Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA) ja sen reseptori (uPAR /CD87) ovat merkittäviä sääntelyviranomaisten soluväliaineen hajoamisen ja osallistuvat solujen vaeltamiseen ja invaasiota fysiologisissa ja patologisia tiloja. UPA /uPAR järjestelmä on ollut suurta kiinnostusta syöpätutkimuksessa, koska se on mukana kehittämässä useimpien kohdunkaulan syöpä ja fenotyyppien on vahva ennustaja huono potilaan selviytymisen. Kuitenkin tiedetään vähän roolista uPA /uPAR pienissä keuhkosyöpä (SCLC), aggressiivisin keuhkosyövän. Siksi selvitettävä, uPA ja uPAR osallistuvat sukupolven lääkkeille vastustuskykyiset SCLC solun fenotyyppiin.

menetelmät ja havainnot

seulottiin kuusi ihmisen SCLC solulinjoissa Pintamerkkiaineilla luulotellun kantasolujen ja syöpäsoluja. Käytimme fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS), fluoresenssimikroskopia ja klonogeenisten määrityksissä osoittamaan uPAR ilmentymisen alaryhmästä peräisin olevien solujen primaarinen ja metastaattinen SCLC-solulinjat. Sytotoksiset määrityksiä käytettiin määrittämään herkkyyttä uPAR-positiivisten ja uPAR-negatiiviset solut kemoterapeuttisia aineita. UPAR-positiivisten solujen kaikissa SCLC linjat osoittivat monilääkeaineresistenssi, korkea klonogeeniset aktiivisuus ja yhteistyön ilmentymä CD44 ja MDR1, otaksuttu syövän kantasolujen merkkiaineita.

Johtopäätökset

Nämä tiedot viittaavat siihen, että uPAR-positiiviset solut voivat määritellä toiminnallisesti tärkeä populaatio syöpäsolujen SCLC, jotka ovat vastustuskykyisiä perinteisiä kemoterapioissa, ja voisi toimia kriittinen tavoitteet tehokkaammin hoitotoimenpiteiden vuonna SCLC.

Citation: Gutova M, Najbauer J , Gevorgyan A, Metz MZ, Weng Y, Shih CC, et al. (2007) tunnistaminen uPAR-positiivisten solunsalpaajaresistentti solut pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 2 (2): E243. doi: 10,1371 /journal.pone.0000243

Academic Editor: Christopher Arendt, Sanofi-Aventis, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 tammikuu 2007; Hyväksytty: 31 tammikuu 2007; Julkaistu: 28 helmikuu 2007

Copyright © 2007 Gutova et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Johdanto

Pieni keuhkosyöpä (SCLC) on kaikkein aggressiivinen keuhkosyövän ja on tasaisesti huono ennuste. Kehittyy metastaaseja nopeasti, pääasiassa luuytimessä ja aivoissa, ja ne ovat yleensä läsnä diagnoosia tehtäessä. Vuonna hoitamattomien potilaiden eloonjäämismediaani on kahden kuukauden oireiden alkamisesta [1].

useita kasvaimia kohonneeseen urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA) ja sen reseptori uPAR (CD87) vahvasti korreloivat huonoon ennusteeseen ja epäsuotuisa kliinistä tulosta [2], [3], [4], [5], [6]. uPA ja uPAR ovat avainasemassa valvontaan kalvoon liittyvä solunulkoisen proteolyysiä ja transmembraanisen signalointi, mikä vaikuttaa solujen vaeltamiseen ja invaasiota fysiologisissa ja patologisissa tiloissa [2], [7], [8], [9], [10]. uPAR yli-ilmentyminen pahanlaatuisten solujen johtuu aktivoinnin useista onkogeenisten reittejä, kuten MAPK, RTK, ERK2 ja FAK [2], [7], [9]. Useita onkogeeniset mutaatiot, mukaan lukien p53 syöpäsoluissa johtaa hallitsemattomaan ilmentymisen uPA /uPAR [11]. Inhibitio uPAR hiirimallissa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja muita kasvaimia inhiboi kasvaimen kasvua, invaasio, angiogeneesin ja metastaasin [12], [13], [14]. Kohonneeseen uPAR korreloivat suurempi kuolleisuutta potilailla, joilla levyepiteelisyöpä ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [15], [16], mutta tiedetään vain vähän roolista uPA /uPAR ilmaisun SCLC.

Tuore tutkimus Alfano

et al

korostaa uPAR signalointi ehkäisyssä apoptoosin vastus syöpäsolujen anoikis (indusoiman apoptoosin menetys ankkurointi). uPAR ilmaisun edistää solujen eloonjäämistä aktivoimalla antiapoptoosi tekijä Bcl-xL transkription kautta MEK /ERK- ja PI3K /Akt-riippuvaisen reittien [17]. Siksi oletamme, että uPAR ilmentyminen voi olla mukana kehittämisessä lääkkeille vastustuskykyisten syövän fenotyyppi SCLC.

Tässä raportoidaan läsnäolo harvinainen väestöstä uPAR-positiivisten solujen ihmisen SCLC solulinjoja, jotka osoittavat merkittäviä huumeiden resistenssin perinteisille kemoterapeuttisten aineiden, kuten 5-fluorourasiili (5-FU), sisplatiinin ja etoposidin. UPAR-positiivisten solujen ilmaisi Stern- ja syöpäsolujen markkereita, mukaan lukien CD44 ja MDR1. Tunnistaminen ja kohdentamista uPAR-positiivisten solujen SCLC voivat antaa arvokasta tietoa biologia ihmisen keuhkosyövän ja se voi luoda uusia kriittisiä tavoitteet tehokkaammin syöpähoitoihin.

Methods

Immunovärjäys ja virtaussytometria-analyysi

Ensisijainen (keuhko) pienisoluisen keuhkosyövän (SCLC) solulinjoissa (H1688, H1417, H69AR), luuytimen (BM) metastaattinen SCLC (H211, H1882) ja aivojen metastaattinen SCLC (H250) solulinjat saatiin ihmisen primaarinen keuhkojen ja metastaattinen kudoksissa (ATCC), kasvatettiin RPMI 1640 modifioitu väliaine (ATCC, N: 30-2001), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). BM metastaattinen solulinja (H1882) viljeltiin täydellisessä HITES väliaineessa (D-MEM /F-12, N: 30-2006 johon on lisätty insuliinia 5 ug /ml, transferriini 10 ug /ml, natriumseleniitti 30 nM, hydrokortisonia 10 nM , β-estradioli 10 nM, L-glutamiinia 2 mM, HEPES 10 mM, ja 5% FBS: ää). Soluja kasvatettiin kahden viikon ajan ja analysoitiin virtaussytometrialla käyttäen seuraavia vasta-aineita: CD59 (CBL467P), CD109 (CBL585P), CD62E (CBL180F) Chemicon, CD87 (3936CJ) American Diagnostica, CXCR4 (FAB170F) R 1%). Syynä tähän saattaa olla mahdollista saastumista lajittelun aikana. Vaihtoehtoisesti uPAR-negatiivinen syöpäsolut voivat hankkia uPAR ilmaisu tietyin viljelyolosuhteissa. Useita uPAR-pesäkkeistä on poimittiin ja kasvatettiin vielä 2 viikkoa RPMI viljelyalustassa, jota seuraa FACS lajittelua ja klonogeeniset määritys. Mielenkiintoista, havaitsimme saman verran uPAR-positiivisten ja uPAR-negatiivisia soluja (1-5% ja 95-99% vastaavasti) näissä kulttuureissa, mikä viittaa siihen, että uPAR-positiivisten pesäkkeiden voi kerrata vanhempien solun fenotyyppi. In johdetut viljelmät uPAR-negatiiviset pesäkkeet Toisaalta olemme havainneet alhaisempi (0,1-0,8%) on uPAR-positiivisten solujen, ja huono yleistä kasvua (tietoja ei esitetty).

Colony muodostava aktiivisuus uPAR-positiivisia ja uPAR-negatiivisia soluja, jotka ovat peräisin SCLC solulinjoista. (A) H1417- johdettu, uPAR-positiivisten lajitellut solut muodostivat useita pesäkkeitä metyyliselluloosaan media, kun taas uPAR-negatiiviset solut samasta lajittelee näkyy vähän tai ei lainkaan klonogeeniset aktiivisuutta. (B) Graafinen esitys pesäkkeitä muodostavien kyky uPAR-positiivisten ja uPAR-negatiivisia soluja eri maljatiheyksiin 3000, 1000, 100 solua /6-kuoppaiselle levylle (H1417, H69AR, H211). (C) jakautuminen uPAR-positiivisten solujen pesäkkeet peräisin lajiteltu uPAR-positiivisten solujen kasvatettu metyyliselluloosa media. Kaikkiaan 20 solun pesäkkeitä H1417 solulinjasta analysoitiin.

Co-ilmentymä uPAR kanssa CD44 ja MDR1

lisäksi arveltu, että jos uPAR-positiivisten solujen osuus huumeisiin kestävä ja klonogeeniset väestön SCLC, ne voivat ilmaista CD44 ja MDR1 (ABCB1) geenejä, jotka osallistuvat syövän kehittymiseen kantasolujen fenotyyppiä ja monilääkeaineresistenssi. Edelleen karakterisoimiseksi uPAR-positiivisilla, suoritimme double-merkintää kokeita uPAR-FITC, ja CD44-PE sekä MDR1-PE on H211, H69AR, H1417 solulinjat. uPAR-positiivisten solujen, jotka ovat peräisin SCLC-solulinjat (H211, H69AR, H1417) ilmaistaan ​​CD44 on 50-80%, kun taas MDR1 on 10-40% soluista (kuvio 5A). Expression edellä merkkiaineiden vahvistettiin myös käyttäen fluoresenssimikroskopialla (kuvio 5B). UPAR-negatiiviset solut ilmaisivat myös CD44 (-70% ja H211 ja H69AR solujen -10% for H1417) ja MDR1 (1-10% kaikkien solulinjojen) (Kuva. 5A). Nämä tiedot viittaavat siihen rikastuminen CD44 ilmaisun H1417-soluissa, kun taas MDR-1 osoittivat lisääntynyttä ilme uPAR-positiivisten solujen peräisin kaikista kolmesta solulinjoista verrattuna uPAR-negatiiviset solut (Fig. 5A).

Expression of CD44 ja MDR1 on uPAR-positiivisten ja uPAR-negatiivisia soluja. (A) FACS-analyysi, H211, H69AR ja H1417 SCLC solulinjoissa double-leimattu uPAR-FITC ja CD44-PE, MDR1-PE. Prosenttiosuudet ilmentävien solujen CD44 ja MDR1 laskettiin erikseen uPAR-positiivisten ja uPAR-negatiivisia soluja. (B) fluoresoiva mikroskooppinen analyysi kaksoisleimattua ja FACS-lajitellut solut. Esimerkkejä uPAR-FITC /CD44-PE double-merkintää (a, b, c) ja uPAR-FITC /MDR1-PE kaksinkertaisen merkintöjä (d, e, f). (Bf-upotus) H1417 solulinja värjättiin hiiren IgG isotyyppikontrollilla-PE (punainen), isotyyppikontrollilla-FITC (vihreä) ja DAPI (sininen).

Keskustelu

tärkein löydös on tunnistaminen harvinainen alapopulaation uPAR-positiivisten solujen SCLC solulinjoissa on peräisin keuhkojen ja etäpesäke luuytimen ja aivot. On hyvin dokumentoitu, että uPAR yli-ilmentyminen eri pahanlaatuisia kasvaimia korreloi voimakkaasti useimpien kohdunkaulan syöpä fenotyyppien ja huonon ennusteen [2], [4], [15], [18].

Useat tutkimukset viittaavat siihen, läsnäolo harvinainen solupopulaation kiinteissä kasvaimissa ja leukemia, joilla on kyky uudistua ja levittää kasvain [19], [20], [21], [22], [23]. Nämä solut voivat myös olla vastuussa siitä, että kasvain on pahanlaatuinen potentiaalia ja toimivat perimmäinen syy kasvaimen uusiutumisen [24], [25]. Nykyinen hoito strategiat saattavat epäonnistua kohdistaa lääkeaineille alaryhmän, ja voisi selittää alkuperäisen terapeuttisen vasteen useimpien kasvainsolujen, jota seuraa myöhemmin sen toistumisen.

Huomasimme, että uPAR-positiivisten solujen olivat vastustuskykyinen hoidon sytotoksinen aine 5-FU, kun taas uPAR-negatiiviset solut kuolivat paljon tehokkaammin. Sytotoksinen vaikutus 5-FU on katsottu johtuvan väärinliittymistä on fluoronucleotides RNA: ksi ja DNA: han ja estämällä nukleotidin synteettinen Tymidylaattisyntaasientsyymin, joka pääasiassa on kohdistettu nopea jakautuvien solujen [26]. Tutkimme myös sisplatiinin ja etoposidin, kemoterapeuttiset lääkkeet käytetään tällä hetkellä hoidossa SCLC potilailla. Tärkeää on, viljelemällä SCLC-solujen läsnä ollessa sisplatiinin ja etoposidin johti valikoiva tappamisen uPAR-negatiivisten solujen samanaikainen rikastusta uPAR-positiivisten solujen populaatio.

uPAR-positiivisten solujen eristetty kolmesta SCLC riviä pystyivät lisääntyä ja muodostaa useita siirtokunnissa metyyliselluloosa media, kun taas uPAR-negatiiviset solut näkyvät vain vähän tai ei klonogeeniset potentiaalia. Osoitimme myös koekspressoimalla uPAR kanssa CD44 ja MDR1, mikä voi selittää yhdistyksen välillä edenneen taudin ja lääkeresistenssin. Useat tutkimukset ovat tutkineet erikseen roolia uPAR, CD44 ja MDR1 eri pahanlaatuisia kasvaimia [5], [13], [14], [17], [19], 24,27,28,29,30,31,32, kuitenkin tietomme tämä on ensimmäinen tutkimus, joka antaa näyttöä ilmentämiseen CD44 ja MDR1 on uPAR-positiivisten solujen SCLC. Olemme myös havainneet CD44 ja MDR1 ilme uPAR-negatiivisia soluja, toiminnalliset vaikutukset on vielä määrittämättä.

ATP-sitova kasetti (ABC) lääkkeiden kantaja on osoitettu suojaavan syövän kantasoluja kemoterapia-aineiden 33 . merkittävä kuljettajana ABC perhe on P-glykoproteiini, tuote on MDR1-geenin, joka on tuotettu hematopoieettisissa kantasolut (HSC) 32. MDR1 geeni tulee alassäädetty on HSC kun solujen erilaistumiseen 32. P-glykoproteiinin ja CD44 on ominaista, ja tiedetään olevan tekijöitä monilääkeaineresistenssi syöpäsolujen, mikä välittyy fyysisen ja geneettisiä vuorovaikutukset CD44 ja MDR1 30. aktivointi CD44 tapahtuu kautta heterodimerisoitumisella CD44 kanssa kasvutekijän reseptoreita (esim EGFR, FGFR, HGFR, VEGFR, TGF-βR), joka johtaa aktivoitumiseen MAP-kinaasin ja PI3K-AKT signalointireittien 34. CD44 stimulaation sen ligandin hyaluronaani up-säätelee ilmentymistä uPA ja uPAR mRNA kautta MAPK-Ras-reitin vaikka PI3K aktivaatio stimuloi MDR1 ilmentymistä ja toimintaa 34. PI3K toimii myös positiivista palautetta silmukka stimuloida hyaluronaani tuotantoa, joka aktivoi CD44 35,36. CD44-MAPK-PI3K signalointi johtaa hallitsemattomaan ilmentymisen uPA /uPAR ja MDR1, joka edistää invasiivisia ja monilääkeresistentin syövän solujen fenotyyppiin. Sen lisäksi, että CD44-MAPK-PI3K signaloinnin, uPAR yli-ilmentyminen voi aiheuttaa solujen eloonjäänti aktivoimalla anti-apoptoosin tekijän Bcl-xL: n transkription 17.

Future tutkimukset eläinmalleissa käsitellään onko uPAR-positiivisten solut ovat vastuussa primaarikasvaimen kasvun ja muodostumisen kaukaisten metastaasien SCLC. Yhteenvetona, olemme tunnistaneet uPAR-positiivinen alipopulaatio SCLC-soluja, jotka omaavat korkean monilääkeaineresistenssi ja klonogeeniset toimintaa, kun taas uPAR-negatiiviset solut ovat herkkiä kemoterapeuttisten ja näyttää vähän tai ei lainkaan klonogeeniset aktiivisuutta. Tarjoamme myös todisteita yhdistyksen uPAR, CD44 ja MDR1 ilmaisun SCLC soluissa. Lisätutkimuksia on perusteltua onko kohdistaminen tämän solupopulaation tulee olemaan kriittinen terapeuttista menestys.

Kiitokset

Kiitämme tohtori Kristine A. Justus asiantuntija editointi käsikirjoituksen, Lucy Brown apua virtaussytometrillä mittaukset ja Sofia Loera apua immunohistokemiallisilla tekniikoita. Kiitämme tohtori Kemp Kernstine tarjota sisplatiinin ja etoposidin. Tämä työ on omistettu rakastava muistiin Hrach Shahmanyan.