Krooninen sairaus

tiivistelmä

Muutokset miRNA ilmaus ovat yhteinen piirre paksusuolensyöpä. Nämä muutokset tapahtuvat siirryttäessä normaalista adenooman ja adenooma sinoomaan kuitenkaan ole määritelty. Lisäksi miRNA muutokset joukossa kasvain alaryhmiä paksusuolensyöpä myös ei ole tutkittu riittävästi. Tässä tutkimuksessa selvitimme maailmanlaajuinen miRNA ilmaisua 315 näytettä, jotka sisälsivät 52 normaalin paksusuolen limakalvo, 41 tubulovillous adenoomia, 158 adenokarsinoomat kanssa asiantunteva DNA mismatch korjaus (pMMR) valitaan vaiheessa ja alkamisiällä, ja 64 adenokarsinoomien vialliset DNA mismatch korjaus (dMMR) valitaan satunnaista (n = 53) ja perinnöllinen paksusuolen syöpä (n = 11). Yksittäisiä dMMR kasvaimia kaikilla oli

MLH1

inaktivoitumisen takia promoottori hypermetylaation. Ohjaamaton PCA ja klusterin analyysi osoitti, että normaali paksusuolikudos, adenoomia, pMMR karsinoomien ja dMMR karsinoomat olivat selvästi havaittavaa. Suurin osa miRNA jotka ilmentyvät differentiaalisesti normaalin ja polyyppien myös ekspressoituu differentiaalisesti kanssa samaa suuruusluokkaa vertailussa normaalin sekä pMMR ja dMMR kasvaimen ryhmiä, mikä viittaa siihen, vaiheittaista etenemisen muutosta normaalin paksusuolen syöpä. Niistä miRNA osoittaa suurimman taittaa ylös- tai alaspäin säädelty muutokset (≥4), neljä novel (miR-31, miR-1, miR-9 ja miR-99a) ja kaksi aiemmin raportoitu (miR-137 ja miR-135b ) miRNA havaittiin normaalissa /adenooma vertailua. Kaikki mutta yksi näistä (miR-99a) oli samanlainen ilme erot kaksi normaalia /karsinooma vertailuja, mikä viittaa siihen, että nämä kasvaimen varhaiseen muutokset ovat tärkeitä sekä pMMR- ja dMMR johdettuja syöpiä. Vertailtaessa pMMR ja dMMR kasvaimia tunnistettiin neljä miRNA (miR-31, miR-552, miR-592 ja miR-224) tilastollisesti merkitsevä ilme eroja (≥2-kertainen muutos).

Citation: Oberg AL , ranskalainen AJ, Sarver aL, Subramanian S, Morlan BW, Riska SM, et al. (2011) miRNA Expression Colon polyypit antaa näyttöä varten Multihit malli Colon Cancer. PLoS ONE 6 (6): e20465. doi: 10,1371 /journal.pone.0020465

Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu 4 maaliskuuta, 2011; Hyväksytty: 26 huhtikuu 2011; Julkaistu: 09 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Oberg et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Minnesota Partnership for Biotechnology ja Medical Genomics [Lääketieteen säätiö 2006-100412]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Colon syöpä (CC) on yksi johtavista syistä syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti noin 148000 uutta tapausta raportoitu Yhdysvalloissa vuonna 2009 [1]. Eteneminen CC pidetään vaiheittainen prosessi kertymistä eri geneettisten ja epigeneettisten muutokset johtavat muodonmuutoksen normaalin solun syöpää edeltävä kasvaimen ja lopulta pahanlaatuinen ja mahdollisesti metastaattinen kasvain (normaali adenooma karsi- sekvenssi). Tämänhetkiset tiedot osoittavat selvästi läsnäolo heterogeenisyys tämän tapahtumasarjan. Näitä ovat: (i) kehittäminen erityyppisten syövän esiasteita, kuten villoosinen adenooma, adenooman, tubulovillous adenooma, ja sahalaitaiset polyyppi oletetun erot molekyyli vikoja; (Ii) siirtyminen kohdunkaulan syöpä osoittavat hyvin erilaiset molekyyli- poikkeavuuksia (esim kasvaimia ja ilman vialliset DNA mismatch korjaus); ja lopuksi (iii) kehittäminen satunnaista versus erilaisia ​​perinnöllisiä CC. Taustatekijöitä vastuussa tästä heterogeenisuus ovat kuitenkin edelleen suurelta osin tuntemattomia.

Yksi selkeimmistä erotteluja osoitti toistaiseksi sporadiselle CC perustuu läsnäolo tai puuttuminen toiminnallisten DNA mismatch korjaus (MMR) [2] , [3], [4]. Kasvaimet viallisia MMR (dMMR) on havaittu -20% satunnaista CC ja on ominaista läsnäolo tietyn kasvaimen fenotyypin, kutsutaan mikrosatelliittien epävakaus (MSI). Yksittäisissä CC, kolme erillistä MSI fenotyyppejä on kuvattu: MSS, MSI-L ja MSI-H [5]. MSI-H fenotyyppi liittyy selvä viittaavia tekijöitä [2], [3], [4], mukaan lukien suotuisamman kehityksen [6]. Joukossa satunnaista CC, suurin osa MSI-H tapauksista johtuu inaktivaation

MLH1

takia promoottori hypermetylaation (~95%) [2], [3], [4]. Loput -80% CC kanssa taitava MMR (pMMR), toisaalta, seuraa kromosomaalinen epävakaus (CIN) reitin ja niihin liittyy korkea aneuploidian ja alleeliset epätasapaino [7].

Vaikka suurin osa CC näyttää olevan satunnaista, jolloin keskimääräinen ikä diagnoosin puolivälissä 60 s, noin 15-20% tapauksista syntyä familiaalinen aggregaatteja, joilla on tunnettu geneettinen olosuhteet osuus vain pieni murto-osa näistä. Vaikka perinnöllinen CC on tunnustettu jo jonkin aikaa, identiteetti liittyvien geenien tauti prosessi on vasta hiljattain tunnistettu monille perinnöllinen. Yleisimpiä perinnöllinen muoto CC on Perinnöllinen Non-polypoosin Colon Cancer (HNPCC), jonka osuus ~2-3% kaikista tapauksista [8].

HNPCC, ituradan mutaatioita DNA MMR-geenit ovat myös vastuussa tästä kunnossa,

MLH1

ja

MSH2

osuus useimmissa tapauksissa (-40% kutakin) ja

MSH6

ja

PMS2

kirjanpito pienemmälle prosenttiosuuden, ~ 10% ja 5%, vastaavasti [2], [8]. Kasvaimet näistä potilaista on ominaista myös läsnäolo MSI-H ja menetys MMR-proteiinin lauseke vaikuttaa geenin. Täten molekyyli etiologiaa kasvaimia, joihin liittyy dMMR on hyvin heterogeeninen, joissa on mukana useita eri geenejä ja lukuisat mekanismit geenin toiminnan lopettamisesta, kuten epigeneettiset, somaattiset ja ituradan muutoksia.

Näyttää olevan ainakin kaksi merkittävää johtavia reittejä satunnaisesti ja perinnöllinen CC. Ensimmäinen polku, johon dMMR, ajatellaan peräisin sahalaitainen esiaste (alustaan ​​kiinnittyneiden sahalaitaiset adenooma) ja kattaa kaikki satunnaisessa MSI-H CC (vaikka kaikki syövät johtuvat kautta sahalaitainen-reitin MSI-H). HNPCC luo myös MSI-H CC. Toinen polku on ajateltu johtuvan tubulo /villous adenoomien ja johtaa satunnaisia ​​CC tai FAP liittyviä CC ominaista kasvain CIN ja pMMR. Käsityksemme näistä reiteistä molekyylitasolla ja niiden osallistuminen siirryttäessä normaalista polyyppi sinoomaan, vaikka parannusta on vielä kesken.

Genome lähestymistapojen (lauseke profilointi, genominlaajuisia SNP-analyysi, aCGH, seuraavan sukupolven sekvensointi) jatkuvat tarkentaa ymmärrystämme prosessi kasvaimen. Löytö kasvava luokka pienet ei-koodaavat RNA: t, mukaan lukien miRNA, on paljastanut vielä suurempi vaativuustason syövän biologian [9], [10], [11]. MikroRNA (miRNA) ovat 18-24 nt pieniä ei-koodaavan RNA-molekyylejä, jotka pääasiassa estävät geenin ilmentymistä transkription jälkeisellä tasolla [9]. Kuten miRNA säätelemään suuri määrä proteiinia koodaavan geenien laajan valikoiman biologisia prosesseja vaikuttaa, kuten aineenvaihdunta, organogeneesin, kehitys, ja määrittää solun kohtalon, mukaan lukien kuoleman [10]. Muuttunut ilmentyminen miRNA on liitetty myös erilaisia ​​ihmisen sairauksia, mukaan lukien syöpä [11]. Vaikka yhä useammat tutkimukset ovat käsitelleet miRNA ilmentyminen CC [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], harvat ovat on julkaistu syöpää edeltävät leesiot paksusuolessa [21], [22], [23], [24], [25]. Erityisesti rooli miRNA siirryttäessä normaalin paksusuolen ja polyyppi välillä polyyppi ja syöpä ei ole ymmärretty.

Tässä tutkimuksessa globaali miRNA (735 miRNA tavoitteet) ilmentyminen arvioitiin 315 näytettä (52 normaali paksusuolen limakalvon ja 263 paksusuolen kasvaimet) käyttäen BeadArray ™ alustan (Illumina, Inc.) [26]. Valitut näytteet luokiteltiin useissa kliinisissä ja molekyylitason perusteita tutkia kasvain heterogeenisuus tarkemmin, löytää biologisesti relevantti miRNA ja käsitellä siirtymäkauden muuttuu normaalista adenooma ja adenooma ja karsinooma. Kasvain nimikkeet tubulovillous adenoomia, adenokarsinoomat jossa dMMR valittu niin satunnaista ja perinnöllinen tapauksissa ja adenokarsinoomien kanssa pMMR valittu vaiheessa (A, B, C ja D) ja alkamisiällä (van- kuin nuorilla puhjennut tauti).

Methods

Ethics lausunto

Mayo Clinic Institutional Review Board tarkastettu ja hyväksytty ihmisen tutkimuksia protokollan ”The tunnistaminen ja validointi miRNA Allekirjoitus Profiilit kuten biomarkkereita Colon Cancer Progression” Dr. Stephen N. Thibodeau. Komitea totesi, että ihmisen tutkimukset näkökohtia käytetä kerätyistä näytteistä alle IRB-hyväksyttyjen käytäntöjen. Komitea määrittää, että suostuu prosessi mahdollistaa tulevaa käyttöä näytteistä Esimerkkeinä nykyisen pöytäkirjan. Suurin osa potilaista kunhan kirjallinen lupa. Niille, jotka eivät, näytteet anonymisoidaan.

Näytteiden valinta

Näytteet potilailta sertin tai polyyppeja valitaan kaksi erillistä kasvain rekistereistä. Ensimmäinen näytteitä saatiin kaikista potilaista, jotka tehtiin kirurginen resektio CC aikana kolmen vuoden kauden 1995 1998 (valitsematta). Toinen kokoelma, aloitettiin vuonna 2000, on jatkuva kokoelma biospecimens alkaen Mayo Clinic Rochester potilailla, joilla peräsuolen kasvain. Lihavuuden rekisterin, ei ennalta valintakriteerit ovat käyttäneet rekisterin paitsi että vain ne polyyppien joiden halkaisija on ≥7 mm kerätään tulevaa käyttöä varten.

Kaikki kudosnäytteet jäädytettiin nestemäisessä typessä keräyshetkellä ja varastoidaan -80 ° C: ssa myöhempää käyttöä varten. Normaali alueilla paksusuolen epiteelin saatiin joko marginaali resektio tai vieressä kasvain. Kaikki paitsi yksi normaalin kudosnäytteiden käytetään tätä tutkimusta varten sovitettu kasvaimia. Peräsuolen syöpiä suljettiin pois. Polyyppeja arvioitiin histologista tyyppiä, jossa on vain tubulovillous adenoomia valittu tutkimus. Patologinen tuumorin luokitus oli luokiteltu Dukes kriteerien [27]. Potilaan kaavio arvostelut suoritettiin saada kliininen ominaisuuksia kasvaimen, mukaan lukien kasvaimen, vaiheessa ja ikä diagnoosin.

Kasvaimen käsittely ja RNA uuttaminen

Jäädytetyt kudos leikattiin kryostaatissa tuottaa hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 30% osoitti epävakaus, ja MSS jos mikään markkereita osoitti epävakaus.

immunohistokemiallinen (IHC) analyysi proteiini ekspressio suoritettiin FFPE näytteitä MLH1 ja MSH2 (kaikissa tapauksissa) ja MSH6 ja PMS2 (osajoukko), kuten aiemmin on kuvattu [29]. DNA dMMR määriteltiin läsnäolo MSI (MSI-H) ja /tai puuttuminen proteiinin ilmaisun MLH1, MSH2, MSH6 tai PMS2. DNA pMMR määriteltiin puuttuminen korkea microsatellite epävakaus (MSS /MSI-L) ja läsnäolo normaalin proteiinin ilmaisun MLH1, MSH2, MSH6 ja PMS2.

Kasvaimet kanssa dMMR osoittaa puuttuminen MLH1 testattiin edelleen selvittää syy geenin toiminnan lopettamisesta, eli epigeneettiset (satunnaista) versus ituradan (peritty). Joko metylaatiospesifinen PCR-määrityksessä tai Hpall entsyymi pilkkoo määrityksessä käytettiin testaamaan promoottorin hypermetylaatio [30]. Lisäksi, PCR-pohjainen määritys muutoksiin sisällä V600E mutaatio BRAF suoritettiin myös. MLH1 tapauksissa esittelemiseen

MLH1

promoottori hypermetylaation luokiteltiin satunnaista (dMMR1). MLH1 tapauksissa villin tyypin BRAF ja ilman

MLH1

promoottori hypermetylaation luokiteltiin ituradan (dMMR2). Tapaukset, joissa MSH2, MSH6 tai PMS2 (menetyksellä proteiiniekspressiota IHC tai ituradan testaus) on luokiteltu myös ituradan (dMMR2).

miRNA Profilointi

Global miRNA (735 miRNA tavoitteet) ilmentyminen arvioitiin käyttämällä BeadArray ™ alustan (Illumina, Inc.) oleellisesti, kuten on kuvattu Sarver et ai. [16]. Kukin tarkastettu, 200 ng kokonais-RNA: ta käytettiin analysointiin.

Tilastollinen analyysi

Tutkimuksen suunnittelu.

Erilliset satunnaistamista järjestelmät luotiin määrittää järjestyksen kudoksen cryosectioning, RNA ja jakamisesta näytteiden 96-Sentrix Array (SAM) levyt varmistaakseen, että näytteiden ryhmien etua ja demografiset ominaisuudet olivat hyvin tasapainossa usean mahdollisia kokeellisia vaikutuksia.

Quality arviointeja.

yhteensä 336 kudosnäytteistä (281 kasvaimia ja 55 normaali kudosnäytteitä) 282 koehenkilöille perin testattiin Illumina alustalla. 54 potilaista, sekä normaalin ja kasvainkudoksen saatiin samasta yksilöstä (taulukko 1). Laadun-valvontaa varten, 8 testattiin yhden ylimääräisen kerran ja 5 näytteet testattiin kolme ylimääräistä kertaa (testi toistettavuus), jolloin yhteensä 23 samanlaiset näytteet testattiin (yhteensä testattu = 359). Kaksikymmentäviisi negatiiviset ja leikkaamalla kontrollit hyödynnetään myös arvioida yleistä laatua.

Lisäksi laboratoriossa laadunvalvontaa arvioinnit, globaali laatu ja bias arvioitiin kautta useita piirtämistä tekniikoita. Kaikki analyysit suoritettiin log

2 laajuuden ja tulokset on esitelty kertamuutosta mittakaavassa. Rasia ja hiuksenhienosti tontteja arviointiin käytettiin maapallon keskimääräisen muutoksista miRNA jakelua tai pitoisuuden välillä yksilöitä ja SAM. Pareittain miinus vs. keskiarvo (MVA) tontteja kahden yksilöitä, määritellään per-koetin ero kahden yksilöt (pystysuora akseli) per-anturi keskimäärin (vaaka-akseli) kahden yksilöiden [31], käytettiin arvioida välisen teknisen rinnakkaista. Jäljellä MVA tontteja tietyn näytteen, määritellään erotuksena että näyte ja keskiarvo kaikkien yksilöiden (pystysuora akseli) vs. keskiarvo kaikkien yksilöiden (vaaka-akseli) [32], käytettiin arvioimaan olemassaolon ja toiminnallinen muoto esimerkiksi (ei) lineaarisuus harhat funktiona runsaasti. Tontteja pääkomponenttianalyysi (PCA) tuloksia käytettiin tutkimaan (DIS) samankaltaisuus yksilöiden negatiiviseen kontrolli näytteitä ja olemassaolon SAM vaikutuksia. Rasiakuvaajien ja pistekuvioita arviointiin käytettiin luonteen ja johdonmukaisuuden per-anturi SAM vaikutuksia. Havaitseminen hinnat arvioitiin kunkin näytteen, jossa koetin havaitseminen määriteltiin p-arvot 0,01.

Näiden laadun arviointiin analyysejä, yhteensä 21 359 näytettä (joista osa toistoa) poistettiin edelleen tutkimus. Kaksitoista todettiin olevan enemmän samanlainen ilme jakelun negatiivinen kontrolli näytteitä perustuu rasiakuvaajien, havaitseminen hinnat ja PCA tontteja ja yksi näyte oli erittäin korkea, mutta kapea ilmaisua. Lisäksi seitsemän yksilöitä oli tietenkin erilainen lattian ja katon vaikutuksia jäljellä MVA tonttien ja aihekokonaisuuksien lähempänä negatiivisen kontrollin näytteitä PCA. Yksi ylimääräinen näyte poistettiin, koska se oli ainoa luokassaan. Siten oli 338 näytettä (318 ainutlaatuinen ja 20 toistoa) 268 aiheista jäljellä analysoitavaksi.

esikäsittely.

runsaus jakauma 735 miRNA ja 20 ohjaus antureista kesti monenlaisia, 40% -60% koettimien näytteessä havaitaan ohimennen laadun arviointi (käyttäen 0,01 havaitseminen p-kynnysarvon). Lisäksi ei ollut

a priori

syytä odottaa epäsymmetrinen jakautuminen muutokset [16]. Siten 338 yksilöt kulkee alkuperäisen laadun arviointiin normalisoitiin yhteen kautta quantile normalisointi [31]. Post-normalisointi jäljellä MVA tonttien osoitettu, että keskimääräinen epälineaarinen bias poistettiin onnistuneesti. Kuitenkin kuvaajat PCA tulokset osoittivat, että SAM vaikutus säilyi. Kontrasti arvioiden ja piste tontteja paljasti, että vaikka oli olemassa juuri mitään SAM vaikutusta useimpien antureista, kourallinen osoitti muutoksia jopa 2-kertainen välillä SAM, jotka olivat yhdenmukaisia ​​kaikissa näytteet kustakin SAM ja ei ohjaa outlier pistettä. Eli johdonmukaisesti SAM-by-koetin yhteisvaikutuksia ei havaittu. Siten jäämät lineaariset mallit, joissa SAM-mallissa kunnossa per-anturi pohjalta quantile normalisoitu tietoja käytettiin lopullisessa normalisoitu, SAM-korjattuja tietoja. Nämä lineaariset mallit antoivat tuloksia desimaalin pöly empiirisen Bayes menetelmien koska otos on suuri [33].

Jäljellä MVA tontteja, rasiakuvaajien ja per-koetin pistekuvioita ei näkynyt suuntaus aikaa yhden näytteen palvelevat leikkurin ohjaus kudoksen leikattu seitsemän kertaa kahden kuukauden aikana tarvitaan käsittelemään kaikki kudosnäytteistä. Jäljellä ja pareittain MVA tonttien osoitti hyvää yleistä välisen teknisen rinnakkaista sijoitettu eri SAM. Suurin SAM vaikutus havaittiin oli 2,33-kertainen (log

2 mittakaavassa ero 1,22), ja vain kourallinen antureista oli SAM vaikutuksia 2-kertainen. 91,5% (691/755) antureista oli SAM vaikutus arvioiden 1,2-kertaiseksi.

Per-anturi havaitseminen hinnat yhdessä kuvaajia per-koetin keskihajonta (SD) kaikkien normalisoitu näytteet (n = 338 ) versus keskimääräinen ilmaus kaikkien normalisoitu näytteet osoittivat selkeitä lattia ja katto vaikutuksia runsaus jakeluun. Viestiä per-anturi kynnyksen SD ≤0.4 näissä näytteenvalmistukseen log

2 mittakaavassa käytettiin suodattaa pois ”ei-informatiivinen” antureista tavalla agnostikko ryhmä [34]. Tämä johti 123 antureilla 0% havaitseminen hinnat, 37 tyydyttyneitä antureista, ja 376 puolivälissä runsaasti antureista, joilla on alhainen SD on suodatettu pois, jättäen 199 informatiivinen antureilla SD 0,4.

Differential ilmaisua.

Per-anturi lineaarinen sekoitettu vaikutuksia malleissa kontrastin lausuntoja arviointiin käytettiin differentiaalikaavojen käyttäen kvantiili normalisoitu, SAM-korjattuja tietoja. Aihe sisällytettiin satunnainen vaikutus, jotta osuus korrelaatiota useiden havaintojen per henkilö (tekninen rinnakkaisnäytteiden ja pariksi luonne kaikki paitsi yksi normaali näyte). SAM vaikutus sisällytettiin malliin selittämään vapausasteita käytetään per-anturi poistaminen SAM vaikutus. Jakaumia p-arvojen ja vääriä löytö hinnat [35], [36] (laskettu mallin tuloksia kaikille 735 miRNA koettimet) käytettiin antamaan yleinen käsitys siitä totta eroja. Todellinen merkitys arvioitiin käyttämällä enemmän konservatiivinen Bonferronin korjattu p-arvoja, jotka perustuvat 0,05 /735 = 6,8 x 10

-5 kutakin vertailua yhdessä kertamuutosta cutoffs sisällyttää biologista merkitystä. Kuusi pääryhmään verrattiin: normaali, polyyppi, pMMR1 (vanha puhkeamista), pMMR2 (nuoret puhkeamista), dMMR1 (satunnaista) ja dMMR2 (ituradan). Muita vertailut sisältyvät pMMR1 Vaiheet B, C ja D (vaihe A n = 3 jätettiin pois tämän vertailun johtuen pienestä näytteen koko), sekä pMMR1 MSS ja MSI-L-ryhmää.

säätäminen muuttujat olivat mukana tarvittaessa, jotta vältetään mahdollinen sekoittava kanssa histologia. Kasvaimen vaihe sisällytettiin kovariaattina malleissa arvioitaessa erot kasvaintyyppeihin säätää mahdollisen epätasapainon sairauden vaikeusasteen vuoksi vaiheeseen. Sijainti paksusuolessa ei sisältynyt kovarianssina malleissa verrattaessa pMMR ja dMMR kasvaimet koska tämän katsottiin olevan osa biologiaan kasvaimia. Ei kovariaatit sisällytettiin malleja verrataan polyyppi tai normaali ryhmiä muiden ryhmien kanssa, koska kumpikaan vaiheessa eikä paikalla paksusuolen merkitystä näissä ryhmissä.

Visualisointi Data.

Visualisointi esiintymisen maailmanlaajuisia vaikutuksia saatiin aikaan läpi ilman valvontaa klustereiden ja PCA hyödyntäen ainutlaatuista kudosnäytteistä vain (318 338 näytettä); tekniset toistojen suljettiin pois analyyseistä. Näytteet, joissa on useita teknisiä rinnakkaisnäytteiden replikaattiketjun näyte merkitty ”1” valittiin. PCA-analyysit suoritettiin per-anturi keskiarvokeskitettiin ja SD-skaalattu dataa Partek [37] ja R-toiminto prcomp [38]. Valvomatta klustereiden analyysit suoritettiin per-anturi mediaani keskittyvää data Partekin käyttämällä Pearsonin erilaisuutta matriisi laskemiseen välimatkat yksittäisten näytteiden ja keskimääräinen nostolaite laskentamenetelmän välisistä etäisyyksistä klustereita. Pisteet tai näyte etikettejä värillinen tonteille tunnetuilla kliinisen ryhmittelyinformaatiota.

Tulokset

Näytteiden ominaisuudet

Laajan laadun arvioinnin miRNA profilointi tulokset (katso menetelmät), 338 kudosnäytteitä 268 potilasta käytettiin lisäanalyysiä varten. Normaali ja kasvaimen kudosnäytteistä (ei sisälly teknisen toistoa) sisältyy 52 normaalin paksusuolen limakalvo, 41 tubulovillous adenoomia, 158 adenokarsinoomat jossa pMMR valittu vaiheessa (3 Stage, 72 Stage B, 43 Vaihe C ja 30 Stage D) ja ikä puhkeamista (148≥50 vuotta vs. 10 50 vuotta), ja 64 adenokarsinoomien kanssa dMMR valittu niin satunnaista (53 dMMR1) ja perinnöllinen CC (11 dMMR2) muutetaan taulukon 1

Kaikki tapaukset satunnaisia dMMR (dMMR1) oli

MLH1

inaktivoitumisen takia promoottori hypermetylaation. Peritty dMMR ryhmä (dMMR2) koostui tapauksista, joilla on: (i) tunnetun ituradan mutaatio joko

MLH1

(n = 1) tai

MSH2

(n = 3); tai (ii) menetys proteiinin ilmentymisen ja MSH2 (n = 3), MSH6 (n = 2) tai PMS2 (n = 2), IHC ja katsotaan olevan ituradan mutaatio näiden geenien. Useita tapauksia dMMR ei helposti luokitella (dMMR3) ja koska pieni määrä, nämä olivat eliminoitu lisäanalyysiä. Niistä 268 aiheita, 119 oli naisia ​​ja 149 miehiä.

Global miRNA ilmaisun eroja normaalin paksusuolen, ja -karsinooman

PCA ja hierarkkinen Klusterianalyysit, molemmat ilman valvontaa, käytettiin visualisoida miRNA ekspressiokuvioiden läsnä maailmanlaajuisesti meidän ilmaisun aineisto. Kaiken kaikkiaan oli selvä ero ryhmien koostuu normaalista, adenooma, pMMR1 ja dMMR1 johdettu kudoksia tutkittaessa molemmat valvomatta PCA (kuvio 1A) ja hierarkkinen klusterointi (kuvio 1 B) käyttämällä joukkoa 199 ”informatiivinen” antureista saatu menetelmät. Kiinnostaa kuitenkin hierarkkinen klusterointi ehdottaa myös läsnä kaksi osapopulaatiosta varten dMMR1 ryhmä kasvaimia, joka näyttää ohjaavat klusterin miRNA (joista suurin osa kromosomi 14) osoittaa heikkoa ilmentymistä yhdessä ryhmässä ja voimakasta ilmentymistä toinen (merkitty nuolella kuviossa 1 B).

(A) Pinta-pääkomponenttien PCA analyysejä. Vaaka-akseli vastaa Pääkomponentti 1 (PC1), pystysuora akseli vastaa PC2, syvyys akseli vastaa PC3. Prosentuaalinen vaihtelu selittyy tietyn PC on merkitty akselin etiketti. Pisteitä värittävät ryhmä tila sininen edustaa normaalia epiteelin, violetti edustavat polyyppi, vihreä edustaa pMMR1, ja punainen edustaa dMMR1. Kaksi eri suuntaan tarjotaan. (B) valvomaton hierarkkinen klusterointi miRNA profiileja joukko 199 ”informatiivinen” antureista saatu Methods. Näytteet on merkitty vaaka-akselilla ja sisältää normaalin paksusuolen, adenoomia, pMMR1 karsinoomien ja dMMR1 karsinoomien kanssa ryhmän jäsenyys merkitty väripalkkia välillä dendogram ja lämmön kartan. miRNA on merkitty pystyakselille. Väripalkkia alapuolella osoittaa ilmentymisen taso.

Maailmanlaajuinen miRNA ekspressiokuvioiden Sitten tutkitaan visuaalisesti eri ennalta määriteltyjä kasvain alaryhmiä onko nämä voitaisiin erottaa. PCA tontteja näiden analyysien esitetään kuvassa 2 (tuloksia ei ole esitetty, että hierarkkinen klusterin analyysit). Sisällä pMMR1 ryhmä kasvaimia, ei ollut ilmeistä havaittavia eroja perustuu vaiheessa joko kaikissa kolmessa vaiheessa tai minkä tahansa kahdessa vaiheessa (Stage ei sisälly takia pieni määrä), tai sukupuolen perusteella. Lisäksi ei erottaminen ryhmien näkyi välillä kasvaimet vanhemman alkamisiällä (≥50 y /o, pMMR1) ja ne, joilla nuorempina puhkeamista ( 50 y /o, pMMR2). Analyysi kasvaimia molempien dMMR alatyyppiä, dMMR1 (somaattinen) versus dMMR2 (ituradan), osoittivat myös, ei havaittavia eroja.

Vaaka-akseli vastaa pääkomponenttina 1 (PC1), pystyakseli vastaa PC2 ja syvyys vastaa toimintalinja PC3. Pisteitä värittävät ryhmän asemaa. Prosentuaalinen vaihtelu selittyy tietyn PC on merkitty akselin etiketti. (A) pMMR1 arvioida Dukes vaiheessa; (B) arviointi alkamisiällä (pMMR1 – old ja pMMR2 – nuori). (C) arviointi 2 ryhmittymät dMMR tapauksista (dMMR1 – epigeneettisellä vaiennetaan MLH1 ja dMMR2 – ituradan); (D) pMMR1 ryhmät MSI-L ja MSS kasvaimia. Värit kullekin ryhmistä vertailtujen näkyvät oikeassa yläkulmassa legenda ruutuun.

Koska kasvaimet ovat usein luokitellaan niiden MSI asema (MSS, MSI-L ja MSI-H), nämä kolme ryhmää tutkittiin edelleen ilmaisun eroja yhdessä, niin systemaattisesti pareittain. Kuten odotettua, MSI-H-ryhmän (määritelty dMMR) ryhmitelty erikseen sekä MSI-L ja MSS ryhmät (sekä määritellään pMMR). Kuitenkin MSI-L ja MSS ryhmät osoittivat mitään havaittavia eroja (kuva 2).

Differential ilmaisun välillä normaali paksusuoli, ja -karsinooman

Olemme suorittaneet ryhmään perustuvaa tilastollisessa vertailussa on probe- by-koetin perusteella käyttämällä lineaarisia malleja useita ennalta määriteltyjä analyysit vaivaa tunnistamaan tilastollisesti merkitsevä ilmentyvät eri miRNA. Kaiken kaikkiaan erittäin merkittäviä eroja havaittiin useiden ryhmien erityisiä miRNA käyttäen Bonferronin korjattu p-arvo kynnyksen merkitys (6,8 x 10

-5). Taulukossa 2 on lasken miRNA osoittavat merkittäviä ilmaisu kertamuutoksia vaihtelevin cutoffs (≥2.0 ja ≥4.0). Taulukossa 3 on esitetty yhdeksän tilastollisesti merkittävä ilmentyvät differentiaalisesti miRNA, jolla on suurin kertainen muutos (kertainen muutos ≥4), kun taas kuvio S1 esittää pistekuvioita kullekin näistä kesken eri kudosten alaryhmään.

muutos ekspressiotaso, joka esiintyy normaalia adenooma ja karsinooma-sekvenssin kunkin yhdeksän miRNA voidaan selvästi nähdä kuviosta S1. Viisi yhdeksästä osoittaneet yhdenmukaisia ​​muutoksia kaikissa ryhmissä verrattuna normaaliin, jossa miR-135b ja miR-31 säädelty ja miR-1, miR-137 ja miR-9 alassäädetty kaikissa näytteissä. HS_29 on säädelty kaikissa karsinoomien mutta ei polyypit, miR-552 ja miR592 ovat säädellään ylöspäin polyypit ja pMMR kasvaimia, mutta ei dMMR kasvaimia, ja lopuksi, miR99a on säädellä vähentävästi polyypit kanssa välitasoja sekä pMMR ja dMMR kasvain ryhmiä.

Käyttämällä Bonferronin P-kynnysarvo yhdessä kertainen muutos ilmentymistason ≥2, yhteensä 54 miRNA joukosta tunnistettiin eri vertailuissa (taulukko 2, taulukko S1). Kolmekymmentä yksi miRNA oli ilmennetty eri normaalin paksusuolen kudosta ja adenoomia. Vertailu normaalin paksusuolen kudoksen kahden tärkeimmän kohdunkaulan ryhmää (pMMR1 ja dMMR1) tunnistettu 31 ja 28 merkittävää miRNA vastaavasti hyödyntäen nämä kriteerit. Lopuksi, 6 ja 11 merkittäviä miRNA tunnistettiin kun adenoomia verrattiin kahteen karsinooma ryhmää. Lämpö kartta, joka on esitetty kuviossa 3, on esitetty suhteellinen ekspressio eroja näiden miRNA ryhmien kesken tutkitaan.

Näytteet on merkitty vaaka-akselilla ja ovat normaali paksusuoli, adenoomat, pMMR karsinoomien (1 ja 2 yhdistetään ) ja dMMR karsinoomia (1 ja 2 yhdistetty) ja ryhmän jäsenyys merkitty väripalkkia välillä dendogram ja lämmön kartan. miRNA on merkitty pystyakselille. Väripalkkia alapuolella osoittaa ilmentymisen taso.

Mielenkiintoista, suurin osa (23 31) miRNA jotka ilmentyvät eri normaalin ja adenooma käännettävät muutoksia ≥2 myös ekspressoituu differentiaalisesti vertailu normaalin sekä pMMR ja dMMR kudoksen ryhmiä, esimerkiksi miR-135b ja miR-31 (taulukko S1). Lisäksi tasot ja suunta muuttuu suhteessa normaaliin useimmat niistä olivat yhdenmukaisia ​​ja -karsinooman. Sen lisäksi, että yhtäläisyyksiä huomattava varten ja -karsinooman ryhmät kuitenkin eroja ilmaisun tunnistettiin myös. Niistä 43 miRNA, joita on huomattavasti differentiaalisesti ilmaistaan ​​kertaiseksi muutoksia ≥2 kahdessa kasvaimen ryhmien 20 ei täyttänyt näitä kriteerejä polyyppi ryhmässä (esim miR-375, mir-147, jne.), Vaikka useat muut miRNA oli huomattava mutta kuitenkin pienempi ekspressiotasot eroa polyyppi ryhmässä (esim miR-188-5p, miR-210) (taulukko S1). Kun kasvain ryhmiä verrattiin suoraan polyyppi ryhmään, 20 miRNA havaittiin; 9 sääteli (esim miR-483-3p, miR34b) ja 11 alassäädetty (esim miR-552, miR-592).

Vaikka PCA ja ryhmäanalyysi pystyi erottamaan pMMR1 ja dMMR1 alaryhmien (kuvio 1), oli yllättävän vähän miRNA, joita on huomattavasti ilmentyvät differentiaalisesti näiden kahden ryhmän (taulukko 2 ja taulukko S1). Vain neljä miRNA (miR-31, miR-224, miR-552, miR-592,) löydettiin 2-kertainen muutos tai korkeampi. Kuten edellä on adenooma vertailuja, suurin osa miRNA jotka ilmentyvät differentiaalisesti välillä normaalin paksusuolen kudosta ja pMMR1 ryhmä kertainen muutoksia ≥2 myös ekspressoituu differentiaalisesti vertailussa normaalin paksusuolen kudoksen dMMR1 kudoksen ryhmään. Jälleen, tasot ja suunnan muutokset suhteessa normaaliin useimpien näiden miRNA olivat yhdenmukaisia ​​näiden kahden vertailuja (taulukko S1).

useita muita ennalta suunniteltua vertailut osoittivat vähän eroja tiettyyn alaryhmään.