Krooninen sairaus

tiivistelmä

käyttö solulinjoja tai eläinmalleissa merkittäviä haittoja käsitellessään joukon heterogeeninen sairauksien kuten epiteelin munasarjasyöpä. Tällä on kliinistä merkitystä, että biomarkkereiden kehitetty käyttäen solulinjaa tai eläinmalleissa eivät useinkaan ole siirrettävissä kliinisessä ympäristössä. Tässä tutkimuksessa kuvaamme kehitystä vankan protokollan kehittämisessä primääriviljelmien munasarjasyöpä joka voittaa joitakin näistä vaikeuksista. Naiset, joille leikkaus munasarjasyöpä rekrytoitiin ja näytteitä vatsaonteloon sekä kiinteän kasvaimen talletukset pohjana käytetty primääriviljelmien. Solut tunnettu siitä, käyttäen paneelia immuunifluoresenssivasta vasta ennen käyttöä erilaisissa määrityksissä, mukaan lukien funktionaalisia arviointi DNA: n korjaukseen reittejä. Neljän vuoden tutkimusajan kuluessa, elinkykyisiä viljelmiä, vahvistettiin epiteelin alkuperää kertyi 156 172 (91%) tapauksista palvelukseen. Karakterisointi suoritettiin käyttäen paneelia aineet mukaan lukien pancytokeratin, CA125, EpCAM, MOC-31, D2-40 ja vimentiinistä. Vanheneminen tapahtui välillä 2

nd ja 8

th kohtia kaikissa kulttuureissa yhtä lukuun ottamatta, jossa spontaani kuolemattomaksi tapahtunut. Solut voidaan onnistuneesti viljellä myös jakson jälkeen säilyttää 4 ° C: ssa ja viljeltiin soluja, joita voidaan käyttää erilaisiin sovelluksiin, kuten funktionaalisissa määrityksissä. Kun toiminnallinen arviointi oli vähäistä sisäistä kasvain heterogeenisuus. Näin ollen on mahdollista johtaa elinkelpoisten munasarjasyövän soluviljelmien suurimmalla osalla potilaista, joille tehdään leikkaus. Soluja viljeltiin suoraan potilaasta syövistä saadaan tarkka ja erittäin monipuolinen malli.

Citation: O’Donnell RL, McCormick A, Mukhopadhyay A, Woodhouse LC, Moat M, Grundy A, et al. (2014) Käyttö munasarjasyöpäsoluja alkaen leikkauspotilaiden tuottaa Ensisijainen Cultures jossa tapahtuu Functional Analysis. PLoS ONE 9 (3): e90604. doi: 10,1371 /journal.pone.0090604

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu 13 marraskuuta 2013 Hyväksytty: 2. helmikuuta 2014; Julkaistu: 06 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 O’Donnell et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on johtava syy gynekologisten syöpäkuolleisuudessa maailmanlaajuisesti [1] ja huolimatta paljon tutkimusta munasarjasyövän, kokonaiskuolleisuus on muuttunut vain vähän viimeisten 20 vuoden 5 vuoden eloonjääneiden kokonaismäärästä 30-39% [2]. Jo kauan on tunnustettu kliinikot että munasarjasyövän on joukko heterogeeninen sairauksien mutta tästä huolimatta munasarjasyöpäpotilailla edelleen käsiteltävä kliinisesti yhtenä tauti yhdistämällä debulking leikkauksen ja platinapohjaisen kemoterapian. Havaittu vaihtelu kliinisen käyttäytymistä munasarjasyövän rinnalla kasvaa raportointijärjestelmän molekyyli epäyhtenäisyys viittaa siihen, että heterogeeninen malli tutkimus munasarjasyöpä on pahasti myöhässä. Syntymässä käsite henkilökohtaisen lääketieteen perustuu biomarkkerit vastauksena uusia hoitoja kohdistaminen erityisiä virheitä kasvaimen DNA korjaus on mahdollista vain, jos biomarkkerit voidaan testata käyttämällä realistinen malli.

Pysyvät solulinjat tarjoavat korvaamaton työkalu opiskeluun biologinen toiminnot molekyylitasolla ja solutasolla. Olemassa ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa hallussaan etu suuren proliferatiivisen kapasiteetin, clonogenecity ja pidentää elinikää viljelmässä. Useimmat ovat saaneet merkittävää geneettisiä muutoksia niiden solujen alkuperä, mukaan lukien poistaminen tärkeitä sääntelyn solukierron geenien tukeva kuolemattomia. Lisäksi on näyttöä siitä, että monet solulinjat sisältävät merkittäviä virheellistä tunnistamista, päällekkäisyyksiä, ja eheyden [3].

Ensiöparit eristetyt potilaat ovat usein hyvin erilainen kuin vakiintuneet solulinjat samaa alkuperää. Kyky kulttuuriin ja luonnehtia vasta eristettyä OSE (munasarjojen pinnan epiteeli) ja EOC (epiteelin munasarjasyöpä) soluja potilailta on tärkeä kokeellinen järjestelmä, joka on potentiaalia muistuttavat potilaan tilannetta paremmin [4], [5].

on kaksi lähteistä kliinisestä materiaalista, joita on käytetty tuottamaan primaariviljelmiä munasarjasyövän: vesivatsanesteestä ja kiinteän kasvaimen kudoksessa. Geenien ilmentyminen tutkimukset ovat osoittaneet eri biologisia profiileja syöpäsolujen johdettu näistä kahdesta lähteestä peräisin samasta potilaasta kannalta metastaasin, invaasion ja angiogeneesin [6]. Vesivatsanestesupernatan- on useita etuja verrattuna kiinteiden kasvainkudoksen tuottavan ensisijaisen kulttuureissa. Vesivatsanestesupernatan- on suhteellisen helppo saada ja viljelemällä suspendoidut solut on teknisesti suoraviivaista. Askites-viljelmät on osoitettu homogeenisen epiteelisolujen runsaasti potilailla kuin ne, jotka saatiin kiinteänä aineena kudoksista. Merkittävä osa munasarjasyöpäpotilaalle läsnä on edennyt pitkälle ja on suuria vesivatsanestesupernatan- joka voidaan saada leikkauksen aikana tai paracentesis. Koska suurin osa potilaista, joilla on runsaasti Askites on kasvaimia on korkealaatuista seroosista histologinen alatyyppi, näytteenottoja askites tulee underrepresent muiden histologisia alatyyppejä. Culture kiinteä kasvain, erityisesti ilman askitesta vuoksi tarvitaan myös kaapata edustava joukko näytteitä.

Ensisijainen soluviljelmässä kummastakin lähteestä voisi tarjota resurssi testaamiseksi molekyyliprofiilin ja suorittamaan toiminnallista tutkimuksia yksittäisten syövät. Viime vuosina yhdistyksen välillä kasvain molekyylien heterogeenisyys, eloonjääminen ja /tai hoitovaste on tunnustettu [7] ja on kiihdyttänyt etsimistä biomarkkerit ennustaa vastaus Uusien hoitomuotojen kohdistaminen DNA korjaukseen reittejä vapaimpiin munasarjasyöpä.

useita menetelmiä viljelmän ensisijainen munasarjasyövän eristetyt solut askites on kuvattu [8]. Nämä menetelmät vaativat kuitenkin monimutkaisia ​​monivaiheinen menettelyjä. Dunfield

et al

ja Shepherd

et al

kuvataan enemmän yksinkertainen ja luotettava viljelymenetelmän mukaan luettuina sekoitus askites suoraan väliaineen, joka johtaa epiteelin soluviljelmässä [4], [9]. Tämä tekniikka on mukautettu ryhmämme käytettäväksi tutkimukseen toiminnallisen tilan DNA korjausmekanismit ja me raportoimme tässä kokemuksemme tätä tekniikkaa.

Methods

Ethics selvitys

tutkimuksen hyväksyi paikallinen eettinen komitea (UK IRAS North West eettinen komitea – 12 /NW /0202) ja kaikki potilaat antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksensa.

reagenssit

Rucaparib oli lahja Clovis (USA), ja se on voimakas inhibiittori PARP-1 ja -2-proteiineja (joissa estovakion 5 nM). Kaikki muut kemikaalit ja kudosviljelmälaitteita reagenssit olivat Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, UK), ellei toisin mainita.

Cell Culture

Näytteiden kerääminen.

Askites ja kiinteät kudos kerättiin suostunut leikkauspotilaiden munasarjasyövän Queen Elizabeth Hospital, Gateshead, UK. Kliiniset tiedot tallennettiin ja yksilöitä rekisteröidään ja käsitellään noudattaen Human Tissue Act. Näytteet osoitettu PCO (ensisijainen kulttuuri Munasarja) viitenumero säilyttämään anonymiteetin.

Näytteiden kuljetus ja valmistelu.

Askites imettiin suoraan potilaasta steriiliin imu pullo. Kiinteän kasvaimen pantiin steriiliin Universal sisälsi kulttuuri (RPMI 1640, jota oli täydennetty 20% FCS: ää, 20 mM L-glutamiinia ja 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä), esilämmitetty 37 ° C: ssa. Näytteet kuljetettiin sairaalaan laboratorioon välittömästi noudattaen UK Luokka B määräysten UN3373.

Ensisijainen Culture askites.

Soluviljely suoritettiin käyttäen aseptista tekniikkaa on eristystaso II laminaarinen virtaus vetokaappityöskentelyyn. 20 ml Askites lisättiin 20 ml lämmitettyä alustaa (RPMI 20% FCS, kuten edellä) T75-pulloissa (Corning, USA) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2, 95% kostutetussa ilmassa, . Elatusaine imettiin pois ja 13 ml lämmitettyä tuoretta väliainetta korvattiin päivänä 3 5. Elatusaine vaihdettiin joka 4-5 päivä, kunnes solut lähestyi yhtymäkohta. Solut siirrostettiin, jäädytettiin ja sulatettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [10]. Soluviljelyt karanteeniin ensisijainen inkubaattorissa odottamaan virallisia patologinen tutkimus tuloksia ja varmistaa, että tartunnan saaneita näytteitä ei tuoda yleiseen kulttuuriin.

Ensisijainen kulttuurin kiinteä kasvain.

Kun laboratoriossa, kiinteä kasvain leikattiin osaksi ~ 3 mm

3 kappaletta käyttäen steriiliä leikkausveitsellä ja siirrettiin T25-pulloihin, jotka sisälsivät riittävästi kollagenaasi /dispaasi (Roche, UK) liuosta (1 mg /1 ml kokonaisuudessaan medium) täysin upotetaan näytteeseen. Soluja inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa tasoravistelijalla (IKA-Vibrax-VKR) 2 x G. Solususpensio siirrettiin Universal säiliöön, sentrifugoitiin 400 x g 5 minuutin ajan PBS: ää, pestiin, suspendoitiin uudelleen kokonaan väliaineessa ja pantiin T25 pullossa 30 minuuttia, jotta fibroblastien kylvö. Pintaepiteelisuspensiota siirrettiin T25 pullossa meneillään soluviljelmässä.

Culture optimointi

Direct viljelemällä päälle peitinlasit.

Aika keruusta toiminnallinen arviointi voi olla enintään 14 päivää. Lyhentämään kulttuurin ja käsittely ennen käyttöä, media ja vesivatsanestesupernatan- (01:01 v:v) lisättiin suoraan steriili kansi liukuu välittömästi analyysiä.

Cytospinning.

Vesivatsa- neste Cytospin suoraan mikroskoopin jälkeen optimointi Sentrifugointinopeuden, näytteen tilavuus ja rikastaminen vesivatsanestesupernatan- avulla lisäämällä punasolujen lyysipuskuria. Sen jälkeen cytospining, objektilasit kuivattiin ilmassa, kiinteät 100% metanolia ja säilytettiin -20 ° C: ssa myöhempää karakterisointia.

ominaispiirteiden

Munasarjasyöpä on joukko heterogeeninen sairauksia. Lisäksi, vesivatsanesteestä sisältää erilaisia ​​solutyyppejä ja yksi markkeri on siis insufficent luotettavasti erottaa munasarjan epiteelin syövän solut muista solutyypeistä. Karakterisointi paneeli koostuu soluviljelmässä morfologia, immunofluoresenssivärjäyksellä kiinnitettyjä soluja, samoin vakiona patologinen ja immunohistokemia tutkimus yhdistettiin varmistaa tarkan epiteelin luonnehdinta jokaisen kulttuurin.

Morfologia.

Morfologiset ominaisuudet tutkittiin alle Olympus CK40 käännettyä mikroskooppia 20-kertaisella suurennuksella. Kuvat otettiin käyttäen VisiCam ohjelmistoa (VWR, USA).

Immunofluoresenssi.

Standarditekniikoita immunofluoresenssilla käytettiin värjäytyä pancytokeratin, epiteelisolujen adheesiomolekyyli (EpCAM), syövän antigeeni 125 (CA125 ), epiteelin liittyvä antigeeni (MOC-31), D2-40 ja vimentiinistä, Taulukko 1. yhtään positiivista markkereita ovat tasaisesti ilmentyy kaikissa EOC soluissa mutta sitä tulkitaan mahdollistavat sopivien kulttuureissa.

Muodollinen histopatologia

Muodollinen patologinen ja sytologinen tutkiminen vesivatsanesteet ja kiinteä kasvain näytteitä potilaista luovuttavia PCO näytteet tehtiin ja käytettiin edelleen luonnehtia kulttuureissa.

Kun kaikki luonnehdinnat olivat sopusoinnussa epiteelin munasarjojen alkuperä, näytteitä käytettiin sitten seuraavissa kokeissa. Kun tulokset olivat ristiriidassa epiteeliperäisten, viljelmiä hylättiin.

Imagestream

X luonnehdinta

Perustettu PCO kulttuurien ja tuoretta askites.

PCO soluja, viljellään menetelmillä edellä trypsinoitiin, kiinnitettiin 0,4% paraformaldehydillä 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja permeabilised BD Phosflow Perm /pesu I (BD Biosciences, USA; 01:10 v:v tislattua vettä).

tuore askites, kymmenen ml vatsaontelonestettä suodatettiin pois suuria roskia (180 um huokoskoko nylon suodatin, Millipore, UK). Kuten Askitesneste usein kontaminoitunut verellä, lisäämällä kiinnitysainetta, joka sisältää punasolujen lyysauspuskuria (01:05 v:v BD Phosflow Lyse /Fix punasolujen lyysipuskuria, BD Biosciences, USA) käyttöön ehtyminen punasoluja. Solut permeabilised BD Phosflow Perm /pesu I ja näytettä edelleen rikastaa ehtyminen valkosolujen käyttäen EasySep Ihmisen CD45 väheneminen Kit (StemCell teknologiat, Ranska), kuten valmistajan ohjeiden.

Kaikki näytteet sitten inkuboitiin jossa immunoflourescent-leimattujen vasta-aineiden 12 tunnin ajan 4 ° C: ssa, mukaan lukien pancytokeratin, EpCAM, CA125, DRAQ5 tumaväriä ja yhteisen leucicytoe antigeenin (CD45) tunnistaa valkoisia verisoluja. Näytteet käsitellään käyttäen Imagestream

X (Amnis, USA) ideoita ohjelmisto käyttää määrittämään solujen osuus, jotka ilmentävät kolme epiteelin markkereita, sekä tarjoaa arvion koekspressio.

Kasvu ja Sytotoksisuus määritykset

SRB.

rutiinia sulforodamiini B (SRB) määritystä käytettiin arvioimaan sytotoksisuuden ja solujen kasvua, kuten aikaisemmin on kuvattu [11]. Lyhyesti, solut ympättiin pitoisuutena 1000 solua /kuoppa, ja kiinnittymisen jälkeen, käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla rucaparib varten 10 päivää ennen kiinnitystä, värjäys ja spektrofotometriä arviointi.

klonogeeninen määritykset.

klonogeeninen määrityksiä pidetään kultakantaan arvioimiseksi sytotoksisuuden. 50000 solua /kuoppa ympättiin 6-kuoppaiselle levylle 24 tuntia. Soluja inkuboitiin sitten 24 tunnin ajan eri pitoisuuksilla sytotoksista ainetta ennen kylvöä pitoisuuksina 2500, 5000 ja 10000-solujen kunkin lääkehoidon. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 14 päivää. Elatusaine imettiin pois, levyt pestiin PBS: ssä ja kiinnitetään sitten käyttämällä Carnoy fiksatiiviin (etikkahappo: metanoli 01:03 v /v) ja sen jälkeen värjäämällä 1% kristallivioletilla.

agar clonogenics.

50000 solut ympättiin kaivoihin, jotka sisälsivät median ja käsiteltiin kuten edellä 24 tunnin ajan agaroosin media. Sitten solut trysinised, pestään ja uudelleen kylvetään puolikiinteässä agaroosi (Promega, UK) media, on erilaisia ​​pitoisuuksia, ja inkuboitiin 14 päivää. Pesäkkeet värjättiin käyttäen 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT).

Cell transfektio

Luciferase ilmentävät plasmidi pGL2 (Promega, USA ) transfektoitiin käyttämällä kahta menetelmää. Ensinnäkin, valmistajan protokollan (Invitrogen, USA) solujen transfektoimiseksi lipofektamiinin TM LTX Plus-reagenssia käytettiin transfektoimaan PCO viljelmien 1-6 ug DNA: ta kuoppaa kohti. Toiseksi, 250 ui PCO solususpensiota, joka sisälsi 1 x 10

6 solua /ml sekoitettiin 1-5 ug pGL2 plasmidin 4 mm elektroporaatiota kyvettejä (Eurogentec, Belgia). Elektroporaatio suoritettiin käyttäen EPI-2500 -elektroporaattoria at 100-500 volttia. Transfektanttien molemmista menetelmistä kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja lusiferaasiaktiivisuus.

Lisäksi PCO viljelmiä transfektoitiin käyttäen MISSION ™ shRNA lentiviruksen transduktiopartikkeleilla (Sigma-Aldrich, USA), kuten valmistajan protokollan mukaisesti.

Homologinen rekombinaatio määritys

Solut ympättiin lasipeitelevyihin ja käsitelty 2Gy ionisoivaa säteilyä ja rucaparib 10 uM 24 tuntia aiheuttaa kaksinkertaisen säikeen katkoksia (DSB). Kaikki kokeet suoritettiin rinnalla käsittelemättömien kontrollien kanssa vastaa 0,1% DMSO. Solut kiinnitettiin sitten ja hydratoida uudelleen ennen värjäystä 1:100 hiiren monoklonaalisella anti-γH2AX (Upstate, Millipore Corp., USA) ja 1:100 vuohen polyklonaalisen anti-Rad51 (Calbiochem, EMD Biosciences, Inc., USA) vasta-aineiden asianmukaisia toissijainen fluorokromiin konjugoituja vasta-aineita, kuten aiemmin on kuvattu [5].

Kuva J laskenta ohjelmisto [12], [13], käytettiin laskemaan γH2AX ja Rad51 nukleiini- pesäkkeitä. Solut luokiteltu homologinen rekombinaatio (HR) toimivaltainen, jos siellä oli enemmän kuin 2-kertainen nousu Rad51 pesäkkeitä jälkeen DNA-vaurioita, vahvistettu 2 kertainen nousu γH2AX.

Tulokset

Generation of primääriviljelmissä vesivatsanesteestä

askites kerättiin 172 munasarjasyöpä potilailla, joille ensisijainen (67%) tai viiveellä ensisijainen leikkaus (seuraavat kolme-neljä sykliä platinapohjaisen neo-adjuvanttihoitoa; 33%) vuosien 2008 ja 2013 . Elävät viljelmät kertyi 166/172 (97%) tapauksista. Punasolut ja solutason roskia askites ei noudattanut kulttuuriin pulloon ja poistettiin seuraavat median muutoksen. Yleisesti ulkonäkö kutakin viljelmää oli se, että mukulakivi yksikerroksinen kuvio, kuvio 1 (A), kuten on kuvattu Dunfield

et ai

[4]. Askitesneste koostuu useista solukomponenttien ja jotta voidaan vahvistaa yksinomaan syöpäsolujen kasvua karakterisointi viljeltyjä soluja tarvitaan. Immunoflourescent luonnehdinta viljelmistä suoritettiin käyttäen paneelin vasta-aineiden detetct ilmentymisen pancytokeratin CA125, EpCAM, MOC-31, D2-40 ja vimentiinin, kuvio 1 (B-F). 10/166 (6%) hylättiin, koska niillä ei pystynyt osoittamaan yli 95% sytokeratiinia positiivisuutta. Yleisenä onnistumisprosentti siis luoda ascitic epiteelin primääriviljelmissä potilailta, joille suoritetaan leikkaus oli 156/172 (91%). Rutiini histopatologinen tutkimus FFPE kudoksen kunkin potilaan toteutettiin taulukossa 2. Kaikkein hallitseva histologinen alatyyppi oli korkealaatuista vakavasta syöpä.

V: Brightfield osoittavat mukulakivi yksikerroksista; immunoflourescent kuvia vasta kohdistettu: B: FITC-anti-pancytokeratin; C: Alexafluor 596 anti-CA125; D: Alexflour 488 anti-EpCAM; E: Alexafluor 596 anti-MOC 31; F: Alexaflour 596 anti-vimentiinista

alaryhmässä näytteitä, immunoflourescent arviointi CA125 ilmentymisen PCO näytteessä verrattiin ca125 ilme immunohistokemiallinen analyysi FFPE kudosta samalta potilaalta Kuvio 2. Korrelaatio tulosten kahden arvion havaittiin 8/11 (72%) tapauksessa. Muissa kolmessa tapauksessa, kaksi osoitti IHC ilmentymä CA125 vain, kun yksi osoitti IF ilmaisun vain.

PCO 158 V: n immunohistokemiallinen havaitseminen CA125 vuonna FFPE kudoksessa; B: Immunofluourescent havaitseminen CA125 kanssa Alexaflour596 vastaavista ensisijainen kulttuuri

Cellular morfologia tutkittiin ajan ja se nähtiin, että suurin osa viljelmät olivat mukulakivi morfologian mutta myöhään passage soluja (tyypillisesti seuraava kappale 4 /5) kehitti enemmän mesenkymaaliset fenotyyppi, tulossa pitkänomainen ja joka osoittaa selvästi kasvun taittumisesta. Vanheneminen tapahtui välillä 2. ja 8. kohtia, yleisimmin välillä 4. ja 5.

th, mikä tekee edelleen kuvaamisen myöhään passage mahdotonta. Viljelmät katsottiin epäonnistuneen, jos mitään kasvu oli 28 päivän jälkeen. Yksi kulttuuri spontaanisti kuolemattomaksi ja on kasvanut yli 20 kohtia. Ei ole selvää, miksi kulttuuri Vesivatsanesteestä on hävinnyt osassa tapauksia, miksi vanhenemista tapahtuu vaihtelevan kohtia tai miksi vain yksi kulttuuri on ikuistanut. On todennäköistä, kuitenkin, että tämä on seurausta puute keskeisiä tekijöitä tarvitaan kasvuun, jotka on järjestetty

in vivo

että monimutkaiset vuorovaikutukset sisällä kasvaimen mikroympäristössä ja jotka puuttuvat keinotekoinen kulttuurin ympäristöön.

Culture kasvu

kasvuvauhdin 30 PCO viljelmiä, kasvatettiin RPMI-alusta täydennettynä 20% FCS, mitattiin SRB joissa käytetään aikaisin kulku soluja tuottamaan kaksinkertaistaa kertaa. Kahdentumisajat välillä PCO viljelmiä erittäin vaihteleva mediaani kaksinkertaistui aika 100 tuntia (vaihteluväli 79-195 tuntia), kuvassa 3. Kuitenkin solut samasta kulttuurista testattava eri kulku oli minimaaliset vaihtelu kahdentumisaikoina (keskimääräinen ero 0,9 tuntia ; SEM 4.8). Mitään korrelaatiota osoitettiin välinen kasvu, histologinen alatyyppi tai taudin vaiheesta klo esitys. Suhteellisen hitaan kasvun nähnyt voi myös olla seurausta articial culturee ympäristön ja puute tekijöistä kasvain micronvironment.

Keskimääräinen ja SD 6 toistojen kunakin ajankohtana piirretään, normalisoitu päivä 1.

Ensisijainen kulttuurin kiinteä kasvain

Samanaikaisesti askites, kiinteä kudos kerättiin 11 potilasta ja käsitellään kuten on kuvattu. Perustaminen soluviljelmissä kudosviljelyistä saavutettiin 100%: ssa tapauksista. Eksplantaatista morfologia menetettiin 72 tuntia kylvö soluina hankittu yksikerroksinen mukulakivi ulkonäkö ajan ja johtamisella. Kulttuuri oli samanlainen morfologinen ulkonäkö, jotka ovat peräisin askites soluviljelmässä Kuva 4. Fibroblast saastuminen minimoitiin maljaamalla soluja inkuboitiin 30 minuuttia ennen kuin irrotat epiteelin rikas supernatantti ja jatkomaljausta, Kuva 5.

V: Passage 0 48 tuntia; B: Passage 0 72 tuntia; C: Passage 1 päivänä 14

V: epiteelisolujen kasvua supernatantti poistettiin 30 minuutin kuluttua alkumaljauksesta (× 20 suurennus); B: Solut kiinni alkuvaiheen 30 minuutin inkubaation olivat lähes kokonaan fibroblastisia (x 10 suurennus).

Näytteiden kuljetus

Transport optimointi.

Paikka näytteenoton on usein kaukana laboratoriotilat. Voidakseen käyttää tätä mallia yhteistyöhön translaation työssä perustamisen onnistuminen kulttuurin seuraavien kuljetuksen otettava huomioon. Siksi verrattuna onnistumisen kulttuurin kuvaamista ja toiminnalliset analyysit seuraavat liikenteen eri menetelmillä.

Ryhmä 1 – Fresh askites (n = 10): kuljetus laboratorioon, jossa käsittely 6 tunnin kuluessa, ja käytetään edellä kuvatulla menetelmällä .

ryhmä 2 – huoneen lämpötila näytteitä (n = 7): askites säilytettiin huoneenlämmössä steriiliin astiaan 24 tuntia ennen sekoittamista 01:01 median pulloon kuin edellä.

Ryhmä 3 – Jäähdytetty näytteitä (n = 10): askites säilytettiin 4 ° C: ssa 24 tuntia ennen sekoittamista 01:01 keskipitkän kuten edellä.

Ryhmä 4 – Jäädytetyt näytteet (n = 6): pariksi sarjaa 50 ml: n alikvootit vatsaontelonestettä sentrifugoitiin 400G: ssa 5 minuutin ajan. Tuloksena solujen pelletit jäädytettiin, säilytettiin -80 ° C: ssa ja 120 ° C ja sulatettiin 6 viikon ja 6 kuukautta.

Onnistunut viljelmiä saavutettiin kaikkien liikenteen ryhmistä kuitenkin tapauksissa hidastunutta kulttuuriin oli parempi ylläpitää viljelmiä 4 ° C: ssa. Ei ollut eroa morfologia viljelmiä kasvatettiin kustakin ryhmästä, taulukossa 3.

Vesivatsa- solupelletit (ryhmä 4) säilytettiin -80 ° C: ssa ja 120 ° C: ssa, sulatettiin 6 viikkoa ja 6 kuukautta. Viljelmiä kasvanut menestyksekkäästi sekä varastointiolosuhteet 6 viikon kuluttua mitään eroa havaittu morfologiassa, kasvu tai toiminnallisia arviointia. Kuitenkin seuraavat 6 kuukautta varastoinnista, merkittävä ero onnistumisen myöhemmin kulttuurin kaksi ehtoa ei havaittu. Vesivatsa- pellettejä säilytettiin -120 ° C: ssa oli onnistuneesti viljeltiin 83% tapauksista. Ei viljelmiä säilytettiin -80 ° C: ssa voitiin onnistuneesti kasvanut.

Coverslip kulttuureissa

morfologinen ulkonäkö peitelasi soluviljelmissä oli sukua rinnakkain kulttuureja käsitellään käyttäen standardin menetelmällä. Immunoflourescent luonnehdinta oli yhdenmukainen kaikissa PCO tapauksissa välillä peitelasi ja perinteinen menetelmä kulttuureissa. Optimaalinen immunoflourescent värjäys kuvaamista saatiin jos suoritettiin yli 24 tuntia ymppäyksen jälkeen.

Cytospinning

Optimaalinen parametrit tasapainottaa maksimaalinen solujen kiinnittyminen säilyttäminen ydin- morfologia oli 200 ui vesivatsanestesupernatan- (pitoisuus 10 x 10

4 solua per ml) Cytospin 80 x g 5 minuuttia. Huolimatta toteutetut toimenpiteet heikentävistä Vesivatsanestettä näyte toivottuja ei-epiteelisolujen ja roskia, dioja pysyi hyvin saastunutta, vahvistettu optimaalista sytokeratiinia värjäys ja huono CA125 ilme. Saastuminen tehty arviointi morfologia, immunoflourescent kuvaamista ja toiminnallinen arviointi HR tilan onnistu.

Imagestream

X arviointi PCO kulttuurien

käyttöönotto Imagestream

X teknologia sen kyky yhdistyvät virtaussytometria korkean resoluution immunoflourescent mikroskoopilla sallittu arviointia ilmentymisen useita immuunifluoresenssivasta-leimatun markkereita yksittäisissä soluissa samanaikaisesti suurella nopeudella ja suurella tarkkuudella. Immunoflourescent havaitseminen kolmen epiteelin munasarjojen markkereita (pancytokeratin, EpCAM ja CA125), arvioitiin käyttäen standardia kiinteitä immunofluoresenssilla ja Imagestream

X tekniikka oli johdonmukaisesti 13/15 tapauksessa (87%), taulukko 4. Lisäksi Imagestream

X mahdollisti määrällisesti prosenttiosuuden ilmaisun ja arvioinnin koekspressoimalla.

Imagestream

X arvio tuoreen askitesta näytteiden

Kymmenen ml tuoretta askites kerättiin ja analysoitiin seitsemän munasarjojen syöpäpotilasta käyttävät Imagestream

X. Solut luokiteltiin epiteelin jos ne nukleoida, negatiivisia CD45 ja positiivisia EpCAM, CK tai CA125. Epiteelisolujen väestön kussakin askites näytteessä voidaan jakaa useisiin Osapopulaatioiden perustuu rakenteessa vasta-merkintää, kuva 6a ja b, ja osoitti suurta välisten kasvain heterogeenisuus. Osuus positiivisiksi värjäytyneiden solujen EpCAM oli erittäin vaihteleva mediaani 52% (0-98%). Ei ollut korrelaatiota Imagestream

X määritellään ilmaus epiteelin merkkejä ja asemaa määritettynä kiinteiden immunofluoresenssilla (ROC käyrä, jota ei ole esitetty, AUC 0,5). On mahdollista, että jotkut näistä alapopulaatioista voivat edustaa ei-epiteelisolujen (eli mesoteelisolujen), mutta se on myös mahdollista, että ne ovat itse asiassa epiteelisoluissa ja tehdään fenotyyppinen muutos seurauksena viljelymenetelmällä; tai että kulttuuri menetelmä positiivisesti valitsee ulos osapopulaatioiden. Solulajittelussa myöhempien molekyyli- profilointia kunkin alapopulaatioiden selvennettäisiin tämän ja mahdollistaa edelleen molekyylitason eroja osajoukkoja EOC on selvitettävä.

V: ImagestreamX solu juoni edustavien solujen osoitetaan kolme suurta solu osapopulaatiosta sisällä vesivatsanesteestä,; i) CK positiivinen vain, ii) CK ja CA125 positiivinen ja iii) EpCAM, CK ja CA125 positiivinen. B: Alaryhmät tunnistettu epiteelisolujen väestön EOC vesivatsanestesupernatan- (n = kokonaismäärä epiteelisolujen tunnistettu 10 ml askites).

Solun transfektio

joukko toiminnallisia määrityksiä vaativat transfektio vektoreita soluihin [14], [15]. Huolimatta optimointi, sekä lipofektamiinin ja elektroporaatio transfektiomenetelmistä jättänyt saadaan riittävän korkea transfektion tehokkuus funktionaalisia määrityksiä.

Kuitenkin solut jatkoivat kasvuaan puromysiinissä mediassa transfektion jälkeen tehtävälle ™ shRNA lentiviraalinen transduktiopartikkeleilla viittaa menestyksekäs transfektio. Pitkäaikainen transfektio ei voitu arvioida, koska lyhyellä aikavälillä elinikä PCO kulttuureissa.

Funktionaaliset homologisen rekombinaation määritykset ja sytotoksisuus

RAD51 määritys HR DNA korjauksen tila onnistuneesti suoritettiin kaikki primääriviljelmissä jotka kasvatettiin onnistuneesti kaikista liikenteen ryhmistä. HR asema kulttuureissa samalta PCO luovuttaja käyttämällä suoraa pinnoitus päälle peitelaseja ja askites viljelmät olivat kaikki yhdenmukaisia. Viljelemällä suoraan peitinlaseja vähentänyt aika keruusta määrittää HR tilan noin 14 5 päivää.

odotetusti GI

50-arvot hoidon jälkeen rucaparib kunkin PCO kulttuurin vaihtelivat, kuitenkin selvästi erillään herkkien ja resistenttien näytteitä nähtiin aiemmin kuvattu [5]. Useimmissa tapauksissa odotetusti, PCO näytteitä viallisia HR asema olivat herkkiä rucaparib, kun taas ne, joilla on toimivaltaisten HR asema oli resistenttejä, Taulukko 5.

Huolimatta optimoinnin usean standardin klonogeeniset tekniikoita, pesäkkeitä muodostusta ei havaittu, ja siksi klonogeeniset määrityksissä hylätty PCO kulttuureissa. Solulinja työ on aiemmin osoittanut lineaarisesti saadut tulokset SRB ja clonogenics ja siksi SRB hyväksyttiin standardi tekniikka tässä tutkimuksessa [16].

Keskustelu

Kyky tuottaa ja hyödyntämään primääriviljelmien munasarjasyöpä on useita etuja verrattuna muihin malleihin kuten vakiintuneet solulinjat ja eläinmalleissa. Se on nyt tunnustettu, että monet solulinjat pitkäaikaisviljelmän kokee geneettisiä poikkeavuuksia, jotka tekevät niistä poikkea niiden kudoksen alkuperän. Lisäksi jopa suuri paneeli solulinjoja voi kerrata valtava heterogeenisuus, joka nähdään epiteelin munasarjasyöpä. Monet eläinmalleja pelkästään ksenografteissa käyttävät näitä solulinjojen ja siksi pitää samoja ongelmia. Siirtogeenisen hiiren mallia yleensä on luotu yhdistämällä pieni määrä mutaatioita [17], joten ne eivät näy massiivinen kromosomi epävakaus, joka on tunnustettu tunnusmerkki munasarjasyöpä [18].

Tässä olemme kuvanneet omien havaintojen tuottamiseksi primääriviljelmien munasarjasyöpä, käyttämällä soluja, jotka ovat peräisin sekä askites ja likahiukkasia taudin. Kyky kulttuurin sekä näiden materiaalien on tärkeä, sillä se riippuu hoitopaikassa, vain yksi näistä aineista voi olla käytettävissä. Esimerkiksi uusiutunut tauti ei ole harvinaista nähdä askites puuttuessa suurten likahiukkasia toisin Alkajaisesitelmän missä vain kiinteitä sairaus voi olla läsnä. Olemme raportoineet peräkkäinen joukko näytteitä osoittaa onnistumisprosentti tuottaa kulttuureissa. 156/172 (91%) näytteistä johti elinkelpoisen viljelmän epiteelisolujen. Tämä luku on riittävän korkea perustelemaan mahdollista käyttää näitä tekniikoita rutiininomaisessa kliinisessä käytännössä, jos diagnostiset testit kehitettiin käytettäväksi tämän materiaalin.

Usein ja todellakin omassa tapauksessa, voi olla merkittäviä maantieteellisiä toisistaan leikkaussaliin ja diagnostisen laboratorion. Kyky kuljettaa näytteitä ilman eheyden vuoksi on välttämätöntä, ja olemme kuvanneet tekniikoita, jotka osoittavat, että nämä näytteet voidaan turvallisesti säilytetään joko 4 ° C: ssa tai -20 ° C: ssa korkeintaan 24 tuntia ennen viljelyn. Lisäksi kyky tallentaa kulttuureissa pitkällä aikavälillä nestemäisessä typessä sallii mahdollisuus yhteistyöhön tutkimus- tai

post hoc

diagnostisia analyysi.

Erityisen suurella vaiheessa, kun kasvaimet ovat levitetään koko vatsaontelon ja yli, monet kasvaimet osoittaa merkittäviä sisäisiä kasvaimen heterogeenisyys [19], [20], vaikka usein nämä muutokset vastaavat paremmin paikalliseen strooman reaktio kuin läsnäolo tai puuttuminen avaintekijä mutaatioita [21].