Krooninen sairaus

tiivistelmä

PTEN, joka on fosfoinositidi-3-fosfataasi, palvelee kaksi rooleja tuumorisuppressorina ja säädin solun anabolisten /katabolisessa aineenvaihduntaa. Mukauttaminen redox-herkkien kysteinyyli tiolin PTEN signaalitransduktion vetyperoksidilla saattaa olla päällekkäin haavoittuvuuden muiden välittäjäaineiden oksidatiivisen stressin ja tulehdusta, erityisesti reaktiivisia karbonyyli lajeja, jotka ovat yleisesti esiintyviä sivutuotteita arakidonihappoa peroksidaation. Käyttämällä MCF7 ja HEK-293-soluissa, me raportoimme että useat reaktiiviset aldehydit ja ketonit, esim. elektrofiilisen α, β-enals (akroleiini, 4-hydroksi-2-nonenaali) ja α, β-enones (prostaglandiini

2, Δ12-prostaglandiini J

2 ja 15-deoksi-Δ-12,14- prostaglandiini J

2) kovalenttisesti muokata ja inaktivoivat solujen PTEN, mistä seuraa aktivointi PKB /Akt-kinaasin; fosforylaatiota Akt alustoista; lisääntynyt solujen lisääntymistä; ja lisääntynyt ydinvoiman β-kateniinin signalointi. Alkylaatio PTEN by α, β-enals /enones ja häiriöitä sen turvalaite solun PKB /Akt signalointi voi voimistaa hyperplastic ja kasvainhäiriöt liittyy krooninen tulehdus, oksidatiivisen stressin tai ikääntyminen.

Citation: Covey TM, Edes K, Coombs GS, Virshup DM, Fitzpatrick FA (2010) alkylointi tuumorisuppressorigeenin PTEN Aktivoi Akt ja β-kateniinin Signaling: mekanismi linkittäminen tulehdus ja oksidatiivinen stressi syöpä. PLoS ONE 5 (10): e13545. doi: 10,1371 /journal.pone.0013545

Editor: Marcelo G. Bonini, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 heinäkuu 2010; Hyväksytty: 30 elokuu 2010; Julkaistu: 21 lokakuu 2010

Copyright: © 2010 Covey et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat National Institutes of Health Research Project Grant R01 AI 26730 (Frank A. Fitzpatrick), -tutkimusohjelma Projects PO1 CA73992 Project 4 (David M. Virshup) ja Projekti 5 (Frank A. Fitzpatrick), ja pienet apurahaohjelma R03 MH082387 -01 (Gary S. Coombs, David M. Virshup ja Frank A. Fitzpatrick). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tulehdus ja syöpä niveltyvät sidoksissa [1], [2]. ”Kytevän” tulehdus [3], jota kutsutaan myös para-tulehdus [4], esiintyy monenlaisia ​​premaligneja ja pahanlaatuisia kasvaimia, esim. suolen kasvainten ja adenokarsinooma joiden sisältö tulehduksellisten leukosyyttien ja tulehduksellinen entsyymi COX-2-(COX-2) vaikutus etenemistä, ennustetta ja selviytyminen [5], [6]. Ei-steroidiset anti-inflammatoriset lääkkeet (NSAID: t), jotka estävät COX-2 voi estää tietyt, mutta eivät kaikki, syövät [7]; ja jotkut tulehduskipulääkkeet, kuten sulindaakkisulfonin, toimia riippumattomasti COX ja prostaglandiini E

2 (PGE

2) esto [8]. Muut tulehduskipulääkkeet, esim. selekoksibi, voi paradoksaalisesti parantaa syövän etenemisen APC

Min /+ hiirillä, mikä malli suoliston tumorigeneesin [9]. Vaikka COX-2 ja sen metaboliitti PGE

2 ovat epäilemättä tärkeitä, para-tulehdus voivat parantaa kasvaimen kehittymisen mekanismeja, jotka ovat puutteellisesti. Synnynnäisen immuniteetin mekanismit ovat ensisijaisia ​​ehdokkaita tutkimuksessa.

yleensä, synnynnäisen immuniteetin tulehdus muodostuu ”haavoittumisen” vaihe tuhota taudinaiheuttajia, ja ”parantava” vaihe korjata ja elvyttää vahingoittuneita isännän kudosta [10]. Siirtyminen vaiheiden välillä riippuu vähittäinen loppuminen tulehduksen välittäjäaineiden ja muuntaminen eräiden proinflammatoristen välittäjäaineiden, esim. PGD ​​

2, osaksi tulehdusta aineenvaihduntatuotteita, Δ12-PGJ

2 [11], [12], [13]. Elements of tulehtunut sivuston itse, esim. reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), albumiini, fibroblastit ja neutrofiilit, organisoida tämä muuntaminen [14], [15], [16], [17]. Esimerkiksi, reaktiivisen hapen (ROS) aiheuttaa ei-entsymaattinen peroksidaation välttämättömiä rasvahappoja, kuten arakidonihappoa (AA) [18]. AA hydroperoksidit muuttaa helposti reaktiivisen sisältävät tuotteet α, β-tyydyttymättömiä karbonyyli [19], [20], jotka sisältävät akroleiinin (2-propenaali) [21], [22], 4-hydroksi-2-nonenaali (4-HNE) [23], ja syklopentenonin prostaglandiinien (cyPGs), PGA

2 ja Δ12-PGJ

2 [24]. Kovalenttisen modifikaation NFKB ja IKKα /β-proteiinien näiden α, ß-tyydyttymättömän karbonyylin aineenvaihduntatuotteiden (eli proteiini alkylointi) näyttää olevan ”kytkin” lopettaa tulehdusta [25]. Tämän ennakkotapauksen, me arveltu, että alkylointi voi toimia myös ”kytkin” aloittaa korjaus ja uudistaminen kudosten vahingoittamien tulehdusta.

PTEN (fosfataasi tensin homologia kromosomissa 10) on fosfoinositidi-3-fosfataasi kanssa kaksi fysiologiset tehtävät: tuumorisuppressoriproteiinia ja säädin anabolisten /catabolic solusignalointia.

PTEN

geeni usein mutatoitunut tai inaktivoituvat edenneisiin syöpiin [26]. Käyttämällä MCF7 ja HEK-293-soluissa, me raportoimme, että reaktiivinen α, ß-tyydyttymättömän karbonyylin (akroleiini, 4-HNE, ja Δ12-PGJ

2) inaktivoivat PTEN-proteiinin – ei geeni – alkyloimalla. Inaktivointi PTEN by α, -tyydyttämättömiin karbonyylit johtaa lisääntyneeseen Akt signalointi, enhanced ydin- β-kateniinin signalointi, ja täydennetty solujen lisääntymistä. Redox opastinjärjestelmillä PTEN ehkä ovat kehittyneet, jotta soluja (kudokset) ositusta vaste oksidatiivista stressiä. Esimerkiksi ohimenevä esto PTEN reaktiivisen hapen tai karbonyyli lajeja, ja vastaava signalointi kautta Akt /GSK3p: n /β-kateniinin /TCF4 /Lef1 hyötyisi isännän kautta kasvava leviämisen ja uudistumista kudoksen vahingoittamien akuutin tulehduksen tai oksidatiivista stressiä. Hairahtunut ja pysyviä PTEN inaktivointia saman molekyylimekanismin saattaa suosia kasvainten etenemistä ja antaa tuntemus on välillä ”kytee” tulehdus ja tiettyjen syöpien, erityisesti kolorektaalisyöpä, jossa sekä PTEN ja APC tuumorisuppressoreita rajoittaa ydinaseiden β-kateniinin signalointi [27] .

tulokset

Euroopan α, -tyydyttämättömiin karbonyylejä akroleiini, 4-HNE ja Δ12-PGJ

2 kovalenttisesti muokkaamaan cellular PTEN

alttiina MCF-7-soluissa edustavia α, -tyydyttämättömiin karbonyyli (kuvio 1 C) tai H

2O

2, niin valikoivasti koodattu tahansa proteiineja, jotka oli hapettunut tai karbonyloidaan tioleja käyttäen NEM-biotiinia (kuvio 1A). Sitten erottautuvat proteiinien kanssa biotiini epitoopin päälle NeutrAvidin (NA) helmet ja tunnistettujen karbonyloidaan PTEN SDS-PAGE ja immunoblottaus. MCF-7-soluja käsiteltiin 10 uM Δ12-PGJ

2, 4-HNE tai akroleiinin sisälsi karbonyloidaan PTEN määrinä verrattavissa soluja käsiteltiin 100 uM H

2O

2 (kuvio 1A, NA alasveto) . Tämä menetelmä ei erotella hapettunut ja karbonyloidaan tioleihin PTEN. Kuitenkin, elektroforeesi ei-pelkistävissä olosuhteissa, mitä seuraa Western blotting osoitti, että PTEN liikkui erillinen isoformi johtuen hapettuneen disulfidi [28], [29], joka tapahtui vain soluissa, joita käsiteltiin 100 uM H

2O

2, mutta ei soluissa, joita käsiteltiin α, ß-tyydyttymättömän karbonyylin (Δ12-PGJ

2, 4-HNE, akroleiini) tai 15-HPETE: tä, joka on lipidivetyperoksiditasojen (kuvio 1 B).

(A) kaavio menettelyn tunnistamiseksi PTEN hapetettu tai alkyloidun tioli soluissa alttiina ROS tai α, -tyydyttämättömiin karbonyylien. Anti-PTEN immunoblottaus osoittaa hapettuneen tai karbonyloidaan PTEN (NA Pulldown) suhteessa koko PTEN (Cell Lysate) eristettiin MCF-7-soluja käsiteltiin 30 min ajoneuvon (DMSO), 10 uM Δ12-PGJ

2 tai 4-HNE vs. 10 min 100 uM H

2O

2; immunoblottauksesta erillisestä koe osoittaa hapettuneen, karbonyloidaan ja yhteensä PTEN soluissa käsiteltiin 30 min ajoneuvon tai 20pM akroleiini vs. 10 min 100 uM H

2O

2. (B) Anti-PTEN immunoblottaus MCF-7-solujen lysaatit eroteltiin SDS-PAGElla ei-pelkistävissä olosuhteissa. PTEN hapettaa Cys

124-Cys

71 disulfidi näkyy nopeammin muuttavien lajien (PTEN hapettunut disulfidi) ainoastaan ​​käsiteltyjä soluja H

2O

2. Tämä laji oli havaittavissa MCF-7cells käsitelty 30 min DMSO ajoneuvon tai 20 uM kutakin Δ12-PGJ

2, 4-HNE, akroleiini tai 15-HPETE. (C) Kemialliset rakenteet tyypillinen α, ß-tyydyttymättömän karbonyylin. Akroleiini ja 4-HNE ovat α, β enals; Δ12PGJ

2 on α, β enoni. Elektrofiilisen β hiiltä on merkitty δ

+. Blotit edustaja saatujen tulosten vähintään kolmen erillisen kokeen.

Cyclopenteneone PG-biotiini analogit ovat malli α, β-enones että alkyloida PTEN

kysteinyylirajatulla tiolaattia PTEN aktiivinen site (-HC (X

5) RT) on altis hapettumiselle, koska se on vahva nukleofiilin, pKa -5. Tämä piirre pitäisi myös helpottaa alkylointi PTEN by α, -tyydyttämättömiin karbonyylien. Käytimme CyPG-biotiini-analogit, joilla on elektrofiilisen β-hiili, joka kykenee nukleofiilinen additio (Michael-reaktio), kemiallisia malleja testata tätä hypoteesia [30]. Alkyloimalla tahansa solun proteiinien nämä analogit toisi biotiini epitoopin

de novo

(kuvio 2A). PGA

1-biotiinia ja Δ12 PGJ

2-biotiinia molemmat otettiin ylös MCF-7-soluihin ja muodostivat kovalenttisia addukteja -20 proteiineja (kuvio 2B). Δ12 PGJ

2-biotiini (bi-funktionaalinen dienonia) oli enemmän reaktiivista kuin PGA

1-biotiini (mono-toiminnallinen enoni), sopimalla toisten kanssa, jotka on raportoitu ~20-30 proteeinikohteet modifioitu cyPG-biotiinia 3T3-soluja tai mitokondrioissa [31], [32]. Takavarikko on

de novo

biotinyloitu solun proteiinien NA helmiä, minkä jälkeen immunoblottauksella anti-PTEN-vasta-aineita, osoitti, että PTEN muodostivat kovalenttinen adduktin -10-kertaisesti enemmän herkästi Δ12-PGJ

2-biotiini kuin PGA

1biotin (kuvio 2C, kaista 4 vs kaista 3).

(A) Michael-addition reaktio PTEN ja Δ12-PGJ

2-biotiini analoginen. Käsittelyn jälkeen solujen cyPG-biotiini, proteiinit, joiden

de novo

biotiinia epitoopin erottautuvat päälle neutravidiini-helmiä (NA Pulldown), sitten fraktioitiin SDS-PAGE immunoblottauksella. (B) Anti-biotiini-immunoblottaus proteiinien lysaateista MCF-7-solut, joita käsiteltiin DMSO: ssa (kaista 1), 10 uM PGA

1-biotiini (kaista 2), ja 10 uM Δ12PGJ

2-biotiini (kaista 3). Δ12-PGJ

2 biotiini muodostunut kovalenttinen additioyhdistettä proteiineja helpommin kuin PGA

1-biotiinia (nuolenpäät). (C) Anti-PTEN immunoblottaus solun PTEN, että muodostuu kovalenttinen addukti cyPG-biotiini (NA Pulldown) suhteessa koko PTEN (Cell Lysate) MCF-7-soluja käsiteltiin DMSO: ssa (kaista 1), 1 tai 10 uM PGA

1-biotiini (kaistat 2, 3), ja 1 tai 10 uM PGJ

2-biotiini (kaistat 4, 5). Blotit edustaja saatujen tulosten vähintään kolmen erillisen kokeen.

Euroopan α, ß-enoni, Δ12-PGJ

2, häiritsee PTEN tukahduttaminen Akt-kinaasin

kasvutekijät, insuliini, ja muut ärsykkeet nopea PI3-K tehdä PIP

3, joka rekrytoi PKB /Akt-kinaasin solukalvoon jossa PDK1 /2 fosforyloi Akt Thr

308 ja Akt Pa

473 jäämiä, vastaavasti [33], [34], [35]. PTEN down-regulation PKB /Akt aktivoitumisen metabolizing PIP

3 PIP

2 [36]. α, -tyydyttämättömiin karbonyyleiksi että alkyloida solujen PTEN voi haitata sen tukahduttaminen Akt-kinaasin. Edustava α, ß-enoni, Δ12-PGJ

2, aiheutti pitoisuus ja ajasta riippuva nousu fosforia (T

308) Akt MCF-7-soluissa. Niin vähän kuin ~ 2 uM Δ12-PGJ

2 aiheutti puoli-maksimaalisen vasteen (kuvio 3A). Kohonneita solu fosforia (T

308) Akt olivat havaittavissa 10 min, maksimaalinen 30 min, ja kestää 120 min (kuvio 3B). Δ12-PGJ

2 lisääntynyt muodostuminen fosforia (T

308) Akt muuttamatta muodostumista fosforia (S

241) PDK1 (kinaasi fosforyloi T

308 Akt), ja ilman muuttamalla PTEN-proteiinin ilmentyminen (kuvio 3C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että Δ12-PGJ

2 häirinneet PTEN kykyä hillitä aktivoitumisen Akt-kinaasin. Tämän mukaisesti tulkinnan, co-solujen käsittely cyPGs plus 50 uM LY294002, alentuneet fosforia (T

308) Akt estämällä PI3-K, kärkeen on PI3-K /→ PDK1 /2 → Akt kinaasikaskadin (kuvio 3C, kaistat 3 vs 2 ja 6 vs. 5). Lisäksi 1 uM eri PGA ja PGJ isomeerit ja muut α, ß-enones suoraan esti eristetään PTEN entsyymiä [Taulukko 1]. Elektrofiilisen β-hiileen cyPGs on välttämätöntä esto, koska rakenteeltaan samanlaisia, mutta ei-elektrofiilisen cyPG, PFI

1, oli aktiivinen.

(A) immunobloteista fosforia (T

308 ) Akt suhteessa koko Akt lysaateista MCF-7-solut käsiteltiin 30 min 0-20 uM Δ12-PGJ

2. Pylväsdiagrammi näyttää lisääntyminen fosforia (T

308) Akt /yhteensä Akt (keskiarvo ± SEM) päässä n≥3 erillisen kokeen. (B) Immunoblotti fosforia (T

308) Akt suhteessa koko Akt lysaateista MCF-7-solut käsitellään 20 uM Δ12-PGJ

2 0-120 min. Pylväsdiagrammi näyttää lisääntyminen fosforia (T

308) Akt /yhteensä Akt (keskiarvo ± S.E.M.) välillä n = 4 erillisen kokeen. (C) immunobloteista yhteensä Akt, fosforia (T

308) Akt, PTEN, fosforia (S

241) PDK1 lysaateista MCF-7-solut käsiteltiin 30 minuutin ajan 20 uM Δ12-PGJ

2 (kaista 2, 3) ja 20 uM PGA

1 (kaista 5, 6), kun läsnä on PI3-K-inhibiittori 50 uM LY294002 (kaista 3, 6) tai DMSO: ajoneuvon (kaista 2, 5). (D) Immunoblotti fosforia (T

308) Akt suhteessa koko Akt lysaateista MCF-7-solut käsiteltiin 4 tuntia kanssa ajoneuvon syklopentenoneista – PGJ

2, Δ12-PGJ

2, ja 15-deoksi-Δ12-PGJ

2, tai niiden esiaste PGD

2. For (C) ja (D), blotteja edustavat tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Rakenne-aktiivisuussuhde kokeet osoittivat, että erilaisia ​​J-sarjan cyPGs, mukaan lukien PGJ

2 , Δ12 PGJ

2 ja 15-deoksi Δ12, 14-PGJ

2, lisääntynyt fosforia (T

308) Akt MCF-7-solut, verrattuna ajoneuvoon tai niiden esiaste PGD

2 (Kuva 3D). PGA

1 oli vähäinen vaikutus solujen Akt-fosforylaation (kuvio 3C, kaista 5), ​​joka vastaa sen heikompi kovalenttinen muokkaus solun PTEN (kuvio 2C, kaista 3).

Aktivoidut fosforia (T

308 /S

473) Akt kinaasi voi fosforyloida eri proteiinin substraatteja, jotka säätelevät solujen lisääntymistä ja kohtalo [35]. Fosforylaatiota Akt substraattien kanssa RxRxx-fosfo-S /T-epitoopin, samaan aikaan lisääntynyt fosforia (T

308) Akt MCF-7-solut käsitellään 10 uM Δ12-PGJ

2 (kuvio 4A). Akt kinaasiaktivaatiota ajoittui myös Akt-riippuvaisen proliferaation MCF-7-solut käsiteltiin 1-10 uM Δ12-PGJ

2 (kuva 4B). Tämä havainto on johdonmukainen raportoitu kaksivaiheiseen toimia cyPGs, jolloin ne lisäävät leviämisen viljellyistä solujen ~ 1 uM [37], [38], vaikka ne vähentävät lisääntymistä tai aiheuttaa apoptoosia muokkaamalla muiden proteeinikohteet ~ 50 uM [39 ].

(A) immunobloteista fosforia (T

308) Akt yhteensä Akt, ja useat fosfopro- kanssa (K /R) -x- (K /R) -xx- (S /T), motiivin tunnustettu ja fosforyloitiin aktiivista fosforia (T

308) Akt, vuonna lysaatit MCF-7-solujen käsiteltyjen 0 ja 10 uM Δ12-PGJ

2. (B) Suhteellinen leviämisen MCF-7-solut (keskiarvo ± sem, n = 4) käsiteltiin 0, 1, ja 10 uM Δ12-PGJ

2 yksin (▪), tai kun läsnä on 10 uM inhibiittoria IV (▪), Akt-kinaasin estäjä. (C) immunobloteista fosforia (S

473) Akt yhteensä Akt; fosfo (S

9) GSK3p yhteensä GSK3p; ja β-kateniinin ja tubuliinin lysaateissa HEK 293-soluissa hoidon jälkeen 0,1, 3, 6 ja 16 tuntia 6 uM Δ12PGJ

2, 6 uM 4-HNE tai 20 uM akroleiini. For (A) ja (C), blotteja edustavat tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

α, ß-tyydyttymättömän karbonyylin aiheuttaa ajasta riippuva kertyminen solujen fosforia (S

473) Akt kinaasi (aktiivinen) → fosforia (S

9) GSK3p (inaktiivinen) → β-kateniinin ja nousun ydin- β-kateniinin signalointi

GSK3p muuntaa β-kateniinin ja fosforia (S

33/37 /T

41) β-kateniinin, joka on nopeasti eliminoitu 26S-proteasomin [40]. GSK3p toimii yhteistuumin tuumorisuppressorigeenin APC. Vuonna soluja mutantti APC, tai kun WNT ligandeja stimuloida solujen villityypin APC, GSK3p ei fosfory- β-kateniinin, jonka avulla se voi kerääntyä, assosioituvat muiden ydin- transkriptiotekijöiden ja ilmaista sen kohde- geenejä (esim

c-myc

,

sykliini D1

) [41]. PTEN voi estää β-kateniinin kerääntyminen /signalointi suosimalla säilyttäminen aktiivisen GSK3 # ja aktiivinen PKB /Akt-kinaasin joissakin [42], [43], mutta ei kaikkia kokeellisia järjestelmiä [44], [45]. Vastaavasti inaktivoitu PTEN pitäisi lisätä β-kateniinin signalointi suosimalla säilyttäminen inaktiivinen fosforia (S

9) GSK3p ja aktiivista fosforia (S

473) Akt kinaasi. Olemme siis arveltu, että nämä elektrofiilisen sovittelijat voivat vaikuttaa ß-kateniinin signalointi tämän mekanismin kautta. Tutkia asiaa tarkemmin, käytimme HEK 293-solut, joilla on ehjä ß-kateniinin signalointireittiin. Huomasimme, että eri α, -tyydyttämättömiin karbonyyleiksi että alkyloidut PTEN (6 uM Δ12 PGJ

2, 6 uM 4-HNE ja 20 uM akroleiinin) aiheuttivat kaikki ajasta riippuva nousu fosforia (S

473 ) Akt (eli aktiivisen Akt kinaasi), jossa on vastaava nousu fosforia (S

9) GSK3p (eli aktiivinen GSK3p) ja β-kateniinin (kuvio 4C). Sen määrittämiseksi, onko α, β-tyydyttymättömiä karbonyylin parannettu ydin- β-kateniinin signalointia, käytimme HEK 293 -solut muokattu vakaasti ilmentämään WNT3A ja SuperTopFlash (STF) reportterigeeni [46]. Nämä solut, joita kutsutaan STF3A soluja, mikä salainen WNT3A, autokriinisellä /parakriininen ärsyke FZD reseptoreihin, joka hidastaa APC-riippuvainen hajoamista β-kateniinin (kuvio 5A). Nuclear β-kateniinin signalointi STF3A soluissa on verrannollinen niiden lusiferaasiekspressio (aktiivisuutta), ja ne reagoivat DKK1, joka on WNT antagonisti, joka esti β-kateniinin signalointi STF3A solujen pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio 5B).

(A) STF3A solujen satama stabiilisti integroitu siirtogeenin, joka ilmentää WNT3A (). Kun erittyy, WNT3A saa aikaan autokriininen /parakriininen stimulaation fzl reseptorien (), joka estää APC-riippuvainen liikevaihdon β-kateniinin (). Jos β-kateniinin ei fosforyloituu GSK3p, se voi kerääntyä kuin β-kateniinin: LEF dimeeriä () ja sitoutuvat tahoja vakaasti yhdistetty β-kateniinin: lusiferaasireportterigeenillä (SuperTop Flash) (). Lusiferaasiaktiivisuutta solulysaateista on verrannollinen ydin- β-kateniinin signalointi. (B) Nuclear β-kateniinin signalointia (lusiferaasin luminesenssi) in STF3A soluissa (2 x 10

4 solua /kuoppa) kasvatettiin 24 tuntia väliaineessa, joka sisältää 0, 10 tai 30 ng /ml DKK1 (keskiarvo + sd, n = 3). DKK1, Wnt- antagonisti, inhiboi β-kateniinin signalointia (C) Nuclear β-kateniinin signalointi STF3A solujen (2 x 10

4 solua /kuoppa) kasvatettiin 24 tuntia väliaineessa, joka sisältää 20 uM cyPGs; α, β-enals tai ensisijainen PG. Useat reaktiivisia elektrofiilejä parannettu β-kateniinin opastinjärjestelmillä ~2-4 kertaiseksi. Histogrammi edustaa keskiarvoa + sem, n = 4.

Useat reative karbonyyli metaboliitteja, joista jokaisella on elektrofiilisen α, β enoni tai enaali substituentti, lisääntynyt ilmentyminen on β-kateniinin: lusiferaasireportteri- geenin STF3A solut (kuvio 5C). Lusiferaasireporttiterilla aktiivisuus nousi ~ 4-kertainen verrattuna lähtötilanteeseen (p 0,01) STF3A soluja inkuboitiin Δ12 PGJ

2 tai 4-HNE; by ~ 3-kertaiseksi (p 0,01) soluissa muiden PGJ analogien, akroleiini tai 4-ONE; ja ~1.5-kertaisesti (p 0,05) soluissa PGA

2. Yhdenmukainen mekaanistetulle hypoteesia, eikä PFI

2 tai MDA oli havaittava vaikutus. PFI

2 on cyPG, mutta tautomerismi estää maksu hajauttamiseen tarvitaan luomaan elektrofiilisen β hiili, jota tarvitaan proteiinien alkylointi. MDA (β-hydroksi-akroleiini) tunkeutuu solukalvojen huonosti, koska se on 99% ionisoitunut fysiologisessa pH: ssa ~7.4 käytetty kokeissa. Kumpikaan PGE

2 eikä muuta ensisijainen PG aineenvaihduntatuotteita COX-1 tai -2 ollut vaikutusta ydin- β-kateniinin signalointi STF3A soluissa. Me kiinnittää huomiota siihen, että kohdunulkoinen yli-ilmentyminen EP reseptorien HEK 293-soluissa tarvittiin aikaan mitään PGE

2: n välittämien β-kateniinin signalointi [47]. Heikko vaste PGE

2 ja muiden PG: n kuviossa 5C voi heijastaa konstitutiivinen taso EP, FP, DP tai IP-reseptorien STF3A soluissa tai nopea aineenvaihdunta PG, tai molemmat.

Tehostettu β- kateniinin signalointi STF3A soluissa oli pitoisuudesta riippuvainen välillä 2-20 uM akroleiini, 4-HNE ja Δ12 PGJ

2 (kuvio 6A). Ehtyminen solun GSH on ~ 10% perustasosta käsittelemällä 100gM BSO voimistua β-kateniinin signalointi, esim. in STF3A solut käsiteltiin 2 ja 6 uM Δ12 PGJ

2 (kuvio 6B). Tämä on sopusoinnussa sen osuuden kanssa pelkistetyn glutationin konjugointimenetelmässä reaktiivisten metaboliittien ja suojelu redox herkkiä proteiinien alkylointi [20].

(A) Nuclear β-kateniinin signalointia (lusiferaasin luminesenssi) in STF3A soluissa ( 2 x 10

4 solua /kuoppa) kasvatettiin 24 tuntia väliaineessa, joka sisältää 0, 2, 6 ja 20 uM kutakin akroleiinin (□), Δ12 PGJ

2 (▪) ja 4-HNE (▪). (B) NMR-β-kateniinin signalointi STF3A solujen (2 x 10

4 solua /kuoppa) kasvatettiin 24 tunnin ajan elatusaineessa, joka sisälsi 0, 2 tai 6 uM Δ12 PGJ

2 yksin (▪) tai Δ12 PGJ

2 plus 100 uM BSO. GSH tasoilla laski 79% ja 88% 6 ja 24 tuntia käsittelyn jälkeen solut BSO; 92-95% soluista oli yhä elinkykyinen 24 tuntia. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SEM n≥3 erillisen kokeen.

Keskustelu

PTEN

tuumorisuppressorigeeniä usein mutatoitunut tai inaktivoituvat pitkälle edenneisiin syöpiin [26 ], [48]. PTEN on fosfoinositidi-3-fosfataasi, joka metaboloi PIP

3 PIP

2 [36], jolloin laskuri säätelevä PKB /Akt, seriini /treoniinikinaasi esikasvaintekijän joka ohjaa anabolisia kasvu ja määrittely solukohtalon [33], [34], [35]. PTEN, itse säätelee posttranslationaalisesti fosforylaatio [49], asetylaatio [50], ja palautuvia hapetus sen katalyyttinen kysteiinin

124 jäännöksen [28], [29]. Hapettuminen solu PTEN voi liittyä H

2O

2 johdettu NADPH oksidaasin [51], superoksididismutaasi [52], tai entsymaattisilla peroksidaation arakidonihapon (AA) COX-1, COX-2 tai 5-LOX [53]. Kaikki nämä entsyymit ovat yleensä yli-ilmaisivat ja aktivoidaan tulehdus tai neoplastisen transformaation. PTEN hapetus, ja niihin mahdollisesti liittyvät patofysiologia, vaihtelee aste solujen altistuminen reaktiivisia happiradikaaleja (ROS). Näissä tutkimuksissa osoitamme, että kemia, joka helpottaa hapetusta PTEN voi myös helpottaa sen alkylointi elektrofiilisellä α, ß-enals ja α, β-enones [19], [20].

PTEN edustaa mukauttamista redox-reagoiva tiolit solujen signalointi, samoin kuin niiden mahdollinen haavoittuvuus sivutuotteiden oksidatiivista stressiä ja tulehdusta. PTEN on inaktivoitu kaksi erilaista redox-välitteisen prosessit: 1) intra- tai molekyylien välisen disulfidin muodostumisen ROS ja 2) tiolaatti karbonyloinnin (Michael-addition) elektrofiilisellä α, ß-tyydyttymättömän karbonyylin (kuvio 1-3). Vetyperoksidia (H

2O

2), joka on prototyyppiä ROS, estää solujen PTEN suoraan hapettamalla katalysointiominaisuudet Cys

124 kautta sulfenic happovälituotetta joka sitten muodostaa aktiivinen, molekyylin sisäisiä Cys

124-71 disulfidi [28], [29]. Meidän tiedot osoittavat, että useita edustavia, elektrofiilisen karbonyyli- lajeja (α, ß-enals ja α, ß-enones), joka voi esiintyä endogeenisesti sivutuotteina lipidiperoksidaation tulehduksen aikana tai oksidatiivista stressiä, alkylaattia ja inaktivoivat PTEN. Inaktivointi PTEN redox-välitteisen prosesseja aiheuttaa lisää aktiivisuutta esikasvaintekijän Akt. Hyperactivation Akt lisää leviämisen ja selviytymistä monia erilaisia ​​syöpiä.

signalointi H

2O

2 kattaa laajan pathophysiological jatkumo [54] ja vertailukelpoinen rooli reaktiivisen elektrofiileja vaikuttaa uskottavalta. Reaktiivisia karbonyyli- lajit, kuten akroleiini, 4-HNE ja Δ12PGJ

2 edustaa alaryhmä Elektrofiilisten yleisesti tuotettu oksidatiivista stressiä ja tulehdusta. Nämä havainnot saattavat ekstrapoloidaan elektrofiilisen tekijöille puuttuu karbonyylin mutta sisältää muita elektronin poistavia ryhmiä, ja kutsumme heitä yleisesti ”reaktiivisia elektrofiileja”. Ensinnäkin, kuten H

2O

2, reaktiivinen elektrofiilit esiintyä

in vivo

tulehduksen aikana ja oksidatiivisen stressin [16], [18], [19], [22]. Toiseksi, reaktiivinen elektrofiilit kovalenttisesti moduloida muita proteiineja, jotka säätelevät tärkeitä signaaliprosesseja; eli LKB1 /STK11 [55], NFKB [56], ja IKKβ. Kolmanneksi, H

2O

2 ja reaktiivinen elektrofiileja molemmat ovat peräisin yhdistelmästä spontaani ja entsyymiprosesseilla, joka usein sama tulehtuneissa kudoksissa [57]. H

2O

2 juontuu superoksidianionia, O

2

-, päämetaboliitin NADPH oksidaasien. Spontaani ja entsymaattiset jakaantumisen muuntaa O

2

– osaksi H

2O

2. Samoin, spontaani ja entsymaattinen lipidiperoksidaation tuottaa akroleiini ja 4-HNE [18], [57]. cyPGs peräisin lipidien endoperoxide PGH

2, päämetaboliitin COX-1 ja -2. Entsymaattinen ja spontaani katkeaminen on endoperoxide joukkovelkakirjojen muuntaa PGH

2 osaksi PGE

2 ja PGD

2; albumiini /seerumi sitten aiheuttaa niiden kuivumista osaksi PGA

2, PGJ

2, ja niiden isomeerit [14], [16], [24].

Vaikka spekulatiivinen, näyttää siltä, ​​että ROS ja reaktiivinen elektrofiilejä (H

2O

2, akroleiini, 4-HNE, Δ12 PGJ

2) voi olla sekä kehittyneet pelata erilaisia ​​rooleja luontaisen immuniteetin: 1) tuhota taudinaiheuttajia ja 2) erotetaan tulehdus. Analogisesti inaktivoinnin NFKB ja IKKαβ, tilapäinen inaktivaatio PTEN tuumorisuppressoriproteiinia sen alkyloinnilla, ja hoitaja aktivointi PKB /Akt-kinaasin esikasvaintekijät, saattaa auttaa normalisoimaan morfologia ja histologia at akuutisti tulehduspaikalle julkaisemalla niiden rajoittaminen soluproliferaatioon, anaboliset kasvua ja kohtalo erittely [34], [35]. Tavallisissa tilanteissa korjaus- ja resoluutio pitäisi auttaa lopettaa synnynnäisen immuniteetin tulehdus (kuva 7,). Tämä järjestelmä voi myös antaa väistämätön riskejä, jos PTEN inaktivoitiin errantly tai jatkuvasti. Lisäksi reaktiivisen elektrofiilit myös inaktivoivat muita merkittäviä tuumorisuppressorien, mukaan lukien p53 [30] ja LKB1 /STK11 [55]. Tämä yhdistettynä ja jatkuvaa inaktivaation tuumorisuppressoreilla voitaisiin edistää merkittävästi tulehdukseen liittyvä kasvaimen kehittymisen ja myöhemmin pidentää kierteen kasvaimeen liittyvien para-tulehdus (kuva 7,). Kaiken tietomme ja malli kohdista sen havainnon kanssa, että kasvaimet ovat haavat, jotka eivät parantua [58]. Tässä tilanteessa, kasvaimen etenemistä voi johtua osittain mal-mukauttaminen molekyyli mekanismi, joka kehittyi purkaa ja ratkaista synnynnäisen immuniteetin tulehdus.

Tulehdus on kriittinen osa syövän etenemisen. Monet syövät syntyy infektio-, kroonista ärsytystä ja tulehdusta. Kasvain microenvironment, joka koostuu pääosin tulehdussolujen, on tärkeä rooli neoplastisen prosessin edistämisessä lisääntymistä, eloonjääntiä, ja muuttoliike. Osoitamme tässä, että reaktiivisia karbonyyli- lajit, jotka ovat yleisesti tuotetaan tulehduksen aikana kovalenttisesti muokata ja inaktivoivat PTEN kasvaimia estävä. Tärkeää on, että mekanismi kuvaamme voi yleistää: 1) muut elektrofiilisen lajin syntyy tulehdus, oksidatiivisen tai xenobiotic stressin (eli muiden α, ß tyydyttymättömiä aldehydejä ja ketoneja; allyylinen tai vinyyli epoksidit, kinonit, chlorhydrins, chloramines, vinyyli- sulfonit, ja 2) muiden jäsenten PTP-superperheen, jotka ovat redox herkkiä. Nämä tutkimukset ulottuvat ymmärrystämme mekanismeista, joilla tulehdus myötävaikuttaa taudin alkamisen ja etenemisen syövän.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Käytimme minimi olennainen väliaine (MEM) , lisäravinteet, naudan insuliini, gentamisiini, ihmisen alkion munuaisen HEK-293-soluja, ja HEK-293-soluista, jotka sisältävät Epstein Barr-viruksen tuma-antigeeni-1-geenin (HEK-EBNA1) (Invitrogen, Carlsbad, CA); MCF-7-solut (HTB-22, American Type Culture Collection, Manassas, VA); PG, cyPG-biotiini analogit, ja WST runsaudenmäärityksessä sarjat (# 10008883) (Cayman Chemical; Ann Arbor, MI); Complete ™ proteaasinestäjä seosta (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN); lyysipuskuria 0,6% Igepal CA-630 PBS: ssä (Promega, Madison, WI); NeutrAvidin konjugoituja helmiä, NEM-biotiini ja vuohen anti-biotiini-polyklonaalisia vasta-aineita (# 31852) (Pierce Chemical, Rockford, IL); PI3-K estäjä, LY294002 (# 9901), polyklonaalisia vasta-aineita PTEN (# 9552), Akt (# 9271), fosforia (Thr

308) Akt (# 9375), fosforia (S

473 ) Akt (# 9271), fosforia (S

9) GSK3p (# 9336), GSK-3β (# 9332), fosforia (Ser

33/37 /Thr

41) β kateniinin ( # 9561S) K /RXk /RxxS /T (PO

4) epitoopit (# 9614) ja fosforia (S

241) PDK1 (# 3061) (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA); β-kateniinin (# C19220) (BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ); HRP (piparjuuriperoksidaasi) konjugoituja sekundäärisiä vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); polyvinylideenidifluoridi (PVDF) ja Western Salama ™ kemiluminesenssin reagenssit (Perkin-Elmer, Waltham, MA); PTEN entsyymianalyysiä sarjat (# 17-351) (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY); Akt estäjä IV (# 124011) (Calbiochem, San Diego, CA); akroleiinin (# 01680), krotonaldehydi (# 262668), L-Buthionine-sulfoksimiini (BSO) (B2515), H

2O

2 30% liuos (H-1009), malonidialdehydi (Fluka Cat. # 63287) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO); DKK-1 (# 1096-DK-010) (R Solut pakastettiin -80 ° C: ssa 15 min; siirretään imuroida ja inkuboitiin 1 h, 25 ° C: ssa 1 ml: lla O

2-uuttopuskuria (50 mM NaHPO

4, pH 7,0, 1 mM EDTA, 10 mM NEM [N-etyyli maleimidi], 10 mM IAA [jodietikkahapolla], 1% Triton X-100, 5 mM NaF, 50 ug /ml leupeptiiniä ja 50 ug /ml aprotiniini). Tämä käsittely valikoivasti alkylaatit kaikki alennetaan tiolien PTEN, mutta ei hapetettu tioleja tai tiolien modifioitu Michael lisäämällä reaktiivisen elektrofiileja. Näytteet pestiin 1 ml: O

2-uuttopuskuria siirrettiin sitten 15 ml kartiomaiseen putkeen. Kun oli lisätty SDS: n lopulliseen konsentraatioon 1% v /v, seosta pidettiin 2 tuntia 25 ° C: ssa pimeässä, ja proteiinit saostettiin TCA: lla [trikloorietikkahapolla], 10% v /v 1 tunti.