Krooninen sairaus

tiivistelmä

adenovirukset (mainokset) on deletoitu

E1b55K

replikoitua edullisesti syöpä solut ja on käytetty syövän hoitomuotoja. Olemme aiemmin osoittaneet, että Ad E1B55K proteiini liittyy induktioon sykliini E Ad lisääntymään, mutta tämä E1B55K toimintoa ei tarvita syöpäsoluissa, joissa vapauttaminen sykliini E havaitaan usein. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet vuorovaikutus sykliini E ja CDK2 Ad-infektoiduissa soluissa. Ad infektio lisäsi merkittävästi suuri muodossa sykliini E (sykliini EL), edistänyt sykliini E /CDK2 kompleksin muodostumiseen ja lisääntynyt CDK2 fosforylaatio klo T160 sivustolla. Aktivoidut CDK2 aiheutti pRb fosforylaatiota klo S612 sivustolla. Tukahduttaminen CDK2 toiminnan kanssa kemiallisen inhibiittorin roskovitiinilla tai erityisiä pieniä häiritseviä RNA: t laskivat merkittävästi pRb fosforylaatio, samanaikaisessa tukahduttaminen virusreplikaation. Tuloksemme viittaavat siihen, että Ad aiheuttama sykliini E aktivoi CDK2 että tavoitteet transkription repressori pRb tuottaa solun ympäristön viruksen tuottavaa replikaatiota. Tämä tutkimus paljastaa uutta molekyylitason perustan onkolyyttistä replikointi

E1 b

-deleted mainokset ja auttavat kehittämään uusia strategioita Ad onkolyyttistä virotherapies.

Citation: Cheng PH, Rao XM, McMasters KM, Zhou HS (2013) Molecular Basis for Viral Selective Replication syöpäsoluissa: aktivointi CDK2 adenoviruksen aiheuttama sykliini E. PLoS ONE 8 (2): e57340. doi: 10,1371 /journal.pone.0057340

Editor: Yi Li, Wuhan biotekniikan instituutti, Kiina

vastaanotettu: 03 lokakuu 2012; Hyväksytty: 21. 2013 Julkaistu: 20 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Cheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NIH Grant R01 CA129975 (jotta HSZ https://www.nih.gov/). PHC on osittain tukee K. C. Huang Scholarship yliopistosta Louisville (https://louisville.edu/medschool/pharmacology). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ihmisen adenovirukset (mainokset) ovat kaksijuosteista lineaarinen DNA-viruksia, jotka kykenevät infektoimaan ja monistuu monenlaisia ​​solutyyppejä

in vitro

ja

in vivo

, lukien postmitoottisia soluissa. Infektion jälkeen viruksen varhaisten proteiinien vuorovaikutuksessa solun tekijöitä luoda suotuisat olosuhteet, joissa viruksen replikaatiota [1]. Ad

E1

alue sisältää kaksi sarjaa geenejä,

E1 a

ja

E1 b-

, jotka ovat omistautuneet solusyklikontrollin, apoptoottiset esto, ja solu- ja viruksen geenin sääntelyä [ ,,,0],2]. Mainokset, joissa

E1

muutokset, jotka replikoitua edullisesti syöpäsoluja on käytetty syövän geenihoitoon.

viruksen

E1a

geeni ilmentyy heti infektion jälkeen. Ensisijainen rooli

E1a

geenituotteiden on säätelevän useiden solun ja viruksen geenien [1]. Sen sijaan, että suoraan sitoutumalla tiettyihin DNA-sekvenssit transkription säätelyyn elementtejä, E1A proteiinit vuorovaikutuksessa useiden keskeisten sääntelyviranomaisten soluproliferaation [3], [4]. Tunnettu cellular seikat, joihin E1A proteiinit sitovat ovat tuotteita retinoblastooma (

Rb

) geenin ja sen rakenteellisesti läheisten geenien,

p107

ja

p130

[5] , [6]. Sitomalla retinoblastoomaproteiiniin (pRb), E1A aktivoi transkription säädin E2F proteiineja. Tutkimukset ovat osoittaneet, että pRb /E2F monimutkainen aktiivisesti tukahduttaa transkription kohdegeenien ja välittää G

1 pidätyksen laukaisee p19 (ARF), p53, p16INK4a, TGF beta tai solukontaktissa [7] – [9]. Äskettäin Pelka

et al.

(2011) osoitti, että E1A voi sitoutua suoraan E2F /DP-kompleksit vuorovaikutuksessa DP-1, jolloin aktivointi E2F-reagoiva geenin ilmentymisen riippumatta sitoutumaan pRb [10] . Useat ryhmät ovat osoittaneet, että ilmaus

E1 a

geeni laukaisee kertyminen p53-proteiinin ja p53-riippuvaista apoptoosia [11], [12] joko aktivoimalla p53 transkriptio tai estää p53: n hajoamisen että proteasomin [11] – [14].

Mainoksen E1B55K on osoitettu joissakin tutkimuksissa vastapainoksi E1A aiheuttama vakauttaminen p53 [11], [15]. E1B55K proteiini voi estää toimintoja p53 läpi vähintään kolme erillistä mekanismeja. E1B55K tiettävästi sitoo aminopäässä p53 [16], ja tämä sitoutuminen voi tukahduttaa p53 transkriptionaalista aktivaatiota, kuten ehdotetaan transkription määrityksissä [17] ja ohimenevän transfektion tutkimuksia [18]. E1B55K voi myös häiritä p53-toiminto yhteistyössä viruksen E4orf6 proteiinin aiheuttamaan proteolyyttisen hajoamisen p53-proteiinin [19] – [21]. Tuore tutkimus on osoittanut, että E1B55K yksin toimii E3 SUMO1-p53 ligaasilla että vuorovaikutuksessa promyelosyyttinen leukemia ydin- elimiä inaktivoida p53 ja stimuloivat sen tumasta [22]. Siten, E1B55K estää p53-geenien, ja näin ollen ehkäisee p53-riippuvaista apoptoosia indusoitiin E1A, joka mahdollistaa tehokkaan viruksen replikaation [16], [17].

Ad

dl

1520 (ONYX-015) sisältää 827 bp: n deleetio ja pistemutaatio tuottaa ennenaikaisen lopetuskodonin E1B55K koodaavan sekvenssin, estää ilmentymisen geenistä [23]. Se oli alun perin ehdotti, että

E1b55K

-deleted mainokset voivat jäljitellä ainoastaan ​​p53 puutteesta kasvainsolujen, kuten E1B55K välittämää hajoamista p53-proteiinia ei tarvita näissä syöpäsoluissa [24], [25].

E1b55K

-deleted onkolyyttisten mainokset on testattu kliinisissä kokeissa ja markkinoidaan syövän hoidossa Kiinan jälkeen hyväksynyt Kiinan valtion Food and Drug Administration (SFDA) [26]. Kuitenkin alkuperäisen hypoteesin vaarantua useiden tutkimusten osoittaa, että

E1b55K

-deleted mainokset kykenevät replikoitumaan soluissa riippumatta p53: [27] – [30]. Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet, että kertyminen p53-proteiinin, sen jälkeen, kun infektio mainokset kirjanpitoarvoja mutatoitunut

E1b55K

geenejä, jotka eivät pysty tukahduttaa p53, joka ei voi tehdä tehokkaasti indusoida apoptoosia eikä transkriptionaalisesti aktivoida ilmentymistä p53: een reagoiva geenien Ad-tartunnan soluihin [31], [32]. Näin ollen, nämä tulokset viittaavat siihen, että estämällä p53: n aktiivisuuden E1B55K proteiini on todennäköisesti merkittävä vaatimus virusreplikaation. Mekanismi (t)

E1b55K

-deleted virusreplikaation syöpäsoluissa ei vieläkään vahvistettu, vaikka vektoreita on jo sovellettu klinikalla ihmisen syövän hoitoon [26].

aiemmin olemme osoittaneet, että Ad E1B55K on mukana solusyklin liittyviä geenejä, mukaan lukien sykliini E ja CDC25A [33]. Ad E1B55K välittää suuri muodossa sykliini E-proteiinia (sykliini EL) induktio Ad-tartunnan saaneiden solujen [34]. Sykliini E ja suuri muodossa sykliini EL syntyvät vaihtoehtoisesta silmukoinnista. Käännös sykliini EL aloitetaan ATG-kodoni, joka sijaitsee eksonissa 2 ja sykliini E on ATG-kodoni eksonissa 3 [35]. E1B55K toimintoa tarvitaan sykliini EL induktio normaaleissa soluissa, mutta ei vaadita syöpäsoluissa säätelemättömään sykliini E Ellei indusoivat tehokkaasti sykliini EL ilmentymistä normaaleissa soluissa, replikaatio

E1b55K

-deleted onkolyyttisten mainokset on rajoitettu. Kuitenkin

E1b55K

-deleted onkolyyttisten mainokset voivat tehokkaasti indusoida sykliini EL syöpäsoluja ja suorittaa riittävä onkolyyttistä lisääntymään. Olemme ehdottaneet, että sykliini E vapauttaminen syöpäsoluissa voi olla tärkeä molekyylitason perustan valikoivan onkolyyttinen replikointi

E1b55K

-deleted mainokset [34].

sykliini E säätelee solusyklin etenemisen, DNA: n kahdentuminen [36], [37], ja sentrosomimäärän päällekkäisyyksiä [38], [39]. Expression of sykliini E valvotaan tiukasti normaaleissa soluissa. Taso sykliini E nousee myöhään G

1 vaihe, piikit G

1 /S vaihe edistää S-vaiheen merkintä, ja pienenee sen jälkeen [35], [40]. Vapauttaminen sykliini E on usein havaittu monenlaisia ​​syöpiä, kuten sykliini E-geenin monistaminen [41], yliekspressio sykliini E mRNA: n tai proteiinin tasot [42], [43], laskua sykliini E liikevaihdon [44], ja läsnäolon aktiivisempaa muotojen sykliini E [45] – [47]. Konstitutiivinen yliekspressio sykliini E: n osoitettiin indusoivan kromosomiin epävakautta ja heikentää normaalin solusyklin etenemisen [48], [49]. Oletusta, että epänormaali sykliini E ilmaisu voi laukaista kasvaimia on myös tuettu siirtogeenisiä eläinkokeissa [50] – [52].

Yksi funktio sykliini E on sitoa ja aktivoida sykliiniriippuvainen kinaasi 2 (CDK2) [53]. Sykliini E /CDK2 kompleksi fosforyloi alustoille kuten pRb ja johtaa transkriptionaalisen aktivaation loppupään geenejä. Tutkimukset osoittavat myös, että sykliini E on CDK2-riippumaton toiminnot [54], [55].

In vivo

Eläinkokeissa osoittavat välinen varianssi fenotyypit sykliini E null (sykliini E1

– /- E2

– /-) hiirillä ja CDK2 nolla (CDK2

– /-) hiirillä . Hiiret puuttuu CDK2 ovat elinkelpoisia, normaalia kehitystä paitsi vialliset sukusolujen kehitystä [56], [57]; mutta tyrmäys sykliini E1 ja E2-geenien hiirillä aiheuttaa alkion kuolleisuutta johtuen puute endoreplication of trophoblast jättisolut ja megakaryosyyttien [58]. Matsumoto

et al.

(2004) tunnisti centrosomal lokalisointi signaali (CLS) verkkotunnusta sykliini E [59]. Tämä CLS verkkotunnuksen avulla sykliini E kohdistaa sentrosomimäärän ja edistää S-vaiheessa merkintä CDK2-riippumattomalla tavalla. Lisäksi Geng

et al.

(2007) osoittivat, että sykliini E kinaasi-puutteellinen mutantti (KD-E) pystyy osittain palauttamaan minikro- huolto proteiini (MCM) lastaus ja S-vaiheen merkintä sykliini E null-solut [54]. Siten sykliini E on CDK2 riippuvia ja riippumattomia toimintoja S-vaiheessa merkintä ja DNA: n replikaatiota. Tärkeä kysymys on, Ad aiheuttama sykliini E voi aktivoida CDK2 ja onko sykliini E-CDK2 vuorovaikutus voi olla ratkaiseva rooli Ad lisääntymään. Tämä kysymys on erityisen tärkeää kehitettäessä onkolyyttisten virotherapy strategioita.

Tässä raportoidaan, että Ad aiheuttama sykliini E sitoutuu ja aktivoi CDK2 että tavoitteet transkriptio repressorin pRb, mikä puolestaan ​​voi säädellä ilmentymistä solujen ja virusten geenit . Tulokset viittaavat siihen, että vuorovaikutus Ad aiheuttama sykliini E ja CDK2 on tuottaa sopiva ympäristö Ad tuottavaa lisääntymään.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

HEK 293 (ATCC no. CRL-1573), ihmisen keuhko fibroblasti Wi-38 (ATCC no. CCL-75), ja ihmisen keuhkosyöpä A549 (ATCC no. CCL-185) solulinjat ostettiin American Type Culture Collection (Rockville, MD). WI-38-soluja viljeltiin vähän essential medium (MEM) Alpha GlutaMAX 0,1 mM ei-välttämättömiä aminohappoja ja 1,0 mM natriumpyruvaattia. HEK 293 ja A549-soluja viljeltiin minimikasvualusta Alpha. Kaikki alustat täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja penisilliiniä /streptomysiiniä (100 U /ml). Soluja viljeltiin 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Kaikki soluviljelmässä reagenssit saatiin Gibco BRL (Bethesda, MD).

adenovirusvektoreilla

Villityypin adenovirus tyyppi 5 (Adwt, ATCC no. VR-5) käytettiin replikaation -competent ohjaus. AdCMV /GFP, Ad-vektoria, jossa E1 deleetio kuljettavat vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP), käytettiin replikaatioviallinen ohjaus. Adhz63, joka on onkolyyttinen Ad vektori poistamisen kanssa

E1b55K

alueella, rakennettiin laboratoriossamme [60].

Virusinfektio ja titraus

Solut ympättiin 6- kuoppaisille levyille tiheydellä 2,5 x 10

5 (solua /kuoppa) ja viljeltiin osoitettujen olosuhteissa. Sen jälkeen solut olivat mock-tai infektoitiin AdGFP, Adwt tai Adhz63 on infektiokertoimella (MOI) 5. sytopaattisen vaikutuksen (CPE) ei havaittu suunniteltu ajankohtina ja valokuvattiin käännettyä mikroskooppia (Olympus CKX41). Yhteensä infektoiduissa soluissa ja supernatantit kerättiin 48 tunnin kuluttua infektiosta (infektoinnin jälkeen), ja hajotettiin vapauttaa viruspartikkeleita kolme sykliä jäädytys ja sulatus. Viruksen tiitterit määritettiin infektiivinen yksikkö menetelmällä kuten aiemmin on kuvattu [61], [62]. Lyhyesti, HEK 293-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 10

3 (solua /kuoppa) ja infektoitiin sitten 5-kertaisesti sarjoittain laimennettua viruksia. CPE rekisteröidään ja teki sen jälkeen, kun oli inkuboitu 7 päivää. Prosenttiosuutta virustiitterin lasketaan kaavalla, vähennys% = [(tiitteri kontrolliryhmä – tiitteri koeryhmä) /tiitteri kontrolliryhmän] x 100%.

viruksen DNA-synteesin määritys

jälkeen virusinfektio, solut kerättiin eri aikapisteissä. Viruksen DNA-synteesi määritettiin Southern blot; 1 ug eristetyn genomi-DNA: ta pilkottiin restriktioentsyymillä

Pst

I ja analysoitiin 1% agaroosigeelillä, joka sen jälkeen transblotatuilla Hybond-N + kalvolle (YA3609; Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL) . Koetin valmistettiin pilkkomalla 0,5 ug pBHGE3 [63] kanssa

Pst

I ja merkitty seuraamalla protokollaa Amersham Alkphos- Suora Labeling ja Detection Systems (RPN 3690, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Blotti esihybridisoitiin 3 tuntia 63 ° C: ssa. Hybridisaation ja pesuja suoritettiin 55 ° C: ssa ja sen jälkeen kemiluminesenssiosoitusta mukaan valmistajan protokollan.

Western blot-analyysi

Infektoidut solut kerättiin osoitettuina ajankohtina ja lyysattiin CDK2 lyysipuskuria (20 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, 0,5% Nonidet P-40, 0,1% Brij 35: ttä, 5 mM natrium- glyserofosfaatti, 1 mM natriumvanadaattia, 1 mM ditiotreitoli). Western blot analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [64]. Lyhyesti, 80 ug solulysaateista ajettiin elektroforeesilla 12% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin Immobilon-P Membrane (Millipore, Billerica, MA). Primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään tässä tutkimuksessa olivat kanin anti-sykliini E (M-20), CDK4 (C-22), hiiren anti-sykliini D1 (DCS-6), PCNA (PC10), p21 (F-5), pRb (IF8) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), hiiren anti-CDK2, p27 (BD Biosciences, San Jose, CA), pCDK2 T160 (Soluviestintä, Danvers, MA), kanin anti-fosforyloitua pRb (fosfo-pRb ) S612, ja aktiini (Sigma, St. Louis, MO), anti-fosfo-pRb S795 (New England Biolabs, Beverly, MA), ja anti-fosfo-pRb T821 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. Membraanit inkuboitiin sitten anti-hiiri-immunoglobuliini G (IgG) tai anti-kani-IgG peroksidaasi-kytketty lajispesifinen kokonainen vasta-aine (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Kemiluminesenssiosoitusta suoritettiin ECL reagenssien mukaan toimittajan suositusten (GE Healthcare). Skannattu bändi intensiteetti kvantitoitiin Gel-Pro Analyzer 4.0 ohjelmisto (Media Cybernetics, Bethesda, MD) mukaan valmistajan opetusohjelma. Densitometristä arvo jokaiselle kaistalle ilmaistiin integroitu optinen tiheys (I.O.D.) ja tulokset normalisoitiin aktiini. Lopulliset arvot edustavat keinot suhteellisen prosentuaalisen muutoksen, vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta, verrattuna mock ryhmä ± S.D .. Tilastollinen ero arvioitiin Studentin t-testiä. P-arvo 0,05 katsottiin merkitseväksi.

immunosaostus

A549-solut siirrostettiin 150 mm: n maljoille solutiheyteen 5 x 10

6 (solua /malja) ja sitten valeinfektoitu tai infektoitu AdGFP, Adwt tai Adhz63 MOI 5. 48 h pi, solut kerättiin ja lyysattiin CDK2 hajotuspuskuria menetelmän mukaisesti kuvattu edellisissä julkaisuissa [34], [65]. Solulysaateista (500 ug) immunosaostettiin sykliini E (HE111), hiiren monoklonaalisella vasta-aineella (Santa Cruz), tai anti-CDK2-vasta-ainetta (BD Transduction Laboratories) 4 ° C: ssa 4 h, minkä jälkeen siihen lisättiin proteiini A Sepharose Cl- 4B (82506, Sigma) ja inkuboidaan yön yli. Immunokompleksit analysoitiin Western blotilla anti-sykliini E ja CDK2-aineet.

Sirna (siRNA) transfektion

siRNA oligonukleotidit syntetisoitiin Eurogentec (Fremont, CA). Kolme eri siRNA-dupleksit suunniteltiin kohdistamaan CDK2 siitä nukleotidin 399-419 (# 1), 619-639 (# 2), ja 691-711 (# 3) mukaan Genbank NM001798.2 (National Center for Biotechnology Information GenBank) . Negatiivinen kontrolli siRNA duplex joka sisältää kahden osion 19 täydentävät RNA emäksiä 3’dTdT ulokkeita saatiin Eurogentec (SR-CL000-005). Solut ympättiin 6-kuoppaiseen levyyn tiheydellä 10

5 (solua /kuoppa) ja transfektoidaan sitten 200 nM CDK2 siRNA-dupleksit tai ei-spesifistä kontrolli-siRNA duplex Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) mukaan valmistajan protokollaa. Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen. Kahdeksankymmentä ug solulysaateista analysoitiin Western blotilla CDK2, pCDK2 T160, pRb, fosforyloitu pRb (p-pRb), sykliini E, kapsidiproteiineja, ja aktiinin vasta-aineita.

Kaikki edellä kokeissa, lukuun ottamatta nimenomaan mainita, toistettiin ainakin kolme kertaa.

tulokset

sykliini E /CDK2 muodostunut kompleksi infektoiduissa soluissa adenovirukset

Olemme aiemmin perustettu yhteys sykliini E ja replikointi adenovirusten [33], [34]. Tiedot kuvassa 1 kerrata että Ad E1B55K osallistuu induktion suuren muodon sykliini E-proteiinia (sykliini EL), joka edistää tehokasta virusreplikaation. Sykliini E ja sykliini EL syntyvät vaihtoehtoisesta silmukoinnista eri alku ATG kodoneja eksonit 2 ja 3 [35]. N-päähän viruksen aiheuttama sykliini EL on 15 aminohappoa pidempi kuin sykliini E-proteiinia. Sykliini E-proteiinia ilmentyy konstitutiivisesti ihmisen A549-keuhkosyövän soluja [34]. Villityypin Ad5 (Adwt), jossa ehjä

E1b55K

alueella, indusoi merkittäviä sykliini EL ilmentymistä sekä WI-38 ihmisen keuhkon fibroblastisoluissa ja A549 ihmisen keuhko- syöpäsoluja (Fig. 1A, kaistat 2 ja 5 ), ja aiheutti tehokas solutuhovaikutus (CPE) (Fig. 1 b, kaistat b ja e). Ad vektori Adhz63 kanssa

E1b55K

-nykyisen [60] myös indusoi merkittäviä sykliini EL A549-soluissa (kuvio. 1A, kaista 6) ja aiheutti tehokas CPE solujen (Fig. 1 B, paneeli c). Kuitenkin vektori onnistunut indusoimaan sykliini EL yliekspressio WI-38-solut (Fig. 1A, kaista 3) ja niiden CPE (Fig. 1 B, paneeli f). Vertailla replikaatiota Adwt ja Adhz63 A549 ja Wi-38 solujen tiitterit näiden kahden viruksen määritettiin. Adhz63 replikointi oli vahvasti tukahdutettu WI-38-soluissa, osoittaa vain 10% suhteellinen replikointi verrattuna Adwt (Fig. 1 C). Kun verrataan Adhz63 replikaation kanssa, Adwt A549-soluissa, sopusoinnussa CPE tuloksia, 80% suhteellinen replikaation Adhz63 havaittiin. Siten Adhz63 replikointi on tukahdutettu WI-38-solut kuin A549-soluja. Tuloksena on yhdenmukainen aiempien havainto, että sykliini EL induktio syöpäsoluissa liittyy selektiivinen replikaatio

E1b55K

-deleted mainokset syöpäsoluissa [34].

Wi-38 tai A549 solut infektoitiin AdGFP, Adwt tai Adhz63 MOI 5 (A) solut kerättiin 48 tuntia, ja sitten analysoitiin Western blot. Solulysaatit immunoblotattiin sykliini E ja aktiini. Aktiini käytettiin latauskontrollina. (B) CPE oli valokuvattu klo 72 tuntia infektion jälkeen (p.i.). Kaikki mikroskopia oli alun perin suurennettuna x100. (C) Viral-tiitterit määritettiin 72 h p.i. jossa infektio yksikkö menetelmällä. Arvo ilmoittaa keskiarvo kolmen erillisen kokeen, näkyy keskimääräinen muutosprosentti suhteessa Adwt kontrolliryhmään ± S.D. * P 0,05 verrattuna Adwt ryhmän Opiskelijan

t

-testissä.

sykliini E voi edistää S-vaiheeseen merkintä ja osallistuvat DNA-replikaatioon kautta CDK2-riippuvainen [53] ja CDK2-riippumattomia reittejä [59]. Tutkia, sykliini E toiminto Ad replikointi on CDK2 riippuvainen tai riippumaton, ensin pyrkimyksistä fyysinen kontakti CDK2 ja sykliini EL soluissa vaikuttaa mainokset. Keuhkosyöpä A549 soluja mock-tartunnan tai tartunnan AdGFP, Adwt tai Adhz63. Ymmärtää, miten

E1 b

-deleted mainokset replikoitua selektiivisesti syöpäsoluja, keskityimme A549 keuhkosyöpäsoluissa jossa sekä Adwt ja

E1 b

-deleted Adhz63 voi tehokkaasti aiheuttaa sykliini EL ja jäljitellä. 48 h infektion jälkeen (p.i.), solut kerättiin ja lyysattiin. Ensin käytettiin anti-sykliini E vasta-immunopresipitoivan sykliini E-proteiinia ja analysoi immunokompleksien kanssa Western blot. Tiedot osoittavat, että sykliini-E-proteiinia saostettiin solujen valehoidettujen tai käsitelty replikaation AdGFP (negatiiviset kontrollit), eivät osoittaneet merkittävää yhteyttä CDK2-proteiinia (Fig. 2A, kaistat 1 ja 2). Kuitenkin immunokompleksit päässä Adwt- ja Adhz63-tartunnan A549-solut sisälsivät sekä sykliini E ja sykliini EL ja kasvoi CDK2 sitoutumisen (Fig. 2A, kaistat 3 ja 4). Todentamaan tämän sykliini E /CDK2 liimaus, me myös käyttää anti-CDK2-vasta kaatamaan proteiinikompleksi ja tutkittiin sitten taso sykliini E proteiinien sykliini E-CDK2 monimutkainen. Immunosaostetut CDK2-proteiinia nostettiin Adwt ja Adhz63-infektoitujen solujen kanssa samanaikaisesti saostuksen sykliini EL (Fig. 2B, kaistat 3 ja 4), erityisesti Adwt-infektoituneissa soluissa (kaista 3). Tulokset osoittavat, että replikoitumiskykyisen Adwt ja Adhz63 aiheuttaa sykliini EL ilmaisun ja lisätä muodostumista sykliini EL /CDK2 kompleksin A549 syöpäsoluja, mikä osoittaa, että sykliini EL aiheutettiin Ad-tartunnan saaneiden solujen vahvasti assosioituu CDK2.

(A) A549 solulysaatit immunosaostettiin anti-sykliini E vasta-aineella (1:50 laimennos). Immunokompleksit analysoitiin Western blotilla sykliini E ja CDK2 vasta-aineita. (B) Solulysaatit immunosaostettiin anti-CDK2-vasta-aineen ja immunoblotattiin CDK2, sykliini E ja sykliini EL.

Adenovirus-indusoidun sykliini EL lisää CDK2 fosforylaation

CDK2 aktivoidaan jonka fosforylaatio on T160 päällä ja tämä fosforylaatio lisää sen elektroforeettisen liikkuvuuden, mikä nopeuttaa liikkuvasta bändejä [66]. Me tutkimme, sykliini EL induktio ja vuorovaikutuksen lisääminen sykliini EL ja CDK2 A549-soluja jälkeen Adwt ja Adhz63 infektio voi edistää CDK2 fosforylaation tietyllä T160 sivustoon. Analyysi solulysaateista kanssa Western blot osoitti, että sykliini EL induktio johti kasvua nopeammin liikkuvasta CDK2, sopusoinnussa fosforyloidun-CDK2-proteiinia (pCDK2) T160 (aktiivinen muoto CDK2), erityisesti 48 tuntia p.i. (Fig. 3A, kaistat 7 ja 8). Varmistimme nopeammin liikkuvasta muoto CDK2 kanssa fosfo-CDK2 (T160) vasta-aine (# 2561, Soluviestintä). Densitomet- analyysi näistä bändejä osoitti, että Adwt infektio aiheutti 1,3-2,7-kertainen (P = 0,03) tason pCDK2 T160 ja Adhz63 infektio aiheutti 1,5-1,9-kertainen (P = 0,0026) verrattuna mock-ohjaus ryhmä 48 h pi (Fig. 3B, kaistat 3 ja 4). Tuloksena kuvassa 3B on yhdenmukainen, että kuviossa 3A (kaistat 7 ja 8).

A549-solut olivat mock tai infektoitiin AdGFP, Adwt tai Adhz63 MOI 5. Solut kerättiin 24 h tai 48 h pi ja sitten analysoitiin Western blot. Solulysaatit immunoblotattiin varten (A) sykliini E ja CDK2; (B) pCDK2 T160; ja (C) sykliini D, CDK4 ja PCNA. Aktiini käytettiin latauskontrollina. Skannattu bändi intensiteetti kvantitoitiin ja arvot edustavat keinot suhteellisen muutosprosentit verrattuna mock ryhmä ± S.D. kolmesta itsenäisestä kolmena kappaleena kokeita. * P 0,05 verrattuna mock-kontrolliryhmään, Studentin t-testi.

Lisäksi sykliini E, sykliini D on mukana myös siirtymistä G

1-S-vaiheessa . Siten tutkimme myös tason sykliini D. Mielenkiintoista, taso sykliini D laski virusinfektion jälkeen. Densitometrinen analyysi bändejä osoitti, että Adwt ja Adhz63 tulehdus 24 tunnin laski sykliini D proteiinin tasot 11% (P = 0,0000025) ja 71% (P = 0,001) pilkata infektio, vastaavasti (Fig. 3C, kaistat 3 ja 4). Tasot sykliini D infektoiduissa soluissa Adwt tai Adhz63 olivat väheni edelleen 48 h 3% (P = 0,00000043) ja 8% (P = 0,00002), vastaavasti (Fig. 3C, kaistat 7 ja 8). Samaan aikaan taso CDK4 ja proliferoivan solun tuma-antigeeni (PCNA) ei merkittävästi muutu missään ryhmässä. CDK4 säätelee ja aktivoidaan sykliini D käsittelemään G

1-S siirtyminen [67], [68]; PCNA, tiedetään säätelevän DNA: n replikaatio ja DNA-korjaus, joka liittyy useita sykliini /CDK-kompleksien solusyklin etenemisen [69], [70]. Tulokset osoittavat, että mainokset laski sykliini D tuotanto ja ei vaikuttanut tasoa CDK4. Siten Ad infektio indusoi spesifisesti sykliini EL joka aktivoituu CDK2 kautta fosforylaation sen T160 sivustolla, mikä viittaa kriittinen rooli sykliini EL ja CDK2 Ad lisääntymään.

adenovirukset kasvu pRb fosforylaation

sykliini E- aktivoitu fosforyloitua CDK2 (pCDK2) on tunnettua ohjata G

1-S siirtymisen fosforylaatio alavirran substraattien. Ottaen huomioon, että pRb on yksi tunnettu tavoitteet pCDK2, tutkimme, onko lisäys aktivoitu pCDK2 muuttaa fosforylaation pRb on S612, joka on CDK2-edullista fosforylaation Jäännös [71], [72]. Olemme havainneet, että taso fosfo-pRb S612 nostettiin 314% (P = 0,016) ja 240% (P = 0,03) infektoiduissa soluissa Adwt ja Adhz63, vastaavasti, vaikka proteiinin taso fosforyloitumaton pRb on vähentynyt hieman ( Fig. 4A, kaistat 3 ja 4). Emme havainneet mitään merkittäviä muutoksia p-pRb T821, toinen CDK2-parempana fosforylaation jäännös [71], [73], ja CDK4-ensisijainen p-pRb S795 [74] (Fig. 4A). Tulokset viittaavat siihen valintaan S612 sivuston pRb Ad-aktivoitua CDK2 proteiinin fosforylaatiota.

A549-solut valeinfektoitiin tai tartunnan AdGFP, Adwt tai Adhz63 ja kerättiin 24 h tai 48 h pi , jonka jälkeen Western blot -analyysi. Solulysaatit immunoblotattiin varten (A) pRb, fosfo-pRb (p-pRb) on S612, T821 ja S795 tai (B) p21 ja p27. Aktiini käytettiin latauskontrollina. * P 0,05 verrattuna mock-kontrolliryhmään, Studentin t-testi.

adenovirukset tukahduttavat CDK-inhibiittorit

Havaitsimme myös, että proteiini tasot sekä p21 ja p27 vähenevät A549-soluissa tartunnan Adwt ja Adhz63 erityisesti p21 (kuvio 4B). p21 ja p27 ovat tunnettuja CDK-inhibiittorit, jotka negatiivisesti säätelevät sykliini E /CDK2: n komplekseja estää solusyklin etenemisen [75]. Densitomet- analyysi näistä bändejä osoittivat, että taso p21-proteiinin laski tasolle 8% (P = 0,0000002) ja 44% (P = 0,00066), että mock valvonnan A549 infektion jälkeen Adwt ja Adhz63 24 h, vastaavasti (Fig. 4B, kaistat 3 ja 4). P21-taso on edelleen tukahdutettu A549-soluja 48 h infektion jälkeen Adwt (2%, P = 0,00000034) ja Adhz63 (6%, P = 0,0000007) (Fig. 4B, kaistat 7 ja 8). Ad infektio laski myös p27-proteiinin tasoa 36% (Adwt, P = 0,0015) ja 49% (Adhz63, P = 0,00043) 24 h; 16% (Adwt, P = 0,00012) ja 37% (Adhz63, P = 0,0092) 48 tuntia A549-solut (Fig. 4B). Tulokset viittasivat siihen, että mainokset aktivoivat CDK2 indusoimalla sykliini EL ja tukahduttaa p21 ja p27.

keskeyttäminen sykliini EL ja CDK2 vuorovaikutus vähentää adenoviruksen replikaatiolle

tutkimiseksi edelleen roolin CDK2 viruksen replikaation käytimme CDK2 kemiallisen inhibiittorin roskovitiinilla (Ros, CYC202) keskeyttää sykliini EL ja CDK2 vuorovaikutusta. Ros on puriini- johdannainen, joka inhiboi CDK2 sitoutumalla sen aktiiviseen kohtaan [76]. Ros vähentää fosforylaation CDK2 [77] ja estää androstenedionin aiheuttama lisäys aktiivisen fosforyloidun CDK2 [78]. Jos aktivointi CDK2 vaaditaan virusreplikaation esto CDK2 aktiivisuus pitäisi vähentää sitä. Kuvio 5A, edustaa yhtä neljästä kokeiden toisto, osoittaa, että lisääntynyt Ros, CPE aiheuttama Adwt ja Adhz63 infektio oli osittain inhiboitu. Kuvio 5B esittää, että hoito 5 uM Ros johti 50%: n vähennys Adwt tiitterin (P = 0,0002) ja 71%: n vähennys Adhz63 tiitterin (P = 0,034), verrattuna vehikkelillä kontrolliryhmä käsiteltiin dimetyylisulfoksidin (DMSO , määritellään 0 uM Ros). Hoito 10gM Ros lisänneet pienenivät virustiittereitä: 81% vähennys Adwt (P = 0.00001) ja 87% vähennys Adhz63 (P = 0,012). Tukahdutettu viruksen saannot ovat sopusoinnussa CPE ilmiö kuviossa 5A.

(A) Soluja käsiteltiin 0 uM (ajoneuvon-kontrolliryhmä käsiteltiin DMSO), 5 uM tai 10 uM roskovitiini, ja vale- tartunnan tai tartunnan AdGFP, Adwt tai Adhz63 MOI 5. Kaikki mikroskopia on alunperin suurennettuna x100 otettu 48 tunnin pi (B) Viral-tiitterit määritettiin 48 h p.i. jossa infektio yksikkö menetelmällä. Arvot edustavat keskiarvoja ± S.D. Riippumattomien neljänä kappaleena. * P 0,05 verrattuna 0 uM roskovitiinilla, Opiskelijan

t

-testissä.

tutki tasoja viruksen DNA ja proteiinit tuotetaan soluissa vaikutti Ros hoitoa. Viruksen DNA-synteesi määritettiin Southern blot koetettiin Ad genomin. Lineaarinen Adwt DNA on 36KB kanssa yhteensä 28

Pst

I restriktiokohtia. Suurin fragmentti on 4333 emäsparin ja pienin fragmentti on vain 12 bp. Koot edustajan DNA-fragmentit oli merkitty kuviossa 6. viruksen DNA-synteesin ja Adwt ja Adhz63 24 h infektoinnin jälkeen inhi- boi vahvasti, että läsnä oli 10 uM Ros (Fig. 6A, kaistat 6 ja 12). Johdonmukaisesti, viruksen kapsidiproteiineja n vaikutuksesta inhiboitui merkittävästi, kun läsnä oli 10 uM Ros (Fig. 6B, kaistat 4 ja 6). CDK2: n toiminnan kanssa Ros vähensi fosforylaatiota pRb klo S612 sivuston AdGFP, Adwt ja Adhz63 käsiteltyjä soluja (Fig. 6C). Mielenkiintoista on, Ros hoitoa merkittävästi tukahdutettu induktion sykliini EL-proteiinin aiheuttaman Adwt ja Adhz63 infektio (Fig. 6C, kaistat 4 ja 6). Yhteenvetona, nämä tiedot osoittavat, että CDK2: n kanssa, Ros tukahdutettu pRb-fosforylaation, ja se esti viruksen replikaatiota.

(A) A549-solut kerättiin 0 h ja 24 h infektoinnin jälkeen Viruksen DNA-synteesi määritettiin Southern blot. 24 h infektoinnin jälkeen, solut kerättiin ja solulysaatit immunoblotattiin ja (B) adenovirus tyyppi 5: n kapsidiproteiinit, (C) sykliini EL, p-pRb S612, ja aktiini. Aktiini käytettiin latauskontrollina. * P 0,05 verrattuna 0 uM roskovitiinilla hoidetussa ryhmässä, Studentin t-testi.

siRNA estämällä CDK2 tukahduttaa adenoviruksen replikaatiota estämällä pRb fosforylaatio

Koska kemiallisen inhibiittorin Ros saa vaikuttavat myös muut CDK ja kinaasien [79], myös soveltaa RNA-interferenssi nimenomaan hiljentää CDK2 ilme.