Krooninen sairaus

tiivistelmä

ennastus kasvainten kehittymistä immunodefisienttien hiiriä eriteltyjä ensisijainen ihmisen kasvain solut on aina haastavaa. Päätavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on luoda luotettava määritys, joka antaisi meille mahdollisuuden toistettavasti liuota ihmisen eturauhasen kasvain palautuminen hiirillä käyttäen potilaan kasvaimen laskettu yksittäinen soluja. Käyttämällä monet 114 käsittelemättömän ensisijainen ihmisen eturauhassyöpä (HPCA) näytteet olemme työskennelleet, täällä osoitamme, että: 1) subcutaneum edustaa herkin sivusto, jonka avulla oksastus implantoidun HPCA kappaletta; 2) ensisijainen HPCA solut itse eivät uudistua kasvaimia immuunivajausta isännät; 3) kun injektoitiin in Matrigel kanssa rUGM (rotta urogenitaalisinuksesta mesenchyme), CAF (karsinooma liittyvä fibroblasteja) tai HS5 (ikuistettu luuytimestä peräisin stromal) parien HPCA solut eivät aloittaa sarjatuotantona transplantable kasvaimia NOD /SCID hiirillä; ja 4) kuitenkin HPCA soluja injektoitiin HS5- solut enemmän immuunivajaisiin NOD /SCID-IL2Rγ

– /- (NSG) hiirillä helposti uudistua sarjatuotantona transplantable kasvaimia. HPCA /HS5 rekonstruoitu ”eturauhasen kasvaimia antaa kokonaiskuva epiteelin morfologia, ovat ihmisen alkuperästä, ja sisältävät solut positiivisia AR, CK8, ja rasemaasin. Sytogeneettinen analyysi antaa lisänäyttöä läsnäolon karyotypically epänormaali HPCA solut HPCA /HS5 kasvaimia. On tärkeää, HPCA /HS5 ksenograftikasvaimissa sisältävät EpCAM

+ soluja, jotka ovat sekä klonogeeniset ja kasvaimia synnyttäviä. Yllättäen kaikki HPCA /HS5 rekonstruoitu kasvaimet ovat eriytymättömiä, jopa HPCA peräisin olevia soluja Gleason 7 kasvaimia. Tuloksemme osoittavat, että ensisijainen HPCA soluja injektoitiin kanssa kuolemattomaksi HS5 stroomasoluissa tuottaa erilaistumattomia kasvaimia NSG hiirillä ja tarjoamme todisteita siitä, että Eriyttämätön HPCA solut saattavat olla

solut, jotka hallussaan Tuumorigeenisuustutkimuksissa regeneroituja HPCA /HS5 ksenograftikasvaimissa.

Citation: Chen X, Liu B, Li Q, Honorio S, Liu X, Liu C, et al. (2013) Hajotettuja Ensisijainen ihmisen syöpäsolujen injektoitiin kanssa ikuistettu HS5 luuydinperuskudos- Cells Luo Eriyttämätön Kasvaimet NOD /SCID-γ hiiret. PLoS ONE 8 (2): e56903. doi: 10,1371 /journal.pone.0056903

Editor: Amit Singh, University of Dayton, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 lokakuu 2012; Hyväksytty: 15 tammikuu 2013; Julkaistu: 22 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustuksia NIH (R01-CA155693-01A), Department of Defense (W81XWH-11-1-0331), CPRIT rahoitus (RP120380), ja MD Anderson Cancer Center Center for Cancer Epigenetiikka ja Laura ja John Arnold Foundation RNA Centerin lentäjä avustus (DGT) ja kahdella Centerin apurahat (CCSG-5 P30 CA016672-34 ja ES007784). XC tukivat Cockrell toveruuden välillä Department of Molecular Carcinogenesis, M. D. Anderson Cancer Center. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Vastaava kirjoittaja, tohtori Dean Tang, on tällä hetkellä Academic Editor PLoS ONE ja että toinen kirjoittaja tohtori Dean Tang on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on johtava maligniteetti arvioitu ~241,740 uutta tapausta ja ~ 28170 kuolemantapausta Yhdysvalloissa vuonna 2012 [1]. Etiologia PCA edelleen arvoituksellinen ja solut alkuperämaan kastraatio kestävä PCa (ts CRPC), tappava tauti, joka tappaa useimmat potilaat edelleen heikosti määritelty. Ihmisen syöpien satama asukkaan varren kaltaisten syöpäsoluja toiminnallisesti kutsutaan syövän kantasolut (CSCS), joiden uskotaan olevan vastuussa kasvaimen aloittamista, edistäminen, eteneminen, etäpesäkkeitä, ja hoito vastus [2]. Työ meidän lab ja monet muut ”viittaa siihen, että ihmisen PCa sisältää myös varsi-kuin syöpäsoluja [3] – [32]. Kuten CSCS muissa kasvaimissa [33], eturauhasen CSCS ovat heterogeeninen sisältää useita alaryhmiä erottuva kasvaimeen uudistava kapasiteettia. Huomattavaa on, että eturauhasen CSCS ilmoittamat useat ryhmät ovat vähemmän eriytetty ilmentävät vähän /ei AR (androgeenireseptorin) ja PSA (eturauhasen antigeeni). Äskettäin käyttäen PSA promoottori perustuva GFP lentivirus toimittaja, olemme puhdistettu pois eriytetty (PSA

+) ja erilaistumaton (PSA

– /lo) PCa solujen geeniekspressioprofilointi ja toiminnalliset tutkimukset ja totesi, että PSA

– /lo solupopulaation satamat pitkäaikaisia ​​kasvainta lisäys soluihin, jotka vastustavat sen kastraatio [25]. Tutkimuksemme osoittaa, että erilaistumattoman PSA

– /lo PCa solupopulaation todennäköisesti edustaa ennalta olemassa solu-of-alkuperän CRPC [25].

KEY avoimeksi kysymys on, samanlainen varsi kaltainen PCa solut tiiviimmän kasvaimeen lisäys ominaisuudet ovat olemassa myös ensisijaisen ihmisen PCa (HPCA) näytteet. Syy siihen, että tämä tärkeä kysymys on väisti lopullisen vastauksen on se, että emme ole vielä luotettavan määrityksen, joka voi toistettavasti ja uskollisesti liuota kasvaimen uudistumista dissosioituneista HPCA yksittäisistä soluista [14]. Useimmat tällä hetkellä käytössä PCa mallit ovat peräisin joko muuntogeenisistä hiirillä jossa tiettyjä geenejä yli-ilmennetään tai tippuu pois tai ksenografteista käyttämällä ihmisen syövän solulinjoja tai kasvain kappaletta ympätty ortotooppisesti tai ektooppisesti osaksi immuunivajaisiin hiiriin [34]. Monista syistä, hiiri malleja Eturauhassyövän hallussaan histopatologisia ominaisuuksia, jotka eivät ole täysin edustavia ihmisen PCa, jotka ovat usein ominaista useita geneettisiä muutoksia, jotka eivät kuulu vaikuttamatta minkään geneettisesti mallit saattavat saada toistaa. Lisäksi tietty geneettinen mutaatio voi johtaa erilliset biologiset ja histologisia fenotyyppejä eläimillä verrattuna ihmisen [35]. Sen sijaan ksenograftimalleja ovat laajalti tutkittu helppokäyttöisyys. Ne ovat ihmisen alkuperästä ja siksi uskotaan paremmin kerrata ihmisen kasvaimista kannalta histopatologisen ja molekyylitason ominaisuudet [34].

Useat laajalti käytetty PCa ksenograftien, kuten LAPC ja LuCaP sarja [36] – [ ,,,0],38], on perustettu istuttamalla ihmisen eturauhasen kasvain kappaletta hiirillä. Eturauhassyövän ksenografteissa voidaan luoda myös ruiskuttamalla perustettu PCa solulinjat kuten PC3, DU145 ja LNCaP [39]. Koska tunnettu tosiasia, että paikallinen PCa tai Eturauhassyövän soluja harvoin muodostaa kasvaimia immuunivajaissa hiirissä [39], edellä mainittu esimerkkejä ksenograftien tai solulinjat kaikki perustetaan etäpesäkkeitä, ja ne edustavat vain vähemmistö poistaa kirurgisesti ihmisen PCa ja eivät täysin vastaa heterogeenisyys taudin [40]. Viime aikoina on pyritty tuottamaan PCa ksenografteissa oksastamalla lokalisoitu PCa kappaletta [41], [42] tai ensisijainen PCa yhdistettyjen solu- Vastasyntyneen hiiren mesenchyme [43] munuaisen kapselin. Regeneroitu ksenograftit näyttävät muistuttavan, histopatologisesti, luovuttajan potilaan kasvaimissa, mutta ne voitaisiin sarjoittain siirrostaa ei tunneta.

päätavoitteena nykyiseen projekti on luoda luotettava määritys, joka antaisi meille mahdollisuuden toistettavasti ja uskollisesti liuota ihmisen eturauhasen kasvain palautuminen hiirillä käyttäen potilaan kasvainperäinen HPCA yksittäisiä soluja. Olemme aiemmin tehneet joitakin pyrkimyksiä tämän tavoitteen mutta suurin osa saattamisen protokollien epäonnistui täysin uudistua kasvaimiin [14]. Tässä olemme käytetty monia 114 käsittelemättömän eturauhasen näytteitä, jotka vaihtelevat Gleason (GS) 6-10, valmistamiseksi yhdessä epiteelin syöpäsolujen, jotka sitten yhdistetään uudelleen eri stroomasolut, kuten rUGM, karsinooma liittyvä fibroblasteissa (valuuttalisien), tai kuolemattomaksi luuytimestä peräisin stroomasolut (HS5), ja istutettiin eri anatomisia alueita joko NOD /SCID tai NOD /SCID-IL2Rγ

– /- (NSG) hiirillä. Alla esittelemme tuloksia meidän kattavia tutkimuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Kaikki eläimiin liittyviä tutkimuksia tässä projektissa on hyväksynyt MD Anderson Cancer Center IACUC (Institutional Animal Care ja käyttö komitea ; ACUF # 08-05-08132). Nykyinen tutkimus ei liity koehenkilöillä (eli elävät yksilöt tai tunnistettavissa yksityisiä tietoja), vaikka se ei liity ensisijaisen HPCA näytteestä saatujen meidän yhteistyötä kliinikoiden alla kattavuus IRB (Institutional Review Board) pöytäkirja numero LAB04-0498. Kaikki muut tutkimukset esitellään tässä olivat tutkinnan aloitti ja ei vaadi hyväksyntää muiden sääntelyelinten.

Solut, reagenssit, ja eläimet

PC3, DU145, LNCaP ja Swiss 3T3-solut saatiin ATCC. HS5- solulinja, joka oli tuotettu ihmisen luuytimestä ja kuolemattomiksi transduktio ihmisen papilloomavirus E6 /7 geenit [44], oli ystävällisesti Dr. M. Andreeff (M. D Anderson Cancer Center). Syöpäliitteinen fibroblasteissa (valuuttalisiin) valmistettiin, kuten aiemmin on raportoitu [45]. Kaikki solut viljeltiin suositeltavaa väliaineessa, joka sisälsi 7% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 200 U /ml penisilliiniä (Gibco). Testosteroni ostettiin Sigma. TrpC -ksenografti linja saatiin tri Palapattu [46]. Immuunivajaisiin hiiret (NOD /SCID, NSG, rag2; katso viite. 14 ominaisuuksista näiden eläinten kantojen) alun perin hankittiin Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) ja Kasvatuslaitoksessa perustettiin eläinpalvelussa ja ylläpidetään vakio olosuhteet mukaan institutionaalisten ohjeiden. Vasta-aineita käytettiin tässä tutkimuksessa on esitetty taulukossa S1.

histologinen ja immunohistokemiallinen (IHC) Analyysit

kasvain kudosten korjattu potilaasta kasvaimista ja rekonstruoitu -ksenografteja kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin 24 tuntia jota seurasi 70% etanolia ja parafiiniin. Osiot (4 pm) leikattiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE). IHC, kohdat poistettiin parafiini ja sammutettua ja endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus estettiin 3% H

2O

2 vedessä 10 minuuttia. Antigeeni haku suoritettiin 10 mM sitraattipuskurilla (pH 6,0) 10 minuutin ajan mikroaaltouunissa, jota seuraa 20 minuutin jäähtyä ja perusteellinen pesu. Dioja inkuboitiin biocare Blocking Reagent (# BS966M kaseiini puskurissa) 10 min estää ei-spesifinen sitoutuminen. Laseja inkuboitiin eri primaaristen vasta-aineiden 30 min huoneen lämpötilassa, ja pestiin fosfaattipuskurilla kahdesti ja sitten inkuboitiin biotinyloidun vuohen anti-kani-tai hiiren IgG: tä (Vector Laboratories, Burlingame, CA) kanssa 1:500 laimennus 30 min huoneen lämpötilassa. Perusteellisen pesun jälkeen ne inkuboitiin SA-HRP (BioGenex, San Ramon, CA) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen pesu. Lopuksi, nämä levyt inkuboitiin BioGenex DAB alustaan ​​(värin kehittymistä seurataan tarkasti mikroskoopilla) ja kevyesti vastavärjättiin hematoksyliinillä. Kuvat otettiin käyttäen MagnaFire Kamera ja koko mount dioja skannattiin käyttäen Aperio ImageScope järjestelmä.

Aperio-avusteinen morfometrinen analyysi

HE tai IHC lasimaalauksia dioja sisältävä potilas tai ksenograftikasvaimissa olivat skannataan käyttämällä Aperio ScanScope kuvantamisen alustan (Aperio Technologies, Vista, CA, USA), jossa on 20 x tavoitteen osalta näytteenoton alueelliset ajan 0,47

μ

m pikseliä kohti. Koko dioja kuvia näytettiin ja analysoitiin käyttämällä pöytätietokoneet varustettu vapaa ScanScope ohjelmisto.

puhdistaminen syöpäsolujen Primary Potilasnäytteet ja ksenograftikasvaimissa

Basic menettelyt on äskettäin kuvattu [14 ]. Ensisijainen PCa näytteet saatiin klo eturauhasen potilas- suostumuksella mukaan MDACC Institutional Review Board suuntaviivat (IRB LAB04-0498). Kukaan potilaista ei saanut mitään hoitoa ennen leikkausta.

Potilaan näytettä

, tuumorikudokset juuri saatu eturauhasen jauhettiin ~ 1 mm

3 kappaletta ja kudokset joutuvat entsymaattisesti (tyyppi I kollagenaasilla ja DNaasi 50 U /ml) 8-10 h 37 ° C: ssa. Pilkottaessa, epiteelin organoids on rikastunut lyhyt sentrifugointi seuraa trypsiinillä (0,05%, Gibco), keinuttajassa 37 ° C: ssa 15-30 min vapauttamiseksi epiteelisoluihin.

vierassiirrännäisille

, tuumorikudokset inkuboitiin 1 x Accumax (1200-2000 U /ml proteolyyttinen aktiivisuus, joka sisälsi kollagenaasia ja DNaasia, Innovative Cell Technologies, Inc.) 10 ml grammaa kohti kudosta 30 minuuttia huoneen lämpötilassa pyörivä olosuhteissa. Single-solususpensiota saatiin suodattamalla supernatantti läpi ennalta kostutettu 40 um: n solusiivilän, ja solususpensio sitten varovasti ladattiin kerroksen Histopaque-1077 (Sigma) gradientti puhdistusvaihe poistaa suurimman punasoluja, kuollut solujen ja jätteiden. Lopuksi saatu solun seos altistettiin MACS-sukuperää olevien solujen väheneminen kit (Miltenyi Biotec) ja cocktail (anti-CD3, 14, 16, 19, 20, 45, 56, ja 140b potilaiden kasvaimet; H2K

d vierassiirrännäisille) poistamiseksi Lin

+ soluihin, kuten hematopoieettiset, endoteelin, ja muut stroomasolut (sileän lihaksen, myoepithelial, fibroblasti jne) potilaan näytteitä, tai hiiren stroomasolut varten ksenograftikasvaimissa vastaavasti.

Kasvaimen Transplantation Kokeet

Puhdistetut PCa-solut (yllä), joko yksinään tai yhdessä auttajasolujen lukien rUGM, valuuttalisiin tai HS5 solut, jotka istutetaan joko ihonalaisesti (sc) tai munuaiskotelon alle (KC) ja immuno-hiirillä. Vaihtoehtoisesti paloja tai fragmentteja HPCA oksastettu ihonalaisesti, alle KC, tai hiiren anterior eturauhanen (AP). Basic menettelyt tällaista elinsiirroissa on kuvattu aiemmin [14]. Lyhyesti,

for s.c. implantaatioiden

, kasvainsoluja ruiskutettiin, 40 ui alustaa, joka sisälsi 50% Matrigel, subkutaanisesti 6-8 viikkoa vanhoja uroshiirillä täydennetty eksogeenisen testosteronia.

For KC elinsiirtoihin

PCA-solut sekoitettiin 250.000 rUGM solujen ja kudosten rekombinantit tehtiin rotan hännän kollageenia ja inkuboitiin yön yli. Kudos rekombinanteilla istutettiin seuraavana aamuna alle munuaisten kapseli vastaanottajan uroshiirten täydennetty testosteroni pellettejä.

AP varttaminen

, pieniä HPCA kudokset suoraan istutettiin. Joissakin tapauksissa, HPCA soluja eri numerot sekoitettiin ensin rotan kollageenin ja inkuboitiin kudosviljelymaljalla 37 ° C: ssa 10-15 min. Sitten jähmettynyt solupelletit kevyesti katettu keskipitkällä ja viljeltiin 4 tunnin yön yli ennen istutusta. Poikittainen viilto tehtiin alavatsan paljastaa AP osittain vetämällä virtsarakon, rakkularauhaset ja eturauhasen ulos vatsaonteloon. 2-3 mm viilto tehtiin AP kautta tubulussolujen kahden pääkanavia tuella 22-neula. Käyttämällä palo-pyöristetty lasipipetillä kärki, kollageenin pisteet olivat työnnetty taskuun muovailla eturauhasen kiemuratiehyessä. Sitten elimet vaihdettiin ja rungon seinän ja iho suljetaan.

Kaikissa yllä kokeissa kasvaimen kehitystä seurataan alkaen toisesta viikosta. Tuumorigeenisyystesti mitattiin pääasiassa kasvaimen esiintymistiheys (eli kasvainten määrä /injektioita), latenssi (eli aika injektiona havaitsemiseen kouraantuntuva kasvaimia), kasvaimen tilavuus, ja päätepisteen kasvaimen painoa.

Western blotting

kokosolulysaateille valmistettiin täydelliseen RIPA-puskurissa (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,5% Triton X-100, 10 mM EDTA), joka sisältää proteaasi-inhibiittori seoksen. Proteiinikonsentraatiot määritettiin MicroBCA (Pierce). Erilaisia ​​määriä proteiineja ladattiin 15% SDS-PAGE. Western-blottaus suoritettiin standardina käyttämällä ECL Plus (PerkinElmer).

Reverse Transcription (RT) -PCR-analyysi

Kokonais-RNA uutettiin kasvaimen palasia tai viljellyt syöpäsolut käyttäen Trizol (Invitrogen), ja käytetään RT-PCR-analyysillä. PCR-alukkeet sisälsivät ihmisen AR (sense: 5′-GCTAAAGACTCGGAGGAAGCAAG-3 ’; antisense: 5′-TGGGGGAAAACAGAGGGTTC-3′); PSA (sense: 5’-TGGGAGTGCGAGAAGCATTC-3 ’; antisense: 5′-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3′); β-aktiinin (sense: 5’-CTGGCACCACACCTTCTACAATG-3 ’; antisense: 5′-AATGTCACGCACGATTTCCCGC-3’).

Karyotyping ja genomin epästabiilisuuden

Solut altistettiin Kolkisiinia (0,04

μ

g /ml) 25 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja sitten hypotonisella liuoksella (0,075 M KCI), 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut kiinnitettiin metanoli ja etikkahappoa (03:01 tilavuuden mukaan) seosta 15 minuutin ajan, ja pestiin kolme kertaa kiinnitysaine. Objektilasit ilmakuivattiin, optimaalisesti vuotiaita, ja G-porrastettuja käyttäen Trypsiiniliuoksen ja värjättiin Giemsa jälkeen rutiininomaisesti. Kuvat otettiin käyttäen Nikon 80i mikroskooppi varustettu karyotyping ohjelmiston Applied Spectral Imaging (ASI) Inc. (Vista, CA). ja vähintään 15 G-porrastettuja metafaasien ei karyotyypitetty.

Fluoresenssi soluerotte- (FACS) ja puhdistus EpCAM

+ Solut

HPCA /HS5 ksenograftikasvaimissa soluja käsiteltiin FcR salpaava aine (Miltenyi Biotec) 10-15 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja värjättiin PerCP-eFluor 710 konjugoitua anti-EpCAM-vasta-aine ja biotinyloitu hiiren H-2K

d-vasta-ainetta 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sitten solut pestiin PBS: llä ja leimattiin Alexa Fluor 405 konjugoitua streptavidiinia (Invitrogen, S-32351) 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. EpCAM

+ ja EpCAM

– soluja puhdistettiin edelleen käyttämällä FACS [21], [25]. Post-analyysi paljasti puhtauksia molemmissa ryhmissä ollessa 98%.

Sphere Formation Analyysit

Basic menettelyt alan muodostumisen määritykset aiemmin kuvattu [21], [25]. Olemme puhdistettiin EpCAM

+ soluja HPCA /HS5 ksenograftikasvaimissa kautta MACS, ja viljeltiin niitä seerumivapaassa eturauhasen epiteelin ruselatusaineeseen (PrEBM), joka sisälsi B27 (Invitrogen), 20 ng /ml EGF: n ja bFGF Purecol (Advanced Biomatrix, # 5005-B) päällystetty T-25 pulloissa. Kun nämä solut kasvaneet yhteen, keräsimme solut kautta 0,05% trypsiini /EDTA: a ja maljattiin yhden solut 6-kuoppaisilla ULA levyille tiheyteen 5,000-10,000 solua /kuoppa. Kuulat pisteytettiin vuonna ~ 2 viikkoa. Serial pallo-muodostumisen määritykset, ensimmäisen sukupolven palloja kerättiin 0,025% trypsiiniä /EDTA: ta, jauhettiin 27-G: n neulalla, suodatetaan 40 um suodattimen, ja maljattiin edellä kuvatulla tavalla. Tämä prosessi toistettiin 3-4 sukupolville.

Tilastollinen analyysi

Kasvain-aloittavat solun taajuudet verrattiin käyttäen todennäköisyyttä osamäärätesti. Erot kasvain-take korko määritettiin Osuus testi. Tilastollinen merkittävyys määritettiin

P

0,05.

Tulokset

HPCA Piece vieraskudossiirteet Näytä Higher Kasvain katsoo tosin ihonalainen Site kuin muut sivustot

lab on toistaiseksi työskennellyt 114 potilaan näytteitä juuri saatu eturauhasen. Osa näistä näytteistä on käytetty edellisessä tutkimuksessa [13], [14], [21], [22], [25], [31] ja useimmat niistä käytettiin nykyisen projektin (taulukko S2). Näistä 114 HPCA näytteet, 15,8% oli yhdistetty Gleason Score (GS) 6, 52,6% GS7, 11,4% GS8, ja 20,2% GS9. Yleensä HPCA näytteitä käytettiin 2 kokeet: joko siirrettyjen kuten pieniä paloja, miesten immunodefisienttien hiirillä tuottaa ksenografteja tai käyttää vasta eristettyjä yksittäisiä soluja in vitro ja in vivo -tutkimukset (Fig. 1).

ksenografti tutkimuksia, me istutettu kasvain kappaletta (~2-3 mm

3) kolmella eri anatomisia sivustoja [14], eli ihonalaiskerroksen (sc), munuainen kapseli (KC), tai etummainen eturauhasen (AP) on yksi kolmesta immuunivajausta hiirikantojen, eli NOD /SCID, rag2

– /-, tai NOD /SCID-IL2Rγ

– /- (NSG) hiirillä. NOD /SCID-hiiriin puuttuu sekä T- että B-solujen ja on toiminnallinen alijäämä (joskaan ei täydellinen puute) NK-soluissa ja rag2

– /- hiirissä puuttuu T- ja B-soluissa, kun taas NSG hiiret ovat immuunivajausta puuttuu T, B , ja NK-solujen [14], [47]. Jotka esitetään taulukossa 1 ja esitetään taulukossa S3, joka hiirikannassa ja jokaisen luokan HPCA, The s.c. implantit oli suurinta kasvain kestää verrattuna KC ja AP vieraskudossiirteet. Lisäksi NOD /SCID-hiiriin, joita käytettiin useimmin, havaitsimme kasvava kasvain ottaa mukaansa kasvaimen lisääntyvän klo s.c. ja KC sivustoja (taulukko 1, taulukko S3). On mielenkiintoista, että kasvaimen liittyvä kasvaimen take ei havaittu rag2 ja NSG hiiret ja HPCA näytteet ksenotransplantaatio in NSG hiiret eivät osoita nousua kasvain vie verrattuna istutettu NOD /SCID-hiirissä (taulukko 1, taulukko S3 ).

HPCA Solut, toisin kuin HPCA Pieces, epäonnistui uudelleen aloittaa kasvaimia NOD /SCID Hiiret: Ei merkittäviä vaikutuksia kanssa rUGM, valuuttalisiin, ja ikuisti Human (Bone Marrow) stroomakasvaimet (HS5) Cells

Seuraavaksi kysyimme, oliko juuri eristetty HPCA-solut, sen sijaan kasvaimen kappaletta, voi myös uusiutua kasvaimia tahansa immuunivajaisiin hiirillä. Aivan alussa, me rekombinoitua HPCA solut rUGM KC elinsiirroissa [48] – [50] tai sekoittaa HPCA solua 50% Matrigel varten s.c. injektiota miespuolisilla NOD /SCID [14]. 3 GS6 HPCA (HPCa9, 10, ja 16) näytettä, kun 10000 100000 HPCA yhdistettyjen solu- rUGM istutettiin alla KC, havaitsimme 0/30 kasvain (katso taulukko 4 ref. 14). Samoin 2 GS7 HPCA (HPCa11 ja 14) näytteet, kun 10000 200000 HPCA yhdistettyjen solu- rUGM istutettiin alla KC, havaitsimme 0/17 kasvain (taulukko 4 ref. 14). Lopuksi, kun 1000000 on HPCa18 (GS7) solua injektoitiin s.c. 50% Matrigel, ei ole olemassa yhtä kasvaimen joukosta 4 injektiota (taulukko 4; ref. 14). Sitten puhdistettu CD44

+, CD133

+ tai CD44

+ CD133

+ (ja vastaava markkeri-negatiiviset) HPCA soluja 4 GS6 kasvaimista (HPCA 9, 10, 13, ja 16), 4 GS7 kasvaimet (HPCa4, 6, 8, ja 12), ja 1 GS9 kasvain (HPCa42) ja istutettu yhä enemmän soluja (peräisin 1000 2 miljoonaa) ihon alle (varten GS9 HPCA solut) tai KC tai AP (varten loput) miehen NOD /SCID-hiiriin ja havaitsimme 0/225 outgrowths (taulukko 6 ref. 14). Olemme myös puhdistettu CD44

+ /CD44

– HPCA solut 3 GS8 (HPCa25, 32, ja 33) ja 1 GS9 (HPCa24) ensisijainen (1 °) -ksenografteja ja istutettiin 1000 500000 solua 50% Matrigel at herkin sivuston, eli ihonalaisessa mies NOD /SCID-hiiriin. Jälleen, emme noudata mitään kasvaimen uudistumista ulos 52 implantaatioiden (taulukko 6 ref. 14). Lopuksi, kun lajittelemattoman HPCA-solut puhdistettiin 3 GS6 kasvaimia (HPCA2, 10, ja 16), 4 GS7 kasvaimet (HPCa3, 11, 14, ja 18), 2 GS8 kasvaimet (HPCa15 ja 37), ja 2 GS9 kasvaimet (HPCa5 ja 21), joko ihon alle yksin Matrigel tai yhdistetään uudelleen rUGM ja sitten siirtää alla KC, syntyi 0/92 kasvaimia (taulukko 7 ref. 14). Kaikissa näissä transplantaation kokeissa mies NOD /SCID-hiiriä täydennetty eksogeenisen testosteronin pellettejä.

Seuraavaksi yhteistyössä injektoidaan lajittelemattomien tai markkeri-lajiteltu HPCA solujen valuuttalisiin, jotka on esitetty edistävän kasvaimen kehitystä joissakin kokeellisissa järjestelmissä [51], joko ihon alle tai alle KC testosteronin-täydennetty uros NOD /SCID-hiiriin. Havaitsimme 3 outgrowths pois yhteensä 56 injektiota (taulukko S4). Kuitenkin, 3 outgrowths eivät sarjaan transplantable (taulukko S4).

Äskettäin ihmisen luuytimestä peräisin mesenkymaaliset strooman (tai kara) soluja (MSC: t) on osoitettu integroida kasvaimeen liittyvien strooman ja edistää rintasyövän syöpäsolumetastaasi [52]. Mietimme, onko MSC: t saattavat helpottaa kasvaimen saattamisen ensisijaisen HPCA soluja. HS5- solulinja, joka oli tuotettu ihmisen luuytimestä, on kuolemattomiksi transduktio ihmisen papilloomaviruksen E6 /7-geenejä [44], ja sen on osoitettu tukemaan leviämisen PCa solujen viljelmissä [53], [54]. Meillä on siis ihon alle injektoitiin lajittelemattomien tai merkki-lajitella (eli CD44) HPCA soluja (2 GS6, 3 GS7, 4 GS8, ja 1 GS9 kasvaimet) 100000 HS5 soluja NOD /SCID-hiiriin. Havaitsimme 4 kasvaimia yhteensä 54 injektiota (taulukko S5). Jälleen 4 regeneroitu kasvaimia ei voitu sarjaan istuttaa (ei esitetty). HS5 pelkät solut eivät tuottaneet kasvaimia, NOD /SCID-hiiriä ≤ 100000 soluja (tietoja ei esitetty).

Yhdessä etukäteistä (ref. 14, taulukot 4, 6, ja 7) ja virran (taulukko S4 ja S5) tutkimukset osoittavat, että

NOD /SCID eivät sallivia ennallistamalla transplantable kasvainten perusopetuksesta HPCA soluista, jopa läsnäollessa rUGM, valuuttalisiin tai MSC: kuten HS5

.

HS5 solut indusoivat HPCA Solut aloittaa transplantable kasvaimia NSG hiiret

Mitä jos käytämme enemmän immuunivajaisiin NSG hiiriä? Ensin ruiskutetaan juuri puhdistettu ensisijainen HPCA soluja 5 potilaan kasvaimia (2 GS7, 1 GS8, 2 GS9) subkutaanisti NSG hiiriin. Vuonna yhteensä 37 injektiota, emme noudata mitään kasvaimen kasvua 8 kuukauden kuluttua (taulukko 2). Koska HS5 soluja hieman lisääntynyt kasvaimen uusiutuminen HPCA soluja NOD /SCID-hiirissä (taulukko S5), me ihon alle injektoitiin lajittelematonta HPCA soluja 9 potilaan näytteitä HS5 soluja NSG hiiriin ja, huomattavasti, tämä muunnettu ”rekombinaatio protokolla” aiheuttama kasvainten muodostumista 41/59 (eli -70%) injektiota (taulukko 3). HPCA-soluja, jotka ovat peräisin 3 GS9, 1 GS8, ja 4 GS7 kasvainten kaikki regeneroidaan kasvaimia injektoitiin kanssa HS5 soluja (taulukko 3). Olemme myös perustaneet 1 ° ksenografteina rag2 hiiriä kappaletta 3 muiden HPCA näytettä (ts HPCa57, 58, ja 70). Kun 1 ° ksenografti solut puhdistettiin ulos ja injektoitiin kanssa HS5 solujen mies rag2 tai NSG hiiriä, me saadaan helposti 2 ° ksenografteista [21, 25; tietoja ei ole esitetty]. Kaikkiaan olemme luoneet 11 HPCA /HS5 ksenograftien 7 GS7 (HPCa57, 58, 70, 83, 84, 85, ja 92), 1 GS8 (HPCa91), ja 3 GS9 (HPCa80, 87, ja 96) kasvaimia. Nämä tulokset näyttävät viittaavan siihen, että HS5 solut erittäin tehokkaasti edistää kasvaimen uudistumista NSG hiirillä tuoreista HPCA soluista.

rekonstruoitu

kasvaimet olivat erittäin tuumorigeenisemmiksi ja voitaisiin siirrostettiin loputtomiin (Taulukko S6; tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi regeneroitu kasvaimet pystyivät aiheuttaa transplantable kasvainten riippumatta HS5 soluja (taulukko S6). Lisäksi lajittelemattomien tai CD44-lajitellaan (molemmat CD44

+ ja CD44

-) HPCA solut pystyivät uudelleen aloittaa kasvaimet sekä ihon alle ja selkäpuoli eturauhasen (DP) ja, merkittävästi, HPCA solut puhdistetaan ksenografteista perin perustettu vuonna NSG hiirillä voisi uudistua kasvaimia NOD /SCID-hiirissä (taulukko S6; tuloksia ei ole esitetty).

saatettu ”Eturauhasen” kasvaimet ovat Human alkuperä ja Esitä eriyttämätön ja epiteelikasvaimet Morfologia: IHC, Biochemical, ja Molecular karakterisoinnit

ensimmäinen suorittaa histologisia ja IHC luonnehdintoja saatetun kasvaimia. Kuten odotettua, HPCa57 potilaan kasvain näytteillä tyypillinen GS7 logian tungosta kasvain rauhaset, jossa useimmat solut värjättiin positiiviseksi eturauhasen luminal epiteelisolujen markkereita PSA, ydin- AR, ja sytokeratiinin 8 (CK8) (Fig. 2A). Lisäksi kasvaimen rauhaset osoitti positiivista värjäytymistä varten rasemaasin (alfa-methylacyl-CoA rasemaasi, joka tunnetaan myös nimellä AMACR tai P504S, jota koodaa

AMACR

geeni), negatiivinen (tai heikosti positiivinen) värjäyksiä CK5 (a eturauhasen pohjapinta epiteelin merkki), ja negatiivinen värjäytyminen p63 (toinen tyvisolusyöpä merkki) (Fig. 2A). HPCa57 /HS5 rekonstruoitu kasvainten NSG hiirillä vaikutti täysin erilaistumaton ja puuttui rauhasrakenteet ja PSA ilmaisun (Fig. 2B). Solut näyttivät yleisesti epiteelisolujen, kuten tukee läsnä noin CK8

+ ja satunnaisia ​​CK5

+ solut (Fig. 2B). Mielenkiintoista, hajallaan AR

+ ja p63

+ solujen voitiin havaita (Fig. 2B). Värjäämällä ihmisen vasta-aineiden varalta mitokondrioiden ja Ki-67, jotka molemmat ei värjäytynyt hiiren kudoksissa (kuvio. S1), vahvisti ihmisestä peräisin regeneroidun HPCa57 kasvain (Fig. 2B). Samanlaiset morfologia ja markkerin ekspressiota havaittiin HS5-rekonstruoitu HPCa58 (Fig. 3) ja 9 muut HPCA näytteitä, eli HPCa70, 80, 83, 84, 85, 87, 91, 92, 96 (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Värjäys HE, AR, PSA, CK8, CK5, p63 ja Racamase in HPCa57 potilaan näytteestä. (B) HPCa57P1 -ksenografti kasvain, joka on johdettu coinjection 100000 HS5 soluja, käytettiin tehdä sarja osia, jotka värjättiin HE, Hu-mito, Hu-Ki67, AR, PSA, CK8, CK5 ja p63. Sekä pieni (so 100x) ja korkea-teho (ts 400x) suurennuksilla näytettiin. Nuoli osoittaa CK5

+ solut.

(A) Värjäys HE, AR, PSA, CK8, CK5, p63 ja Racamase in HPCa58 potilaan näytteestä. (B) HPCa58P1 -ksenografti kasvain, joka on johdettu coinjection 100000 HS5 soluja, käytettiin tehdä sarja leikkeitä värjättiin HE, Hu-mito, Hu-Ki67, AR, PSA, CK8, CK5 ja p63. Sekä pieni (so 100x) ja korkea-teho (ts 400x) suurennuksilla näytettiin. Nuoli osoittaa CK5

+ solut.

Yhdenmukaisesti IHC tuloksia, RT-PCR-analyysi käyttäen ihmisen alukkeita osoitti, ettei mikään HPCA /HS5 ksenografteja ilmaistuna

PSA

mutta useimmat ilmaisivat eri ihmisen

AR

mRNA (Fig. 4A). Erityisesti viljellään hiiren fibroblasteja (Swiss 3T3) ja HS5 solut olivat negatiivisia sekä

AR

ja

PSA

mRNA: t (Fig. 4A). Western blottausta 4 luminaaliselle solun markkereita, rasemaasin, PSA, AR, ja CK18 vahvisti puute PSA ilmaisun ja paljasti eriasteisesti muiden 3 markkereita eri ksenografteissa (Fig. 4B-D). Huomaa, että viljellyt HS5 solut ja HS5 kasvaimia (katso alla) ei ole näihin CK18 (Fig. 4D, nuoli), vaikka ne ilmaisivat alhainen rasemaasia (Fig. 4B). Satunnaisesti, HS5 kasvainten havaittiin ilmentävän alhainen AR-proteiinin (Fig. 4C), vaikka ne ilmaisivat tuskin havaittavissa

AR

mRNA: ta (Fig. 4A). Useimmat HPCA /HS5 ksenografteissa ilmaistuna korkeampi rasemaasin kuin PC3-solut (Fig. 4B). Mielenkiintoista on, että Western-blottaus ja p63 paljasti erittäin korkea PC3 ja LNCaP-solut, helposti havaittavissa ekspressiota HPCa57 ja HPCa96 ksenografteissa, ja hyvin pieniä määriä useissa muissa HPCA ksenografteja (HPCa58, 70, ja 91) (Fig. 4B). Nämä tulokset kokonaisuudessaan viittaavat siihen, että

HPCA /HS5 ksenografteissa sisältävät ihmisen eturauhasen epiteelisolujen

. Kuten lisätukea, Western blottaus AR ja CK18 useisiin HPCa57 /HS5 ksenograftikasvaimissa, alkaen 1 ° sukupolvi (P1) ja 4 ° sukupolvi (P4), joka on johdettu sc tai DP implantaatioiden, osoitti, että kaikki nämä kasvaimet olivat positiivinen AR ja CK18 (kuvio 4E).

(A) RT-PCR tulokset AR, PSA, ja β-aktiini käyttäen ihmisen alukkeita. LNCaP, TRPC (hoidolle huonosti eturauhassyöpä, 46), ja DU145-soluja käytettiin kontrolleina. (B-D) Western blottaus rasemaasin, PSA, p63, CK18 ja AR HPCA-HS5 ksenograftikasvaimissa ja kasvaimen soluista peräisin aloilla. GAPDH ja β-aktiini käytettiin lastaus valvontaa.