Krooninen sairaus

tiivistelmä

kenttä cancerization

hengitysteiden epiteelin on yhä tutkittu ymmärtää varhainen synnyssä ei-pienisoluisen keuhkosyöpä. Kuitenkin laajuus alalla cancerization koko hengitysteihin on epäselvä. Täällä pyrimme määrittämään ero geenin ja microRNA ilmaisuja liittyy alaan cancerization reuna hengitysteiden epiteelisolujen sairastavien potilaiden keuhkojen adenokarsinooma. Saimme perifeerinen hengitysteiden harjausta peräisin tupakoitsija valvonnan (n = 13) ja keuhkoista contralateral kasvaimeen syöpäpotilailla (n = 17). Suoritimme geeni ja microRNA ilmentymisen profilointi seuraavilla oheislaitteiden hengitysteiden epiteelisolujen käyttäen Affymetrix GeneChip- ja TaqMan Array. Integroitu geeni ja microRNA analyysi suoritettiin tunnistaa merkittävät molekyyli polkuja. Havaitsimme 26 mRNA: t ja 5 miRNA jotka olivat merkitsevästi (FDR 0,1) sääteli ja 38 mRNA: t ja 12 miRNA jotka olivat merkittävästi alas-säädellä syöpäpotilaiden verrattuna tupakoitsijan valvontaa. Funktionaalianalyysi tunnistettu ero transcriptomic ilmauksia, jotka liittyvät kasvaimien syntyyn. Integrointi miRNA-mRNA tiedot vuorovaikutusverkosto analyysi osoitti modulaatio ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi /mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (ERK /MAPK) väylän contralateral keuhkoissa alalla cancerization. Lopuksi potilailla, joilla on keuhkojen adenokarsinooma on kasvain liittyviä molekyylejä ja reittejä histologisesti normaalissa esiintyy perifeeristen hengitysteiden epiteelisolujen, oleellisella etäisyydellä itse kasvain. Tämä havainto voi mahdollisesti tarjota uusia biomarkkereita varhaiseen toteamiseen keuhkosyövän ja uusia terapeuttisia kohteita.

Citation: Tsay J-CJ, Li Z, Yie T-A, Wu F, Segal L, Greenberg AK, et al. (2015) Molecular karakterisointi Peripheral Airway alalla Cancerization Lung Adenokarsinooma. PLoS ONE 10 (2): e0118132. doi: 10,1371 /journal.pone.0118132

Academic Editor: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, FRANCE

vastaanotettu: 14 elokuu 2014; Hyväksytty: 05 tammikuu 2015; Julkaistu: 23 helmikuu 2015

Copyright: © 2015 Tsay et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Tietoja on saatavilla alkaen GEO tietokannasta, liittymisen numerot GSE54495, GSE54541 ja GSE54543.

Rahoitus: JJT rahoittaa National Institutes of Health avustuksen T32 ES007267, UO1 CA086137, UL1 TR000038 ja Stony-Wold Herbert Fund Fellowship (http: //www.stonywoldherbertfund.com). WNR rahoittaa National Institutes of Health avustuksen T32 ES007267, UO1 CA086137, UL1 TR000038, RO1 HL090316 ja K24 AI080298A. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka keuhkosyöpä on johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti alussa molekyylimuutokset yhä puutteellisia, joissa on enemmän tutkimusta tarvitaan parantamaan alkuvaiheen diagnoosin ja lisätä eloonjäämistä. Odotettua vähäisempää (15%) 5 vuoden pysyvyys keuhkosyöpään kuvastaa sitä, että suurin osa potilaista on edennyt sairaus [1]. Sitä vastoin, kun keuhkosyöpä havaitaan vaiheessa I ja kirurgisesti resektoitiin, 10 vuoden eloonjääminen on niinkin korkea kuin 88% [2]. Selvittämisessä alussa molekyylitason tapahtumia keuhkojen kasvaimien synnyn on potentiaalia parantaa kliinisen hoidon keuhkosyöpään.

Altistuminen ympäristön epäpuhtauksien, etenkin tupakansavu, radon, ja asbesti, on merkittävä syyllinen aloittamisessa ja edistää keuhkojen tuumorigeneesiä . Altistuminen näille epäpuhtauksille ja isännän tulehduksellinen vastauksia ärsyttävien johtaa histologinen ja molekyylitason kentän loukkaantumisen koko keskus- ja reuna-hengitysteihin [3]. Käsite kentän cancerization ensin kuvannut Slaughter et al. 1953, viittaa alueita histologisesti normaalin epiteelin, vieressä kasvainkudoksen, mutta epänormaali molekyyli profiili on samanlainen kuin itse kasvain [4]. Vuonna keuhkosyöpä, tutkimukset ovat osoittaneet, että vierekkäiset histologisesti normaalit hengitysteiden epiteelisolujen on mutaatioita p53, KRAS, ja EGFR-geenien, poikkeava promoottori metylaatio, ja alleeliset tappio [5-11]. Lisäksi tutkimukset MikroRNA (miRNA) ja niiden kohde-lähetti-RNA-transkriptien (mRNA: t) ovat osoittaneet, että nämä molekyylit on tärkeä rooli keuhkosyövän taudin alkamisen ja etenemisen [12-14]. Ekspressoituu differentiaalisesti miRNA normaaleissa kudoksissa ja keuhkosyövässä on todettu kohdistaa proteiinia koodaavan tuumorisuppressoreilla ja oncogenes [15,16]. Samoin geeniekspressioprofiilien proksimaalisessa hengitysteiden epiteelin aiheita keuhkosyöpä ovat tarjonneet oivalluksia vaikutus keuhkojen alalla cancerization [17].

Vaikka merkittävää edistystä on tapahtunut profilointi molekyylitason muutoksia alalla of cancerization, tiedetään hyvin vähän tästä kentän vaikutus perifeerisissä hengitysteissä ja kuinka pitkälle ”kentän” ulottuu. Transcriptomic tutkimukset perifeeriseen hengitysteihin tupakoitsijoiden ja tupakoimattomien ovat osoittaneet muutoksia koodaavat geenit immuniteetti, apoptoosin, musiinituoton ja vastaus hapettimien ja vierasperäiset aineet [18,19]. Koska adenokarsinooma tyypillisesti syntyy syrjäisillä hengitysteiden tai alveolaarista epiteelisolujen, erityisesti Clara-solut ja tyypin II penumosyy-, parempi luonnehdinta molekyyli poikkeavuuksien näissä terminaalin hengitysteiden bronchoalveolar solut voivat johtaa parempi ymmärtäminen aikaisin tapahtumien kasvainten synnyssä. Oletimme, että käyttämällä suurikapasiteettisia tekniikoita samanaikaisesti profiilin miRNA ja mRNA: n ilmentymisen perifeeristen hengitysteiden epiteelisolujen korkean riskin tupakoitsijoita ja keuhkosyöpäpotilaita, voimme ensinnäkin löytää korkeamman asteen miRNA-mRNA vuorovaikutukset liittyvät alan cancerization ja tuumorigeneesiä; ja toiseksi, osoittaa vaikutuksia keuhkojen alan cancerization kontralateraaliseen keuhkojen kasvain.

Methods

Potilasjoukko

Vuosina huhtikuussa 2010 ja toukokuuta 2012, rekrytoimme 30 koehenkilöillä (17 keuhkojen adenokarsinooma ja 13 tupakoitsija valvonta), ja kaikki allekirjoittivat tietoon perustuvan suostumuksen. Osallistuivat nykyisten tai entisten (lopeta 5 vuotta) tupakoitsijoita ( 20 pack-vuotiaat), ikä 55-75 vuotta, epäilyttävien kyhmyjä, jotka on alistettu diagnostisia bronkoskopia New Yorkin yliopistossa Langone Medical Center ja Bellevue-sairaala. Me ulkopuolelle ne, joilla on jokin aiempi syövän. Seitsemäntoista koehenkilöt vahvistettu olevan diagnoosi adenokarsinooma jälkeen bronkoskopia. Kolmetoista aiheita luokiteltiin ohjaus tupakoitsijoita; myös tupakoitsijoilla hyvänlaatuinen kyhmyjä jälkeen normaalin diagnostisia bronkoskopian ja yli kolmen vuoden vakautta CT; ja normaali tupakoitsija vapaaehtoisia ilman keuhkonoduluksia. Protokolla hyväksyttiin New York University Langone Medical Center Institutional Review Board (IRB) ja Bellevue tutkimuskomitea (BRC) Bellevue Hospital Center.

Hengitysteiden epiteelisolujen keräämistä ja RNA käsittely

kautta bronkoskopia, keräsimme perifeerinen hengitysteiden epiteelisolujen harjaamalla pienten hengitysteiden keuhkoissa kontralateraaliseen on epäilyttävä kyhmy, i. e. ennallaan keuhko. Kontrolleissa ilman kyhmyjä, harjauskertaa kerättiin reuna hengitysteihin on lingula tai vasemmalle pienempi koru. Läsnäolo Clara solujen sytologisesta harjan vahvisti näytteenotto pieni reuna-hengitysteissä (katso S1 kuvio online täydennys). Sytologia harja sentrifugoitiin ja solupelletti otettiin talteen ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA.

MicroRNA ja mRNA mikrosirujen

uutettiin kokonais-RNA: sta käyttäen Qiagen miRNeasy Mini Kit (Valencia , CA). Tunnistaa kohdegeenien, globaali geeniekspressioprofilointi suoritettiin Affymetrix (Santa Clara, CA) GeneChip- Human Genome U133 Plus 2.0 Array (HG-U 133 Plus 2.0). Käytimme TaqMan Array Human MicroRNA Cards v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) profiloida miRNA samaan RNA-näytteet. Kaikki microarray tiedot on toimitettu Gene Expression Omnibus (GEO) hakunumerolla GSE54495 (mRNA) ja GSE54541 (miRNA).

analyysi microarray mRNA ja miRNA tietojen

Affymetrix array tiedot olivat analysoitiin GeneSpring GX versio 12.6.1 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, USA) käyttäen Linear Models for Microarray Data (Limma). MiRNA Taqman array data normalisoitiin perustuen vertailevaan CT esitys käyttämällä yleisiä normalisoinnin menetelmää. DAVID 6.7 käytettiin toiminnallista rikastamiseen analyysi mRNA tietoja. Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) käytettiin arvioimaan vastaavuutta välillä tietojen ja

a priori

määritellyistä geenejä. DIANA-mirPath [20] tehtiin miRNA TaqMan array tietoja Kioto Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg) reitin analyysi. Hierarkkinen lämpökarttoja syntyi täysin sidoksen klusterointimenetelmä ja potenssiin Euklidinen etäisyys toimenpide. Kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA) käytettiin tunnistamaan alkuun biologiset toiminnot ja sairauksien /häiriöt ja tuottaa polkuja säännelty integroitu mRNA-miRNA data (https://www.ingenuity.com). MiRNA ennustettu tavoitteet integroitu analyysi luotiin perusta TargetScan 6,2 (www.targetscan.org) tai Miranda (microRNA.org). (S2 Kuva yleisen tutkimuksen suunnittelu). Käytimme tukivektorikoneet (SVM) kehittää monimuuttuja molekyyli- allekirjoitukset keuhkojen alalla cancerization peräisin ilmentyvät eri miRNA ja mRNA jälkeen jätettävissä one-out rajat validointikuvauksessa.

Quantitative Reaaliaikainen Käänteinen transkriptio-PCR-analyysi

eristettiin kokonais-RNA käyttämällä Qiagen miRNeasy Mini Kit (Valencia, CA) mukaan yhtiön protokollaa, ja suoritetaan kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio neljään mRNA: t (ASCL1, AMOTL2, CLCN3, ja MAP3k8) ja neljä miRNA (miR-486-3p, miR-483-5p, miR-374A, ja miRNA-375).

tilastolliset menetelmät ja kuvaajat

Käytimme GeneSpring ja MATLAB (MathWorks, Inc .) laskea Limma-arvo, opiskelija

t

-testi

p

-arvo, Benjamini-Hochberg False Discovery Rate (FDR) säätämiseksi monimuuttujille, ja taita muutos (FC) varten kukin yksittäinen geeni /miRNA anturi. Korrelaatio fenotyyppi ja miRNA /mRNA arvioitiin käyttämällä sekä korrelaatiokerroin ja osittainen korrelaatiokerroin ehdolla ikä, sukupuoli, ja tupakoinnista. Differentiaalikaavojen verrattiin toisiinsa alkuvaiheen I ja II adenokarsinooma vs. myöhäisessä vaiheessa III ja IV adenokarsinooma. Pearsonin korrelaatiota käytetään laskemaan korrelaatio RT-PCR: llä ja microarray alustoille. Rank-kertaluvun analyysiin käytettiin vertaamaan miRNA-mRNA korrelaatio. Käyrän alapuolella oleva alue oli muodostettu käyttäen Mann-Whitneyn U tilastot teoriaa.

(katso S1 menetelmät Tarkemman kuvauksen) B

Tulokset

Väestörakenteen ja kliinisiä tekijöitä

30 aiheita rekrytoitiin tässä tutkimuksessa 17 diagnosoitiin keuhkoadenokarsinooma jälkeen alkuperäisen bronkoskopian ja 13 määritettiin olevan tupakoitsija valvonta, vapaa keuhkosyöpään. Kliininen ominaisuudet näistä aiheista on esitetty taulukossa 1. Suurin osa koehenkilöistä oli miehiä, valkoihoinen ja oli merkittävä tupakoinnin historia ( 30 pack vuotta), ja useimmat syövät olivat III-IV keuhkoadenokarsinooma.

Gene Expression in Peripheral Airways vastakkaisen kasvaimeen

luonnehtia eroja geenien ilmentyminen löytyy alan cancerization keuhkosyöpäpotilaiden verrattuna tupakoitsijan tarkastuksia, keräsimme perifeerinen hengitysteiden epiteelisolut hengitysteiden kaukana kasvain,

i

.

e

. kontralateraaliseen keuhkoissa, mikä kutsumme contralateral oheislaitteiden hengitystiet. RNA-näytteet uutetaan ja ajettiin Affymetrix HG-U 133 Plus 2.0 siru. Säätämisen jälkeen ikä, sukupuoli, ja tupakointi, käytimme FDR korjaus 0.10 kynnyksenä. 64-mRNA: kontralateraaliseen reuna hengitysteiden epiteelisolujen todettiin olevan ilmentyvät differentiaalisesti välillä keuhkosyöpäpotilaita ja tupakoitsija valvonta (S1 taulukko); Top 30 mRNA: t on esitetty kuvassa. 1A. Näistä 64 mRNA: t, 38 mRNA: t olivat säädellä vähentävästi keuhkosyöpäpotilaita, joista top 5 mRNA: t olivat CHGB, B4GALT1, ZNF434, GLB1, ja ASCL1 (

p

≤0.0001). Niistä 26 mRNA: t, jotka olivat säädelty, INSIG1, SGK223, RND3, TUFT1, DPYD, ja AMOTL2 olivat merkittävimmät (

p

≤0.0001). Kuva. 1B-C esittää yksittäisiä pistekuvioita kullekin top 30 mRNA: t tunnistettiin merkittävästi erilaisia ​​tapausten ja kontrollien välillä. Nämä havainnot viittaavat siihen mahdolliset erot taustalla biologisiin prosesseihin.

A) käyttäminen Affymetrix Gene Chip HG U133 Plus 2.0, Top 30 eriytetty mRNA syrjäisillä hengitysteiden alalla cancerization syöpäpotilaiden (musta palkki) vs. reuna-hengitysteissä tupakoitsija säätimet (harmaa palkki) on esitetty. 13 mRNA: t olivat vahvasti säädelty ja 17 mRNA: t olivat vahvasti alassäädetty perifeerisessä hengitysteiden alalla cancerization. Geenien ilmentyminen kertainen muutos on esitetty keskimääräinen ilmentyminen suhteessa viitearvoon. Alla olevassa taulukossa FDR arvon perusta Benjamini-Hochberg useita testaus ja log2 kertainen muutos arvon syöpäpotilaan suhteessa tupakoitsija valvontaa. B) Yksittäiset pistekuvaajan syöpäpotilailla (n = 17) verrattuna tupakoitsijan valvonnan (n = 13), jossa sääteli mRNA: t. C) Yksittäiset pistekuvaajan kanssa alassäädetty mRNA: t.

edelleen arvioimista biologisia prosesseja esiintyy reuna hengitysteiden alalla cancerization teimme DAVID bioinformatiikka- toiminnallinen rikastamiseen analyysi yllä geenistä luettelosta. Toiminnalliset Lisäykset analyysi (S2 taulukko), jossa on ”medium” luokittelu tiukkuuden tuotti luettelo biologisista prosesseista, joiden alkuun ehdot sisältyvät apoptoosin (kertainen rikastus = 3,9, p-arvo = 0,01), ohjelmoitu solukuolema (kertainen rikastus = 3,9, p -arvo = 0,01), disakkaridi aineenvaihduntaa (kertainen rikastus = 133,1, p-arvo = 0,01), solukuolemaa (taittaa rikastamiseen = 3,3, p-arvo = 0,02), ja solujen lisääntymistä (taittaa rikastamiseen = 3,9, p-arvo = 0,04). Apoptoosi, ohjelmoitu solukuolema, ja solukuolemaan geenien mukana TNS4, BAD, AHR, B4GALT1, ja PLG. Cell Proliferation geenit sisältyvät Calca, TUSC2, ASCL1, INSIG1, ja BAD. Nämä differentiaalisesti ilmaisi biologisia prosesseja kontralateraalista syrjäisillä hengitystiet, joista monet ovat tärkeitä kasvainten synnyssä, viittaavat siihen, että kudos kaukana kasvain voi myös olla epänormaalia molekyyli ilmaisuja. Suoritimme GSEA käyttäen julkisesti saatavilla aineistoja. Havaitsimme yhdenmukaisia ​​suhde 10 geenin sarjaa (FDR 0,1) on C4 laskennallisen geenin sarjaa, syöpää geeni lähiöissä kokoelman Broad Institute Molecular allekirjoitukset Database (MSigDB). Nämä geeni sarjat ovat mukana apoptoosin (MORF_DAP, MORF_CSNK2B, MORF_PHB), DNA: n korjaukseen (MORF_DDB1), ja oncogenes MYC (MORF_NME2) ja RAS (MORF_RAN). (S3 kuvio, S3 taulukko). Havaitsimme myös 14 geenin sarjaa (FDR 0,1) on C4 laskenta geenin sarjaa, syöpä moduulit kokoelman MSigDB (lisätietoja S4 taulukko). Top 5 geeni sarjasta esitetään S4 kuvassa. Sekä DAVID ja GSEA tunnistettu vastaavia biologisia prosesseja reuna hengitysteiden alalla cancerization, joista monet liittyvät keuhkosyöpä synnyssä.

Seuraava käytetty kvantitatiivinen RT-PCR vahvistaa meidän Affymetrix mikrosirujen tuloksia. Ensin validoitu kaksi eniten merkittävästi muuttunut geenejä, ASCL1 ja AMOTL2, alaryhmässä 20 koehenkilöä (13 keuhkosyöpäpotilaita ja 7 ohjaa). Eri geenien ilmentymisen tunnistusmenetelmiä tuottivat samankaltaisia ​​

p

-arvot ja kertamuutoksia (Fig. 2A). ASCL1 väheni huomattavasti syövän kontrolliin verrattuna 0,32-kertaiseksi, p = 0,003 (RT-PCR) vs. 0,36-kertainen

p

= 0,0001 (Affymetrix microarray). AMOTL2 oli merkittävästi lisääntynyt syövän kontrolliin verrattuna 1,2-kertaiseksi,

p

= 0,006 (RT-PCR) vs. 1,7-kertaiseksi,

p

= 0,0001 (Affymetrix microarray). Samoin käytimme RT-PCR arvioida ilmaisun kahden muun satunnaisesti valittua geenejä, CLCN3 ja MAP3k8, ja löysi kertainen muutos samaa suuruusluokkaa ja suuntaa käyttämällä kahta menetelmää (Fig. 2B). CLCN3 aleni syövän kontrolliin verrattuna 0,80-kertaiseksi,

p

= 0,09 (RT-PCR) vs. 0,84-kertainen,

p

= 0,01 (microarray). MAP3k8 lisättiin syövän verrattuna valvonta 1,51-kertaiseksi,

p

= 0,11 (RT-PCR) vs. 1,57-kertainen,

p

= 0,001 (microarray). Korrelaatiopisteet välillä RT-PCR data ja mikrosirujen tiedot eri oppiaineiden esitetään S5 kuvassa.

A) Kaksi erittäin merkittävä ilmentyvät eri geenit (ASCL1 ja AMOTL2) havaitsee mikrosirun reuna hengitysteiden epiteelisolujen syöpäpotilaiden verrata tupakoitsijat valvontaa vahvistettiin RT-PCR, tuottaa vastaavia p-arvon ja taita muutos. B) kaksi satunnaisesti valittu geeneistä (CLCN3 ja MAP3k8) varmistettiin RT-PCR tuottaa kertaluokkamuutos samaan suuntaan ja samaa suuruusluokkaa kuin nähty mikrosirun. Geeniekspressioiden ilmaistiin keinoja ja ± keskivirheet keinoja. C-D) Kolme sääteli miRNA ja neljännen alassäädetty miRNA olivat Valitse RT-PCR vahvistusta miRNA ilme. miR-486-3p, miR-483-5p, ja miR-374A oli säädelty ja miR-375 oli alassäädetty perifeerisissä hengitysteissä alan cancerization keuhkosyöpäpotilaiden verrattuna tupakoitsijan valvontaa; kertainen muutos välillä syöpäpotilaiden ja tupakoitsija valvonta olivat samansuuntaisia. MiRNA ilmaisuja ilmaistiin keinoja ja ± keskivirheet keinoja.

On mielenkiintoista huomata, että kun verrataan näytteitä perustuu kasvaimen vaiheessa analyysi vaiheen I /II (varhainen) vs. vaiheessa III /IV (myöhäinen) eivät tuottaneet tilastollisesti merkittäviä mRNA: t (FDR 0,1); viittaa siihen, että patogeneesi alalla cancerization voi poiketa kasvaimen etäpesäke. On mahdollista, että tämä tutkimus ei saa virtaa analysoida geenin ilmentymisen eroja kasvaimen vaiheissa; vaihtoehtoisesti on mahdollista, että eroja ei havaittu, koska ei ollut suoraa etäpesäke contralateral keuhkojen meidän koehenkilöillä.

MicroRNA ilmentymistä Peripheral Airways vastakkaisen kasvaimen

Käytimme samaa RNA-näytteet uutetaan kontralateraalista oheislaitteiden hengitysteiden epiteelisolujen keuhkosyöpäpotilaiden ja tupakoitsija ohjaa profiloida miRNA ilmaisua käyttäen TaqMan Array Human MicroRNA Cards v2.0. Tarvittiin ikä, sukupuoli, ja tupakointi, ja käyttävät FDR 0,1 suodatin, 17 miRNA havaittiin ilmentyvät differentiaalisesti (Fig. 3A). Näistä 17 miRNA (S5 taulukko), 12 miRNA olivat säädellä vähentävästi keuhkosyöpäpotilaita; miR-224, miR-708, miR-221, ja miR-328 olivat merkittävimmät. Niistä 5 miRNA jotka olivat säädellään ylöspäin tapauksissa keuhkosyöpä, miR-483-5p, miR-374A, ja miR-486-3p olivat merkittävimmät. Kuva. 3B-C esittää yksittäisiä pistekuvioita kullekin 17 miRNA. Erot miRNA ilmaisun välillä syöpäpotilaiden ja tupakoitsija ehdottavat, että modulaatio miRNA voi aktivoida biologinen väyliä liittyvät tumorigensis.

A) käyttäminen TaqMan miRNA Array, 5 miRNA olivat erittäin (FDR 0,1) säädellään ylöspäin perifeerinen hengitysteiden alalla cancerization syöpäpotilaiden (musta palkki) vs. reuna-hengitysteissä tupakoitsija valvonnan (harmaa palkki). 12 miRNA (FDR 0,1) olivat voimakkaasti alassäädetty. MiRNA kertaluokkamuutos näkyy keskiarvo ilmaus suhteessa viitearvon. Alla olevassa taulukossa FDR arvon perusta Benjamini-Hochberg useita testaus ja log2 kertainen muutos arvon syöpäpotilaan suhteessa tupakoitsija valvontaa. B) Yksittäiset pistekuvaajan syöpäpotilailla (n = 17) verrattuna perifeerinen hengitysteihin tupakoitsija valvonnan (n = 13), jossa sääteli miRNA. C) Yksittäiset pistekuvaajan kanssa alassäädetty miRNA.

tutkia biologisia polkuja, jotka voidaan säädellä näillä miRNA, teimme Kegg polku luokitus analyysi käyttäen DIANA-mirPath [20] kanssa microT -CDS ennustaminen. MicroT-CDS ennustus tunnistaa viisi eniten merkitsevä Kegg reittejä: ErB signalointireitin (p = 2.3×10

-26, 14 miRNA), eturauhassyöpä (p = 2.3×10-26, 14 miRNA), TGF-beeta signalointireittiin (p = 2.1×10

-25, 13 miRNA), mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) signalointipolkujen (p = 6.2×10

-49, 24 miRNA), ja Pathways syövän (p = 5.1×10

-21, 16 miRNA) (S6 kuvio). Kiinnostavaa useimmat Kegg väyliä johtuvat neljä miRNA: miR-374A, miR-26a, miR-27b, ja miR-320a. Modulaatio syöpään liittyvien reittien tukee läsnäolo alalla cancerization klo miRNA tasolla kontralateraaliseen syrjäisillä hengitysteiden epiteelisolujen.

Validoida meidän microarray havainnot me satunnaisesti valittu neljä miRNA määrällisesti kvantitatiivisen RT-PCR ja verrattiin kvantifiointiin miRNA mukaan TaqMan array alaryhmässä 19 koehenkilöä (12 keuhkosyöpäpotilaita ja 7 ohjaa). Ylös säädelty miRNA sisältyvät: miR-486-3p, 2,9 kertainen muutos (

p

= 0,034) RT-PCR vs. 4,8 kertainen muutos (

p

= 0,001) mukaan TaqMan array; miR-483-5p, 2,5 kertainen muutos (

p

= 0,014) RT-PCR vs. 4,1 kertainen muutos (

p

0,0001) mukaan TaqMan matriisi; ja miR-374A, jossa on 1,3-kertainen muutos (

p

= 0,24) RT-PCR vs. 1,9 kertainen muutos (

p

= 0,001) mukaan TaqMan array (Fig. 2C-D) . MiRNA-375 oli alassäädetty, 0,8 kertainen muutos (

p

= 0,21) RT-PCR vs. 0,3 kertainen muutos (

p

= 0,002) mukaan TaqMan array. Korrelaatiopisteet välillä RT-PCR data ja TaqMan array tietoja eri oppiaineiden esitetään S7 kuviossa. Mikä tärkeintä, erot miRNA ilmentyminen oli samaan suuntaan kummankin menetelmän. Kuitenkin suuruus eron tapausten ja kontrollien välillä oli suurempi TaqMan array data.

Integrated mRNA ja miRNA analyysi tunnisti ERK /MAPK Pathway

edelleen tutkimaan polkuja liittyvä tunnistettu muutokset uninvolved syrjäisillä hengitysteiden epiteelisolujen syöpäpotilaista vs. tupakoitsija valvontaa, me integroitu ilmentyvät eri miRNA datan korreloi negatiivisesti ennustettu mRNA tavoitteet näistä 30 potilasta analysoitavaksi. Olettaen suurempi tilastollinen teho integroimalla miRNA ja mRNA tiedot, valitsimme korreloi negatiivisesti miRNA ja mRNA: iden FDR 0,15. Kaikkiaan 24 miRNA ja 67 mRNA: t koettimet valittiin jälkeen suodatin, joka tuottaa 102 miRNA-mRNA parit (S6 taulukko). Käyttämällä IPA analysointi- tunnistimme alkuun biologisiin toimintoihin näiden miRNA-mRNA parit olevan osallisena solujen kehitystä (

p

= 7.8×10

-8, 38 molekyylit), solujen kasvun ja lisääntymisen (

p

= 2.5×10

-7, 43 molekyylit), solukuoleman ja eloonjäämisen (

p

= 1.1×10

-6, 44-molekyylit), solu liike (

p

= 3.1×10

-5, 31 molekyylit), ja solusyklin (

p

= 2.6×10

-5, 19 molekyylien). IPA verkko sukupolvi tunnistaa, että suurin osa näistä mRNA ja miRNA (54 molekyylejä) on verkotettu ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi /mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (ERK /MAPK) reitin (Fig. 4), joka edustaa komposiitti sulauttaa 3 top vuorovaikutus verkot perustuvat ”verkon pisteet.” Tämä korkeamman asteen analyysi kykeni tunnistamaan aikaisemmin tunnettu kasvaimia synnyttävän signalointireitin, MAPK, reuna hengitysteiden alalla cancerization, mikä viittaa siihen, että vuorovaikutus mRNA ja miRNA voivat olla tärkeitä alalla cancerization .

IPA käytettiin tuottamaan verkosto molekyylien mRNA ja miRNA jotka olivat merkittävästi erilaisia ​​reuna hengitysteiden alalla cancerization keuhkosyöpäpotilaiden verrattuna tupakoitsijan valvontaa. Tämä yhdistetty verkko yhdistää kolme top verkot perustuvat ”verkon pisteet”, joka konvergoi ERK /MAPK-reitin: erityisesti yhdistämällä on Solunulkoisilla signaali liittyvien kinaasien 1 ja 2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminaalinen kinaasien (JNK) ja p38-kinaasien subfamily. Punainen on säädelty ja Green säätyy alas.

miRNA ja mRNA: n ilmentymisen korrelaatio tunnistaa miR-374A ja ASCL1 vuorovaikutus

edelleen karakterisoimiseksi miRNA-mRNA vuorovaikutus reuna hengitysteiden alalla cancerization, selvitimme erityisiä miRNA-mRNA pairings. Vosa ja työtovereiden tunnistettu miR-374A ennustetyövälineenä biomarkkereiden varhaisessa vaiheessa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [21]. Havaitsimme myös miR-374A kuin ilmennetty eri miRNA perifeerisissä hengitysteissä alalla cancerization; sen ekspressio lisääntyi keuhkosyöpäpotilaita verrattuna tupakoitsijan valvontaa (Fig. 3). Jotka käyttävät yleisesti saatavilla miRNA tavoite ennustus ohjelma, Miranda etsimme mahdollisia tavoitteita miR-374. Yksi ennustettu tavoitteiden ASCL1 geeni jäsen perus helix-loop-helix perheen transkriptiotekijöitä, tunnistettiin myös tutkimuksessamme kuin ilmentyvät eri. Kvantitatiivinen RT-PCR vahvisti meidän microarray tuloksia (Pearsonin korrelaatio = 0,47, p = 0,04) (S7 kuvio). Kun me korreloi miR-374A ja ASCL1 kvantitatiivinen RT-PCR ilmaisuja kunkin yksittäisen, löysimme merkittävä negatiivinen korrelaatio (p = 0,013), odotetusti miRNA-mRNA parit (Fig. 5.) Vaikka on huomattavaa kuvaileva funktio ASCL1, tiedetään vähän miR-374A. Tiedämme, että ASCL1 on tärkeä keuhkojen neuroendokriinisolun kehitys, keuhkovaurion korjaus, hengitysteiden dysplasia, ja neuroendokrii- eriytetty keuhkosyövän synnyssä [22-24]. On olemassa jonkin verran näyttöä siitä, että matalan miR-374A ilmentymistaso ei-pienisoluinen keuhkosyöpä on yhteydessä huonoon säilymiseen, mikä viittaa se voi olla kasvain estävää vaikutusta. Oletamme, että miR-374A on ylöspäin säädellään alalla cancerization, ja taas alas säätelee ASCL1 transkriptiotekijä, joka voi edustaa reaktio epiteelisolujen läsnäolon kasvain keuhkoissa; mahdollisesti torjua ja /tai estämällä kasvaimen etäpesäke. Olisi tärkeää tutkia edelleen mekanismia, jolla tämä vuorovaikutus vaikuttaa syövän leviämisen.

kvantitatiivinen RT-PCR miR-374A ja ASCL1 tehtiin jokaisen yksilön perifeerisen hengitysteiden epiteelisolujen (n = 17 syöpäpotilaasta ja n = 13 tupakoitsija tarkastukset) vahvistaa miRNA-mRNA negatiivinen korrelaatio jono. Vahvistamme, että ASCL1 ilmentyminen korreloi negatiivisesti miRNA-374A ilmentymisen reuna hengitysteiden epiteelisoluissa (Pearsonin = -0,56, p = 0,013).

Molecular allekirjoitukset Lung alalla Cancerization

Tutkitaan onko ilmentyvät eri mRNA: t ja miRNA kontralateraaliseen syrjäisillä hengitysteiden epiteelisolujen voitaisiin käyttää erottamaan meidän syöpäpotilaille syöpää vapaa tupakoitsijoita, kehitimme molekyyli- allekirjoitusta mRNA ja miRNA dataa tukivektorikoneet (SVM) jälkeen loman -oni-out ristivalidointi (LOOCV) protokollaa. Kun SVMs sovellettiin ilmentyvät eri mRNA: ita (FDR 0,15 | FC | 1,5, määritettynä LOOCV) toimivan vastaanottimen (ROC) käyrä pinta-ala (AUC) oli 0,92, 95% CI 0.82- 1,00, p 0,0001 luotiin (S8A kuvio). Keskimäärin 30 mRNA: t olivat mukana tuottamaan nämä molekyyli allekirjoitukset. Käyttämällä miRNA data, SVM molekyyli allekirjoitukset perustuivat 24 miRNA keskimäärin ja tuotti ROC käyrä AUC = 0,94, 95% CI +0,86-+1,00, p 0,0001 (S8B kuvio). Top mRNA: t ja miRNA valittu luetellaan S8C kuvassa ja S8D Fig. Nämä tulokset, vaikka vain suoritetaan training set viittaavat siihen, että sekä mRNA: t ja miRNA kontralateraaliseen syrjäisillä hengitysteiden epiteelisolujen erilaistua keuhkosyöpä potilaita tupakoitsija valvontaa meidän kohortin ja voitaisiin käyttää biomarkkerina diagnoosia. Siksi, toiminnan arviointi näiden molekyylien allekirjoitusten validointi asetettu tarvitaan.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa ilmeni, että reuna-hengitysteiden epiteelisolujen etäällä keuhkotuumoreiden paljon ilmentyvät eri mRNA: ita ja miRNA yleisesti liittyvät kasvaimen kehittymisen verrattuna oheislaitteiden hengitystiet peräisin tupakoitsija valvontaa. Transcriptomic profiili Näiden epiteelisolujen osoittivat solujen liittyvät toiminnot soluadheesiota (DST, RND3) [25,26], apoptoosin (NR4A2, STK17B, miR-21) [27-29], hengitysteiden dysplasia (ASCL1) [23], tuumorisuppressiogeeneksi (MAP3k8) [30], angiogeneesin (AMOTL2) [31], ja signalointireittejä, kuten MAPK signalointi (miR-483-5p, LDLR) [32,33], ja PI3K-Akt (IRS2, miR-26a ) [34,35]. Olemme myös tunnistaneet useita miRNA reuna keuhkoputkien ovat sekaantuneet karsinogeneesissä. Esimerkiksi miR-483-5p, aiemmin tunnistettu olevan poikkeuksellisen ilmaistu maksasolukarsinoomassa ja peräsuolen syöpä [36,37], vaikuttaa siten suoraan kohdistamalla ERK1 polku [33], ja se on äskettäin osoitettu olevan tärkeitä keuhkosyövän soluproliferaatiota ja vanhenemista [38]. Havaitsimme miR-483-5p kuin alkuun ilmennetty eri miRNA meidän miRNA array ja vahvisti sen ilmentymistä kvantitatiivisen RT-PCR (kuviot. 2C ja 3), myös viittaa siihen, että miR-483-5p voi olla rooli reuna hengitysteiden alalla cancerization. Lisäksi havaitsimme, että 71% (12/17) ja differentiaalisesti ilmaisi miRNA olivat alassäädetty. Tämä tulos heijastaa nykyistä näyttöä useiden eri syöpätyyppejä, että on olemassa maailmanlaajuinen alas-säätely miRNA syövässä [39,40]. Mascaux ja työtovereiden tarkasteltiin keuhkoputken kudos- monenlaisia ​​potilaita lukien tupakoimattomia, tupakoitsijoita normaali keuhkoputken epiteelin, ja potilaille, joilla on keuhkoputken dysplasia, syöpä

in situ

, ja invasiivisia levyepiteelikarsinoomien, ja löysi lineaarinen vähennys miR-32 ja miR-34c ilmaisu korreloi etenemisen normaalista keuhkoputken epiteelin okasolusyöpä [41]. Tämä on mielenkiintoinen havainto viittaa siihen, että maailmanlaajuinen alas-säätely miRNA voi olla merkitystä kasvainten synnyssä. Jos totta, lisätutkimuksia koskien miRNA ilmaisun alalla cancerization saattaa tarjota potentiaalisia chemopreventive strategioita keuhkosyövän [42].

Integroimalla miRNA ja mRNA tietojen alalla cancerization, osoitimme ensimmäistä aika, että MAPK -signalointireitistä on vapautettu kontralateraaliseen syrjäisillä hengitysteiden epiteelisolujen. MAPK signalointi koostuu kolmesta kinaasien: ERK kinaasien 1 ja 2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK: t), ja p38-kinaasi. ERK1 /2 MAPK signalointi on erittäin herkkä kasvutekijöiden ja sytokiinien, johtaen solujen lisääntymisen, solunjakautumisen ja solujen erilaistumista [43,44]. Aktivointi ERK1 /2 on osoitettu korreloivan kehittyneitä ja aggressiivinen NSCLC [45]. Dubinett et ai. osoittivat, että ERK1 /2 reitti näyttää olevan potentiaalinen välittäjänä Snail-välitteinen säätely ylöspäin SPARC, joka edistää keuhkojen syövän leviämisen ja muuttoliike [46]. Sen sijaan, JNK: n ja p38-kinaasit vastata ultraviolettisäteilylle, oksidatiivisen stressin, ja tuumorinekroositekijä, joka johtaa apoptoosiin, tulehdus, ja solusyklin pysähtymisen. Khatlani et ai.