Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Immunosuppressiivinen tekijät, kuten säätelijä-T-solujen (Tregs) raja tehoa immunoterapian. Histonideasetylaasi- (HDAC) estäjien on raportoitu olevan kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta eri maligniteettien ja immunomodulaarisia vaikutuksia. Tässä me raportoivat Tregs kohdistamisen ja immuuni edistävää vaikutusta luokan I erityinen HDAC estäjä, entinostat, yhdessä joko IL-2 in hiiren munuaissyövän (RENCA) mallia tai surviviiniperäisen perustuva rokote terapia (SurVaxM) on kastraatio kestävä eturauhassyövän (CR Myc-cap) malli.

menetelmät ja tulokset

RENCA tai CR Myc-cap kasvaimet istutettiin ortotooppisesti tai ihon alle, vastaavasti. Ympätty hiiret satunnaistettiin neljään hoitoryhmään: ajoneuvo, entinostat, sytokiini tai rokote, ja yhdistelmä. Tregs veressä arvioitiin FACS-analyysillä. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR ja Western blot-analyysi eristetyn T solualapopulaatioiden perna suoritettiin määrittämään Foxp3 geenin ja proteiinin ilmentymiseen. Ehkäisevän toiminnan Tregs testattiin T-soluproliferaatiomääritys. Pieni annos (5 mg /kg) entinostat vähentää Foxp3 tasoa Tregs ja tämä liittyi parannettu kasvaimen kasvun inhibition yhdessä joko IL-2: a tai SurVaxM rokotetta. Entinostat alassäädetty Foxp3 ilmaisun transkriptionaalisesti ja tukossa Tregs tukahduttava toiminto vaikuttamatta T efektorisolujen (Teffs).

In vitro

pieniannoksisen entinostat (0,5 uM) aiheuttama STST3 asetylaatio ja erityinen estäjä STAT3 osittain pelastettiin entinostat aiheuttama alas-säätely Foxp3, mikä viittaa siihen, että STST3 signalointi on osallisena Foxp3 alassäätöä by entinostat.

Johtopäätökset

Nämä tulokset osoittavat uutta immunomodulatorinen vaikutus luokan I HDAC esto ja tarjota perustelut kliiniseen testaukseen entinostat parantaa syövän immunoterapiassa.

Citation: Shen L, Ciesielski M, Ramakrishnan S, Miles KM, Ellis L, Sotomayor P, et ai. (2012) I luokka histonideasetylaasi Inhibitor Entinostat vaimentaa Regulatory T Cells ja lisää immunoterapioiden munuaisten ja Eturauhassyöpä mallit. PLoS ONE 7 (1): e30815. doi: 10,1371 /journal.pone.0030815

Editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia

vastaanotettu: 10 elokuu 2011; Hyväksytty: 21 joulukuu 2011; Julkaistu: 27 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Shen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain tutkimus avustusta National Cancer Institute-23 R21CA137649. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvaimen kasvu merkitsee tulos syöpäsolujen pakenevat isännän immuunivalvonnalle. Huolimatta joistakin onnistumisia, immunoterapeuttiset interventiot ovat osoittaneet vähän hyötyä. Suurin este edustaa läsnäolo immunosuppressiivisia tekijöitä, jotka näyttävät olevan vallitseva syöpäpotilailla. Nämä immunosuppressiiviset komponentit sisältävät Tregs [1], [2], myeloidinen johdettu vaimennin soluja (MDSCs), immunologinen tarkistuspisteitä välittämä solun pinnan molekyylejä, kuten CTLA-4 [3] ja PD-1 [4], ja verenkierrossa sytokiinien, kuten TGF -β ja IL-10 [5]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että nämä toleranssi mekanismeja voidaan indusoida kasvaimen ja ympäröivän strooman solut. Tregs normaalisti säilyttää toleranssi omia antigeenejä ja estää autoimmuunivasteiden [6], [7]. Toisaalta, Tregs on tunnistettu yhdeksi suurimmista toimijoista kasvain siedätyshoitoa. Aineistoon sisältyy Tregs edistäminen syöpäpotilailla ja Tregs laajentumassa immunoterapia [2], [8] – [11]. Lisäksi kliiniset raportit viittaavat siihen, että ehtyminen Tregs voi parantaa kasvainta torjuvaa immuunivasteen syöpäpotilailla.

Korkean annoksen IL-2 on FDA: n hyväksymä hoito valittujen metastasoituneen kirkas cell munuaissyövän [12], [ ,,,0],13]. IL-2-hoidon indusoi tavoite vasteita noin 20%: lla potilaista, jossa kestävä täydellinen vaste pieneen murto. Koska harvoilla teho suuren annoksen IL-2-terapiaan, lisäponnisteluja on suunnattu tehokkuuden lisäämiseksi tämän immuuniterapeuttista lähestymistapaa.

Vaccine hoitokeinoja määrä on rajallinen hyöty kiinteitä kasvaimia, vaikka rokote terapia Sipuleucel-T oli hiljattain hyväksytty hoitoon kastraation resistenttien eturauhassyöpää. Tregs ovat hallitsevia erilaisten syöpien, kuten edenneen eturauhassyövän [2]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että kun läsnä on immunosuppressiivisten tekijöiden, kuten Tregs on tärkeä rooli immuunitoleranssin ja vähän tehoa rokotteen hoidossa [14], [15]. Siten yhdistelmä rokotteiden lähestymistapa (es) heikentävistä tai tukahduttaa Tregs edustaa järkevä strategia eturauhassyövän hoidossa.

HDAC on osoitettu olevan osallisena syövän syntyyn välittämällä transkriptionaalinen säätely osallistuvien geenien solusyklin etenemisen, lisääntymistä, ja apoptoosin [16], [17]. HDAC-inhibiittorit kehitetään parhaillaan syövän hoidossa ja ovat osoittaneet antituumorivaikutus eri kasvaimissa. HDAC: t ovat ominaista neljään eri luokkaan eri tavoitteet ja subsellulaariset sijainnit. Lisäksi histonien, useita ei-histoni-proteiinien myös käänteisesti asetyloitu lysiinitähteet ja nämä translaation jälkeiset modifikaatiot voi myös olla tärkeä rooli antituumorivaikutukset HDAC-inhibiittorit [18] – [20]. Synteettiset bentsamidi, entinostat, on selektiivinen luokan I HDAC: t. Entinostat on antituumorivaikutus sekä

in vitro

ja

in vivo

useita kasvainmuodoista [21] – [24]. Lisäksi ryhmämme on aiemmin raportoitu synergistinen antituumoriaktiivisuuden entinostat yhdistettynä suurella annoksella IL-2: n RENCA malli [25].

Viimeaikaiset kokeelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että HDAC-inhibiittorit ovat potentiaalisia immunosäätelyaktiivisuutta molemmissa i

n vitro

ja

in vivo

malleja tulehduksen, autoimmuniteetin ja elinsiirrot. HDAC-inhibiittorit voivat vaikuttaa immuunivasteita säätelemällä sytokiinien. Hiirimallissa allogeenisen luuydinsiirron, HDAC-inhibiittori, vorinostat (SAHA), vähentää akuuttia Käänteishyljintä jonka poistaminen pro-tulehdus sytokiinien, kuten TNF-α, IL-1, ja INF-γ [26 ]. HDAC-inhibiittori, LAQ824, on osoitettu muuttavan aktivoitumista ja toimintaa, makrofagien ja dendriittisolujen. LAQ824 on myös havaittu moduloivan dendriittisolujen toiminto estää Th1, mutta ei Th2-efektoritoiminnon [27]. Lisäksi, HDAC-inhibiittorit voi säädellä transkriptiota major histocompatibility luokan I ja II [28], tai aktivointi kostimuloivien molekyylien [28], [29]. Viime aikoina on raportoitu, että yleiseurooppalainen HDAC estäjä, tricostatin A (TSA) voi lisätä toimintaa Tregs ja parantaa niiden immunosuppressiiviseen vaikutukseen

in vivo

[30]. Lisäksi positiiviset tulokset kliinisissä tutkimuksissa ihon T-solu lymfoomat (CTCL) viittaavat siihen, että HDAC-estäjät voivat vaikuttaa immuunivasteeseen, koska osa patologisia mekanismeja CTCL välittyvät tulehduksen ja epätasapaino immuunijärjestelmää. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että antituumorivaikutuksen HDAC-inhibiittorit voivat olla osittain johtuu niiden immunomodulatorisia ominaisuuksia.

Tässä tutkimuksessa olemme erilaisia ​​tuloksia järjestelmässämme ja ilmoittaa, että hoito entinostat pienenee Foxp3 ilmaisun Tregs ja estää ehkäisevän toiminnan Tregs. Lisäksi STAT3 signalointi osoitettiin liittyvän Foxp3 alas-sääntelyä entinostat. Tämä ominaisuus entinostat voi parantaa antituumorivaikutuksen immuunivasteen IL-2 ja rokotteen hoito ja tarjoaa perustelut käyttämällä entinostat yhdistettynä strategioiden immunoterapioiden.

Tulokset

Entinostat parantamalla suuren annoksen IL-2 hoito liittyy modulointiin Tregs kasvaimia omaavilla hiirillä

Ryhmämme aiemmin raportoitu, että luokan I HDAC estäjä, entinostat, on kasvainta torjuvaa vaikutusta RENCA malli [25], [31]. Entinostat näyttää olevan im- vaikutus, joka johtaa synergistiseen antituumorivaikutus yhdessä IL-2. IL-2-hoito edistää proliferaatiota ja aktivaatiota T-efektorisolujen (Teffs), mutta indusoi myös immunosuppressiivisia Tregs stabiilia ekspressiota IL-2-reseptorin CD25. Siksi nykyisessä tutkimuksessa olemme keskittyneet vaikutusta entinostat on Tregs. Testasimme vaikutus entinostat ainoana lääkkeenä ja yhdessä IL-2 Tregs että RENCA mallissa. RENCA-solua ympättiin ortotooppisesti BALB /c-hiirissä. Kolme päivää inokulaation jälkeen eläimet saivat hoitoa joko vehikkeliä, IL-2, entinostat (5 mg /kg), tai näiden yhdistelmä. 5 päivän kuluttua hoidon, perifeeristä verta kerättiin kustakin hiirestä, värjättiin solun pinnan markkereita ja solunsisäisiä Foxp3 proteiinia, ja niille suoritettiin fluoresenssi liittyy solujen lajittelu (FACS). Merkittäviä eroja ei havaittu määrä CD4

+ Foxp3

+ Tregs (Fig. 1A ja B). Kuitenkin Foxp3 proteiinin tasot CD4

+ Foxp3

+ soluja, kuten edustettuina fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti (MFI), pieneni entinostat hoitoon (Fig. 1A ja B). Kasvu Foxp3 tasojen havaittiin IL-2 hoito yksinään, mikä vahvisti käsitystä, että IL-2 edistää Tregs samalla tuetaan T-solujen proliferaatiota. Hoidossa yhdistelmähoito, entinostat silti pelastettu Foxp3 tasot takaisin ohjaus tasolle (Fig. 1A ja B). Western blot-analyysit osoittivat, että

in vivo

entinostat käsittely lisäsi Asetylaationopeus H3 histoni vuonna pernasolua (Fig. 1 F). Antituumorivaikutukset hoitojen arvioitiin arvioimalla kasvaimen painot kahden viikon kuluttua. Mitään merkittäviä kehon painon muutoksia havaittiin hoitoja. IL-2 indusoi lievää laskua kasvaimen paino ( 10%). Entinostat ainoana lääkkeenä hallinnon 5 mg /kg johti merkittävästi kasvaimen laihdutus verrattuna hallita ryhmään (-40%: n vähennys, Fig. 1 C). Yhdistelmä entinostat IL-2 oli paljon suurempi estovaikutus kasvaimen kasvuun (-80%: n vähennys, Fig. 1 C). Sen määrittämiseksi, onko vähentäminen Foxp3 ilmentymisen ja kasvaimen kasvun inhibitiota indusoima entinostat liittyi lisääntynyt immuunivasteen, tutkimme IFN-γ induktio. IFN-γ on hieman indusoitiin CD8-solujen IL-2-käsiteltyjen eläinten, kun taas CD8-solujen yhdistelmällä käsiteltyjen eläinten oli paljon suurempi IFN-γ induktio (Fig. 1 D). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että entinostat parantaa CD8 solujen indusoiman immuunivasteen IL-2 ja vähentää Foxp3 tasolla Tregs.

Hiiret ortotooppisten ymppäyksen RENCA-soluja käsiteltiin 5 päivää. Verta otettiin hiiriä viidentenä päivänä ja värjättiin spesifisten vasta-aineiden CD4, CD25, ja Foxp3. Kasvaimen painot mitattiin lopussa kahden viikon hoidon jälkeen. A ja B, vaikutus entinostat on Tregs tuumoreita hiirissä. A vaikutukset ajoneuvon IL-2, entinostat tai yhdistelmä hoidon Tregs Foxp3 ilme. Solut värjättiin ja alistettiin virtaussytometria-analyysi. Piste tontteja aidatulla CD4

+ soluja. Suorakulmainen alue sulkee CD4

+ Foxp3

+ soluja, numerot päällä edustavat prosenttiosuutta Foxp3

+ soluja. Numerot pohjassa alueella edustaa fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti (MFI) FOXP3 PE värjäytymisen CD4

+ Foxp3

+ soluja. B, kvantifiointi Tregs prosenttiosuus CD4 väestöstä (vasen paneeli) ja Foxp3 tasot (MFI) in Tregs (oikea paneeli) FACS-analyysi. Arvot ovat keskiarvoja ja virhepalkit edustavat S.D. 5-7 näytettä per ryhmä. Oikeassa paneelissa,

p

= 0,0011 IL-2 vs. ajoneuvon

p

= 0.000009 varten entinostat vs. ajoneuvoon. Tulokset edustavat kolmea erillistä koetta. C, kasvaimen punnituksia. Pylväät, keskimääräinen grammaa kasvain; Bars, S.D. n = 5-7.

p

= 0,0209 varten entinostat vs. ajoneuvon

p

= 0,0077 yhdistelmä- vs. ajoneuvon

p

= 0,0272 kumulointihakemus vs. entinostat. Tulokset edustavat kolmea erillistä koetta. D, Entinostat parantaa IFN-γ tyypin indusoiman immuunivasteen IL-2 hoitoa. Pernasoluja (1 x 10

6 solua) kerättiin ja stimuloitiin PMA: lla (20 ng /ml) ja ionomysiini (1 ug /ml) 5 tunnin ajan, kun läsnä on Brefeldin A. Sitten solut värjättiin pintamarkkereiden ja solunsisäinen IFN-γ. Histogrammit osoittavat prosentteina IFN-γ ilmentävien solujen CD8 väestöstä.

p

= 0,01 yhdistelmä vs. IL-2. E, Entinostat vähensi kasvainten soluttautumisen Tregs. Kasvaimen leikkeet värjättiin anti-Foxp3-vasta-aine näyttää tunkeutumisen Tregs. Histogrammissa keskimääräinen lukumäärä värjättyä Tregs satunnaisessa 20 × resoluutio kirkas kentät (Tregs numero kunkin kentän saatiin sokaissut count). F, Entinostat indusoi H3 histoni asetylaatio in pernasolua. BALB /c-hiiriä käsiteltiin vehikkelillä (0,5% methocel) tai 5 mg /kg /päivä entinostat letkulla on 5 päivää. Solut kerättiin pernat ja alistettiin Western blot analyysi asetyloitu H3 histoni.

tutki entinostat hoito vaikuttanut Tregs että ujutettiin kasvaimia. Immunohistokemia värjäys kasvaimen osat osoittivat, että entinostat vähensi Tregs tunkeutumista (Fig. 1 E ja kuvio. S1).

Testasimme myös anti-hiiri-CD25-vasta-aine, PC61, heikentävistä Tregs [32] ja RENCA malli. PC61 käsittely 500 ug /hiiri /vko riitti heikentävistä CD25

+ soluissa (kuvio. 2A), vähentynyt huomattavasti CD4

+ Foxp3

+ Tregs solumäärä (Fig. 2A), ja oli samanlainen antituumorivaikutus, kuten havaittiin entinostat (Fig. 2B). Lisäksi lisäämällä PC61 hoito ei ole ylimääräistä kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta yli entinostat hoitoon (Fig. 2B), mikä viittaa siihen, että entinostat ja PC61 voi olla tarpeeton mekanismi toimintaa.

A, Tontti osoittavat vaikutuksen ajoneuvon PC61, entinostat tai yhdistelmähoito on CD25 ja Foxp3 tasolla. Kvantifiointi Tregs prosenttiosuuden, Foxp3 ilmaisu FACS-analyysi on esitetty histogrammeja. Arvot ovat keskiarvoja ja virhepalkit edustavat S.D. 6-7 näytettä per ryhmä. B, kasvaimen painon mittauksia PC61 ehtyminen kokeilu. Pylväät, keskimääräinen grammaa kasvain; Bars, S.D .. n = 6-7. * Edustaa

p

0,05 merkittyjä piste vs. ajoneuvo; ** Edustaa

p

0,01 merkittyjä piste vs. ajoneuvo.

Entinostat synergoi Peptidirokotetta hoito on kastraatio kestävä eturauhassyöpämallin

Lisäksi joka sytokiinihoidolle testasimme myös entinostat yhdistelmänä toisen immunotherapeutic lähestymistapa, peptidi rokote hoito, joka kastraatio kestävä eturauhassyövän (CR Myc-cap) malli. Käytimme uutta modifioitua surviviinipeptidiä rokotteen SVN53-67 /M57-KLH (SurVaxM) [33]. Surviviini on solunsisäinen kasvaimeen liittyvä antigeeni ilmaistaan ​​kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien eturauhassyöpä. Taso surviviinin ilmentyminen liittyy kasvaimen etenemiseen ja aggressiivisuus [34], ja se on sopiva kohde rokotteen terapiassa. Transplantable kastraatio kestävä eturauhassyövän (CR Myc-cap) on kehitetty meidän lab [35]. Myc-CaP-soluja, jotka ovat peräisin Hi-Myc siirtogeenisen eturauhassyövän hiirimallissa [36], injektoitiin (1 x 10

6 solua /hiiri) ihonalaisesti urospuolisten FVB hiirillä. Kasvaimen omaavilla eläimillä kirurgisesti kastroitu kasvainten perustaminen ja siitä kasvaimia siirrostettiin kautta 5 ylimääräistä kierrosta kirurgisesti kastroitu FVB hiirillä. Surviviinispesifisiä ilmentyminen vahvistettiin Myc-Cap kasvaimet immunohistokemiallisesti. CR Myc-CaP kasvaimen kantavia hiiriä satunnaistettiin neljään ryhmään ja käsiteltiin vehikkelillä, entinostat (5 päivää /viikko, 5 mg /kg), SurVaxM (1 annos /wk) tai yhdistelmänä. Seuraavat kolme viikon hoidon, entinostat tai SurVaxM yhden hoidon näytetään vähäinen antituumorivaikutus (10-25% vähennys) (Fig. 3A ja B). Kuitenkin yhdistelmä entinostat ja SurVaxM vähentänyt dramaattisesti kasvaimen paino (-80%: n vähennys,

p

= 0,002) verrattuna joko ajoneuvoon tai yksittäisen hoitoryhmissä (Fig. 3A ja B). Perifeerisen veren solujen värjäys osoitti, että käsittely entinostat yksin ja yhdessä SurVaxM alennettu Foxp3 tasolla Tregs kasvaimen kantavien hiirten (Fig. 3C), mutta sillä ei ollut vaikutusta Tregs määrä (tuloksia ei ole esitetty).

A ja B, Entinostat parantaa antituumorivaikutusta Surviviiniproteiinin rokotteen, SurVaxM. FVB hiiret kastroitu ja ihon alle on ympätty pieni kastraatio kestävä kasvain kappaletta. Noin 7 päivää inokulaation jälkeen, kun kasvaimet olivat saavuttaneet koko on keskimäärin 50 mm

2, hiiriä käsiteltiin kolme viikkoa ajoneuvon, entinostat (5 mg /kg, 1 annos /päivä, 5 päivää /viikko), surviviini rokote SurVaxM (100 ug /annos, 1 annos /vk), tai yhdistelmä. A Single kasvaimen kasvu kuvaajan linjat kertyi sarja mittaharppimittauksilla. B, Kasvaimet kerättiin talteen hoidon päättyessä ja punnitaan (yhdistelmä vs. surviviinista rokote,

p

= 0,003). C, Entinostat vähensi Foxp3 tasoilla Tregs CR Myc-CaP tuumoreita kantavaa hiirtä. 5 päivän kuluttua hoidon, perifeerisen veren solut kerättiin hiiristä, värjättiin CD4 ja Foxp3, ja altistettiin FACS-analyysiä. Kvantitointi Foxp3 tarkoittaa fluoresenssivoimakkuus (Foxp3 MFI) (ajoneuvon vs. entinostat,

p

= 0,0002; yhdistelmä vs. surviviinista,

p

= 0,0004).

surviviini rokote hoito indusoi antigeenispesifisten CD8-solut ja entinostat synergistisesti rokotteena IFN-γ immuunivasteen

jotta voitaisiin arvioida läsnä surviviinin antigeenispesifisten T-soluja, jotka voidaan generoida vasteena rokotuksen, teimme surviviiniperäisen rokote peptidi-MHC-luokan I tetrameerin sitoutumismääritys. Tetrameeri on spesifinen surviviinipeptidiä epitooppi [33]. Pernasoluja eristettiin hiiristä, jotka saivat erilaisia ​​hoitoja, kuten tehdään hoitokoe ja altistettiin surviviiniperäisille erityisiä tetrameerin ja pintamarkkerin värjäys. Vain pernasoluja hiiristä, jotka oli käsitelty surviviiniin rokote (rokotteen yhden ja yhdistelmähoito) osoitti induktion antigeenispesifisten CD8-solut (Fig. 4A). Mielenkiintoista, solunsisäinen sytokiinien värjäyksellä ehdottaa huomattavia CD8

+ IFN-γ

+ solujen yli ajoneuvo taso yhdistelmässä ryhmää, joka vastaa sen parannettu antituumorivaikutus (Fig. 4B).

. Tetrameeri Splenosyyttien saatu immunisoiduista hiiristä SurVaxM. Pernasolut värjättiin anti-CD8-vasta-aineiden ja surviviini-erityisiä tetrameerien virtaussytometrianalyysiä. Tulokset perustuvat ruiskutus CD8 + T-solujen ja osoittavat prosenttia kaksinkertainen leimattujen solujen (CD8 + /tetrameeriä +) suhteessa tiettyihin tetrameerin. B, Yhdistelmähoito johti CD8

+ IFN-γ

+ solujen induktio. Hiiret käsiteltiin kuten on ilmoitettu. Pernasoluja stimuloitiin ja solunsisäisen IFN-γ värjäys suoritettiin kuten on kuvattu kuviossa 1D.

p

0,01 yhdistelmä vs. ajoneuvon.

Entinostat tukahduttaa Foxp3 geeniekspressiota Treg soluissa ja estää Tregs toiminto

tutkimiseksi edelleen immuuni edistävä vaikutus ja entinostat, käsittelimme naiivi BALB /c-hiirten joko vehikkelillä tai entinostat (5 mg /kg tai 20 mg /kg) 5 päivää. Pernasoluja ja imusolmukkeiden solut kerättiin. Määrä Tregs ja Foxp3 ilmentyminen käsiksi FACS-analyysi.

In vivo

hoidon entinostat ei ollut merkittävää vaikutusta määrään Tregs (CD4

+ Foxp3

+ T-solut) CD4

+ T-solujen populaation joko imusolmukkeisiin tai perna. Kuitenkin verrattuna vehikkelillä käsitellyillä hiirillä, Tregs päässä käsitellyistä hiiristä oli annoksesta riippuvainen lasku Foxp3 tasoilla (Fig. 5A). Vaikutus entinostat on Foxp3: n ilmentyminen testattiin myös mittaamalla Foxp3-mRNA-tasoja eristetyssä solupopulaatioissa kvantitatiivisen reaaliaikaisen RT-PCR: llä. Tregs (CD4

+ CD25

+) ja ei-Tregs (CD4

+ CD25

-) CD4-T-solut puhdistettiin entinostat- ja ajoneuvo- käsiteltyihin hiiriin käyttäen magneettisia helmiä.

In vivo

entinostat hoitoon merkittävästi vähentynyt Foxp3 lähetti-RNA: Tregs, verrattuna Tregs ajoneuvon käsitellyistä hiiristä (kuvio. 5B). Alennetun Foxp3-proteiinin ilmentyminen käsitelty Tregs vahvistettiin myös Western blot -analyysillä (kuvio. 5C).

BALB /c-hiiriä käsiteltiin vehikkelillä (0,5% methocel) tai 5 mg /kg /päivä tai 20 mg /kg /päivä entinostat letkulla on 5 päivää. Solut kerättiin pernat ja imusolmukkeet. A,

In vivo

entinostat hoito vähensi ilmaus FOXP3 CD4

+ Foxp3

+ (Treg) soluja. Solut värjättiin fluoresenssi-konjugoidulla vasta-aineita spesifisiä CD4, CD25, ja Foxp3 ja alistettiin virtaussytometria-analyysi. Piste tontteja aidatulla CD4

+ soluja. Suorakulmainen alue sulkee CD4

+ Foxp3

+ soluja, numerot päällä edustavat prosenttiosuutta Foxp3

+ soluja. Numerot pohjassa alueella edustaa fluoresenssin voimakkuuden keskiarvolla Foxp3 PE värjäytymisen CD4

+ Foxp3

+ soluja. Paneelit oikealla edustavat kvantifiointiin Tregs prosenttiosuus (ylhäällä) ja Foxp3 lauseke (alhaalla) FACS-analyysi. Kuvaaja osoittaa keinot, virhepylväät edustavat keskihajonnat 6 näytettä kussakin ryhmässä.

p

= 0,00078 5 mg /kg entinostat vs. ajoneuvo;

p

= 0.000004 20 mg /kg entinostat vs. ajoneuvo;

p

= 0,0038 20 mg /kg entinostat vs. 5 mg /kg entinostat. α = 0,05. Tulokset edustavat kolmea erillistä koetta. B,

In vivo

entinostat vähensi Foxp3 mRNA-tasoja eristetyssä Tregs. Yhteensä RNA: t uutetaan eristetty CD4

+ CD25

+ T-solut (Tregs) ja CD4

+ CD25

– T-soluja (Teffs) ja analysoitiin Foxp3 mRNA reaaliaikaisella RT-PCR. Foxp3 mRNA-tasot normalisoituivat GAPDH mRNA (tai ribosomaalinen RNA RPL13A) ja arvot edustavat välineet kolme näytettä (kolme hiirtä per näyte) ryhmää kohti ja ei sitäkään.

p

= 0,0157 varten Tregs hoidettiin entinostat vs. Tregs vehikkeliä. Tulokset edustavat kolmea erillistä koetta. C,

In vivo

entinostat vähensi Foxp3 proteiinin tason Tregs. Solun kokonaisproteiinista uutettiin eristetty Tregs ja Teffs ja analysoitiin Foxp3-proteiinin Western blot. D, vaikutukset HDAC estäjä, entinostat puolesta Tregs ehkäisevästä toiminto ja Teffs lisääntymistä. Tregs tukahduttaminen määritykset: 2 x 10

5 CFSE-leimattua Teffs stimuloitiin 0,5 ug /ml anti-CD3ε-vasta-aineen ja 4 x 10

5 säteilytetty antigeeniä esittelevien solujen (CD4-solut oli poistettu pernasolujen) ja viljeltiin yh- kanssa Tregs erilaisissa suhteissa ja Teffs varten 62-80 tuntia. Prosenttiosuudet jaettu Teffs laskettiin lainkaan suhde pisteitä jokaisesta hoitoon. Prosenttiosuus tukahduttaminen Teffs jakava laskettiin kunkin kohdan vertaamalla solun jakamalla jokaisessa suhteessa soluun jaolla puuttuessa Tregs (00:01). Vasen paneeli: vaikutus entinostat hoidon Tregs toiminto. Oikea paneeli: vaikutus entinostat hoidon leviämisen Teffs. Histogrammissa prosentteina jaettuna Teffs ilman Tregs. Tiedot edustavat kolmea erillistä koetta. Arvot ovat keskiarvoja kolminkertaisista mittauksista. * Edustaa

p

0,05 merkittyjä piste vs. ajoneuvo; ** Edustaa

p

0,01 merkittyjä piste vs. ajoneuvo.

Voit selvittää laski Foxp3 ilmaisun entinostat käsitelty Tregs johtaa heikentyneeseen tukahduttava toiminta Tregs, CFSE-leimattua puhdistettu CD4

+ CD25

– T-soluja (Teffs) viljeltiin anti-CD3e vasta-aineen ja antigeenin esittelevien solujen. Tregs lisättiin sitten viljelmän eri Treg vs. Teff suhteet (Fig. 5D). BALB /c-hiiriä käsiteltiin vehikkelillä tai eri annoksilla entinostat

in vivo

kuten on osoitettu. Tregs eristettiin pernasoluja differentiaalisesti käsitellyistä hiiristä ja viljeltiin eristetty Teffs ajoneuvojen-käsitellyistä hiiristä testata käsittelyn vaikutus Tregs suppressiivinen toiminta (Fig. 5D, vasen paneeli). Lisäksi Teffs eristettiin pernasoluja differentiaalisesti käsitellyistä hiiristä stimuloitiin testaamaan vaikutuksia eri hoitoja leviämisen kapasiteetti Teffs (Fig. 5D, oikea paneeli). Entinostat (5 mg /kg) käsiteltyjen Tregs oli kaksi tai kolme kertaa (esimerkiksi lämpötilassa Tregs:Teff = 01:04, 25% vs. 63% vaimennus) vähemmän tehokkaita tukahduttamaan Teffs proliferaation kuin vehikkelillä käsiteltyjen Tregs (Fig. 5D , vasen paneeli). Korkeampi entinostat annos (20 mg /kg) lisäksi esti Treg tukahduttava funktion jopa seitsemän kertaiseksi (Tregs:Teffs = 01:02) vähentäminen (Fig. 5D, vasen paneeli). Mielenkiintoista on, että

in vivo

pienen annoksen entinostat hoitoa (5 mg /kg) oli minimaaliset proliferaation inhibitiota kapasiteetin Teffs, kun taas suurempi annos (20 mg /kg) inhiboi merkittävästi proliferaatiota kapasiteetti Teffs, verrattuna ajoneuvon -käsitellyssä Teffs (Fig. 5D, oikea paneeli). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että

in vivo

hoidon alhainen, ei sytotoksinen annos entinostat [25] estää Tregs tukahduttava toiminto minimaalinen vaikutus Teffs lisääntyvien kapasiteettia.

STST3 on asetyloitu entinostat hoito ja liittyy Foxp3 alassäätöä

seuraava tarkasteltiin mahdollisia signalointi välittäjäaineiden vastuussa Foxp3 alassäätöä aiheuttama entinostat. STAT3 signalointi aktivoidaan asetylaatio ja on liitetty Foxp3 modulaatio [37], [38]. Testata onko STAT3 on yksi tavoitteista entinostat, HepG2-soluja, hepatoomasolulinja indusoitavissa STAT3 signalointia käytetään STAT3 signaloinnin tutkimuksia [38], käsiteltiin 6 tunnin ajan. Hoito 0,5pM entinostat riitti aiheuttamaan asetylaatio STAT3 (Fig. 6A) muuttamatta merkittävästi yhteensä STAT3 proteiinin tasot (Fig. 6A). Lisäksi testasimme STST3 asetylointi in pernasolua. Jälleen entinostat hoito lisäsi asetylaatio STAT3 pernasoluissa (Fig. 6B). Edelleen testata onko STST3 on välittävä alas-säätely Foxp3 mukaan entinostat käytimme erittäin spesifinen, solun läpäisevä peptidi STST3 estäjä [39]. Entinostat pienensi Foxp3 tasoa Tregs, kun taas läsnäolo STAT3 spesifisen inhibiittorin osittain, mutta huomattavasti neutraloitiin estävää vaikutusta entinostat on Foxp3 ilmentymisen Tregs (-50% neutralointi) sekä poissa ja läsnä ollessa IL-2 (Fig. 6C ja 6D, vastaavasti). Kaikissa olosuhteissa, ei ollut merkittävää eroa määrä Tregs. Tämä tulos viittaa siihen, että STST3 on osittain mukana entinostat alas-säätely Foxp3 ilmaisun Tregs.

A ja B, Entinostat hoito indusoi STST3 asetylaatio. HepG2-soluja tai pernasoluja käsiteltiin 6 tunnin ajan, kerättiin ja lyysattiin ja Western immunoblotting tai immunosaostus. A, Entinostat aiheuttama STST3 asetylointi HepG2-soluissa. Ylempi paneeli: Solulysaatit analysoitiin suoraan ja blotattiin anti-STAT3 ja aktiini. Pohjalevy, Solulysaatit immunosaostettiin anti-STAT3-vasta-aineen ja sitten blotattiin anti-STAT3-vasta-aineen ja anti-asetyloitu lysiini-vasta-ainetta. B, Entinostat aiheuttama STST3 asetylointi in pernasolua. IP ja Western blot suoritettiin kuten on kuvattu A. C ja D, Down-regulation Foxp3 on estyy STST3 signalointi. Pernasolut kerättiin BALB /c-hiiristä ja pantiin viljelyyn. Viljelmiä käsiteltiin vehikkelillä tai 0,5 mM erityisiä STAT3 peptidi-inhibiittorin yhden tunnin ajan, jonka jälkeen ajoneuvo tai 0,5 uM entinostat hoitoa 23 tuntia. Solut kerättiin ja analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä fluoresenssi-konjugoidulla vasta-aineita spesifisiä CD4 ja Foxp3. Korjattavissa Live /Dead väriaine käytettiin värjäämään soluja ja elävät solut porteilla. Soluviljely oli poissa (paneeli C) tai läsnä ollessa (paneeli D) IL-2. Jokaisessa kunnossa, histogrammit osoittavat määrällisesti Foxp3 ilmaisun Tregs FACS-analyysillä. Kuvaaja osoittaa keinot, virhepylväät edustavat standardipoikkeamaa. In C,

p

= 0,0002 entinostat vs. STST3 estäjä + entinostat. In D,

p

= 0,00015 varten entinostat vs. STST3 estäjä + entinostat. Tulokset edustavat kolmea erillistä koetta.

I luokkaan, mutta ei luokan II HDAC esto estää Foxp3 ilmaisun Tregs

in vitro

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että esto HDAC: t kasvaa Tregs numero, ja edistää Tregs funktio ja joka liittyy immuunivasteen suppressio [30], [40]. Siksi me tutkimme, estämällä eri luokkiin HDAC: t voi olla ero vaikutuksia Tregs. Testasimme muita HDAC-inhibiittorit mukaan lukien selektiiviset luokka I: n estäjä, MGCD0103, pannulla estäjä, panobinostat, ja kaksi selektiivinen luokan II-inhibiittorit, MC1568 ja MC1575 [41]. Pernasoluja eristettiin BALB /c-hiiristä viljeltiin erilaisia ​​hoitoja 24 tuntia. Annokset estäjien valittiin perustuu aiempiin tutkimuksiin [41], [42]. Solut kerättiin, värjättiin pintamarkkereiden ja Foxp3, ja altistettiin FACS-analyysiä. Sekä luokan I HDAC-inhibiittorit, entinostat ja MGCD0103, alassäädetty Foxp3 in Tregs (Fig. 7A). Sekä entinostat ja panobinostat vähentää Foxp3-proteiinin tasot Tregs väestön annoksesta riippuvalla tavalla. Valikoiva Luokan II HDAC-inhibiittorit ei ollut merkittävää vaikutusta Tregs (Fig. 7B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että esto luokan I, ei luokan II HDAC johtaa alas-säätely Foxp3.

Splenosyyttejä eristettiin BALB /c-hiiristä ja pantiin viljelyyn eri kohtelu osoittamien sairauksien 24 tuntia. Solut kerättiin, värjättiin pintamarkkereiden ja solunsisäisen Foxp3, ja altistettiin FACS-analyysiä. Plot gating ja parametri merkintä kuvattiin kuviossa 1. histogrammit osoittavat kvantifiointiin Foxp3 tasoa Tregs. A Molemmat luokan I HDAC-inhibiittorit, entinostat ja MGCD0103, estävät Foxp3 ilmaisun Tregs. Verrattaessa entinostat kanssa MGCD0103, PE-konjugoitu anti-Foxp3 vasta-ainetta. B, luokan I HDAC estäjä, entinostat, ja yleiseurooppalainen estäjä, panobinostat, mutta ei luokan II HDAC-inhibiittorit, MC1568 ja MC1575, estävät Foxp3 ilmaisun Tregs. Verrattaessa entinostat luokan II HDAC-inhibiittorit ja pan-inhibiittori, panobinostat, Alexa 700 konjugoitu anti-Foxp3 vasta-ainetta käytettiin, koska muiden fluorokromi kanavat häiritsee autofluoresenssi luokan II HDAC-inhibiittorit. ** Edustaa

p

0,01 merkittyjä hoitoon vs. ajoneuvo.

Keskustelu

Tutkimuksessamme me osoittaa, että luokan I HDAC estäjä, entinostat, estää Tregs ja parantaa antituumorivaikutusta kahden eri immunoterapian. Vuonna entinostat ja IL-2 yhdistelmä strategiaa, IL-2 hoitoa aktivoitu ja edistetään leviämistä Teffs, mutta myös aktivoitu Tregs (Fig. 1).