Krooninen sairaus

tiivistelmä

MUC16 (CA125) kuuluu perheeseen korkean molekyylipainon O-glykosyloitunut proteiineja tunnetaan musiineja. Vaikka MUC16 on tunnettu biomarkkerina munasarjasyövän, sen ilmentämiskuviota haimasyövän (PC), neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa, on edelleen tuntematon. Tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia ilmaus MUC16 aikana aloittamista, etenemistä ja etäpesäkkeiden PC mahdollisesti implisiittisesti PC diagnoosi, ennuste ja hoito. Tässä tutkimuksessa microarray sisältäviin kudoksiin terveistä ja PC potilasta, tutkimaan ero proteiinin ilmentymistä MUC16 PC. MUC16 mRNA-tasot mitattiin myös RT-PCR: normaalissa ihmisen haiman, haimatulehdus, ja PC kudoksissa. Tutkia sen ekspressiokuvio aikana PC etäpesäke, kudosnäytteitä ensisijainen haimakasvaimesta ja etäpesäkkeitä (samasta potilaasta) imusolmukkeiden, maksan, keuhkojen ja omentum vaiheesta IV PC potilasta analysoitiin. Määrittää sen yhdistyksen aloittamisesta PC, kudosten PC potilaista, jotka sisältävät pre-neoplastisia vaurioita vaihtelevan laadut värjättiin MUC16. Lopuksi MUC16 ilmentyminen analysoitiin 18 ihmisen PC solulinjoissa. MUC16 ei ilmenny normaalin haiman kanavat ja on vahvasti yliaktiivista PC ja havaita haimatulehduksen kudoksessa. Se on ensimmäinen havaittu korkean asteen pre-neoplastisia vaurioita edellisen invasiivisia adenokarsinooma, mikä viittaa siihen, että sen säätelyä on myöhässä tapahtuma aloittamista tämän taudin. MUC16 ekspressio näyttää olevan voimakkaampi etäpesäkeleesioita verrattuna primaarikasvaimen, viitaten rooliin PC etäpesäkkeitä. Olemme myös tunnistaneet PC solulinjoja, jotka ilmentävät MUC16, jota voidaan käyttää tulevissa tutkimuksissa selvittämiseksi sen toiminnallinen rooli PC. Kaikkiaan tuloksemme osoittavat, että MUC16 ilmentyminen merkittävästi lisääntynyt PC ja voisi olla potentiaalinen rooli etenemistä tämän taudin.

Citation: Haridas D, Chakraborty S, Ponnusamy MP, Lakshmanan I Rachagani S, Cruz E, et ai. (2011) Pathobiological vaikutukset MUC16 Expression in Haimasyöpä. PLoS ONE 6 (10): e26839. doi: 10,1371 /journal.pone.0026839

Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 04 lokakuu 2011; Julkaistu: 31 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Haridas et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Institutes of Health (RO1 CA78590, RO1 CA131944, UO1 EDRN CA111294 ja P50 SPORE CA127297), Department of Defense (BC101014), Susan G. Komen Foundation (KG070826), NCI Cancer Center Support Grant 5 P30 CA036727-2452 ja Nebraska Department of Health Institutional LB595 Grant syövän ja Tupakointi Disease Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä (PC) on erittäin tappava maligniteetti. Mukaan American Cancer Society, arvioitu uusien tapausten määrä ja kuolemista johtuu PC Yhdysvalloissa vuonna 2010 oli 43140 ja 36800 vastaavasti 5 vuoden eloonjäämisaste 6% [1]. Adenokarsinooma haiman kanavien osuus on lähes 95% kaikista haiman kasvaimia [2], ja liittyy mediaanielossaolosta vain 3-6 kuukautta. Huono näkymät PC potilaiden johtuu suurelta osin kliinisesti hiljainen luonne pahanlaatuisen, joka johtaa usein sen diagnoosi edistyneellä ja usein leikkaushoitoon sairauden vaiheesta.

Useita proteiineja on raportoitu väärin säädellystä aloituksen aikana ja etenemistä PC. Yksi tällainen perhe proteiinien, joiden ilmentymistä poikkeuksellisesti yliaktiivista PC on musiineja. Nämä ovat suuren molekyylipainon, voimakkaasti glykosyloitu toimivat proteiinit useita toimintoja normaaleissa kudoksissa, mukaan lukien voitelun ja loukkuun haitallisten patogeenien [3] – [7]. Niiden ilme on ilmeisesti muuttunut useassa pahanlaatuisten sairauksien kuten PC [8].

CA125 (MUC16) on pintaglykoproteiinille joka on ensimmäiseksi tunnistettiin Bast

et ai

vuonna 1981 [9]. MUC16 pilkotaan ja karistanut verenkiertoon ja on painopiste aktiivisen tutkimuksen biomarkkerina seerumissa erilaisia ​​kasvaintyypeissä [10]. Se on tällä hetkellä ainoa seerumin tuumorimarkkeri rutiininomaisesti käyttää klinikat diagnosointiin ja erityisesti ennustettaessa ennusteen munasarjasyöpää sairastavilla potilailla [11]. CA125 on parhaiten tunnettu vasta-aine, joka tunnistaa MUC16 sekä kudoksissa ja kehon nesteissä ja on suunnattu epitooppia sijaitsee tandem-toisto alueen MUC16 proteiini [4], [12].

Rakenteellisesti MUC16 proteiinin käsittää solunulkoisen N-pään domeeni, joka koostuu yli 22000 aminohappotähdettä ja sen uskotaan olevan voimakkaasti glykosyloitunut. Keskeinen domain sisältää jopa 60 glykosyloituneen peptidisekvenssejä toistetaan peräkkäin (luonteenomainen piirre limakalvon perhe) seuraa C-pään domeeni sisältää potentiaalisen proteolyyttisen, transmembraanidomeeni ja lyhyt sytoplasminen häntä useiden potentiaalisten sivustoja fosforylaation [13], [14].

Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet ilmentymisen MUC16 PC kudoksissa ja solulinjoissa käyttäen CA125 monoklonaalinen vasta-aine. Lisäksi olemme analysoineet ilmaisuna sen mRNA kudoksissa eristetty PC ja haimatulehdus potilaita RT-PCR. Yleisenä tavoitteena meidän oli selvittää, onko ero ilmaus MUC16 etenemisen aikana ja kehittäminen PC ja tutkimaan mahdollisia korrelaatio MUC16 ilmaisun ja kasvainten ominaisuuksiin. Tutkimuksemme osoittavat, että MUC16 ei ilmenny normaalin haiman kanavat mutta upregulated aikana PC etenemistä ja kehitystä, mikä viittaa mahdollinen rooli MUC16 PC synnyssä ja sen kliininen diagnoosi.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

kirjallinen tietoinen suostumus saatiin kaikkien ei-arkistointi kudosta ennen kudoksen keräämistä kaikille näytteille saadaan UNMC.

kudosnäyte ja solulinjoissa

Viisikymmentä -eight PC ja 8 normaalia haiman kudosnäytteistä (formaliinilla ja parafinoidut) saatiin Accumax (Array numero A207IV). Array sisälsi kudokset luokiteltu ei-neoplastisia (8 täplät), hyvin erilaistunut adenokarsinooma (12 paikkoja), kohtuullisesti erilaistunut adenokarsinooma (22 täplät) ja huonosti eriytetty adenokarsinooma (24 paikkoja). Expression of MUC16 analysoitiin RT-PCR: llä 2 normaalin ihmisen haiman kudoksista, 6 haimatulehdus ja 17 haimasyövän kudoksia, jotka saatiin hyväksymisen jälkeen protokollan mukaan IRB (IRB- 491-97) yliopiston Nebraska Medical Center, Omaha , NE. MRNA muutettiin cDNA: ksi käyttäen oligo-dT-alukkeita. Käytetyt alukkeet tarkistaa MUC16 ilmaisu ovat MUC16_F-5 ’GTCCCCAACAGGCACCACACCG-3’ ja MUC16_R-5’GGGCACTGTTGCTGGACGTTGTATT-3 ’ja PCR-tuote sekvenssi tarkistettiin UNMC DNA sekvensointi laitokseen.

Lisäksi, formaliinilla ja parafiiniin (FFPE) PC kudosnäytteitä 34 PC potilaista käsittää normaalin haiman (7 spots), ensisijainen PC (31 täplät) ja etäpesäkkeiden maksaan (23 täplät), keuhkoissa (11 paikkoja), imusolmukkeesta (17 paikkoja) ja omentum /kalvo (11 täplät) saatu University of Nebraska Medical Center nopean ruumiinavauksessa ohjelma (IRB-091-01) analysoitiin myös tutkia muutoksia MUC16 ilmaisun aikana PC etäpesäke. Nopealla ruumiinavaus ohjelman UNMC, kudokset luovuttajasta potilaista ovat korjattu kolmen tunnin kuluessa kuolemasta ja yksilöt flash pakastettiin nestetyppeen tai sijoittaa formaliinilla välitöntä kiinnitystä. Kudossiruina (TMA) valmistettu parafiiniblokit kudosten nopeasta ruumiinavauksen ohjelmaa käytettiin MUC16 immunovärjäyksen. Sen lisäksi, että kasvaimen ydintä, jokaisen lohkon sisälsi ohjaus yksilöitä ei-neoplastisten paksusuolen, munuaisten ja kasvaimen vieressä haima samasta luovuttajilta. TMA lohkot leikattiin 4 uM osaan ja asennettuna veloitetaan dioja.

Kaksikymmentäviisi PC kudosnäytteiden sisältävien Haiman intraepiteliaalista kasvaimet (Panin) leesioita vaihtelevia laadut (määrä vaurioita tunnistettu-Panin I- 163; Panin II-197, Panin III-26 ja normaali kanavat-140) vieressä alueet PC saatiin myös hyväksymisen jälkeen protokollan Institutional Review Board (IRB-491-97) yliopiston Nebraska Medical Center, Omaha, NE. Neljä mikronin paksuinen parafiinileikkeillä leikattiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla patologista arviointia. Arvosana PanINs ja MUC16 ilmaisun kunkin Panin vaurio arvioitiin kirurgisen patologi (SML).

ilmentyminen MUC16 mRNA ja proteiini analysoitiin myös paneelia PC solulinjojen (MiaPaca, Panc89 , Dang, LVI-, SU86.86, Colo357, CD18 /HPAF, HUPT3, Capan1, Suit2, CD11, T3M4, FG, Aspc1, Panc1, HG625, Capan2 ja BxPC3) käyttäen alukkeita edellä on mainittu. Solulinjat kasvatettiin 37 ° C: ssa, kun läsnä on 5% CO

2 DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia ja antibiootteja (penisilliiniä ja streptomysiiniä 100 ug /ml). Kaikki solulinjat saatiin ATCC: ltä.

immunohistokemia

kalvot prosessoitiin immunovärjäystä kuten aiemmin on kuvattu [15], [16]. Anti- MUC16 hiiren monoklonaalinen vasta-aine (M11 klooni, valmistaja Dako, Carpinteria, CA, USA) käytettiin primäärisenä vasta-aineena (Stock: 764 ug /ml laimennuskerroin 1:500).

Kaikki värjättiin diat pisteytettiin patologi alle Nikon E400 Kevyet mikroskooppi ja edustavia valokuvista. Värjäys intensiteetti MUC16 (CA125) pisteytettiin asteikolla 0-3 (0-negatiivinen, 1-heikko, 2-kohtalainen, 3-voimakas immunoreaktiivisuus). Prosenttiosuus positiivisten solujen MUC16 tietyn vaurion pisteytettiin asteikolla 1-4 seuraavalla tavalla: 1: 0-25% positiivisten solujen; 2: 26-50% positiivinen; 3: 51-75% positiivinen; ja 4: 76-100% positiivinen. Pisteet värjäyksen intensiteetin ja prosenttiosuus immunoreaktiivisia soluja sitten kerrotaan saamiseksi komposiitti pisteet välillä 0 12. jakso katsottiin ”positiivisiin” MUC16 jos intensiteetti MUC16 oli 1. Niinpä kudokset myös luokiteltu ”positiivinen” tai ”negatiivinen” varten MUC16 ilme.

konfokaali immunofluoresenssimikroskoopilla

PC soluja käsitellä konfokaalimikroskopia kuten aiemmin on kuvattu [17], [18] . Lyhyesti, soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa 48 h steriiliä lasipeitelevyihin, pestiin Hanks-puskurissa, joka sisälsi 0,1 M HEPES ja kiinnitettiin jääkylmällä metanolilla 20 ° C: ssa 2 min. Solut blokattiin 10% vuohen seerumia fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 30 minuutin ajan, jonka jälkeen inkuboitiin anti-MUC16 monoklonaalinen vasta-aine (CA125) laimennettuna PBS: ssä (CA125 varastossa: 764 ug /ml; laimennuskerroin 1:500) ja 1 h huoneen lämpötilassa. Solut pestiin 10 min (x 4 kertaa) PBS: llä ja inkuboitiin sitten FITC-konjugoidun vuohen anti-hiiri-vasta-aineen kanssa 30 min. Solut pestiin jälleen (10 min x 4) ja asetettiin lasilevyille anti-fade Vectashield kiinnitysväliaine (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).

Western blot-analyysi

PC solu linjat käsiteltiin proteiinin uuttamalla ja sitä seurasi western-blottauksella SDS-agaroosi, kuten aiemmin on kuvattu [17], [18]. Kuumadenaturoitu lysaatit eroteltiin 2% SDS-agaroosigeelillä elektroforeesilla ja sen jälkeen siirrettiin PVDF-kalvoille. Siirron jälkeen kalvo blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa PBS: ssä 2 tunnin ajan, ja inkuboitiin anti-MUC16 mAb (stock: 764 ug /ml laimennuskerroin 1:1000) tai anti-β-aktiini-monoklonaalinen vasta-aine yön yli 4 ° C. Membraanit pestiin PBS: llä, joka sisälsi 0,1% Tween-20 ja sen jälkeen inkuboitiin piparjuuri peroxidase- konjugoitu vuohen anti-hiiri-vasta-aineita (laimennettu 1:2000 5% rasvatonta kuivamaitoa PBS: ssä) (Amersham Biosciences Buckinghamshire, UK) 1 h . Signaali havaittiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssin (ECL, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK).

RNA ja RT-PCR

Yhteensä RNA eristettiin kudoksista käyttämällä

mir

Vana miRNA eristyspakkausta (Ambion, Foster city, CA, USA) ja solulinjoista käyttämällä QIAGEN RNeasy Mini kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA) valmistajan protokollan. MRNA eristettiin muutettiin cDNA: ksi käyttäen oligo-dT-alukkeita. CDNA laimennettiin 1:05 käytettiin määrittämään ekspression MUC16 mRNA käyttäen PCR mukaisesti edellä kuvatun menetelmän [19]. Tuotteet ajettiin 1,5% agaroosigeelillä, joka sisälsi etidiumbromidia (10 ug /ml). Käytetyt alukkeet tarkistaa MUC16 ilmaisu ovat ne, jotka on aiemmin mainittu.

Tilastollinen

Jatkuva muuttujat (egcomposite pisteet) verrattiin käyttämällä Studentin kaksisuuntaista t-testiä olettaen epätasainen varianssi. Kategorinen muuttujat (vaiheessa luokan kasvain, elimen etäpesäkkeiden) verrattiin käyttäen Kruskal Wallis ANOVA-testiä tai Fisherin testiä. P-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastollinen analyysi tehtiin käyttämällä MedCalc for Windows versio 9.6.4.0 ohjelmisto (MedCalc ohjelmisto bvba, Mariakerke, Belgia).

Tulokset

MUC16 differentiaalisesti yliekspressoituu haiman adenokarsinooma kudoksissa

tunnistamiseksi ekspressiokuviota MUC16 PC synnyssä, sen ilmentymistä verrattiin ei-neoplastisia kanavat ja haiman adenokarsinooma käyttämällä kudosta microarray, joka käsittää ei-neoplastisten haima (n = 8) ja kudosten pääasiallinen PC vaihtelevia laadut (n = 58 ). Kudosnäyte katsottiin positiiviseksi, jos ainakin 5% soluista ilmaistuna MUC16. MUC16 ilmentymistä ei havaittu ei-neoplastisten kanavat (kuvio 1A). Kuitenkin 38/58 (65%) tapauksessa PC, pahanlaatuinen kanavat olivat positiivisia MUC16. Ilmaus MUC16 oli merkitsevästi korkeampi PC verrattuna ei-neoplastisten kanavat (p = 0,003, jonka kaksisuuntainen Fisherin tarkka testi). Edelleen, onko olemassa vaihtelua MUC16 lausekkeen etenemistä PC vertasimme sen ilmaisun välillä PC kudosten luokiteltu kasvaimen vaiheesta ja laatu. Oli asteittainen kasvu ilmaus MUC16 menettäminen on kasvain eriyttäminen, jossa 50% on hyvin erilaistunut (6/12), 59% kohtalaisen eriytetty (13/22) ja 66% huonosti eriytetty PC kudoksia (16/24) on positiivinen (kuvio 1A). Vaikka ilmaus MUC16 ollut merkitsevää eroa kolmen ryhmän keskimääräinen yhdistetty pistemäärä oli merkitsevästi korkeampi kohtalaisesti ja huonosti eriytetty PC verrattuna hyvin erilaistunut adenokarsinoomat (p = 0,02 ja 0,001 vastaavasti). Kuitenkin komposiitti pisteet ollut merkitsevää eroa kohtalainen ja huonosti eriytetty PC tapauksissa. Tämä viittaa siihen, että MUC16 ilmentyminen lisääntyy merkittävästi erilaistumisen häviäminen PC kudoksissa.

kudosleikkeiden saatiin ACCUMAX muodossa array ja värjättiin anti-MUC16 monoklonaalinen vasta-aine. Värjätyt leikkeet havaittiin mikroskoopilla ja immunoreaktiivisuus arvosteli intensiteetti ja levitä tumma tahra. Anti-MUC16 vasta-aineella eivät osoittaneet mitään värjäytymistä normaalin haiman kudoksen (sekä kanavat ja acini), kun taas voimakas värjäytyminen havaittiin syöpäkudoksiin. (A) rasiakuvaaja edustavat pisteet MUC16 poikki eri laatuja PC. Vuodesta rasiakuvaaja havaitsimme immunoreaktiivisuus olevan suurempi huonosti (D) ja kohtalaisen eriytetty (C) kudoksiin verrattuna hyvin eriytetty (B) kudoksissa. Normaali haima (A) kudos on myös negatiivinen. Edustavia osoittavat osat MUC16 ilmentymistä normaalissa haimatiehyitä ja eri laatuja invasiivisia adenokarsinooman näkyvät. Huomautus hallitseva kalvon värjäytymistä MUC16 PC. (B) ekspressio tutkimuksia MUC16 normaalissa, haimatulehdus ja haiman syöpäsoluissa RT-PCR: llä. RT-PCR suoritettiin mRNA eristettiin normaalista ihmisen haiman kudoksen (N1, N2), ihmisen haimatulehdus kudos (Pt1-PT6) ja ihmisen haimasyövän kudoksen (PC1-PC17). Mitään monistusta ei havaittu normaaleissa kudoksissa, mutta vahvistus havaittiin haimasyövän ja haimatulehduksen kudoksiin. Aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina.

ero ilmentyminen MUC16 PC tutkittiin myös tarkistamalla ilmentymistä MUC16 transkriptionaalisella tasolla eristetään mRNA normaalien ihmisen haiman, haimatulehdus ja PC kudoksissa. MUC16 mRNA-ekspressio ei ollut läsnä normaaleissa haiman kudoksista (0/2, 0%), mutta oli läsnä 12/17 (71%), PC: n ja 1/6 (16,7%) haimatulehdus kudoksiin (kuvio 1 B). Useimmat PC kudokset luokiteltiin kohtalaisen tai huonosti eriytetty PC (8/17). Oli 1 tapauksessa hyvin eriytetty PC, yksi pseudopapillary kasvain ja yksi on mucinous kystinen adenokarsinooma ja jättiläinen solu kasvain. 5/8 (62,5%) ja kohtalaisen huonosti eriytetty, 1/1 (100%) hyvin eriytetty, 1/1 jättiläinen kasvain ja 1/1 mucinous kystinen adenokarsinooma ilmaisi MUC16. Kuusi PC potilaista oli aikaisemmin ollut myös krooninen haimatulehdus (CP). 5/6 (83%) näistä kasvaimista olivat myös positiivisia MUC16. Vertailun, 7 PC potilailla ei ole aiemmin CP. Näistä tapauksista 5/7 (71,4%) oli positiivinen MUC16. Ilmentyminen MUC16 ei ollut merkitsevästi erilainen näiden kanssa tai ilman historiaa CP (taulukko 1).

Differential säätelyä MUC16 korkean asteen haiman dysplasian

Koska havaittiin, että MUC16 on poikkeuksellisesti ilmaistaan ​​haiman adenokarsinooma meidän vieressä pyrkii tarkastelemaan ilmaus MUC16 kehityksen aikana PC. Tätä varten tutkittiin ilmaisunsa premaligneja vaurioita tiedetään ennen invasiivisia adenokarsinooma, kutsutaan kuin haiman epiteelinsisäisen neoplasia (PanINs). Panin vauriot luokitellaan Panin I, Panin II ja Panin III, jotka vastaavat matala-, keski- ja korkean asteen dysplasia ja niille on ominaista hyvin määritelty histologisia muutoksia kuten ydin- atypia, ydin- syrjäyttämisen, pseudostratification ja korkealaatuista PanINs, cribriforming [20] . Havaitsimme, että 20%: PANIN-I (33/163), 28% PANIN-II (55/197) ja 42% PANIN-III leesioita (11/26) oli positiivisia MUC16 ilmentymisen, mutta sen ilmentymistä ei havaittu viereisessä normaalissa kanavat (n = 140), kuten kuviossa 2A on esitetty. MUC16 ilmentyminen oli merkitsevästi suurempi kaikissa kolmessa vaiheessa dysplasia (p 0,00001) verrattuna normaaliin kanavat. Mutta MUC16 ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi korkealuokkaisesta dysplasia (Panin-III) verrattuna huonolaatuisen dysplasia (Panin-I, p = 0,02). Kuitenkin, ei ollut merkitsevää eroa MUC16 positiivisuus välillä PANIN-I ja PANIN-II (kuvio 2B). Kuten invasiivinen karsinooma, MUC16 pääasiassa paikannettu solukalvon dysplastic soluja.

(A) MUC16 ilmentyminen arvioitiin kudoksissa, jotka sisältävät sekä normaali haima, ja vieressä dysplastiset vauriot. Vaikka MUC16 ilmentyminen oli heikkoa huonolaatuista, alkuvaiheen Panin leesioita (Panin I), se progressiivisesti suurenee dysplasia korkein ekspressiotaso havaittiin dysplasiaan (Panin III) ja PC. Huomautus hallitseva kalvon värjäytymistä MUC16 kaikissa laatuja PanINs (Original suurennos x 200). (B) rasiakuvaaja edustava komposiitti pisteet MUC16 poikki eri laatuja Panin vaurioiden ja normaali kanavat. Vuodesta rasiakuvaaja havaitsemme, että MUC16 ilmentyy voimakkaasti Panin II ja III verrattuna Panin I

Vertailu MUC16 ilmaisun välillä ensisijainen ja metastasoituneen haimasyövän

Useat proteiinit ovat tiedossa on ero ilmaisun ensisijainen vs. metastaattinen [21], [22]. Sen tutkimiseksi, onko ilmentymisen MUC16 muutetaan aikana etäpesäkkeiden PC etäisiin paikkoihin, tutkimme sen ilmentymistä täsmäsi (saatu samasta potilaasta) ensisijainen haiman adenokarsinoomia ja etäpesäkkeiden imusolmukkeisiin, keuhkot, maksa ja omentum /kalvon (saatu osana nopean ruumiinavauksen ohjelma). MUC16 ei ilmaistu mitään ei-neoplastisten kanavat, kun taas ensisijainen ja etäpesäkkeitä samasta potilaasta ilmaistaan ​​MUC16 lähes saman intensiteetin. Tulokset on esitetty kuviossa 3A ja 3B. Ei ollut merkittävää eroa komposiitti pisteet välillä ensisijainen ja metastaasien (yhteenveto rasiakuvaajan). Kuitenkin potilaat, jotka ilmaisivat MUC16 niiden primaarikasvaimen ilmaisi MUC16 klo metastaasien. Tämä viittaa siihen, että haiman kasvaimia ylläpitää MUC16 ilmaisun aikana niiden leviäminen, mahdollisesti osoittaen roolin MUC16 PC solussa levittämiseen.

tutkimiseksi muutoksen MUC16 ilmaisutapoja etenemiseen, tutkimme ilmaus MUC16 vuonna Hyväksytty ensisijainen haiman syövän ja etäpesäkkeitä joko keuhkojen, imusolmuke, maksan tai omentum /kalvo. (A), kun taas ekspressio MUC16 oli suurempi metastaattisen PC kuin primaarikasvaimen, tämä ei ollut merkittävä. A- normaali haima; B- haimasyöpä; C- Maksa etäpesäke; D- Lung etäpesäke; E- imusolmukemääritysmenetelmä etäpesäke; F- Omentum /Kalvo etäpesäke. Edelleen, (B) osoittaa, että samalla potilaalla, ei-neoplastisia kanavat olivat negatiivisia, vaikka oli voimakas ilmaus MUC16 ensisijaisessa haiman kasvain ja tämä säilyi jopa etäpesäkkeitä.

ilmentäminen MUC16 eri ihmisen haimasyövän soluja

on osoittanut, että MUC16 oli differentiaalisesti ilmaistu PC kudoksissa, me tarkemmin tutkimuksen ilmaisunsa PC solulinjoissa. Expression of MUC16 sekä mRNA: sta (PCR-tuotteen koko on 341 bp) ja proteiinin taso havaittiin Colo357, T3M4, HPAF /CD18, Dang, LVI-, SU86.86, FG ja Capan-1-solut (kuvio 4A ja 4B). Kaikki muut PC solulinjat testattiin olivat negatiivisia MUC16 ilmaisua. Rajaamiseksi solunosasijaintia MUC16, immunofluoresenssitutkimukset tehtiin Capan1 ja HPAF /CD18-solut (MUC16 ilmentävät) ja SUIT2 ja CD11 (MUC16 ei-ilmentävien) solujen. Värjäys havaittiin sekä positiivisia solulinjoja yhtäpitävä jakelu MUC16 kudoksissa ja mitään värjäytymistä ei havaittu negatiivisen solulinjoissa (kuvio 4C).

(A) Western blot -analyysi MUC16 ilmentymisen PC solulinjat. Proteiini lysaatit kahdeksantoista PC solulinjojen erotettiin 2% SDS-agaroosigeelillä. MUC16 ilmentymistä havaittiin Dang, LVI-, SU86.86, Colo357, CD18 /HPAF, Capan1 ja T3M4 solulinjoissa. β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina (B) RT-PCR-analyysi MUC16 ilmentymisen eri PC solulinjoissa. Aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. (C) immunofluoresenssitutkimukset kahden solulinjoista (CD18 ja Capan1), joka ilmentää MUC16 ja kaksi solulinjaa (CD11 ja SUIT2), jotka eivät ilmennä MUC16.

Keskustelu

PC on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa vain noin 20%: lla potilaista elossa 2 vuotta ja vain 6% viiden vuoden ajan. Sen esiintyvyys on kuolleisuuden suhde on pysynyt lähes muuttumattomana jo usean vuosikymmenen ajan huolimatta voimakkaasti käsitys ja sen biologia [23], [24]. Tämä korkea kuolleisuus PC potilaiden johtuu taipumus syöpäsolujen etäispesäkkeitä varhaisessa vaiheessa. Tämä, yhdessä huono hoitovaste ja korkea-korko toistumisen tekee siitä yhden kaikkein vaarallisin syövät tiedetään mies [24]. PC diagnosoidaan usein edennyt pitkälle, lähinnä puutteen vuoksi luotettavia varhaisdiagnostiikan markkereita [24]. Siksi on kiireesti yksilöimään erityiset varhainen havaitseminen merkki (t) ja sopivaa molekyylikohteista torjumiseksi PC. Musiinit ovat yksi tärkeimmistä biomarkkerit, jotka ovat viime vuosina erittäin spesifisiä diagnostisia markkereita useilla maligniteetteja kuten haima-, gynecologic ja aerodigestive suolikanavan pahanlaatuisten kasvainten [25]. Lisäksi niiden poikkeava ilmaisu on osoitettu moduloida solujen kasvuun, erilaistumiseen, transformaatio, tarttuvuus, invaasio ja immuunivalvonnan [7].

CA125 /MUC16 on kasvain biomarkkereiden joka on tällä hetkellä käytetään seurantaan munasarjasyöpäpotilaalle [26]. Kuitenkin sen rooli PC synnyssä edelleen tutkimatta. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme ekspressiokuviota MUC16 PC kudoksissa ja verrata sitä, että normaali haima. Lisäksi tutkimme myös sen yhdessä PC kehitystä ja kasvaimen vaiheesta, laatu ja etäpesäke. Mielenkiintoista, tuloksemme osoittivat, että normaali haima ei ilmaista MUC16 mutta sen ilmentyminen on huomattavasti yliaktiivista 12/17 PC ja 1/6 haimatulehdus kudosta. Aiemmin on osoitettu, että on olemassa välisestä assosiaatiosta syöpä haiman ja krooninen haimatulehdus (satunnaista ja familiaalinen) ja standardoitu tapaus suhde kehittää PC krooninen haimatulehdus potilaita on 14-18 [27]. Tämä havainto MUC16 on merkittävästi yläreguloituja PC on johdonmukainen ilmaus muiden kalvoon sitoutuneiden musiinien MUC4 ja MUC1 jotka myös poikkeavasti ilmaistu PC ja on tunnistettu mahdollisiksi diagnostisia markkereita tähän maligniteetin [24], [28] – [31 ] Havaitsimme myös, että MUC16 ilmaisua lisääntyi asteittain erilaistumisen häviäminen PC kasvain. Aikaisemmin on havaittu, että PC potilaalla on diagnosoitu etäpesäkkeiden oli taipumusta huonosti eriytetty haiman adenokarsinooma [32], [33]. Siten meidän tulokset viittaavat siihen MUC16 voi olla tärkeä rooli etenemistä ja etäpesäkkeiden PC.

Mukaan tunnettu etenemisen malli PC, duktaalikarsinooma kehittää epäneoplastisis- kanavat vaikka sarja pre-pahanlaatuisten leesioiden kutsua PanINs [33]. Havaitsimme, että MUC16 ilmaisu kasvaa progressiivisesti Panin I Panin III. Erityisesti prosenttiosuus MUC16 positiivisuus korkealaatuista Panin esiintyvyys oli merkittävästi suurempi kuin huonolaatuisen PanINs. Tämä viittaa siihen, että MUC16 ilmentyminen on muuttunut siinä vaiheessa, haiman dysplasia ja voi olla ratkaiseva rooli etenemistä PC. MUC4, toinen kalvoon sitoutunut Musiini on aiemmin osoitettu olevan differentiaalisesti voimistuvan asteittain kasvaa dysplasia, mikä viittaa siihen mahdollisuuteen, että voi olla tiettyjä yhteisiä säätelyreittejä, että ilmentymisen moduloimiseksi molempien musiineja aikana PC kehittäminen [28], [34], [ ,,,0],35]

kuolleisuuteen PC potilailla johtuu esiintyy usein kaukainen etäpesäke. Vuonna analyysi 4012 ruumiinavauksia suoritettiin PC potilaiden välillä 1914 ja 1943 kerrottiin, että Yleisin kaukaisten etäpesäkkeitä maksaan, jonka jälkeen vatsakalvon, keuhkojen ja keuhkopussin, luut ja lisämunuaiset [33], [36] . Mutta tietokone ei rajoitu näihin elimiin. Pienetkin tietokoneet ( 2 cm halkaisijaltaan) näytteille etäpesäke, tukevat oletuksesta, että PC on maligniteetti, joka metastasizes hyvin varhain edetessään [33], [37] joukossa useita molekyylejä havaittiin osansa siinä etäpesäke PC solut, musiineilla on tullut yksi tärkeimmistä tekijöistä. Olemme aiemmin osoittaneet, että MUC4, toinen transmembraani- musiini kun ilmaistaan ​​edistää etäpesäke ja invasiivisuus PC-soluissa [18], [38], [39]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ne ensisijaisesti tietokoneita, jotka ilmentävät MUC16 myös ilmaista MUC16 lähes yhtä suuri intensiteetti metastaasien. Tämä viittaa siihen, että PC-solut voivat edelleen ilmentävän MUC16 aikana metastaattisen prosessin. MUC16 on aikaisemmin osoitettu olevan tärkeä etäpesäkkeiden kiinteiden kasvainten ja keskushermoston kautta vuorovaikutus Mesothelin, proteiini ekspressoituu differentiaalisesti normaaleissa mesoteelisolujen, mesotelioomatapausten ja joidenkin muiden mesenkymaalisten maligniteettien [40], [41]. Näin ollen on mahdollista, että MUC16 voi vuorovaikutuksessa Mesothelin ja helpottaa etäpesäkkeiden PC.

molekyylitason mekanismit ajo etäpesäkkeiden PC vaatii parempaa ymmärtämistä proteiineja, jotka moduloivat epiteelisolujen-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja käänteinen prosessi (MET ), jotka ovat välttämättömiä irrottamista ja uudelleen kiinnittymisen kasvainsolujen paikalla etäpesäkkeiden osalta. Tulokset Tutkimuksemme osoittavat, että MUC16 voisi olla rooli kehittymistä ja etenemistä PC ja tutkimalla sen erityinen rooli etenemistä PC on perusteella meidän seuraava tutkimus. Sen ylössäätely, mikä oli erityisen voimakasta aikana loppuvaiheissa PC dysplasia, viittaa siihen, että mekanismit, jotka kääntävät sen ilme on mahdollisesti päällä myöhään aikana PC kehitys. Tutkimukset MUC4 mukiinia ovat osoittaneet, että sen ilmentyminen on vaiennettu normaalissa kanavat nojalla hypermetylaatiota sen promoottorin [42], [43]. Olipa samanlainen epigeneettiset muutokset myös säädellä MUC16 ilmaisua vielä tutkittava tulevissa tutkimuksissa. Havaitseminen MUC16 korkealaatuista PanINs (pidetään tosi dysplastic vaurioita, joilla on korkea riski kohdunkaulan syöpä) ehdottaa sen mahdollinen käyttö varhaisessa havaitsemisessa mahdollisesti pahanlaatuisten vaurioiden haimassa. MUC16 myös irtoa verenkiertoon (tunnetaan CA125), tehden siitä houkuttelevan molekyyli tutkittavaksi mahdollisena erittyy biomarkkeri PC [44].

lisäksi löytää sopiva

in vitro

malli tutkia toiminnallista roolia MUC16, paneeli PC solulinjojen seulottiin MUC16 ilmentymisen sekä proteiinin ja mRNA-tasolla. Suorittamiseen western blot-analyysi, havaittiin, että MUC16 ilmaisu joko esiintyi yhtenä vyöhykkeenä tai juovikas bändi. Aiemmin on osoitettu, että kun musiineja käsitellään 2-merkaptoetanolia, ja analysoitiin SDS-PAGE-geelin, silava kaista on saatu musiineja on vähennetty sen oligomeerisen rakenteen sen monomeerinen muoto. Tämä monomeerinen muoto mahdollistaa musiineilla siirtyä nopeammin geelillä ja ehjän oligomeerit jäävät hyvin [45]. Tämä siis selittää ero ekspressiokuviota MUC16 saadaan poikki eri PC solulinjoja seulotaan. Lisäksi meillä on myös havaittu, että MUC16 ilmentämissolulinjat, kuten Capan 1 (maksa met), Colo 357 (imusolmuke met) ja T3M4 (imusolmuke met) olivat peräisin metastaasien kun MUC16 ei ilmentämissolulinjat kuten Panc1 , AsPC1 ja BxPC3 eristettiin ensisijaisen kasvaimen (haima). Edelleen, mistä RT-PCR-tutkimukset havaitsimme, että mRNA-tasot noin PC-solulinjojen ei tukevat niiden vastaavan proteiinin tasoja. Me spekuloida, että MUC16 mRNA läpikäy lähettää transkription jalostukseen eräissä solulinjoissa.