettiin 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS) (PAA Lab., Itävalta), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (PAA Lab., Itävalta) ja soluja inkuboidaan 37 ° C: ssa 5% CO

2: ssa kosteutetussa ilmakehässä (Shel Lab., USA).

Neutral Red otto (NRU) Pitoisuus

sytotoksisuus

P. watsonii

otteita, jakeet ja osa-jakeet mitattiin Neutral Red otto (NRU) määritys, joka perustui ottoa ja myöhempää lysosomien kertyminen supravital väriaine, neutraali punainen elinkelpoiset ja loukkaantuneet soluja. Kun määritellään, kuinka väriaine uutettu soluista on osoitettu olevan lineaarinen kanssa solujen määrä, sekä suoralla solujen määrän ja proteiinin määrityksiä solupopulaation [31]. Solut siirrostettiin 96-kuoppaiselle mikro- tiitterilevy (Nunc, Tanska) pitoisuutena 30000 solua /ml ja laitettiin CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa, jotta solut kiinni ennen lisäämistä uutteiden , jakeet ja osa-alat

P. watsonii

. 3 tunnin kuluttua solut käsiteltiin tiivisteet ja jakeet

P. watsonii

kuudella eri konsentraatiolla eli 1, 10, 25, 50, 75 ja 100 ug /ml, ja inkuboitiin 72 tunnin ajan. Kuopat, jotka sisälsivät käsittelemättömiä soluja (ei ole lisätty mitään uutetta) pidettiin negatiivisena kontrollina, kun taas solut, joita käsiteltiin doksorubisiini (0,5-10 ug /ml) toimi positiivisena kontrollina. Lopussa itämisaika, elatusaine korvattiin elatusaineella, joka sisälsi 50 ug /ml Neutral Red (NR) liuosta (50 ug /ml NR elatusaineissa 24 tuntia esi-inkuboitiin pimeässä huoneenlämpötilassa ja sitten sentrifugoidaan 1500 g: ssa 10 minuuttia ennen käyttöä), ja inkuboitiin vielä 3 tuntia, jotta oton vitaaliväri osaksi lysosomeihin elinkelpoisten ja uninjured soluja. Sitten väliaine poistettiin ja solut pestiin nopeasti kanssa kalsiumkloridia-formaldehydi seos. Väriaine sisällä eläviä soluja eluoitiin solut etikkahapon, etanolin ja veden (1:50: 49) (0,2 ml). Levyjä ravisteltiin on mikro tiitteri levyravistimessa (LT BioMax 500) 30 minuutin ajan ja sitten absorbanssi tyhjä viittaus mitattiin 540 nm: ssä käyttäen mikro-levylukijaa (Emax, Molecular Devices, USA).

NR: n otto, verrannollinen elävien solujen sisällä hyvin, ilmaistiin prosentteina ottoa kontrollisoluja [(OD

ohjaus – OD

näyte) /(OD

kontrolli) x 100%] . IC

50-arvot (konsentraatio, joka tarvitaan vähentämään solujen elinkelpoisuutta 50% verrattuna kontrollisoluihin) kunkin uute ekstrapoloida kuvaajat piirrettiin käyttäen OD-arvoja. Sen tutkimiseksi, onko sytotoksinen aktiivisuus oli spesifinen syöpäsoluja, sytotoksista aktiivisuutta uutteet, fraktiot ja osa-fraktio testattiin ja selektiivisyys indeksi (SI) aktiivista uutetta määritettiin. Selektiivisyys (SI) uutteiden määritellään suhde sytotoksisuuden (IC

50-arvot) normaali keuhko fibroblasti (MRC-5) soluja syöpäsolujen (SKOV-3, Ca Ski ja HT-29). (SI = IC

50 MRC-5 solua /IC

50 syöpäsoluihin). Näytteitä, joiden SI on suurempi kuin 3 katsottiin olevan korkea selektiivisyys syöpäsoluissa [32].

Detection of Apoptosis

morfologinen arviointi apoptoottisten solujen faasikontrasti- käännettyä mikroskooppia.

solut (3 x 10

4 solua /ml) inkuboitiin 24 tunnin ajan läsnä ollessa tai ilman PW-M, PW-H ja PW-E

P. watsonii

ja osa-osa PPWH-7 konsentraatioissa 10,0 ug /ml 24-kuoppaisille kudosviljelylevyille. Lopussa itämisaika, väliaine poistettiin ja solut pestiin kerran fosfaattipuskuri- suolaliuoksella (PBS, pH 7,4) ja niitä tarkkailtiin Leica-DMI 3000B faasikontrasti- käännettyä mikroskooppia (Leica, Saksa) 200 x suurennuksilla ja valokuvataan.

morfologinen arviointi apoptoottisten solujen akridiiniorans- (AO) -ethidium bromidia (EB) kaksinkertainen värjäys.

Cell morfologisia muutoksia arvioitiin ero värjäyksellä käyttämällä DNA-interkalatoi fluoresoivia väriaineita, akridiinista oranssi (AO) ja etidiumbromidia (EB). -Soluja (3 x 10

6 solua /ml) siirrostettiin 24-kuoppaisiin kudosviljelylevyihin, käsiteltiin PW-M, PW-H, ja PW-E ja PPWH-7 pitoisuutena 10,0 ug /ml ja inkuboitiin 24 tunnin ajan. Käsittelemättömiä soluja käytettiin negatiivisena kontrollina. Inkubaation jälkeen ohjaus ja käsitellyt solut pelletoitiin ja suspendoitiin 25 ui PBS: ää, pH 7,4. Kuhunkin näytteeseen, 1 ui AO /EB-liuosta (1 osa 100 ug /ml AO PBS: ssä, 1 osa 100 ug /ml EB PBS: ssa) lisättiin ennen mikroskooppista tutkimusta. Solususpensio sijoitettiin 3-hyvin teflonpinnoitettu mikroskooppisen dioja, peitetty lasipäällyslevyn, ja havaittiin ja valokuvattiin Nikon Eclipse 80i (Nikon, NY) alla fluoresenssivalaistusta kolminkertainen suodattimet (FITC, Cy3 ja DAPI) . Kuvat analysoitiin Nikonin kuvankäsittelyohjelma, NIS-elementit (Nikon, NY).

DNA fragmentaatioanalyysillä agaroosielektroforeesilla

Soluja käsiteltiin läsnä ollessa tai poissa ollessa PW-M, PW- H, PW-E ja PPWH-7 (1,0, 10,0 ja 100,0 pg /ml) 48 tuntia, sitten ne kerättiin käyttämällä 500 ui liuottava puskuri [50 mM Tris-HCI: ää (pH 8,0), 20 mM EDTA (pH 8,0), 1,43 ml Tergitol

® liuoksen tyyppi NP-40, ja 20 ui SDS: ää 10%] 65 ° C: ssa 30 minuutin ajan jään päällä. Seuraavat vaiheet suoritettiin jäissä. 100 ui 8 M kaliumasetaattia lisättiin keskeytettiin seoksia ja inkuboitiin jäillä 1 tunti. Supernatantti saatiin sentrifugoimalla lysaatit 10000 x g 10 min (Heraeus PICO 17, Thermo Scientific, USA) ja liukoiset proteiinit uutettiin fenoli /kloroformi /isoamyylialkoholia (PCI, 25:24: 1, v /v /v) (Invitrogen Life Technologies). Lopuksi, DNA saostettiin käyttäen 2 x tilavuutta jääkylmää absoluuttista etanolia. Suorittaa DNA-fragmentaation määrityksellä, DNA-pelletti liuotettiin 20 ui TE-puskuria [10 mM Tris-HCl ja 1 mM EDTA: ta, pH 8,0] ja 1 ui RNAasi (10 ug /ml) ja 1 ui proteinaasi K: (100 ug /ml) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. DNA: n fragmentoituminen analysoitiin 1,5% agaroosigeelielektroforeesilla. DNA bändit havaittiin ja valokuvattiin käyttäen Gene Flash geeli asiakirjajärjestelmä (Syngene- Bioimaging, UK). Apoptoosin on osoitettu ulkonäkö DNA tikkaiden fragmentteja noin 180-200 bp moninkertaisesti agaroosigeelistä.

kaspaasi-3-aktiivisuusanalyysi

kaspaasi-3 määritettiin käyttämällä kaspaasi -3 /CPP32 kolorimetristä määritystä kit (BioVision, CA) valmistajan protokollan mukaisesti. Määritys perustuu valon detektori kromofori,

p

nitroanilidi (

p

NA), sen jälkeen, kun katkaisun leimatusta substraatista DEVD-

p

NA. -Soluja (2 x 10

6) pelletoitiin ja lyysattiin käsittelyn jälkeen 10 ug /ml PW-M, PW-H, ja PW-E

P. watsonii

ja osa-osa PPWH-7: ssa 48 tuntia. Kokeet suoritettiin 96-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä inkuboimalla 100 ug proteiinia solulysaattia näytettä kohti 50 ul: ssa 2 x reaktiopuskuria. Reaktion puskuri on täydennetty 10 mM DTT: tä ja substraatteja 4 mM DEVD-pNA: n lopullisessa tilavuudessa yhteensä 100 ui ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1,5 tunnin ajan. Muodostuminen

p

nitroanilidi mitattiin käyttäen ELISA mikro-levylukijalla aallonpituudella 405 nm ja kaspaasi aktiivisuudet ilmaistiin prosentteina entsyymin aktiivisuus verrattuna kontrolli (käsittelemättömät solut).

Cell Cycle Analysis virtaussytometrialla

Jos haluat vertailla vaikutuksia uutteen PW-H ja Alafraktio PPWH-7 solun syklin CycleTEST ™ PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, USA) käytettiin. Solut (1 x 10

6 solua /ml) ympättiin 6-kuoppaiselle levylle ja käsiteltiin 10 ug /ml PW-H ja sub-osa PPWH-7. 24 tunnin kuluttua inkuboinnin jälkeen solut otettiin talteen, tuodaan suspensioon, permeabilisoitiin trypsiinillä puskurilla. Ydinvoiman DNA leimattiin propidiumjodidilla (PI) väriliuos ja inkuboitiin pimeässä 2 ° ja 8 ° C: ssa 10 min. Solusyklin vaihe jakelu tuman DNA määritettiin virtaussytometrialla (Becton Dickinson FACS Calibur, USA) analysoimalla vähintään 10000 solua per näyte. Prosenttiosuus solujen G1, S ja G2 vaiheisiin analysoitiin ModFit LT ohjelmisto (Verity Software House, Topsham, ME).

TILASTOANALYYSI

Tiedot esitettiin keskiarvo ± keskihajonta. Merkittäviä eroja määritettiin käyttämällä Studentin

t

-testi, jossa *

p

0,05 tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa. Kaikki näytteet mitattiin kolmena rinnakkaisena.

Tulokset

sytotoksisuus

P. watsonii

Otteet-NRU Pitoisuus

Tässä tutkimuksessa, mahdolliset sytotoksiset vaikutukset (IC

50)

P. watsonii

poimia metanolissa (PW-M), heksaania (PW-H) ja etyyliasetaatin (PW-E) sekä fraktiot ja osa-alat PW-H tutkittiin kahdessa ihmisen gynekologiset syöpäsoluja (SKOV- 3 ja Ca Ski), yksi paksusuolen syövän soluja (HT-29) ja yksi normaaleja soluja (MRC-5) käyttämällä NRU määritystä. Perustuen US National Cancer Institute ohjeita, raakauutteena pidetään yleisesti olla

in vitro

sytotoksisen aktiivisuuden jos IC

50 arvon karsinoomasoluja, inkuboinnin jälkeen välillä 48 ja 72 tuntia, on ≤20 ug /ml, kun taas puhtaan yhdisteen IC

50-arvo on ≤4 ug /ml [33] – [34]. Sytotoksinen aktiivisuus (IC

50) ja Selektiivisyysindeksi Uutteiden fraktiot ja osa-fraktiot on koottu taulukkoon 2. Lisäksi, doksorubisiini, joka on yleisesti käytetty kemoterapeuttinen lääke akuutin leukemian, lymfoomat ja erityyppiset kiinteiden tuumorit, kuten rinta-, maksa- ja keuhkojen syövät [35], käytettiin positiivisena kontrollina kokeissa.

P. watsonii

uutteet osoittivat eniten sytotoksinen aktiivisuus kaikissa syöpäsoluissa testattu jossa kaikki osoittivat IC

50-arvot 20 ug /ml. Lupaavin ja eniten valikoiva sytotoksista aktiivisuutta havaittiin PW-H ja PW-E. IC

50 (ig /ml) ja SI arvot kanssa PW-H SKOV-3, Ca Ski ja HT-29-soluja 5,79 ± 0,29 (SI = 9,9), 6,94 ± 0,96 (SI = 8,3) ja 11,79 ± 1,61 (SI = 4,9), tässä järjestyksessä. Kun taas arvot PW-E oli 5,52 ± 0,50 (SI = 6,1), 3,58 ± 1,01 (SI = 9,4) ja 5,14 ± 0,36 (SI = 6,6), tässä järjestyksessä. PW-H valittiin Biotestin-ohjattu fraktiointi koska se osoitti vahvin sytotoksinen vaikutus syöpäsoluihin ja oli vähiten myrkyllisiä normaaleille soluille verrattuna PW-M ja PW-E. Nämä kriteerit yleensä katsota perusteeksi lisäpuhdistusta uutteen [36].

eliökokeessa-ohjattu fraktiointi-NRU Pitoisuus

Pylväskromatografia (CC) on PW-H saatiin yhteensä 10 fraktioita. Fraktiot PW-H osoitti voimakkaampaa sytotoksinen aktiivisuus ja suurempi selektiivisyys verrattuna PW-H erityisesti silloin, kun testattiin SKOV-3-soluja (taulukko 2). SKOV-3-soluissa, fraktiot PWH-4, PWH-5, PWH-6, PWH-7 ja PWH-8 osoitti IC

50-arvot 0,29 ± 0,06 (SI = 56,0), 0,18 ± 0,06 (SI = 68,1), 0,42 ± 0,12 (SI = 18,7), 0,77 ± 0,29 (SI = 10,4) ja 0,36 ± 0,12 (SI = 23,0) ug /ml, vastaavasti. IC

50-arvot saadaan, kun Ca Ski ja HT-29-soluja käsiteltiin fraktiot PWH-4 – PWH-8 olivat välillä välillä 2,77-13,19 ja 1,21-10,78 ug /ml, vastaavasti. Fraktiot PWH-4 PWH-8 saatiin keskiosa silikageelipylväässä (heksaani /Me

2CO: 40:60 /50:50), ja tämä osoittaa, että läsnä on erittäin sytotoksinen yhdisteiden olivat väli- polaarisuusvaihe. Nämä fraktiot yhdistettiin ja altistettiin toisessa vaiheessa biomäärityksen-ohjattu fraktiointi ja saatiin 8 sub-jakeet. PPWH-7 oli kaikkein sytotoksinen ja oli korkeampi selektiivisyys (SI) Cartr Ski ja HT-29-solujen IC

50 (ig /ml) ja SI arvot 0,83 ± 0,00 (SI = 12,8) ja 0,83 ± 0,10 ( SI = 12,8), vastaavasti (taulukko 2). Päinvastoin, puhdistettu osa-osa PPWH-7 osoittaa, alempi sytotoksinen ja selektiivisyys vaikutusta SKOV-3-soluja (IC

50 = 0,66 ± 0,06 ug /ml; SI = 15,5) verrattuna fraktiot PWH-4 (IC

50 = 0,29 ± 0,06 ng /ml; SI = 56,0), PWH-5 (IC

50 = 0,18 ± 0,06 ng /ml; SI = 68,1), PWH-6 (IC

50 = 0,42 ± 0,12 ug /ml; SI = 18,7) ja PWH-8 (IC

50 = 0,36 ± 0,12 ng /ml; SI = 23,0). On syytä mainita, että PPWH-7 osoittivat samanlaisia ​​sytotoksinen aktiivisuus kuin vakio syöpälääke, doksorubisiinin, jota käytettiin positiivisena kontrollina esillä olevassa tutkimuksessa. Kuitenkin doksorubisiini oli myös korkea myrkyllisyys MRC-5 normaaleissa soluissa, kun taas PPWH-7 osoitti noin 6 kertaa pienempi myrkyllisyyden MRC-5 normaalit solut.

LCMS /MS-analyysi

Sub-jae PPWH -7 analysoitiin LC-MS /MS-järjestelmä, ja ainakin 15 yhdisteet olivat läsnä PPWH-7, joka 7 yhdisteet retentioaikojen pääpiikit tunnistettiin massaspektrometrialla (taulukko 3). Eräs esimerkki LC-MS /MS-analyysi, joka osoittaa positiivista koko spektri kromatogrammissa yhden havaitun yhdisteen (ellagiinihappoa osa-osa PPWH-7) on positiivinen ioni-tilassa (EPI-tila) on esitetty kuviossa 3. Tärkein piikki, jonka retentioaika 13,99 min tunnistettiin metyyliesteri geraiinic happoa (MS

m /z

= 397), ja kalium phyllanthin (MS

m /z

= 457). Phyllanthin tunnistettiin myös natrium- phyllanthin (MS

m /z

= 441), jonka retentioaika oli 11,66 min. Toinen merkittävä huippu tunnistettiin steroli glukosidi (MS

m /z

= 718), joka on isoprenoideja klo retentioajalla 9,39 minuuttia. Kaksi triterpene eluoitiin retentioajalla 10,20 min ja 13,45 min ja tunnistettiin glochidone (MS

m /z

= 423) ja betuliiniin (MS

m /z

= 443), tässä järjestyksessä . Polyfenoliyhdistepitoisuus tunnistettu trimetyyli eetteri ellagiinihappo (MS

m /z

= 345) eluoitiin retentioaika 7,77 min (kuva 4).

Peak numerot viittaavat taulukossa 3.

morfologinen arviointi apoptoottisten solujen by Phase-kontrasti käänteismikroskooppi

morfologinen havainnointi käsittelemättömien SKOV-3, Ca Ski ja HT-29-solujen osoitti, että kontrollisoluja säilyttivät alkuperäisen morfologian, jotka ovat cuboids ja monikulmainen muotonsa ja oli kiinnittynyt levyt (kuvio 5). Sen sijaan, SKOV-3, Ca Ski ja HT-29-soluja, käsiteltiin PW-M, PW-H, ja PW-E ja PPWH-7 osoittivat apoptoottisten kaltaiset ominaisuudet, kuten kutistuminen solujen, rakkulan muodostumista ja ydin- kromatiinin kondensaatio ja yhteen osaksi tiheä massojen alla tumakalvoa. Solut apoptoosin johti myös muun tyyppisiä morfologisten muutosten, kuten kutistuminen pyöristettynä solujen ja menettää kosketusta viereisiin soluihin. Tämän seurauksena jotkut herkät solut jopa irtoaa pinnasta kuoppaisilla levyillä.

SKOV-3, Ca Ski ja HT-29-solujen hoidon jälkeen 10 ug /ml PW-M, PW-H, PW-E ja PPWH-7: ssa 24 tuntia. Nuolet osoittavat muodostumista (A) apoptoottisten kappaleiden; (B) kondensoidaan ytimet ja (c) kalvo kupliminen todisteena apoptoosin. Kuvat ovat edustavia yksi kolmesta vastaavia kokeiluja.

morfologinen arviointi apoptoottisten solujen akridiiniorans- (AO) -ethidium Bromide (EB) Double Värjäys

morfologiset muutokset SKOV -3, Ca Ski ja HT-29-solut, joita käsiteltiin 10,0 ug /ml PW-M, PW-H, PW-E ja PPWH-7: ssa 24 tuntia havaittiin AO /EB värjäys ja solut luokiteltiin live ( normaali), apoptoottisten ja nekroottinen (kuvio 6). Eläviä soluja ehjän DNA: n ja tuman on pyöreä ja vihreä ytimeksi.