Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Korkea-asteen serous munasarja- ja kohdun limakalvon syövät ovat kaikkein vaarallisin naisen synnytyskanavan syöpäsairauksia maailmanlaajuinen. Osittain ole kohdellut näitä kahta aggressiivinen syöpien onnistuneesti keskittyy siihen, että vaikka suurin osa potilaista diagnosoidaan perustuvat tämänhetkisiin valvontastrategiat olevan täydellinen kliininen vaste niiden ensisijainen hoito, lähes puolet kehittävät taudin uusiutumisen 18 kuukauden kuluessa ja suurin kuolevat tauti uusiutuu 5 vuoden kuluessa. Myöskään nykyisin käytössä biomarkkerit tai kuvantamistutkimukset voi ennustaa lopputulosta seuraavat hoidon aloittamisesta. Kiertävä kasvain DNA (ctDNA) edustaa teoreettisesti voimakas biomarkkereiden havaitsemiseksi muuten piilevästä sairaudesta. Siksi tutkitaan käyttämällä yksilöllisiä ctDNA markkereiden sekä valvonta- ja ennustetekijöiden biomarkkereiden vuonna gynecologic syöpien ja verrataan tätä nykyiseen FDA: n hyväksymä valvontavälineitä.

menetelmät ja havainnot

Kasvain ja seeruminäytteet kerätty leikkauksen aikana ja sen jälkeen koko hoitojakson varten 44: llä gynekologiset syövät, jotka edustavat 22 munasarjasyöpä tapauksissa 17 kohtusyöpä tapauksissa yksi vatsakalvon, kolme munanjohdin, ja yksi potilas, jolla synkronoitu munanjohdin ja kohtusyöpä. Potilaan /kasvain-mutaatioita tunnistettiin käyttäen koko-exome ja kohdegeenin sekvensointi ja ctDNA tasot kvantifioidaan pisaran digitaalista PCR. CtDNA havaittiin 93,8%: lla potilaista, joille alukkeet suunniteltiin ja tasot korreloivat voimakkaasti CA-125 seerumia ja tietokonetomografia (CT) Skannausjälki. Kuudella potilaalla, ctDNA havaittu syövän läsnäolon, vaikka CT skannaus oli negatiivinen ja keskimäärin oli ennustava läpimenoaika seitsemän kuukauden ajan CT kuvantaminen. Selkeimmin havaitsemattomia tasoja ctDNA kuusi kuukautta hoidon alussa liittyi selvästi parantunut ilman taudin etenemistä ja kokonaiselinaika.

Johtopäätökset

Detection jäljellä taudin gynecologic, ja itse asiassa kaikki syövät, edustaa diagnostinen ongelma ja mahdollinen kriittinen käännepiste tarkkuutta lääketieteessä. Tämä tutkimus viittaa siihen, että käyttö henkilökohtainen ctDNA biologisten merkkiaineiden gynekologiset syövät voidaan tunnistaa läsnäolon jäljellä kasvain samalla lisää dynaamisesti ennustamisessa hoitovastetta suhteessa nykyisin käytössä seerumin ja kuvantamistutkimukset. Erityisen kiinnostavaa, ctDNA oli itsenäinen ennustaja hengissä Munasarjasyöpäpotilaiden ja kohdun limakalvon syöpiä. Aiemmin tunnustamista taudin pysyvyys ja /tai toistumisen ja kyky ositusta parempaan ja huonompaan tulokseen ryhmien kautta ctDNA valvontaan voi avata ikkunan parantaa selviytymisen ja laatua ja elämän näiden syöpien.

Citation: Pereira E, Camacho -Vanegas O, Anand S, Sebra R, Catalina Camacho S, GARNAR-Wortzel L, et ai. (2015) Henkilökohtainen Kiertävä kasvain DNA biomarkkerit dynaamisesti Ennakoi hoitovasteen ja eloonjäämisen naistentautien Syövät. PLoS ONE 10 (12): e0145754. doi: 10,1371 /journal.pone.0145754

Editor: Goli samimi, National Cancer Institute, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 27 lokakuu 2015; Hyväksytty: 08 joulukuu 2015; Julkaistu: 30 joulukuu 2015

Copyright: © 2015 Pereira et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: Nämä tutkimukset rahoitettiin, osittain lahjoituksia Varadi Munasarjojen aloite Cancer Education (ÄÄNI), The Derald H. Ruttenberg Foundation ja MS Gordon perhe. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

naistentautien syöpäsairauksia diagnosoidaan yli 94000 naisten Yhdysvaltain ja johtaa lähes 29000 kuolemantapausta pelkästään tänä vuonna [1]. Kehittäminen herkempi ja tarkempi biomarkkerit ovat kriittisiä sekä aiemmin havaita taudin ja tehokkaamman valvonnan jälkikäsittelyssä ympäristössä. Esimerkiksi epiteelin munasarjasyöpä, kaikkein vaarallisin naisen synnytyskanavassa maligniteetti maailmanlaajuisesti, useimmat naiset esittelee kanssa pitkälle tauti, joka hallinnoi kirurginen resektio seurasi yhdistelmä platinaa ja taksaania kemoterapiaan. Harhaanjohtavasti, nykyisellä ilmaisinteknologiasta, 80% näistä potilaista tulee saada valmiiksi kliininen vaste ensisijainen hoito. Itse asiassa yli puolet kehittyy tauti uusiutuu 18 kuukauden kuluessa. Siten kriittinen ajanjakso aloittamista aggressiivisempaa hoitoa aikaisemmin ja parantaa selviytymistä on mahdollisesti menetetään lopullisesti. Ainoa käytettävissä oleva seerumin biomarkkereiden vuonna gynecologic pahanlaatuisia CA-125, puuttuu herkkyys ja seurantaa hoitovasteen ja varhainen havaitseminen toistumisen [2,3]. Kuvantamismodaliteetit lukien tietokonetomografia (CT) skannaus käytetään yleisesti taudin seurannan lisäksi puuttuu herkkyys ja jäävät usein epäselvä tai jätättää osoittavat taudin etenemiseen [4,5].

absoluuttinen määrä solutonta DNA (cfDNA) potilaan seerumia merkki taudin esiintyminen gynekologiset maligniteettien oli ensin tutkittu yli 10 vuotta sitten [6,7]. Myötä uusien sekvensointiteknologioihin ja analyyttisiä tekniikoita, kyky havaita verenkierrossa kasvain-spesifisen DNA: n (ctDNA), jota usein kutsutaan nimellä ”nestemäinen koepala”, on kehittynyt. Mittaus ctDNA on osoitettu olevan tarkkaa kuvaa sairauden läsnäolon ja kasvaimen kehittyminen useissa syöpätyypeissä, mukaan lukien rinta-, keuhko-, paksusuoli-, ja mahasyöpä [8-12]. Aiemmat tutkimukset gynekologiset pahanlaatuisia kasvaimia ovat arvioitiin pääasiassa läsnäolo ctDNA yhdellä kertaa pisteen avulla lantion pesee, askites, seerumi ja plasma [13-15]. Koska proof-of-periaatteen tutkimus osoittaa kykyä sarjatuotantona seurata taudin äskettäin käytetty kasvainspesifisen fuusio tapahtuma osoittaa jatkuva läsnäolo ctDNA, ja täten minimaalinen jäljellä taudin yhdellä potilaalla yli neljän vuoden aikana edessä toistuvasti normaalin CA125 mittaukset [16]. Tämän lisäksi pitkittäistutkimuksissa korreloivat ctDNA tasoilla kasvaintaakkaa ja kliininen kurssi gynekologiset syövät puuttuvat. Kuitenkin teoreettinen dynaaminen, herkkä ja erityisen luonteen ctDNA biomarkkerina ehdottaa hyvät mahdollisuudet mullistaa lähestymistapamme kasvaimen valvontaa gynekologiset syövät.

Ohessa kuvataan nopea ja tehokas putki että parit kasvainspesifisiksi pistemutaatio samaistuminen pisaran digitaalinen PCR-pohjainen ctDNA havaitsemiseen. Olemme testanneet tämän putken havaita ja valvoa kasvain asemaa 44 naisilla gynekologiset syövät. Erityisesti käyttämällä yhdistelmää koko exome sekvensointi (WES) ja ohjannut geenisekvensseihin paneeli, olemme koonneet kasvain mutaatio profiileja kohortin munasarjojen ja kohdun limakalvon syöpä potilaita. Potilaasta peräisin paneelit ctDNA biomarkkereiden luotiin ja testattiin käyttäen pisaran digitaalisen PCR, jota validoitu pystyttävä havaitsemaan yksittäisiä kopioita ctDNA per seeruminäytteessä. CtDNA Tuloksia verrataan nykyiseen FDA-hyväksytty seerumin biologisten merkkiaineiden, CA125, CT skannaus ja tunnetun kirurgisen /kliininen potilaan asemaan. Tämä on ensimmäinen tutkimus osoittaa in gynekologiset syövät, jotka ctDNA voi havaita syövän aikaisemmin kuin muut nykysuositusta testaus säännöt ja että ctDNA tasoilla loppuun ensisijainen hoito on itsenäinen ennustaja sekä progression free (PFS) ja kokonaiselossaoloaika ( OS).

Methods

Patient Ilmoittautuminen ja Sample Collection

Neljäkymmentäneljä potilaalla on gynecologic pahanlaatuisia otettiin ja osallistumaan hyväksyttyjen saatuaan asianmukaisen kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen osana meidän Institutional Review Board (IRB) -hyväksytty gynekologiset syöpään genomiikka ohjelma on Icahn School of Medicine Mount Sinai (taulukko 1). Kasvaimen kerättiin klo leikkauksen. Verinäytteet otettiin heti leikkauksen ja uudelleen jokaisen verenotto potilaan koko kliininen kurssi. Kirurginen Kasvainkudos heti flash jäädytettiin nestetypessä sadonkorjuun jälkeen ja seerumi kerättiin BD Vacutainer SST II Advance Putket (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ). Neljän tunnin sisällä keräyksen jälkeen verinäytteet sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 12000 g). Seerumi siirrettiin 15 ml: n Falcon-putkeen ja sentrifugoitiin 1,200g vielä 10 minuuttia poistamaan jäljellä solujätteen. Kliiniset tiedot uutettiin potilaskertomustaan ​​ja mukana demografiset muuttujat, alustava kasvainpaikkaa, histologia, laatu, vaihe, CA-125 tasot ja solunsalpaajahoitojen. Tiedot koskevat kirurgisia toimenpiteitä, sivustoja etäpesäkkeitä, ja kasvaimen uusiutumisen, kerättiin myös. Kaikki potilaat, joilla kohdun limakalvon tai munasarjasyöpä olivat oikeutettuja ilmoittautuminen, jos tarvittavat näytteet mukaan tutkimussuunnitelman ja kliiniset tiedot olivat saatavissa: CA-125 tasoilla, tietokonetomografia (CT) tulokset, kirurgiset tuloksia ja sytostaattihoitoon.

DNA Extraction pöytäkirjat

Perimän kasvaimen DNA uutettiin noin 25-50mg kudosta käyttäen DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, GmbH, Hilden) mukaan valmistajan ohjeiden. Ituradan DNA uutettiin kokoverestä käyttäen ArchivePure DNA Kit (5 Prime) mukaisen DNA: n puhdistus protokollan kokoveren, jos valmistajan. Kvantifiointi genomista DNA: ta suoritettiin käyttämällä jonka Qubit fluorometrialla. Verenkierrossa vapaa (cfDNA) eristettiin 1 ml seerumin käyttämällä Liikkuva Nucleic Acid Kit (Qiagen, GmbH, Hilden) ja eluoitiin 105 ul DNase- ja RNAasi-vapaa vesi.

tunnistaminen somaattisista mutaatioista

Henkilökohtainen kasvain mutaatio profiileja havaittiin jokaisen potilaan kasvain joko koko exome sekvensointi (WES) tai kohdennettu geenisekvensseihin lähestymistapaa. Molemmissa määrityksissä, genomista DNA: ta (gDNA) peräisin kasvainkudoksen ja normaalin valvonnan sekvensoitiin tunnistaa geneettisiä variantteja (SNVs ja pieni indeleitä) spesifinen kasvaimeen vain (somaattisista mutaatioista). Kaikki sekvensointi suoritettiin sisällä Genetiikan ja Genomics klo Icahn School of Medicine Mount Sinai. Koko genomin kirjastot valmistettiin gDNA käyttäen NEBNext DNA-kirjasto Prep Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA), rikastettu koko exome kirjastoja käyttäen SeqCap EZ Human Exome Library v3.0 talteenottojärjestelmä (Roche NimbleGen, Madison, WI) , jotka kattavat noin 64 Mb genomin jossa variantteja voidaan kutsua; pariksi-end sekvensointi (2×100 nt lukee) tehtiin Illumina HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, CA) joko High Output tai Rapid Run tilassa. Kohdennettu geenin sekvensointi suoritettiin käyttäen Ion AmpliSeq

TM Cancer hotspot Panel v2 (Life Technologies, Carlsbad, CA) käyttäen Ion Torrent PGM sekvensointi teknologiaa ~ 1000 3000X kattavuus. Ion AmpliSeq

TM Cancer hotspot Panel v2 kuulustelee 50 onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille poikki 207 amplikoneihin (joka kattaa 21820 nt jossa variantteja voidaan kutsua). Kokemuksen perusteella ehdokas somaattiset mutaatiot triaged varten Taqman koetinta kehittämiseen jos mutantti alleeli osa oli ≥ 8% ja johdetaan manuaalista tarkistusta tarkastamalla raaka lukea linjauksia vuonna IGV genomin selain työkalu, sitten validoitu lopullinen sukupolven koetin suoralla Sangerin sekvensoinnilla kasvain DNA ja sen pariksi ääreisverenkierron mononukleaarisia solu (PBMC) genomista DNA: ta. Koska WES tietojen suuremman määrän ehdokkaan somaattisten mutaatioiden kuin oli käytännöllistä vahvistaa, ehdokkaita korkeampi alleelinen fraktion ja parempaa variantin puhelun laatua priorisoitiin.

PCR Assay Design and Validation

Custom Taqman suunniteltiin käyttämällä Life Technologies web-pohjainen suunnittelu työkalu (www.lifetechnologies.com/order/custom-genomic-products). Analyysit sisälsi merkitsemätön PCR-alukkeet (eteenpäin ja taaksepäin) lisäksi VIC, TET tai FAM leimattuja koettimia, jotka testattiin villityyppisen ja mutantin variantteja vastaavasti. Kokeet sitten validoitu kvantitatiivinen PCR (qPCR) käyttäen TaqMan® genotyypin Master Mix (Life Technologies, Foster City, CA) ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Ensin spesifisyys määritettiin testaamalla määrityksiä kasvaimen ja Hyväksytty PBMC genomista DNA: ta. Lineaarisuus kunkin testin jälkeen määritettiin vertaamalla kutakin määritystä standardikäyrää vastaan, joka on valmistettu sarjasta sarjalaimennoksia kasvaimen DNA: ta, jotka vaihtelevat arvoista 400-4000 genomista yhtä kappaletta erityisiä, että määritys.

Mutaatio kvantitointi in Circulating Free DNA (cfDNA) B

edelleen vahvistaa herkkyys, lineaarisuus ja alarajat havaitsemisen, kehitetty määrityksiä testattiin sitten pisaran digitaalinen PCR (Raindance Technologies, Billerica, MA) kohti valmistajan protokollaa. Tätä tarkoitusta varten sarjalaimennoksia kasvaimen DNA: ta, valmistettiin kutakin määritystä varten, ja jotka vaihtelevat 2-24 kopioita oli lisätty taustalla 100000 kopiota genomisen villityypin DNA: ta. Kun detektion alaraja määritettiin jokaisessa määrityksessä, ddPCR suoritettiin cfDNA uutettu potilaan seerumia ja /tai plasmaa. Kaksikymmentä ui eluoitiin cfDNA käytettiin kunkin PCR-reaktiossa, mikä 200 ui seerumia. Kokonaismäärä PCR-reaktion tilavuus oli 50 ui (tuottaa 10 ^ 6 pisaroita). PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 95 ° C 10 minuutin ajan yhden syklin; 95C (15 sekuntia) ja 58C (yksi minuutti), jossa on vaihe 45 sykliä kutakin; ja 98C (10 minuuttia). PCR-tuote syötetään sitten sadepisara Sense väline määrän villityypin ja mutantti-kopioluvut. Kukin cfDNA näyte analysoitiin vähintään kaksi rinnakkaista. Perustaa määritys toistettavuus ja tehokkuus cfDNA louhinta, me piikki kutakin potilasta verinäytteestä tunnetun pitoisuuden kanssa Lambda DNA pilkottiin HindIII faagilla (Qiagen, GmbH, Hilden) ennen cfDNA eristämistä. qPCR käytettiin määrällisesti 125 ja 535 bp: n DNA-fragmentteja λ- HindIII: lla. Perustuen λ DNA uuttotehokkuuden, elpyminen hyötysuhde cfDNA uuttoja käytettiin näissä tutkimuksissa oli 60 ja 90%.

Tilastollinen analyysi

arvioimiseksi kykyä ctDNA ja CA125 ennustaa läsnäoloa kasvaimen TT kuvantamisen ja leikkauksen aikana, parametrien herkkyyden ja spesifisyyden sekä vastaavat 95%: n luottamusväli laskettu käyttäen log-binomiselle malleja, otettiin huomioon korrelaatiot syntyneestä että on useita mittauksia samalla potilaaseen aika. Ennustettu todennäköisyydet Näistä varustettu mallien käytettiin sitten logistisen regression avulla voidaan arvioida ja verrata alueilla Vastaanottimen Operating Characteristic (ROC) käyrät (AUC) sekä ctDNA ja CA125. Kokonaiselinaika (OS) ja elinaika ilman taudin etenemistä (PFS) arvioitiin käyttäen menetelmää Kaplan-Meier ja verrattiin log-rank-testi, potilaiden välillä tasojen ctDNA jotka olivat läsnä- tai poissaolevaksi seuraavan kirurginen resektio ja adjuvanttihoito. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SAS versiossa 9,3 (SAS Institute, Inc., Cary, NC). Hypoteesien testaus oli kaksipuolisia ja suoritettiin 5%: n merkitys.

Tulokset

ennusteeseen viittaavia ominaisuudet Potilaiden ja heidän Kasvaimet

Neljäkymmentäneljä potilailla, jotka saavat hoitoa gynekologiset syöpä otettiin tätä tutkimusta varten ja niiden syövän tyyppi ja ennusteeseen viittaavia tietoja on esitetty taulukossa 1. Kasvaimen johdettuja DNA, ituradan DNA, ctDNA ja kliiniset tiedot olivat käytettävissä kaikille potilaille. Kaikki munasarjojen kasvaimia olivat korkealaatuista serous histologia lukuun ottamatta yhtä pahanlaatuinen sekoitettu mesodermal kasvain. Vaikka suurin osa kohdun limakalvon syöpiä olivat korkeat luokalla histologiset alatyypit vaihdeltiin. Varten meidän analyysi korkealaatuisesta vakavasta kasvaimia munanjohdin, vatsakalvon ja munasarja olivat ryhmittyneet lantion korkealaatuisesta vakavien karsinoomien (HGSC). Suurin osa kasvaimista sekvensoitiin kerättiin aikaan ensisijaisen leikkaus (n = 40), kun taas neljä kasvain näytteet olivat peräisin toistuminen.

tunnistaminen somaattisen Genomic vaihtoehdot ja kehittäminen Henkilökohtainen ddPCR Analyysit

Katsaus meidän henkilökohtainen ctDNA analyysi putki esitetään S1 kuvassa. Käyttämällä yhdistelmää WES ja kohdennettuja paneeli sekvensointi, ensin tavoitteena oli tunnistaa merkittävät kasvain mutaatioiden kehittämiseen pisaran digitaalisen PCR (ddPCR) -pohjaisen määritykset. Kahdeksan kasvaimia sekvensoitiin käyttäen WES tietojen Illumina pariksi lopussa sekvensointi kerätään HiSeq 2500 ja 36 sekvensoitiin käyttämällä kohdennettua Ion AmpliSeq ™ Cancer hotspot Panel v2 käyttäen Ion Torrent PGM sekvensseri. Kaikki kasvaimet sekvensoitiin käyttämällä WES olivat munasarjojen kasvaimia. Seeruminäytteet olivat saatavilla joko primäärinen tai sekundäärinen leikkaus kaikille potilaille. Pitkittäinen seerumit olivat käytettävissä 23 potilasta. ctDNA uutettiin yhteensä 228 yksittäisten ajankohtina ja keskimäärin 7,8 ajankohtina potilasta kohden (kuvio 1).

Candidate mutaatioita tunnistettiin 36 potilailla (S1 taulukko). Mutaatioista löysi käyttäen kohdennettua paneelin yleisimmin mutatoitunut geeni oli TP53 (23/36 potilasta; 66%), joka on aina esiintynyt korkealaatuisesta seroosinen histologia sekä munasarja- ja kohdun limakalvon kasvaimet. Mutaatiot tunnistettiin myös, vaikkakin alemmilla taajuuksilla, PTEN, PIK3CA, MET, KRAS, FBXW7 ja BRAF. Useita ehdokas mutaatioita tunnistettiin 16 potilailla. Kaikki ehdokas mutaatiot vahvistettiin Sangerin sekvensoinnilla vastaavien kasvaimia.

Yhteensä 52 ainutlaatuinen määrityksiä, ulos 55 suunniteltu, todensi herkkyys, spesifisyys ja lineaarisuus käyttämällä kvantitatiivista PCR (qPCR), jotka edustavat 32 potilasta joka ctDNA kvantitatiivisia tutkimuksia voitaisiin suorittaa. Kestävyydestä eri määrityksiä luodaan jokaista potilaiden osoitettiin useita eri tietoja. Kaikkien 52 määrityksissä, korrelaatiokerroin lineaarisuuden, R

2, oli suurempi kuin 0,99 (keskiarvo, 0,9988, S2A kuvassa). Alempi Toteamisrajojen perustettiin kullekin henkilökohtaisen määrityksessä käytetään teräviä kasvain DNA vastaavista potilaan tunnettujen mutaatioiden ja testataan 2-24 mutantti kappaleena taustalla 100000 villityypin niiden kopioiden ituradan DNA. Perustuu Näiden testien herkkyys erottamaan villityypin ja mutantti-sekvenssin kaikkia koettimia käytettiin tässä tutkimuksessa vaihteli 0,01% ja 0,002%. Kvantifiointi erityisiä kasvain mutantti kappaleena cfDNA oli korreloi vuonna ddPCR näytteitä (Pearson r: 0,9938, S2C kuvassa). Oli myös suuri lineaarinen korrelaatio alleeliset osa määritettynä ddPCR ja kohdennettua sekvensointi (Pearson r: 0,95) ja tämä korrelaatio oli tilastollisesti merkitsevä p = 4.47E-15 (S2D Kuva).

arvioiminen Herkkyys ja erityisyys ctDNA ennustaa kasvaimen Presence

arvioitiin sitten kykyä sarjatuotannossa kerättyjen ctDNA seulomiseksi kliinisiin läsnäolo kasvain. Samalla olemme myös verrattuna nykyisin käytössä FDA-hyväksytty koe, CA-125. Perustaa suhteellinen kentällä totuus kasvaimen läsnäolon, käytimme CT kuvantaminen ja havainnot aikaan leikkauksen. Vaikka suhteellisen epätarkka, tämä ei anna voimme tunnistaa useita tärkeitä havaintoja. Data verrataan ctDNA ja CA-125 tasoilla läsnäolo kasvain CT kuvantaminen oli saatavilla kaikkialla 53 ajankohtina 23 potilasta.

herkkyys ja spesifisyys ctDNA ennustaa läsnäolo kasvain pariksi CT oli 0,91 [0,73-0,97] ja 0,60 [,31-+0,83], vastaavasti (taulukko 2). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin CA-125 ja CT-skannaus (taulukko 2). Alhainen spesifisyys ctDNA oli yllättävää meille ja niin me tutkimme tätä tarkemmin. Ero havaittiin olevan seurausta puute välistä yhdenmukaisuutta testien kuudella potilaalla. Erityisesti kaikki kuusi potilailla oli havaittavissa olevia ctDNA mutta negatiiviset CT kuvantamisen tuloksia kahden viikon ctDNA veren piirtää. Kuulustelu niiden täydellisen historian paljasti, että kaikki kuusi potilasta havaittiin myöhemmin leikkaukseen todistettu kasvaimia, joita ei ollut havaittu CT skannaus. Lisäksi analyysi potilaan tietojen mukaan keskimäärin ctDNA ennustaa toistumisen noin 7 kuukautta (vaihteluväli: 1-11 kuukautta) aikaisemmin kuin TT kuvantaminen (kuvio 2).

Tässä edustava esimerkki, nousu ctDNA tasoilla potilaan 137 tasoa edeltää noususta CA-125 tasot kuudella kuukaudella ja edeltävältä ajalta positiivinen tunnistus tuumorikasvun vaativat suoliston resektiota seitsemän kuukautta myöhemmin. CT skannaus oli epäspesifistä ja potilas tuotiin leikkaussaliin koekalastuksen kirurgia, joka paljasti kasvain.

CA-125 ja ctDNA tasoja verrattiin sitten läsnäolo kasvain klo leikkauksen yli 30 kertaa pistettä 21 potilasta. Kun verrataan läsnäolo tuumorin leikkauksen, ctDNA herkkyys oli 0,81 [0,60-0,92], ja spesifisyys 0,99 [0,81-0,99]. Vertailun vuoksi herkkyys ja spesifisyys CA-125 oli 0,82 [+0,61-+0,93] ja 0,64 [,17-,94], tässä järjestyksessä. Alaan kuuluvat ROC käyrät laskettiin ctDNA ja CA-125 ja oli 0,91 [0,83-0,99] ja 0,70 [0,44-0,95], tässä järjestyksessä. Vaikka nämä tulokset viittaavat siihen, että ctDNA voisi olla tarkempi diagnostinen testi kuin CA-125, ero ROC kaarteissa ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,3575) [Taulukko 2].

ctDNA Levels seuraavat Aloitushoito ennustavat of Survival erot

seuraava arvioineet ctDNA tasoilla leikkaushaavan resektion ja adjuvanttihoito oli ennustetekijöiden merkitys. Pre- ja jälkikäsittely ctDNA tasot analysoitiin 10 potilasta ja verrattiin PFS ja OS. Tämänhetkinen kliininen tila, kuollut taudin (DOD), elossa tauti (AWD) ja mitään tautiin (NED), oli saatavilla kaikille 10 potilaalla (taulukko 3). Havaitsemattomia tasoja ctDNA Alkuperäisten adjuvanttihoitona liittyivät sekä parannettu PFS (p = 0,0011 Kaplan Meier) ja OS (p = 0,0194; kuvio 3). Mediaani PFS ero oli vain yli 2 vuotta (kuusi kuukautta vs. 32 kuukautta). Kaikki neljä potilasta, joilla keskimääräinen jälkikäsittely ctDNA tasolle ≥ 10 kopiota /ml ovat DOD, kun taas yksi potilas, jolla ctDNA = 5 kopiota /ml, joka myös kiehtovan oli hyvin alhainen ctDNA esikäsittely, on AWD. Viidestä potilaalla on havaittavissa ctDNA tasoilla jälkikäsittelyä, kukaan ei ole kuollut heidän sairautensa, kolme ovat AWD ja kaksi NED. Kaksi potilaista on jo, selviytyivät yli 5 vuotta. Totesimme ei selviytymisen eroja perustuu ctDNA hoitoa edeltävällä.

Kaplan-Meierin analyysin etenemisestä vapaan (vasen paneeli) ja kokonaiseloonjääminen (oikea paneeli) välillä yksilöiden havaittavissa (ctDNA = 0; siniset viivat) ja havaittavissa ctDNA (≥ 1, punaiset viivat). Merkittäviä eroja ilman taudin etenemistä (p = 0,001) ja kokonaiseloonjääminen (p = 0,0194) välillä huomaamaton ja havaittavissa ryhmiä.

Keskustelu

osoittaa, että sarja mittaus of ctDNA on valvonta biomarkkereiden gynekologisissa syöpiä, jotka on niin herkkä ja yksityiskohtainen kuin FDA-hyväksytty seerumin biomarkkereiden CA-125 ja voi havaita taudin uusiutumisen kuukautta aikaisemmin kuin CT skannaus. Lisäksi mittaus ctDNA tasoilla aikaan loppuun ensimmäisenä hoitona, rajaamisvai- leikkaus ja yhdistelmä platina /taksaani dubletti kemoterapiaa, tarjoaa uuden ennustaja selviytymisen eroja potilailla. Erityisesti havaittavissa tasot ctDNA liittyivät sekä parannettu ilman taudin etenemistä ja kokonaiselinaika. Tutkimuksessamme väestö, ero PFS oli runsaat kaksi vuotta naisten kanssa havaittavissa ja havaitsemattomia tasoja ctDNA. Nämä erot, aiemmin havaita kuin TT kuvantaminen ja erottelu naisten huonompi ja parempi eloonjääminen, on silmiinpistävää, koska teoreettinen perusta syövän valvonta on, että aiemmin havaita johtaa parempiin hoitovaihtoehtojen ja tuloksia. Mikä on tällä hetkellä tiedossa on, että tällä hetkellä, ja tukeutuen kliininen tutkimus, CA-125 mittaukset ja kuvantaminen, valtaosa munasarjasyöpä potilaista hoidon alussa on diagnosoitu olevan täydellinen kliininen vaste. Tästä huolimatta yli puolet näistä naisista kehittyy tauti uusiutuu 18 kuukauden kuluessa.

CA-125 ja CT kuvantaminen ovat useimmin käytetyt valvonta säännöt munasarjojen ja kohdun limakalvon syöpiä. Jopa niin, CA-125 pidetään vapaaehtoista ja CT-kuvantaminen suositellaan vain osoitettu kliinisesti National Kattava Cancer Network (NCCN) suuntaviivat [17]. Ylöspäin 50% munasarjasyöpäpotilaalle normaali CA125 tasoilla kemoterapian jälkeen kuitenkin olla pysyviä sairaus vaan erotettaisiin toisistaan ​​potilaat pelkästään tämä biomarkkereiden hetkellä ei ole mahdollista [18]. Sillä ~ 50% potilaista, joilla jatkuva sairaus, lisääntynyt herkkyys ja tarjoaman genomiikan lähestymistapa voisi mahdollistaa alakohtia luokittelun potilaiden auttaa erottamaan taudin ja terapeuttinen alatyyppejä. CA-125 on myös laajalti ilmaista muissa kudoksissa ja on kohonnut hyvänlaatuinen prosesseissa kuten endometrioosi, kohdun leiomyoomat, hyvänlaatuinen adnexal massat, munanjohtimien tulehdus, maksasairaus, sydämen vajaatoiminta, kuukautisia, ja raskaus, rajoittaa sen hyödyllisyys valvontaan munasarjasyöpään [ ,,,0],19]. Lopuksi puoliintumisaika arvioitu vaihtelevan 9-44 päivää [20], CA-125 ei voi tarjota yhtä nopeaa vastauksena kasvaimen tilavuuden muutoksia ctDNA. Toisaalta, kun CT kuvantaminen on tavallinen lähestymistapa arvioinnissa toistumisen tauti, meidän kohortissa oli kuusi antamalla negatiivisille CT kuvantamisen havaittavissa ctDNA edessä jäljellä tauti. Lisäksi, ja kuten edellä on mainittu, nousua ctDNA edeltää radiologinen todisteita kasvaimen uusiutumisen, keskimäärin 7 kuukautta.

useita muita syöpätyyppejä, ctDNA tasojen on osoitettu tarkemmin korreloivat muutoksiin kasvaimen tilavuus kuin tällä hetkellä saatavilla biomarkkerit [8], mutta pitkittäinen ihmisen tutkimukset korreloivat ctDNA tasoilla tuumoritaakka gynekologiset pahanlaatuisia kasvaimia oli puuttunut. Aiemmin ryhmämme raportoitu havaitsemiseen geneettisten uudelleenjärjestelyjen, erityisesti fuusio tapahtumia, ja niiden käyttö ctDNA määrityksissä jälkikäteen seurata potilaan kanssa pitkälle munasarjasyöpä [16]. Perusteet aloittamisen meidän oli, että tästä huolimatta potilaan historian näennäisestä kliinisen remission perustuu useita negatiivisia kliinisiä, biokemiallisia ja radiologisia tutkimuksia hänellä oli useita toistuminen. Neljän vuoden aikana potilas koki ensisijainen debulking kirurgian ja kemoterapia, kasvaimen uusiutumista, ja useita solunsalpaajahoitojen. Verinäytteet pitkittäin kerätty ja tallennettu meidän Biopankkiverkosto osana tutkimusohjelmaa. Kun taas postsurgical CA125 tasot kohosivat vain kolme kertaa 28 mittauksia, erityiset fuusio ctDNA biomarkkerit oli helposti havaittavissa kaikissa näistä samoista verinäytteistä ja kasvaimen uusiutumista. Vaikka emme suoraan korreloi ctDNA määrän kanssa tuumorikuorma, kasvain-spesifisen fuusion ctDNA edelleen havaittavissa aikoina ilmeisen kliinisen remission, joka osoittaa kykyä ctDNA havaita okkultismin taudin munasarjasyöpä.

Tässä Tässä tutkimuksessa, nyt osoitettava kykynsä herkästi havaita yhden pistemutaatioiden digitaalisen PCR klo erityispiirteet jopa yli 0,01% monimutkaisesta näytteestä. Käyttämällä tätä putki, kun potilas-erityinen ctDNA koettimet on luotu ja vahvistettu, testaus seeruminäytteistä voidaan suorittaa muutamassa tunnissa ja on helppo sisällyttää seurantaohjelmaa (S3 kuvassa). Lähestymistapamme ei vaadi aikaisempaa tietoa kasvainspesifisten geneettisiä muutoksia kunkin potilaan kasvaimesta. Tässä tutkimuksessa käytimme yhdistelmää WES ja kohdennettua paneeli, joka kohdistuu 50 yleisesti muuntunut onkogeenien ja tuumorisuppressoreilla. Tämä yhdistetty lähestymistapa pystyimme tuottamaan ctDNA koettimien 82% naisista tutkimuksessamme. Kuten odotettua, WES tunnistettu mutaatioita 8/8 kasvaimen näytteitä. Syöpä paneeli että käytimme antoi meille mahdollisuuden kuulustella 207 amplikoneihin poikki 50 onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille hyvin peittävä ja johti mutaatioiden tunnistaminen 28/36 (78%) näytteistä. Tulevaisuudessa käyttöön sekvensointi paneelien keskitytään erityisesti munasarjojen ja kohdun limakalvon syöpien pitäisi mahdollistaa vieläkin vahvempaa ja tehokkaampaa tunnistamisen alustalla.

Tavoitteena Näiden seuraavan sukupolven seurantatutkimuksia on havaita taudin uusiutumisen aikaisemmin niin että potilaat on enemmän optimaalinen kirurgisia ehdokkaita, niiden hoidoista tehokkaammin yksilöllisiä ja, jos ja kun välttämätöntä, triaged terapeuttista tutkimuksissa. Toisaalta joillekin naisille, käyttö ctDNA perustuvien biomarkkereiden voisi vähentää tarpeettomat toimenpiteet, johtaa vähemmän yli hoidossa ja kiertää taloudellisia kustannuksia ja säteily liittyvät CT kuvantamistutkimukset. Lopulta, nyt ctDNA on osoitettu havaita jäljellä taudin aikaisemmin ja voidaan erottaa toisistaan ​​naisten huonompi ja parempi eloonjäämisen munasarja- ja kohdun limakalvon syöpien, kliiniset tutkimukset määritellään hyödyllisyys ctDNA kuin valvonta-työkalu gynekologiset syövät voidaan nyt suunnitella.

tukeminen Information

S1 Kuva. Katsaus ctDNA analyysin putki.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0145754.s001

(TIF)

S2 Kuva. Tarkkuus ja toistettavuus ddPCR määritystä PT208 (TP53 mutaatio; CHR 17: 7577539; G A) ctDNA havaitsemiseen ja kvantifiointiin.

(A) määritys lineaarisuus määritettiin analysoimalla sarja- kertaiseksi kasvain alleelin murto laimennoksia. Mutant kopioita havaitsema ddPCR järjestelmän tuki se R

2 0,99. (B) alaraja havaitsemisen tätä analyysiä varten perustettiin piikittämällä sarja- kasvaimen DNA laimennoksia pohja 100000 kopiota genomiyksikköä potilaan ituradan DNA. Fractional mutaatio pitoisuus prosenttiosuudet vaihtelivat +0,025-+0,002 ja analysoitiin ddPCR. Mutaatio jae havaittiin niinkin alhainen kuin 0,002%. (C) Samanlaiset toistettavuutta varten ctDNA havaitsemiseen. Pearsonin korrelaatio yksittäisten rinnakkaisnäytteiden lasketaan ja esitetään (Pearson r = 0,99) (D) sopimus mutantti alleeliset murto määrityksen tilan sekvensointi ja ddPCR (p = 4.47E-15).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0145754. S002

(TIF)

S3 Fig. Nykyinen ja ehdotettu gynecologic valvonta algoritmia.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0145754.s003

(TIF) B S1 Taulukko. Ehdokas kasvain spesifisiä mutaatioita tunnistettiin WES ja kohdennettuja sekvensointi.

Näytteet kuulustelivat WES on korostettu tähdellä.