Krooninen sairaus

tiivistelmä

stromasoluja kuten myofibroblasteja vaikuttaa syövän etenemiseen. Mekanismit ovat epäselviä, mutta voi aiheuttaa vaikutuksia sekä kasvainsoluihin ja rekrytointi luuytimestä saaduissa mesenkymaalisissa stroomasolut (MSC: t), joka sitten asuttaa kasvaimia. Käyttämällä iTRAQ ja LC-MS /MS tunnistimme adipokine, chemerin, kuten yli-ilmentynyt ruokatorven levyepiteelikarsinooma syöpään liittyvän myofibroblasteja (CAM) verrattuna viereiseen kudokseen myofibroblasteja (pankkiautomaatit). Chemerin reseptori, ChemR23-, ilmaistaan ​​MSC:. Medium (CM) peräisin CAM lisäsi merkittävästi MSC solumigraation verrattuna ATM-CM; toiminnan CAM-CM heikkeni huomattavasti chemerin-neutraloiva vasta-aine, esikäsittely CAM kanssa chemerin siRNA, esikäsittely MSC: eiden kanssa ChemR23- siRNA sekä ChemR23- reseptorin antagonisti, CCX832. Stimulointi MSC: by chemerin fosforylaatio lisääntyy p42 /44, p38 ja JNK-II kinaasien ja inhibiittorit näiden kinaasien ja PKC päinvastaiseksi chemerin stimuloimaa MSC muuttoliikettä. Chemerin stimulaatio MSC: eiden myös indusoima ja eritystä makrofagin estävä tekijä (MIF), joka yleensä rajoittaa muuttavien vastauksia pieninä pitoisuuksina chemerin mutta ei suuremmilla pitoisuuksilla. Vuonna ksenograftimallia koostuu OE21 ruokatorven syöpä soluja ja CAM, itseohjautuva MSC: eiden annettiin i.v. estyi CCX832. Siten chemerin erittyy ruokatorven syöpä myofibroblasteja on potentiaalinen kemoattrak- MSC: ja sen estäminen voi viivyttää syövän etenemiseen.

Citation: Kumar JD, Holmberg C, Kandola S, Steele I Hegyi P, Tiszlavicz L, et al . (2014) Lisääntynyt ilmentyminen Chemerin vuonna Squamous ruokatorven syöpä myofibroblasteja ja tehtävästä rekrytointi Mesenkymaaliset stroomasoluissa. PLoS ONE 9 (8): e104877. doi: 10,1371 /journal.pone.0104877

Editor: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 toukokuu 2014; Hyväksytty: 15 heinäkuu 2014; Julkaistu: 15 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Kumar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: Cancer Research UK (AV), NIHR (AV), National Institute of Health /NCI (5U54CA126513, TCW, AV) ja unkarilainen Tieteellinen tutkimus Fund (NF100677, PH), Wellcome Trust (AV, CH, SK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: TC ja MP maksetaan työntekijöille ChemoCentryx. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja. Toinen kirjoittajat ei ole eturistiriitoja.

Johdanto

merkitys kasvaimen microenvironment määritettäessä syöpäsolujen kasvua ja leviämistä on nyt hyvin tunnustettu [1]. Strooman solutyyppejä, jotka edistävät mikroympäristön ovat tulehdus- ja immuunisolujen, endoteelisolut, perisyytit ja fibroblastien solulinjasta [2]. Kun kyseessä jälkimmäinen kasvava määrä todisteita osoittaa, että syöpään liittyvä fibroblasteja (valuuttalisiin), joista myofibroblasteja ovat näkyvästi alatyyppi, eroavat heidän kollegansa normaalia kudosta [3], [4], [5]. On myös kasvava arvostus että luuytimestä peräisin mesenkymaaliset strooman (kantasolujen) soluja (MSC) voi vaikuttaa syövän etenemisen siirtyminen kasvain sivustoja, joissa ne voivat erilaistua erilaisiksi solutyyppejä kuten myofibroblasteja [6], [7]; ne voivat myös olla käyttökelpoisia ajoneuvoja kohdistaa annettava syövän hoitoon [8]. Vaikka on todisteita kemokiini osallistumisesta MSC rekrytointi mekanismit ovat yhä puutteellisia [9], [10].

Ruokatorven syöpä katsotaan osuus on lähes puoli miljoonaa kuolemantapausta vuosittain maailmanlaajuisesti. Adenokarsinooma, liittyy refluksi ja lihavuus, syntyy taustalla Barrettin ruokatorvi ja kasvaa esiintyvyys länsimaissa; ruokatorven okasolusyöpä (ESCC) liittyy tupakointi, alkoholin nauttiminen ja huono ruokavalio ja on korkea esiintyvyys kehitysmaissa [11]. On kasvava arvostusta roolin valuuttalisiin /myofibroblasteja sisään ESCC erityisesti edistämään syövän invaasio ja angiogeneesi vaikka yleisesti ne pysyvät huonosti [12], [13].

Chemerin (tazarotene aiheuttama geeni 2, TIG2- ; retinoiinihapporeseptoriin responder 2, RARRES2) on 18 kDa: n kemokiini-kaltainen proteiini, joka toimii tällä ChemR23 (kemokiinin kaltainen reseptori 1, CMKLR1) [14], [15]. Se erittyy inaktiivisena esiasteena, joka on aktivoitu erilaisilla solunulkoisen proteaaseja, jotka poistavat C-terminaalisen heksapeptidin ja vapauttavat 157 aminohapon aktiivisessa muodossa; se ilmaistaan ​​rasvasolut, maksan ja istukan ja on rooleja adipogeneesi ja valkosolujen kemotaksista lukien rekrytointi dendriittisten ja luonnollisten tappaja (NK) solujen tulehdus- tai syöpä [16], [17], [18], [19] . Esillä olevassa tutkimuksessa tunnistettujen lisääntyneen ilmentymisen chemerin in ESCC syöpään liittyvän myofibrobroblasts (CAM) verrattuna viereiseen kudokseen myofibroblasteja (pankkiautomaatit), ja ilmaistu sen vastaavan reseptorin ChemR23- MSC: eiden. Siksi arveltu, että chemerin toimii MSC kemoatrak- ja esittelemme täällä todisteita hypoteesin.

Materiaalit ja menetelmät

Solut

myofibroblasteja kertyi kasvaimia ja viereisten kudosten kärsivien potilaiden ESCC käyttäen aikaisemmin kuvattuja menetelmiä (taulukko S1 File S1) [20], [21], ja niitä käytettiin välillä kohdat 3 ja 10. Tämä työ oli hyväksynyt eettinen komitea Szegedin yliopiston, Unkari ja kaikki aiheet antoi tietoon perustuva suostumus. ESCC solut (OE21) ja ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Ihmisen luuytimestä peräisin mesenkyymikantasoluista käytettiin kohdat 3-12 niiden erilaistumaton tilassa; jopa passage 12 niillä oli adiposyyttien, osteosyyttien ja rustosolujen erilaistumista adiposyyttien, osteosyyttien ja rustosolujen erilaistumista media (Lonza, Cambridge, UK); solut olivat CD105, CD166, CD29, CD44, α-SMA ja vimentiinista positiivisia ja olivat CD14, CD34, CD45, sytokeratiinista ja desmiinille negatiivinen.

Cell Culture

myofibroblasteja viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [20]. MSC: t pidettiin eriyttämätön tilassa MSCGM (Lonza), joka sisältää ruselatusaineeseen ja MSC kasvua täydentää. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa 5% v /v CO

2; HUVEC pidettiin EGM väliaineessa ja käytettiin kohtia 5-9; OE21-soluja viljeltiin RPMI-1640, johon oli lisätty 10% v /v FBS, 1% v /v penisilliini-streptomysiiniä, 2% v /v L-glutamiinia.

väliaine

myofibroblasteja (1,5 x 10

6 solua) maljattiin T-75 falcon pulloihin ja pidettiin 37 ° C: ssa 5% v /v CO

2 24 tunnin kokonaisuudessaan media (FM). Sitten viljelmät pestiin 3 kertaa steriilillä PBS: llä ja inkuboitiin 15 ml: ssa seerumivapaassa (SF) media 24 tuntia. Esikäsitelty väliaine (CM) otettiin talteen, sentrifugoitiin (7 min, 800 x g, 4 ° C) ja alikvootteja säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka.

Immunosytokemia

Soluja paraformaldehydiä (PFA) -Kiinteä (4% w /v), permeabilised 0,2% Triton X-100 PBS: ssä (PBS-T) 30 minuutin ajan ja käsitellään immunosytokemia kuten aiemmin on kuvattu [22] käyttämällä ensisijaista vasta-aineita CD105, CD34, CD29 (Ancell Corporation, Bayport, MN), α-SMA, vimentiinin, desmiini, pancytokeratin (Fitzgerald, NJ), ChemR23 (Millipore, MA,) tai GPR1 (Abcam, Cambridge, UK), jota seurasi inkubointi sopivan, fluoreseiini tai Texas Red leimatut sekundääriset vasta-aineet in aasi (Jackson Immuno-, Soham, UK), ja asennettu Vectashield

® sisältävä DAPI (Vector Laboratories, Peterborough, Iso-Britannia). Dioja näytettiin käyttäen Zeiss Axioplan-2 (Zeiss Vision, Welwyn Garden City, UK). Kuvat otettiin käyttäen JVC-3 CCD-kenno kamera 40-kertaisella suurennuksella kanssa KS300 ohjelmisto (Imaging Associates, Bicester, Oxfordshire, UK).

proteomiikan analyysi

secretome ruokatorven myofibroblasteja tutkittiin jälkeen iTRAQ merkintöjä proteiinien media seurasi LC-MS /MS kuten aiemmin on kuvattu (katso Methods S1) [3]. Otaksutun chemerin tavoitteet MSC-haettiin SILAC merkintöjä solujen altistamisen seuraamana chemerin (R Köln, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kukin transfektio palveluksessa 2 ug DNA: ta (5 x 10

5 solua) ja 100 ui täydellistä Nucleofector ratkaisu. Transfektio saatiin aikaan käyttämällä ohjelmaa U-23 (korkea transfektion tehokkuus) lisäämällä 500 ui esilämmitettyä elatusainetta kyvetti ja näytteiden siirtoa T-75-pulloihin, jossa on 20 ml juuri valmistettua väliainetta.

MSC ohjautumista ksenografteissa

Kaikki eläinkokeet suoritettiin hyväksynnän jälkeen Liverpoolin yliopiston animal Welfare komitean ja olivat noudattaen Britanniassa Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (PPL 40/3137) .Voit tutkimus MSC rekrytointi ksenografteja 6-8 viikon ikäiset immuunipuutteisilla BALB /c nu /nu-hiiriä (Charles River, Wilmington, MA) ruiskutettiin sc kanssa OE21 soluja (10

6) yksin tai CAM (5 x 10

5). Hiiret kasvaimia vastaavan kokoinen (1,0-1,2 cm halkaisijaltaan) jälkeen saanut CCX832 (2 mg /ml, 125 ui, iv), tai ajoneuvo, jonka jälkeen 24 tunnin jälkeen annetaan toinen annos ja MSC leimattiin PKH67 (7,5 x 10

5). 24 tunnin kuluttua kasvaimet leikattiin, kiinnitettiin 4% PFA ja käsitellään lokalisointia fluoresoivien solujen.

Tilastot

Lopulliset tulokset laskettiin keskiarvo ± keskivirhe välineet (SEM). Studentin t-testi ja ANOVA suoritettiin tiedot tarpeen mukaan merkitsevyyden p≤0.05 käyttäen Systat Software Inc. (London, UK) ellei toisin mainita.

Tulokset

Lisääntynyt chemerin ilmaisun squamous ruokatorven LÄHETYKSET

myofibroblasteja tunnistetaan α-SMA ilmentyminen havaittiin suurempi määrä ja osoittivat häiritsi morfologia ja arkkitehtuuri ESCC verrattuna viereiseen kudokseen (Kuva S1 File S2). Viljellyt myofibroblasteja näistä kasvaimista ja viereiseen kudokseen ilmaistaan ​​α-SMA ja vimentiinista, mutta ei desmiinille tai sytokeratiinia; CM alkaen CAM stimuloi kasvua ja migraatiota OE21 solujen verrattuna ATM-CM (kuviot S2, S3 File S2). Käyttämällä iTRAQ merkinnät seurasi LC-MS /MS tunnistaa mahdolliset solusignalointimolekyylien erittämiä CAM, löysimme lisääntynyt chemerin runsautta CAM median verrattuna ATM kaikista neljä paria ESCC näytteistä (kuvio S4 File S2; taulukko S3 File S1). Western blotting vahvisti kasvoi chemerin CAM verrattuna ATM media (kuvio 1A), ja ELISA median ilmoitettu 2,1 ± 0,4 kertaa suurempi chemerin eritystä CAM

vs

pankkiautomaatit. Soluekstrakteissa, Western blotit osoittivat vaatimaton mutta merkittävästi kohonnut chemerin in CAM verrattuna niiden pariksi pankkiautomaatit (kuvio S5 File S2). Oletettu chemerin reseptoria, ChemR23-, ilmaistiin MSC: (katso jäljempänä), ja chemerin stimuloitiin pitoisuudesta riippuva kulkeutumista MSC: kahdessa eri määrityksissä (kuvio 1 B). Lisäksi CAM-CM stimuloi MSC muuttoliike ja vastaus oli merkittävästi suurempi kuin ATM-CM (kuvio 1 C, vasemmalla). Suora näyttöä rooli chemerin aktiivisena komponenttina CAM-CM saatiin havainto, että immunoneutralisation on chemerin esti vaikutusta CAM-CM (kuvio 1C, keskellä); lisäksi siRNA knockdovvn chemerin ilmaisun vähensi aktiivisuutta CM myöhemmin soveltaa MSC: siirtymätesteissä määrityksissä (kuvio 1 C, oikea; kuvio S6 File S2).

. Edustavia Western-analyysi chemerin sisään median ESCC CAM ja pankkiautomaatit (vasemmalla). Kvantitatiivinen analyysi densitometrisesti chemerin runsautta median ESCC CAM ja pankkiautomaattien (n = 4 erilaista paria myofibroblasteja) (oikealla).

B

. Pitoisuudesta riippuva stimulaatio MSC muuttoliikkeen chemerin Scratch haavan muuttoliikkeen määritykset (vasemmalla) ja Boyden kammion muuttoliike määritykset (oikealla) (n = 3).

C

. Lisääntynyt maahanmuutto MSC: in Boyden kammioissa vastauksena elatusaineessa (CM) peräisin CAM ja niiden pankkiautomaatit (vasemmalla) (n = 4 erilaista paria myofibroblasteja). Stimulaatio MSC siirtymää CAM-CM estyi chemerin neutraloivan vasta-aineen (Chem.Ab; 10 ug /ml) (keskellä). MSC muuttoliike väheni vastauksena CM päässä CAM1 ja CAM4 transfektoitujen solujen chemerin siRNA # 3 (oikealla). Vaaka nuolet, p 0,05, t- testi (n = 3).

ChemR23 ilmaiseman MSC: sovittelee muuttavien vastauksia chemerin

Ilmaisu MSC-oletetun chemerin reseptoria, ChemR23-, on tunnistettu geeni array [28] ja varmistimme ilmaus tästä ja toinen mahdollista reseptoria, GPR1 [29], immunosolukemiallisella. Knockdown siRNA ChemR23 (kuvio 2A, vasen; kuvio S7 File S2) estivät merkittävästi muuttavien vastaus molempiin chemerin (kuvio 2A, keskellä) ja CAM-CM (kuvio 2A, oikealla), kun taas knockdovvn GPR1 oli vain vähän vaikutusta. ChemR23- antagonisti, CCX832, annosriippuvaisesti esti MSC muuttoliike vastauksena chemerin (kuvio 2B, vasen ja keskellä) ja CAM-CM (kuvio 2B, oikea), kun taas ei-aktiivisen analoginen, CCX826 ollut vaikutusta; estyminen CAM-CM by CCX832 oli samanlainen kuin saavutetaan immunoneutralisation (kuvio 2B, oikea).

, edustaja kuvia MSC: värjättiin vimentiinista (positiivinen kontrolli) ja ChemR23 paljastava knock-down (KD) jälkeen ChemR23 siRNA hoidon (vasemmalla). Knockdown ChemR23, mutta ei GPR1, esti MSC muuttoliike vastauksena chemerin (100 ng /ml) (keskellä) ja CAM-CM (oikealla).

B

, konsentraatiosta riippuvaisen eston MSC muuttoliikkeen vastauksena chemerin jonka ChemR23 antagonisti CCX832 (vasemmalla), mutta ei ohjaus- yhdiste CCX826 (1 uM) (keskellä). MSC muuttoliike vastauksena CAM-CM estyi niinikään chemerin neutraloivan vasta-aineen, ja CCX832, mutta ei CCX826 (1 uM) (oikealla).

C

, edustaja Western blot osoittaa, fosforylaatio lisääntyy p42 /44, p38 ja JNK-II kinaasien MSC-käsitelty chemerin (100 ng /ml) (vasen). Vuonna Boyden chamber määrityksissä, chemerin-stimuloitu MSC muuttoliikettä estyi JNK-II-estäjä, SP600125 (50 uM), The p42 /44-estäjän, UO126 (10 uM), p38-estäjän SB202190 (3 uM), ja PKC-inhibiittori Ro320432 (2 uM) muttei di pIK3 estäjä LY294002 (50 uM) (oikealla). Vaaka- suorat nuolet, p 0,05, ANOVA (n = 3 kussakin tapauksessa).

Chemerin stimulaation proteiinikinaasi reittejä välittää MSC vaeltavien vasteita

Chemerin nopeasti fosforylaatio lisääntyy useiden proteiinikinaasien kuten P42 /44, p38 ja JnkII kinaasien MSC-(kuvio 2C, vasemmalla). Inhibiittorit kaikki kolme kinaasien vähensi merkittävästi muuttavien vaste MSC: eiden ja chemerin mutta inhibitio PI-3-kinaasi käyttäen LY294002 ei ollut vaikutusta. PKC estäjä Ro320432 esti myös muuttoliikettä, ja yhdistelmä Ro320432, U0126, SP600125 ja SB202190 estivät täysin vaeltavia vasteita (kuvio 2C, oikealla). Todisteet siitä, että PKC aktivaatio oli ylävirtaan MAP-kinaasin stimulaatio tarjoamia havainto, että PMA stimuloi MSC muuttoliikettä ja tämä estyi U0126, SP600125 ja SB202190; Lisäksi PMA stimuloi fosforylaatio p42 /44, p38 ja JnkII kinaasien (kuvio S8 File S2). Oli huomattava vähentyminen fosforylaatio p42 /44, p38 ja JnkII kinaasien jälkeen ChemR23 pudotus käyttämällä siRNA sopusoinnussa ajatus, että nämä kinaasit ovat alavirtaan ChemR23 (Kuva S8 File S2).

Chemerin lisää MIF ilme MSC-mikä hillitsee muuttoliikettä

jotta edelleen määritellä otaksuttu tavoitteet chemerin haimme SILAC ja LC-MS /MS tunnistamiseen proteiinien solun tiivisteet ja median MSC: eiden käsitelty chemerin 24 tuntia. Yllättäen MIF korotettiin chemerin stimuloiduista (taulukko S4 File S1; Kuva S9 Tiedosto S2). Western blot varmisti, että chemerin, sekä IGF-II käytettiin positiivisena kontrollina, lisääntynyt MIF solu-uutteissa ja media (kuvio 3A, vasemmalla), ja käyttäen ELISA oli noin 10 kertaa suurempi MIF pitoisuudet media jälkeen chemerin hoidon. Sen jälkeen ChemR23 pudotus MIF vaste chemerin oli syvästi estetty (kuvio 3A, keskellä). Läsnä ollessa MIF, MSC muuttavien vaste chemerin estyi noin 50% (kuvio 3A, oikealla). Määrittää toiminnallinen merkitys MIF MSC muuttoliike käytimme MIF antagonisti ISO-1; Tämä tukahdutti vaikutus MIF estämisessä chemerin stimuloiman MSC muuttoliike sekä lisäsi merkittävästi muuttavien vaste MSC: jotta chemerin (kuvio 3B). Vastaavasti MIF taintumisen (kuvio S10 File S2) kasvoi MSC muuttoliikkeen vastauksena pieninä pitoisuuksina chemerin (4 ng /ml), mutta kiinnostavaa vastaus chemerin suuremmilla pitoisuuksilla (20 ng /ml) ei vaikuttanut MIF taintumisen ( Kuva 3C).

, edustaja Western blotit osoittavat MIF MSC media (ylhäällä vasemmalla) ja solu-uutteiden (alhaalla vasemmalla) käsiteltiin chemerin (Ch; 100 ng /ml) tai IGF -II (100 ng /ml) 15 minuuttia. ChemR23- knock-down laski MIF julkaisu vastauksena chemerin (keskellä). Chemerin stimuloiman MSC muuttoliikettä estyi MIF (200 ng /ml) (oikealla).

B

, tukahduttaminen MIF signalointia ISO-I (50 uM) entisestään chemerin stimuloiman muuttoliikettä.

C

, MIF knock-down MSC-lisääntynyt maahanmuutto vastauksena 4 ng /ml, mutta ei 20 ng /ml chemerin. Vaaka nuolet, p 0,05, t- testi (n = 3).

Chemerin stimuloi MSC siirtymät endoteelisolujen ja vaatii MMP-2

Tiedot sotkea chemerin rekrytoinnissa MSC: eiden ja CAM sisältäviä syöpä mikroympäristöihin.

In vivo

tämä edellyttää migraatiota ja niin me tutki chemerin pystyi stimuloimaan MSC siirtolaisuutta yksisolukerroksen endoteelisolujen aiemmin muodostunut Boyden kammioihin. MSC: t on leimattu PKH67 (kuvio 4A, vasemmalla) todettiin muuttavien vastauksena chemerin (kuvio 4A, keskellä) ja CAM-CM (kuvio 4A, oikealla) ja muuttavia vaste estyi CCX832 muttei CCX826. Erittyvien proteaasien, jotka saattavat helpottaa migraatiota Sitten haetaan proteiini luetteloissa saatu SILAC-leimattu MSC: t on käsitelty chemerin. Runsas MMP-2 tunnistettiin chemerin stimuloiman näytteet (taulukko S5 File S1) ja Western blotit (kuvio 4B, vasemmalla) ja MMP-2-entsyymin aktiivisuus määrityksissä (kuvio 4B, oikealla) vahvisti runsastuminen media vastauksena chemerin. Siirtymätesteissä tutkimuksissa Lisäksi MMP-2 stimuloi MSC muuttoliikettä ja tämä väheni merkittävästi jonka MMP-2-estäjä (kuvio 4C vasemmalla). Sama estäjä vähensi merkitsevästi myös MSC migraatiota vastauksena chemerin (kuvio 4C, oikealla).

, edustaja kentät MSC migraatiota kokeet osoittavat migraation PKH67-leimattua MSC: (vasen ). CCX832 (1 uM) esti chemerin- (keskellä) ja CAM-CM stimuloi MSC migraatiota mutta CCX826 (1 uM) ei ollut vaikutusta (oikealla).

B

, Chemerin, ja IGF-II käytettiin positiivisena kontrollina, viipymättä (30 min) stimuloidaan proMMP2 runsautta media havaittiin Western blot mutta ei ollut vaikutusta solujen proMMP2 runsaus (vasemmalla); chemerin huomattavasti MMP-2 entsyymiaktiivisuus MSC media havaita selektiivisen alustan MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-NH

2 (oikealla).

C

, Human yhdistelmä-MMP-2 (80 ng /ml) stimuloi migraatiota ja siellä oli annoksesta riippuvaa inhibitiota MMP-2 selektiivinen (MMP-2-estäjä I) (vasemmalla). MMP-2-estäjä (60 uM) esti merkittävästi chemerin stimuloiman MSC migraatiota (keskellä). Vaaka nuolet, p 0,05, t- testi (n = 3).

In ksenograftimallia, MSC homing stimuloivat CAM ja estävät CCX832

perusteella data edellä on kuvattu, me arveltu, että

in vivo

chemerin sovittelee MSC homing kasvaimia koostuu syöpäsolujen ja CAM. Vuonna ksenograftimallia on OE21 solujen nude-hiirissä, Hyväksytty kasvaimet samankokoiset (1,0-1,2 cm halkaisijaltaan) generoidaan ja ilman samanaikaisen annon CAM tutkittiin jälkeen myöhempien i.v. injektio PKH67-leimattujen MSC:. Merkityt solut -ksenografteja lisääntynyt kasvainten OE21 ja CAM verrattuna OE21 pelkät solut (kuvio 5A). Esikäsittely hiirten ChemR23- antagonisti CCX832 ennen injektointia MSC: vähensi merkittävästi leimattujen solujen ksenografteissa näin ilmaissut rooli chemerin MSC rekrytointi

in vivo

(kuvio 5B).

, visualisointi PKH67-leimatun MSC: in edustaja kentille ksenografteista perustettu OE21 syöpäsolujen yksin tai yhteistyössä ruiskutetaan CAM seuraa käsittely ajoneuvo (top) tai CCX832 (alhaalla) ja iv injektio PKH67- merkitty MSC:.

B

, In ksenografteissa kanssa OE21 syöpäsolujen ja CAM siellä lisättiin MSC homing ilmaistaan ​​leimattujen solujen pinta-alayksikköä kohti ksenografti verrattuna ksenograftien on OE21 syöpäsolujen yksin; hoidon CCX832 esti itseohjautuva (OE21 /ajoneuvon, n = 3, OE21 /CCX832, n = 4, OE21 ja CAM /ajoneuvon, n = 6, OE21 ja CAM /CCX832, n = 6). Vaaka nuolet, p 0,05, ANOVA.

Keskustelu

On yhä enemmän todisteita siitä, että MSC: muuttavat kasvaimiin, joissa ne edistävät kasvaimen kasvua [6], [30]. Mekanismit itseohjautuva ja muuttoliike pysyvät epätäydellisesti ymmärretty. Tässä tutkimuksessa antaa todisteita siitä, että ilmentymisen kemokiinin kaltainen peptidi, chemerin, on lisääntynyt CAM päässä ESCC ja toimii kemoattraktantti MSC: aktivoimalla G-proteiiniin kytketyn reseptorin ChemR23. Pieni molekyyli antagonisti ChemR23, CCX832, esti toiminta chemerin sekä

in vitro

ja ksenograftimallia

in vivo

. Havainnot tunnistaa chemerin uutena CAM-johdettuja tekijä MSC rekrytointi kasvaimia.

Aikaisemmat tutkimukset ovat raportoineet useita eri rooleja valuuttalisiin, CAM ja liittyvien solujen etenemisen ja hoitovaste erilaisia syöpiä, kuten eturauhas-, rinta-, maha-, keuhko- ja paksusuolen [2], [31], [32], [33], [34], [35]. CAM käytetty Esillä olevissa tutkimuksissa on saatu kasvaimia, jotka myofibroblastin numero, arkkitehtuurin ja morfologia hajotettiin; Lisäksi CM näistä CAM herätti aggressiivisempi fenotyyppiin syöpäsoluissa (solujen lisääntymisen, migraation) verrattuna CM automaateista. Yleisemmin toimintaa myofibroblasteja on raportoitu olevan sekä positiivisia että negatiivisia syövästä solujen proliferaatio ja migraatio, ja siellä on myös vaikutuksia angiogeneesiin, ja modulaatio immuunimekanismit [3], [12]. Vaikka MSC homing syöpään sivustoja tunnustetaan, erityistä roolia myofibroblasteja tässä prosessissa on ollut epäselvä. Esillä data ehdottaa ei vain, että CAM osallistuvat aktiivisesti MSC rekrytoinnin lisäksi, että yksi erityinen välittäjänä chemerin, ilmentyy differentiaalisesti CAM ja pankkiautomaatit.

Chemerin syntynyt läpi proteomic tutkimuksen myofibroblastin secretomes. On kasvavaa kiinnostusta soveltamisessa proteomic tutkimuksia määritellä secretomes peruskudoksen solujen, mutta silti nämä pysyvät tutkittu vähemmän kuin syöpäsolun secretomes. Aiemmat secretome tutkimukset molemmin fibroblastisia linjaa solujen ja MSC ovat tunnistaneet joitakin molekyylien löytyy tässä tutkimuksessa etenkin ECM proteiinit, MMP, IGFBP: istä; signalointimolekyylit havaittu näissä tutkimuksissa sisältävät SDF-1, HGF, EGF ja muut kemokiinit [36], [37]. Meidän alustava tunnistaminen chemerin tehtiin kaikissa neljässä solupareina tutkittiin ja validoitiin Western blot ja ELISA median jotka yhdessä osoittavat, että chemerin olisi pidettävä uusi välittäjä myofibroblastin solusignalointia.

Chemerin tavallisesti ilmaistaan by adiposyyttien, maksan, keuhkojen ja muiden solujen. Useissa syövissä, mukaan lukien okasolusyöpä ihosyöpä, melanooma, eturauhassyöpä, keuhko-, rinta- ja hepatosellulaarista karsinoomaa, vähentynyt chemerin ilmentyminen liittyy vahingollisia. On kuitenkin syytä huomata, että edellinen työ ei ole, suurimmaksi osaksi, ottaa huomioon eri mallien ilmentymisen chemerin kasvainsoluissa epiteelisolujen verrattuna stromasoluja [18], [38]. Koska chemerin on kemoattraktantti NK-solut ja dendriittisolut [14], [16], [19], on ehdotettu, että menetys chemerin mahdollistaa kasvainten kiertää immuunipuolustuksen mekanismit, jotka estävät kasvaimen kehittymisen [18], [38], [ ,,,0],39]. Kuitenkin, ruokatorven solut voivat tarjota tolerogeenisen ympäristön [40], joka lieventää suojaavia vaikutuksia chemerin. Lisäksi mahasyövän on lisääntynyt plasman chemerin ja chemerin stimuloi syöpäsoluinvaasiota

in vitro

[41]. Siten chemerin voi käyttää sekä positiivisia että negatiivisia vaikutuksia syövän etenemiseen.

On olemassa useita mahdollisia rooleja chemerin vapautuu CAM lukien modulaatio syövän ja immuunijärjestelmän solujen toimintaa ja angiogeneesiä. Olemme havainneet, että vastaavan reseptorin ChemR23- ilmaistiin MSC: ja että chemerin oli kemoattraktantti näissä soluissa. Koska reseptori pudotus, immunoneutralisation ja ChemR23- reseptorin antagonisti vain osittain inhiboi vaikutukset CAM-CM, on myös todennäköistä, että muihin CAM kemoattraktantteja. Ehdotamme chemerin on hyvä ehdokas jatkotutkimuksiin ei vähiten siksi, saatavuudesta reseptoriantagonistien. Mekanismit kemotaksista sisältävät aktivointi PKC ja useiden alavirran kinaasin reittejä kuten p42 /44, p38 ja JNK-II kinaasien, jotka kaikki näyttävät osansa. Ainakin osittain näiden solunsisäinen signalointi mekanismit voivat muistuttaa kuvattu muille soluille, jotka osoittavat chemerin-stimuloidun kemotaksista, mukaan lukien dendriittisolut [14].

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että erilaisia ​​kasvutekijöitä ja kemokiinien stimuloivat MSC maahanmuutto ja HGF, TNFa, SDF-1, CXCL12, CXCL13, CHCL16 ja CCL22 [42], [43]. MSC: t transmigrate poikki endoteeleille by kemokiinin välittämän mekanismeja liittyy myös metalloproteinaaseja erityisesti MMP-2 [43], [44], [45], [46], [47]. Löydettiin nopeasti (30 min) stimulaatio proMMP-2-erityksen MSC: vastauksena chemerin ja rooli MMP-2 helpottamisessa chemerin stimuloiman migraatiota, oletettavasti aktivaation jälkeen muut solunulkoiset proteaasit, kuten MMP-14 [45].

tiedetään, että MIF estää MSC muuttoliike [48], [49]. Esillä tiedot viittaavat siihen, että pitoisuudesta riippuva induktio MIF MSC-by chemerin säädöksillä hillitä muuttoliikettä. Kuitenkin estävä vaikutus vaimenee korkeita pitoisuuksia chemerin. Yksi seuraus on, että valvonta myofibroblasteja, jossa chemerin ilme on vaatimaton, älä tehokkaasti edistää MSC rekrytointia koska autoinhibitorinen toiminnan MIF; Kuitenkin CAM joissa on lisääntynyt chemerin, kyky MSC rekrytoinnin paranee, koska autoinhibitorinen vaikutusta MIF on voitettu.

ChemR23 antagonisti CCX832 on aiemmin käytetty määrittämään uusia vuorovaikutuksia verisuonia rasvasolut ja verisuonia supistava vasteet [ ,,,0],26]. Nyt näyttää sekä

in vitro

ja

in vivo

in ksenograftimallia joka CCX832 estää MSC muuttoliike vastauksena CAM. Olipa chemerin vaikuttaa MSC erilaistumisen jälkeen rekrytointi syöpiin on vielä määrittämättä. Se ei olisi yllättävää, jos se ei, koska tiedetään stimuloivan mesenkymaalisten kantasolujen adipogeneesi [17], [50]. Kokonaisuutena esillä tiedot osoittavat chemerin on uusi potentiaalinen säätelijä syövän etenemisen kohdentamalla MSC rekrytointia ja ehdottaa mahdollisuutta käyttää ChemR23- reseptoriantagonistien säädellä tätä prosessia.

tukeminen Information Tool Menetelmät S1.

täydentävillä menetelmillä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0104877.s001

(PDF)

Tiedosto S1.

lisätaulukot. Taulukko S1 Taulukko S5.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0104877.s002

(PDF)

Tiedosto S2.

Täydentävä kuviot. Kuva S1 kuvioon S10.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0104877.s003

(PDF) B

Kiitokset

Olemme kiitollisia professori Rod Dimaline varten hyödyllisiä keskusteluja, Biomedical palveluyksikkö, University of Liverpool apua ksenograftit ja kirurgit osastolta Surgery, Szegedin yliopiston kirurgisen näytteitä.