Krooninen sairaus

tiivistelmä

kaksivaiheista strategiaa, intraperitoneaalisen (IP) injektio poly (etyleeniglykoli) –

lohko

poly (ε-kaprolaktoni) (PEG-

b

-PCL) misellejä, jotka sisältävät paklitakselia (PTX), syklopamiini (CYP), ja gossypol (GSP) 30, 30, ja 30 mg /kg, tässä järjestyksessä, rajatusta tuumorikudokset 1,3-kertainen, perustuen menetys bioluminenssin 10% ruumiinpainon muutos, ja indusoi apoptoosia vatsakalvon kasvaimissa käytettäessä neoadjuvanttikemoterapian (nact) käytettäessä ES-2-luc-laakeri ksenografti malli munasarjasyöpä. Toisessa vaiheessa, yhden suonensisäisen (IV) injektio apoptoosin kohdistaminen GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-

b

-PCL misellien sisältää lähi-infrapuna (NIR) fluoresenssin koetin, DiR (1,1′-dioctadecyltetramethyl indotricarbocyanine jodidi), lisännyt vatsakalvon DiR kerääntyminen apoptoosin aiheuttaman ES-2-luc tuumorikudoksista (

ex vivo

) 1,5-kertaiseksi verrattuna DiR molekyylien toimittama metoksi- PEG-

b

-PCL misellejä (ei-kohdennettu) 48 h kuluttua IV injektion toisessa vaiheessa. Tämän seurauksena, tandem on PEG-

b

-PCL misellejä käytössä korkean resoluution havaitseminen

ca

. 1 mm kasvaimia, jolloin resektio noin 90% kasvaimista, ja alhainen vatsakalvon syövän indeksi (PCI) on

ca

. 7. Siten tandem on PEG-

b

-PCL misellejä käytetään NCAT ja NIR fluoresenssikuvantamisella hoidon aiheuttaman apoptoosin intraoperatiiviselle kirurginen ohjeet saattavat olla lupaava hoitostrategia metastaattisen munasarjasyövän.

Citation: Cho H, Cho CS, Indig GL, Lavasanifar A, Vakilin MR, Kwon GS (2014) Polymeeriset Misellit varten Apoptosis-Kohdennettu Optical Imaging of Cancer ja Intraoperative Surgical ohjaus. PLoS ONE 9 (2): e89968. doi: 10,1371 /journal.pone.0089968

Editor: Sung Wan Kim, University of Utah, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 marraskuu 2013; Hyväksytty: 23 tammikuu 2014; Julkaistu: 26 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Cho et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ sai taloudellista tukea National Institutes of Health (R21 CA-161537) ja Carbone Cancer Center University of Wisconsin-Madison. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyövän on kuvata sairauden, joka kuiskaa johtuen veltto oireita alkuvaiheessa [1]. Valitettavasti ei ole olemassa tehokkaita seulontatestit: yleinen seulonta seerumin syöpäantigeenipep- 125 (CA 125) tai transvaginal sonography ei salli varhainen havaitseminen munasarjasyöpä. Tämä johtuu osittain vaikeuksista diagnoosi, munasarjasyöpä on kaikkein vaarallisin gynecologic maligniteetti [2]. Tavanomainen hoito strategia munasarjasyövän liittyy yhdistettyä lähestymistapaa käyttäen aggressiivinen sytoreduktiivisen kirurgian ja suonensisäisen (IV) kemoterapia (platina ja taksaania analogit) [3].

Viime vuosikymmenen potentiaalinen hyöty kemoterapian kautta annettuja vatsaonteloon (IP) reitin munasarjasyöpä on nähty useissa kliinisissä tutkimuksissa, ja se on korostettu, että IP kemoterapiaa voi antaa korkean hoitovaste sisällä vatsan takia vatsakalvon plasman este rajoittamalla altistumista kemoterapiaa vatsakalvon pintoja, mikä johtaa suurempiin huumeiden pitoisuus vatsaonteloon [3].

Leikkaus on kriittinen potilailla, joilla on paksusuolen ja peräsuolen ja munasarjan syövät, jotka ovat levinneet laajalti vatsaontelo. On olemassa kolmenlaisia ​​kirurgisten debulking jotka ovat yrittäneet hoitaa munasarjasyöpä potilaat: (1) ensisijainen debulking leikkaus (alustava leikkaus), joka on suurelta osin ollut tavanomaista lähestymistapaa; (2) väli debulking leikkauksen jälkeen neoadjuvanttikemoterapian (nact), sellaisilla potilailla, jotka eivät terveydentilansa vuoksi välitöntä toimintaa varten tai joiden laaja etäpesäkkeitä ei voida aluksi resekoitu; ja (3) toissijainen debulking leikkaus (ylimääräinen leikkaus), potilaille, joille kehittyy uusiutuva solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpä [1]. Vaikka optimaalisen kirurginen lähestymistapa on edelleen kiistanalainen, on hyvin selvää, että parannettu intraoperative syöpä kuvantamisjärjestelmien tuottaa merkittävän edun onnistuneen kirurginen debulking munasarjasyöpä. Vaikka radiologisen lähestymistavat kuten tietokonetomografia (CT) ja magneettikuvaus (MRI) on suureksi avuksi kuvaavat maligniteettien sisällä vatsaontelossa, ne eivät ole käyttökelpoisia intraoperatiiviselle arviointia. Sen sijaan fluoresenssikuvantamisella on osoitettu olevan menestyksekäs prekliinisissä ja kliinisissä kokeissa optisena tekniikka tarjoaa reaaliaikaista kuvaa kirurgisen tavoitteiden (vatsakalvon carcinomatosis ja rintasyöpä) riittävän kuvantamisen tarkkuuden ja suuren intraoperative herkkyys [4] – [8] . Coll ja kollegat ilmoitti, että intraoperative lähi-infrapuna (NIR) fluoresenssi kuvaohjatut leikkausta käyttäen kasvaimeen kohdistaminen peptidi, lautta-c (RGDfK)

4-Alex Fluor 700 (IV reitti), joka TSA-pGL3-laakeri hiirimallissa vatsakalvon adenokarsinooma voitaisiin parantaa kirurgisen debulking kaksinkertaistamalla havaittujen kasvaimen kyhmyjä ja lyhentää toiminta-aikaa [5]. Ntziachristos ja työtovereiden toteuttanut ensimmäisen ihmisen oikeudenkäynti intraoperatiivisen kasvainspesifisten fluoresenssin kuvantamisen lavastus ja rajaamisvai- kirurgia munasarjasyöpä käyttäen IV folaatti-FITC, ja osoittautui, että määrä kasvaimia havaitaan kirurgien johdolla kasvainspesifisten fluoresenssi kuvien lisääntynyt 5,3-kertaiseksi (34

vs.

7) verrattuna valkoinen valo näköhavainnointia yksin [7]. Frangioni ja työtoverit osoittivat myös hyödyllisyys FLARE (Fluoresenssi-Assisted Kaarileikkaus ja Exploration) laite kuvaohjatut onkologisesta kirurgian ensimmäisen ihmisen kliinisessä tutkimuksessa rintasyövän Sentinel imusolmuke (SLN) kartoitus seuraavat kasvaimensisäistä /ihonalaisen 1 :1 sekoitus indosyaniinivihreää ja ihmisen seerumialbumiinia (ICG: HAS) [6]. Tässä tutkimuksessa SLNs tunnistaa lymphoscintigraphy ja NIR fluoresenssikuvantamisella oli sama 4 6 rintasyöpäpotilaiden.

Sovelluksen nanomateriaalien optisen fluoresenssikuvantamisella aineita käyttäen kvanttipisteiden, kultananopartikkeleilla, ja fluoresenssi koetin sisältäviä tai – konjugoitu nanohiukkasten on kiinnittänyt huomiota diagnoosia varten prekliinisissä tutkimuksissa [9] – [13]. Polymeeriset misellien kuuluvat suuren luokan nanomateriaaleja, jotka ovat tehneet useissa kliinisissä tutkimuksissa lääkkeen antamista varten,

esim

. SP-1049C (doksorubisiini, vaihe II), Genexol-PM (paklitakseli, vaihe II), ja NC-6004 (sisplatiini, vaihe I) [14]. Polymeeriset misellit tarjoavat useita etuja paitsi lääkekantajina vaan myös optisen kuvantamisen aineina onkologian: pienissä-hiukkasia, joiden kokojakauma on kapea, rakenteellinen vakaus, korkea vesiliukoisuus, matala myrkyllinen sivuvaikutus tavanomaisiin pinta-(

esim

. Cremophor EL), etuoikeutetut kerääntyminen kiinteitä kasvaimia tehostamalla läpäisevyyttä ja säilyttäminen (EPR) vaikutus, kiertää munuaissuodatuksen, ja monitoimisuuteen pinta koristeluun.

on keskusteltu, että apoptoosin kohdistuva lääkkeiden annostelu ja syövän kuvantaminen ( erityisesti varten kuvantamisen kasvaimen vastata kemoterapiaa) [15], [16] voisi olla parempi kuin syöpään liittyvää antigeeniä tai proteiinia kohdistaminen strategian laaja maligniteettien koska merkittävä heterogeenisyys syöpäsolun populaatioiden ei takaa yksinomainen läsnäolon antigeenin ja proteiinin biomarkkereita kohdekudoksissa [17]. Kirurginen onkologit voisivat hyödyntää apoptoosin kohdistetun kasvaimen kuvantamiseen (riippumatta solutyypin ja solukuolemaa indusoiva laukaisee) jälkeen nact tarkemmin ja tarkkuus [18]. Siten kirurginen kasvaimen rajaamisvai- käyttäen intraoperative visuaalista ohjausta reaaliaikaista NIR fluoresenssikuvia voisi parantaa kirurgisen tarkkuutta ja lopputulos. Yksi merkittävimmistä ominaisuuksista ohjelmoidun solukuoleman, apoptoosin, on ulkoistamisen fosfatidyyliseriinin (PS), jotka normaalisti asuu pääasiassa sisempi pakkausselosteessa solukalvon [18].

Meidän edellinen työ, kerroimme että poly (etyleeniglykoli) –

estää

poly (ε-kaprolaktoni) (PEG-

b

-PCL) misellit sisältävät DiR (1,1′-dioctadecyltetramethyl indotricarbocyanine jodidi) voi passiivisesti kerääntyä in LS180 ihmisen kiinteiden paksusuolen kasvain kudosten EPR toiminnalle sekä tarjotaan noninvasiivinen rajaaminen LS180 tuumorikudoksista Kasvaimelle-to-lihas suhde 30-43 kerätystä kudoksista [19]. Havaitsimme myös parannettu DiR kertymistä ”pohjustettu” LS180 tuumorikudoksista jälkeen IV injektion usean lääkkeen sisältävän poly (etyleeniglykoli) –

estää

poly (

D, L-maitohappo) (PEG –

b

-PLA) misellejä, mikä viittaa saatavuus tandem polymeerimateriaalien misellejä, jotka voivat antaa mahdollisuuden parannettu kasvain määrittely käytettäväksi kirurgisissa onkologian [20]. Viime aikoina, PEG-

b

-PCL misellejä paklitakselilla (PTX), syklopamiini (CYP), ja gossypol (GSP) 30, 30, ja 30 mg /kg, vastaavasti (q7d x 3) kautta toimitettu IP, esti metastaattisen leviämisen munasarjasyövän ja laaja askites muodostumista, mikä johtaa pitkäaikaiseen eloonjäämiseen vatsakalvonsisäisesti metastaattisen ES-2-luc (erilaistumaton adenokarsinooma, aggressiivinen alatyyppi) ja SKOV-3-luc (vakavien adenokarsinooma, kohtalainen-grade alatyyppi) hiiren -ksenografti malleja munasarjasyöpä [21].

Ehdotamme uutta kaksivaiheinen strategia nact, apoptoosin kohdistettuja optisen kuvantamisen ja intraoperative kirurgiset ohjaus (kuvio 1). Vaiheessa yksi, PEG-

b

-PCL misellejä sisältävän PTX, CYP, ja GSP käytetään IP nact ja apoptoosin induktio kasvainkudoksissa. Toisessa vaiheessa, apoptoosin kohdistus PEG-

b

-PCL misellejä, jotka sisältävät DiR voi aktiivisesti kerääntyä apoptoottisen tuumorikudoksissa, joka mahdollistaa optisen fluoresenssin kuvantamisen apoptoosin reaaliaikainen tavalla (kuvio 1). DiR molekyylejä, NIR fluoresenssikoetinta säteilevät valoa NIR aallonpituusalueella ikkuna, voisi olla käyttökelpoinen optisena fluoresenssikuvantamisella agentti, välttäen voimakas autofluorisaatiota iholta ja veren ja mahdollistaa havaittavia signaaleja mitata useita millimetrejä kudosten [22]. Tässä työssä osoitamme, että tämä kaksivaiheinen strategia parantaa kasvaimen rajaus NIR fluoresenssin optisen kuvantamisen ja hyödyllistä aineistoa aikaväli debulking kirurgian IP ES-2-luc-laakeri ksenograftimallia munasarjasyöpä, kytkemällä kaksi hakemusta polymeerimateriaalien misellien lääkkeenantojärjes- ja optisen kuvantamisen kirurgisiin syöpäsairauksien hoitoon munasarjasyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

valmistaminen PEG-

b

-PCL Misellit kantaminen PTX, CYP , ja GSP

Huumeisiin ladattu PEG-

b

-PCL -misellit valmistettiin haihduttamalla liuotin menetelmällä edellisen kuvattu [21]. Lyhyesti, 4,0 mg PTX, CYP, ja GSP kukin ja 120 mg PEG-

b

-PCL (M

n PEG = 5,000 g /mol, M

n PCL = 10000 g /mol, ja M

p /M

n = 1,26) (Advanced Polymer Materials Inc., Montreal, Kanada) liuotettiin täydellisesti 1,0 ml: ssa asetonia seuraa nopea lisäämällä 1,0 ml esilämmitettyä 0,9% suolaliuosta 60 ° C: ssa voimakkaasti sekoittaen. Asetoni haihdutettiin alennetussa paineessa 60 ° C: ssa. Vesipitoinen miselliliuosta sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 10000 x

g

ja läpi 0,2 um: n regeneroitua selluloosaa (RC) steriilillä ruiskulla suodattimen (Corning, Andover, MA) poistamaan liukenematon huumeita. Sisällön PTX, CYP, ja GSP-PEG-

b

-PCL misellien kvantitoitiin käänteisfaasi-HPLC: llä (RP-HPLC), jossa käytetään Shimadzu Prominence HPLC-järjestelmää (Himadzu, Japani), kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],21]. Erottaminen PTX, CYP, ja GSP tehtiin isokraattinen tilassa liikkuva faasi 55% asetonitriiliä, 45% tislattua vettä, ja 0,1% trifluorietikkahappoa. PTX, CYP, ja GSP seurattiin 227, 204, ja 373 nm, vastaavasti, ja eluoitui 2,7 min, 1,9 min ja 10,6 min, vastaavasti.

Valmisteet Apoptosis kohdistaminen PEG-

b

-PCL ja metoksi-PEG-

b

-PCL Misellit kantaminen DiR

valmistaminen apoptoosin kohdistaminen PEG-

b

-PCL (GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-

b

-PCL) misellien kuljettaa DiR aloitettiin muuntaminen asetaaliryhmiä pinnalla PEG-

b

-PCL misellien aldehydiryhmiksi (kuvio S1). Asetaali-PEG-

b

-PCL (M

n PEG = 5,000 g /mol, M

n PCL = 5,000 g /mol, ja M

p /M

n = 1,13) luovutti ystävällisesti Dr. Afsaneh Lavasanifar, University of Alberta (Edmonton, Kanada). Muunnostapa oli hieman muutos kirjallisuudesta [23]. Asetaali-PEG-

b

-PCL kopolymeeri liuotettiin asetoniin konsentraatiossa 20 mg /ml. Tislattua vettä lisättiin sitten nopeasti polymeeriliuokseen samalla voimakkaasti sekoittaen huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen haihduttamalla asetonia alennetussa paineessa huoneen lämpötilassa. Miselliliuosta sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 10000 x

g

ja johdetaan 0,2 pm RC steriiliin ruiskuun suodatin. Muuntaminen asetaaliryhmiä on asetaali-PEG-

b

-PCL misellien suoritettiin pH: ssa 2,0 lisäämällä 0,5 N HCI: a. 4 h kuluttua ja kohtuullisesti sekoittaen huoneen lämpötilassa, reaktio neutraloitiin 0,5 N NaOH reaktion pysäyttämiseksi. Neutraloitu miselliliuosta sitten dialysoitiin vettä dialyysikalvolle (MWCO 6000 g /mol) poistaa suolaa yön yli ja lyofilisoitiin 48 tunnin ajan tulevaa käyttöä varten. Lyofilisoitu näyte liuotettiin CDCI

3 (6 mg /ml) arvioida tulosprosentin asetaalin aldehydiksi ryhmään PEG-

b

-PCL by

1H-NMR. Vapaata peptidiä, GFNFRLKAGAKIRFGS (UW Biotechnology Center, Madison, WI) on Mw = 1769 g /mol (kuvio 2A), liuotettiin HEPES-puskuria (10 mM, pH 6,4) ja sekoitettiin lyofilisoitu aldehydin-PEG-

b

-PCL misellien saamiseksi 4 mg /ml polymeeriä ja 0,35 mg /ml peptidin pitoisuus, 02:01 moolisuhteessa (aldehydi-PEG-

b

-PCL: GFNFRLKAGAKIRFGS). 2 h kuluttua ja kohtuullisesti sekoittaen, NaBH

3CN (10 ekvivalenttia) lisättiin seokseen vähentää Schiffin emäksen. Jälkeen 4 päivää, miselliliuosta jälleen dialysoitiin vettä dialyysikalvolla (MWCO 6000 g /mol) yön yli ja sitten GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-

b

-PCL misellin liuos lyofilisoitiin 48 tuntia. Konjugaatio tehokkuus peptidin aldehydi–PEG-

b

-PCL määritettiin RP-HPLC-analyysillä. Lyhyesti, näytteet (10 ui) injektoitiin Zorbax 300SB-C18-pylvästä (4,6 x 15 mm, 3,5 um, Agilent), jota pidettiin 40 ° C: ssa ja virtausnopeus oli 0,8 ml /min. Gradienttieluointi suoritettiin liikkuva faasi 0,1% trifluorietikkahappo tislattua vettä ja 0,1% trifluorietikkahappoa 90/10 (v /v) asetonitriili /tislattu vesi. Liikkuva faasi ohjelmoitu seuraavasti: 0 min 85% liuotinta A ja 15% liuotinta B; 35 min, 50% liuotinta A ja 50% liuotinta B. Vapaa peptidi tarkkailtiin 215 nm ja eluoitui 16 min. Peptidin määrä konjugoidaan PEG-

b

-PCL misellien laskettiin vähentämällä määrä vapaan peptidin peptidin määrä alun perin lisättiin reaktioon. Samanaikaisesti lyofilisoitu peptidi konjugoidaan PEG-

b

-PCL liuotettiin DMSO

d

6 (6 mg /ml) laskemiseen konjugaation nopeudella peptidin PEG-

b

-PCL by

1 H-NMR 80 ° C: ssa.

tulokset esitetään% FLI DiR sitoutuneiden molekyylien lautasille ja% FLI DIR molekyyleistä sidottu ES-2-luc munasarjojen kasvain pallosia. BLI peräisin ES-2-luc soluja ja FLI DIR molekyyleistä kvantitoitiin käyttäen Xenogen IVIS 200 Series. (A) Kilpailukykyinen sitovaa testi apoptoosin kohdistaminen PEG-

b

-PCL misellejä kuljettaa DiR (1,0 uM peptidi ja 500 nM DiR) ja PC- tai PS-pinnoitettu 96-kuoppaisille levyille (yhteensä 200 uM fosfolipidiä ). (B) Kilpailukykyinen sitoutumisen testi apoptoosin kohdistaminen PEG-

b

-PCL misellien kuljettavat DIR apoptoosin aiheuttaman ES-2-luc munasarjakasvain pallosia (** 0,01, *** 0,001) .

metoksi-PEG-

b

-PCL ja apoptoosin kohdistamisen PEG-

b

-PCL misellejä kuljettavat DiR valmistettiin liuotinta haihduttamalla menetelmä: 4.0 mg polymeerien ja 0,1 mg DiR (Invitrogen, Carlsbad, CA) liuotettiin 1,0 ml: aan asetonia, minkä jälkeen lisätään nopeasti PBS: ää (10 mM, pH 7,4) samalla voimakkaasti sekoittaen. Asetoni haihdutettiin alennetussa paineessa huoneenlämpötilassa. Vesipitoinen miselli, joka sisälsi DiR sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 10000 x

g

ja johdetaan 0,2 pm RC steriiliä ruiskua suodatin poistaa rekisteröimätön DiR. Pitoisuus DiR misellejä kvantitatiivisesti RP-HPLC: llä, kuten aikaisemmin on kuvattu [20]. Eluointi DiR tehtiin gradientilla tilassa liikkuva faasi 70% tislattua vettä ja 0,07% trifluorietikkahappoa liuottimena A ja 30% asetonitriiliä ja 0,03% trifluorietikkahappoa liuottimena B. DiR tarkkailtiin 745 nm: ssä ja eluoitui 16 min.

Fyysinen karakterisointi metoksi-PEG-

b

-PCL ja Apoptosis kohdistamisen PEG-

b

-PCL Misellit kantaminen DiR

Z -average halkaisijat metoksi-PEG-

b

-PCL misellejä ja apoptoosin kohdistamisen PEG-

b

-PCL misellejä kuljettavat DiR määritettiin dynaamisella valonsironta (DLS) mittaukset Zetasizer Nano- ZS (Malvern Instruments, Iso-Britannia) 25 ° C: havaitsemisen kulma 173 ° ja He-Ne ioni laser (4 mW, λ = 633 nm) tulevan säteen. Autokorrelaatiofunktioista luotiin perusta Cumulant analyysin laskettaessa hydrodynaaminen halkaisija misellit Stokesin-Einsteinin yhtälö ja polydispersiteetti-indeksi (PDI). Ennen mittausten, miselli laimennettiin PBS: llä (10 mM, pH 7,4), jolloin saatiin polymeerin konsentraatio ~ 0,4 mg /ml, joka edustaa polymeerin pitoisuuden yläpuolella kriittinen misellikonsentraatio. DiR lataamisteho näkyi% paino DiR /paino polymeeri.

in vitro

DiR vapautumiskinetiikka metoksi-PEG-

b

-PCL ja apoptoosin kohdistamisen PEG-

b

-PCL misellien kuljettavat DiR tutkittiin arvioida aika 50% lääkeaineen vapautumista (t

1/2), joka perustuu yhden vaiheen rappeutuminen malliin käyttäen GraphPad Prism versio 5.00 Mac OS X (La Jolla, CA). DiR ladattu misellejä, jotka edustavat 100 ug /ml DiR, jotka lisättiin dialyysin kasetteja (MWCO 20000 g /mol), ja kasetteja laitettiin 2,0 l: aan PBS: ää (10 mM, pH 7,4) 37 ° C: ssa sekoittaen kohtuullisesti. Näytteet (20 μΛ poistettiin kasetit eri aikapisteissä, 0, 0,5, 1, 2, 3, 8, 12, ja 24 h ja sen jälkeen jokaisen näytteenoton, kasetit, täydennettiin 20 μΛ tuoretta PBS: ää (10 mM, pH 7,4 ). pitoisuus DiR miselleihin jäljellä kasetit analysoitiin RP-HPLC edellä kuvatulla tavalla.

arviointi PS-selektiivisen Binding of Apoptosis kohdistaminen PEG-

b

-PCL misellit kantaminen DiR

Sitovat apoptoosin kohdistaminen PEG-

b

-PCL misellien kuljettavat DiR PS arvioitiin käyttäen fosfolipidi-päällystettyjen kuoppalevyillä [24] ja 3-D kasvain pallosia muodostettu lusiferaasia ekspressoivan ES-2-luc-soluissa. PC tai PS liuotetaan etanoliin immobilisoitiin selvää pohjan 96-kuoppalevyille pitoisuudessa noin 200 uM kussakin kuopassa, ja etanoli haihdutettiin huoneenlämpötilassa yön yli. Jotkut PC tai PS-päällystetyn kuoppia inkuboitiin 1,0 uM vapaan peptidin 3 h kyllästää PS fosfolipidi-päällystettyihin kuoppiin. Apoptosis kohdistaminen PEG-

b

-PCL misellejä kuljettaa DiR, eli 1,0 uM peptidin ja 500 nM DiR, lisättiin kuoppiin ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Kukin kuoppa pestiin PBS: llä (10 mM, pH 7,4) ja apoptoosin kohdistamisen PEG-

b

-PCL misellit kuljettavat DiR sidottu kaivojen havaittiin Xenogen IVIS 200 Series (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) . ES-2-luc 3-D kasvaimen sferoidit muodostettiin pinnoittamalla 5000 ES-2-luc solua /kuoppa agaroosilla pinnoitettu 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 4 päivää. ES-2 ihmisen munasarjasyövän soluja transfektoitiin stabiilisti lusiferaasi-ilmentävien plasmidin pGL4.51 sisälsi neomysiiniresistenssigeenin (Promega, Madison, WI) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), kuten aiemmin on kuvattu [21]. ES-2-luc-soluja viljeltiin McCoyn 5a, jota oli täydennetty 1% L-glutamiinia, 10% naudan sikiön seerumia, 1% penisilliini /streptomysiiniä ja 750 ug /ml G418: aa antibiootteja ja pidettiin 37 ° C: ssa ilmakehässä 5 % CO

2: ssa kosteutetussa inkubaattorissa. PEG-

b

-PCL misellejä, jotka sisältävät PTX, CYP, ja GSP (3,3, 3,3, ja 3,3 nM, vastaavasti) lisättiin ES-2-luc kasvaimen sferoideina ja inkuboitiin 3 päivää. Jotkut käsitellyn ES-2-luc pallosia inkuboitiin 3 h 200 nM vapaan peptidin kyllästää PS paljaana kasvain pallosia. Apoptosis kohdistaminen PEG-

b

-PCL misellejä kuljettaa DiR lisättiin sitten ES-2-luc kasvaimen pallosia, jonka lopulliset pitoisuudet 200 nM peptidiä ja 100 nM DiR ja inkuboitiin 30 min 37 ° C: ssa 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa. Kontrollina, bioluminenssi intensiteetti ES-2-luc-soluissa seurattiin myös sen varmistamiseksi, että ES-2-luc kasvaimen sferoidit olivat johdonmukaisesti muodostettu kuhunkin kuoppaan käyttäen Xenogen IVIS 200 Series.

vatsaonteloon Human munasarjasyöpä Vieraslajisiirteen ja Miselli Hoidot

Nainen 6-8 viikkoa vanha kateenkorvattomiin nude Foxnl

nu hiiret hankittiin Harlan Laboratories (Madison, WI). Kaikki eläinkokeet suoritettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health (NIH). Eettinen ja inhimillinen eläinten käyttö neuvoi All Campus eläinten suunnittelu ja neuvoa-antava komitea (ACAPAC) ja protokolla hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) at University of Wisconsin-Madison (Luvan numero: M02472) . Yleisanestesiassa indusoitiin 1,5% isofluraania /happea ja ylläpidetään 1% isofluraani /happea. ES-2-luc solut trypsinoitiin, kerättiin sub-konfluentteja viljelmiä, ja 1 x 10

6 solua /eläin ES-2-luc-soluja injektoitiin vatsaonteloon nukutettujen hiirillä. IP injektio PEG-

b

-PCL misellejä kuljettaa 30, 30, ja 30 mg /kg PTX, CYP, ja GSP suoritettiin 7 päivää post IP inokulaation ES-2-luc solujen jälkeen havainto bioluminenssin signaali koko kehon kuvia eläinten Xenogen IVIS 200 Series. Yhden päivän kuluttua IP injektion PEG-

b

-PCL misellejä sisältävän PTX, CYP, ja GSP, metoksi tai apoptoosin kohdistamisen PEG-

b

-PCL misellit kuljettavat 250 ug /kg DiR injektoitiin häntälaskimoon nukutettujen eläinten. Kehon paino eläinten mitattiin kannettavalla mittakaavassa, ja ulkonäöltään ja eläinten kuolleisuus oli huolellisesti seurattava kaikkia sarjaa eläinkokeita. Kaikki pyrittiin minimoimaan eläinten kärsimykset. Eläimet lopetettiin lääketieteellisestä hiilidioksidia kanssa virtausnopeudella 10-30% eutanasia kammion tilavuutta kohti minuutissa.

TUNEL Pitoisuus

ES-2-luc-laakeri vierassiirrettä annosteltiin kautta IP reitillä PEG-

b

-PCL misellejä kuljettavat PTX, CYP, ja GSP 7. päivänä sen jälkeen, kun ES-2-luc-soluja istutettiin vatsaonteloon. Sen jälkeen eläimet (

n

= 4) lopetettiin 0, 12, 24, 48, ja 72 tunnin kuluttua misellin hoitoon. Kasvain, perna, munuainen ja maksa kudokset leikeltiin. DNA: n fragmentoituminen indusoima apoptoosi havaittiin kudoksissa TdT-välitteisen dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) menetelmä, jossa käytetään DeadEnd fluorometrinen TUNEL-määritys kit (Promega, Madison, WI). Kudokset jäädytettiin leikattiin 10 um viipaleiksi, läpäiseviksi proteinaasi K ja kiinnitettiin 4% formaldehydiä. Reaktioseos, joka koostuu TdT ja fluoreskeiinileimattua dUTP lisättiin kiinteän osan kudosten ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa kostutetussa kammiossa pimeässä. Fluoreseiini-leimattu DNA-fragmentteja ja tumat solujen couterstained mukaan DAPI visualisoitiin 520 nm: ssä ja 460 nm, vastaavasti, käyttäen -konfokaalimikroskoopilla (Olympus FV1000 FLUOVIEW, Minneapolis, MN). Apoptoottisia soluja ja tumat soluja esitetty vihreä ja sininen, vastaavasti.

Bioluminescence ja Fluoresenssi kuvantamisten

Xenogen IVIS 200 Series käytettiin kuvan sekä bioluminenssia ja fluoresenssi esineistä

in vitro

,

in vivo

, ja

ex vivo

. Xenogen IVIS 200 -sarjan oli varustettu 150 W: n kvartsihalogeenilamppu ja 1 mW skannaus laser. Kuvat otettiin näytön näytetään alueellisen erotuskyvyn 60 mikrometriä /pikseli. Bioluminesenssi kuvat osti ladattu pari laite (CCD) kamera seuraavat parametrit: valotusaikaa = 1 s, binning = medium, ja f /stop = 2.

In vitro

, D-lusiferiini (Caliper Life Science, Hopinton, MA), 10 ug /kuoppa, lisättiin ES-2-luc kasvaimen pallosia 5 min ennen bioluminesenssin kuvantamiseen, ja

in vivo

, D-lusiferiini 113 mg /kg injektoitiin IP osaksi ES-2-luc-laakeri ksenograftimallia 5 min ennen koko kehon bioluminesenssin kuvantamisen. Dynaaminen ES-2-luc kasvaimen kasvua kerättiin ja esitetty värikoodatut kuvien suorassa kuvankäsittelyohjelma kvantitatiivisen analyysin ja BLI ES-2-luc kasvainten skaalataan kokonaismäärät.

Fluoresenssi kuvat olivat myös hankkima ladattu pari laite (CCD) kamera seuraavat parametrit: valotusaikaa = 1 s, binning = medium, ja f /stop = 2. suodattimen asetukset DiR havaitsemiseen oli vahvistettu 745 nm viritykseen ja 800 nm: päästöjen. Kaikki värein kuvia kerättiin Elävät kuvankäsittelyohjelma kuvien hankintaa ja analyysiä. FLI Dir osoitettiin keskimäärin säteilevä hyötysuhde, yhteensä fotonit sekunnissa neliösenttimetriä kohden steradiaania on säteilyvoimakkuuden alueella (microwatts neliösenttimetriä kohti): [ps

-1cm

-2sr

-1] /[ ,,,0],iW cm

-2]. Fluoresenssi DiR kasvainkudoksissa määritettiin keskimääräisestä säteilevä hyötysuhde ROI ympärille piirretään tuumorikudoksista esivalinta bioluminenssina kuvantaminen samanlaisen eläimen.

Koko kehon bioluminenssina ja fluoresenssi kuvat kirjattiin 6, 12, 24 , ja 48 h jätä IV injektion PEG-

b

-PCL misellejä kuljettavat DiR. Hiiret sijoitettiin vatsan kannat saadaan koko kehon värikoodatut bioluminenssina ja fluoresenssi kuvia. Kaikki laitteet asetukset bioluminenssina ja fluoresenssi kuvantamisten oli sama aika kurssin kokeen.

Reaaliaikainen fluoresenssi Imaging Acquisition in Eläimet

Fluobeam 800 on 2-D NIR fluoresenssikuvantamisella järjestelmä koostuu CCD kamera ja integroitu NIR valonlähteen (100 mW), jossa heräte aallonpituudella 780 nm ja emissio aallonpituudella 820 nm. Tässä järjestelmässä 7,5 x 10 cm: n homogeeninen kevennetyn kentän ja käsikoneita järjestelmä koostuu kameran ja laserin sijaitsi noin 20 cm kohteen yläpuolelle. Fluoresenssi kuvat olivat näytön näytetään alueellisen erotuskyvyn 110 um /pikseli ja kirjataan joko musta-valkoinen staattisia kuvia (9 kuvaa /s) tai reaaliaikainen videoita (25 kuvaa /s).

kirurgisen

Eläimet saivat IP injektiona D-Luciferin (113 mg /kg) 5 min ennen koko kehon bioluminenssina kuvantamisen päivänä 9 jälkeen ES-2-luc soluinokulaation (24 h post IV injektion of PEG-

b

-PCL misellit kuljettavat DiR). Sen jälkeen koko kehon bioluminesenssi kuvantaminen suoritettiin, eläimet lopetettiin välittömästi. Kaikki uhrieläinten kävivät läpi keskiviivan laparotomy ja bioluminesenssi koko kehon kuvia viilletty eläimet saatiin jälleen. Kaikki kirurgiset toimenpiteet tehtiin uhrieläinten ja kirurgisella onkologi kokemusta hiiren leikkausta. Eräässä koesarjassa (

n

= 4), vertailun vuoksi perinteinen kirurginen kasvaimen resektion tehtiin normaalissa valkoista valoa. Kun kirurginen kasvaimen resektion katsottiin tyydyttävä, leikattiin kasvain kaltainen kudokset ja ruho pyyhkäistiin Xenogen IVIS 200 Series saamiseksi bioluminesenssin kuvia. Toisessa eläinryhmälle (

n

= 4), NIR kuvantamisen järjestelmä, Fluobeam 800 NIR kuvantamisjärjestelmä kytkettiin päälle ja kirurginen kasvaimen resektion avustivat reaaliaikaisen fluoresenssin kuvia näytöllä. Kun kasvain kaltainen FLU

+ kudokset leikattiin mahdollisimman täydellisesti, leikattiin kasvain kaltainen kudosten ja ruhon skannattiin käyttäen Xenogen IVIS 200 Series saada bioluminenssina ja fluoresenssi kuvia. Kesto kirurgian nauhoitettiin, kun viilto loppuun kasvaimen debulking. Kirurginen tarkkuus arvioitiin kahdella laskelmat: (1)% summasta BLU

+ kasvain kaltainen kudokset summata koko kasvaimeen vastaavat kudokset leikataan koko kirurgisen toimenpiteen, ja (2) yhteensä syytettä BLI of [ROI puolivälissä line viilletty eläin miinus ROI leikeltiin eläimistä] syrjäyttäen ROI puolivälissä line viilto eläin. Kirurginen tarkkuus mitattiin myös laskemalla jälkeinen resektio vatsakalvon syöpää indeksin (PCI), kuten on kuvannut Sugarbaker [3]. PCI perustuu jakeluun ja koko vaurioiden vatsan eläinten. Tässä tutkimuksessa, PCI on sovitettu kasvaimen kokoa hiirissä seuraavat tulokset: Vatsa jaettiin 13 alueella ja leesion koon (LS) teki (0-3) kullakin alueella seuraavasti: ei visuaalista kasvaimia (LS = 0), ja gt; 0-0,5 mm kasvain (LS = 1), 0,6-2,0 mm kasvain (LS = 2), ja 2,0 mm kasvain (LS = 3). Yhteensä LS pisteet per eläin summataan numeroarvona pisteet, joka voidaan vaihtelivat 0 (ei kasvaimet havaittu) 39 (13 alueet x 3).

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi tehtiin käyttämällä yksisuuntainen ANOVA 5% merkitsevyystasolla yhdistettynä Tukeyn monivertailu testien GraphPad Prism ver 5,00 Mac OS X (La Jolla, CA).

tulokset

karakterisointi Apoptosis kohdistaminen PEG –

b

-PCL Misellit kantaminen DiR

taulukossa 1 esitetään koot ja lastaus tehokkuutta (% paino DiR /paino polymeeri) apoptoosin kohdistaminen PEG-

b

-PCL ( GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-

b

-PCL) ja metoksi-PEG-

b

-PCL misellejä saavutetaan muodostamalla DiR-sisällytetty misellien liuottimella haihdutustekniikalla. Apoptosis kohdistaminen PEG-

b

-PCL misellit oli z-keskimääräinen halkaisija 83 ± 2 nm (polydispersiivisyydestä, PDI 0,1) ja metoksi-PEG-

b

-PCL misellien oli z-keskimääräinen halkaisija 45 ± 2 nm (PDI 0,1). Lastaus tehokkuus DiR sekä misellejä oli noin 2%. Peptidi (GFNFRLKAGAKIRFGS) konjugoitiin päälle PEG-

b

-PCL misellien kanssa moo- konjugaatio suhde 30%

kautta

Schiffin emäksen reaktio, joka perustuu tuloksiin sekä HPLC (subtraktiivisten määrällinen non konjugoidun peptidin peptidi aluksi lisätty reaktioon) ja

1H-NMR (määrällisesti konjugoitua peptidiä) analysoidaan (tuloksia ei ole esitetty). In

1H-NMR-analyysi, suhteellinen intensiteetti huippuarvon suhde bentsyyli protonien fenyylialaniini δ = 7,2 ppm peptidin metyleeni protonin huippu PEG protonien δ = 3,7 ppm määrittää tason peptidin PEG-

b

-PCL. Tiedot peptidi kvantifiointiin HPLC ja

1 H-NMR tarjotaan vastaavia arvoja.