Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aberrant aktivoituminen PI3K /AKT signalointi edustaa yksi yleisimmistä molekyylitason muutoksia keuhkosyöpää, vaikka suhteellinen osuus yhden komponenttien cascade NSCLC kehitykseen edelleen huonosti määritelty. Tämän käsikirjoitus olemme tutkineet suhdetta ilmaisun ja geneettisiä muutoksia komponenttien PI3K /AKT-reitin [KRAS, katalyyttisen alayksikön PI3K (p110α), PTEN, AKT1 ja AKT2] ja aktivointi AKT 107 kirurgisesti resektoitiin NSCLCs ja ovat analysoineet olemassa olevia suhteita kliinis-patologisten ominaisuuksia. Expression analyysi suoritettiin immunohistokemia Tissue Micro Array (TMA); mutaatio analyysi suoritettiin DNA-sekvensointi; kopioluvun vaihtelu määritettiin FISH. Me raportoimme että aktivoituminen PI3K /AKT-reitin Italian pienisoluista keuhkosyöpää liittyy korkealaatuista (G3-G4 verrattuna G1-G2; n = 83; p 0,05) ja kehittyneempää tautien (TNM-luokitus III vs. vaiheet I ja II ; n = 26; p 0,05). Lisäksi olemme havainneet, että PTEN menetys (41/104, 39%) ja yli-ilmentyminen p110α (27/92, 29%) ovat yleisin poikkeavuus havaittiin NSCLCs. Harvemmin molekyyli leesiot koostuvat yli-ilmentyminen AKT2 (18/83, 22%) tai AKT1 (17/96, 18%), ja KRAS mutaatio (7/63, 11%). Tuloksemme osoittavat, että kaikkien geenien, vain p110α yli-ilmentyminen oli merkittävästi liittyy AKT aktivaation NSCLCs (p = 0,02). Manipulointi p110α ilmentymisen keuhkosyöpäsoluissa kuljettaa aktiivisen PI3K alleelin (NCI-H460) tehokkaasti pienentää leviämisen NSCLC-solujen

in vitro

ja kasvaimen kasvu

in vivo

. Lopuksi, RNA: n profilointia keuhkojen epiteelisolujen (BEAS-2B), joka ilmaisee mutantti alleeli pIK3 (E545K) tunnistetaan verkon transkriptiotekijöiden, kuten MYC, FOS ja HMGA1, ei ole aiemmin kirjattu liittyvän poikkeava PI3K signalointia keuhkosyöpä.

Citation: Scrima M, De Marco C, Fabiani F, Franco R, Pirozzi G, Rocco G, et al. (2012) Signaling Networks Associated kanssa AKT Aktivointi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC): New Insights merkityksestä Phosphatydil-inositoli-3-kinaasi. PLoS ONE 7 (2): e30427. doi: 10,1371 /journal.pone.0030427

Editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerchen (CNR), Italia

vastaanotettu: 25 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 16 joulukuu 2011; Julkaistu: 17 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Scrima et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC) ja GV ja AW ja Euroopan unionin (IP: CRESCENDO, sopimus n.er LSHM-CT-2005-018652), Ministero dell’Università e della Ricerca (PRIN, Grant n.er 2008CJ4SYW_004) AW Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti [1], [2]. Epiteelin keuhkosyöpä luokitellaan kahteen pääryhmään: pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) (noin 15% kaikista keuhkosyövässä) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) (noin 85% kaikista keuhkosyövässä) [3] . NSCLC käsittää squamous-cell carcinoma (SCC), adenokarsinooma (ADC), ja suuret keuhkosyöpä (LCC) [3]. Edistysaskelista huolimatta varhainen havaitseminen ja tavallinen hoito, NSCLC diagnosoidaan usein edennyt pitkälle ja potilaiden on usein huono ennuste, jossa on viiden vuoden eloonjäämisaste alle 15% [4], [5]. Tästä syystä ymmärrettäisiin paremmin molekyyli alkuperää taudin se auttaa parantamaan terapeuttisen hoidon keuhkosyöpäpotilaiden.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) signalointiryöpyn usein overactivated ihmisen syöpä [6] – [8] niillä on keskeinen merkitys sekä taudin alkamisen ja etenemisen NSCLC [9], [10]. PI3K koulutusjakso säätelee solujen toimintoja, kuten lisääntymistä, eloonjääntiä, liikkuvuuteen ja angiogeneesin, jotka ovat kriittisiä kasvuun ja /tai ylläpito kasvainten [11], [12]. Loppupiste on PI3K reitti on AKT, seriini /treoniini proteiinikinaasi, joka välittää useimmat signaalit funneled kautta PI3K koulutusjakso. AKT aktivoidaan värväyksen solukalvon kautta sitoutuminen sen PH domain 3′- fosforyloidun fosfatidyylinositoleja syntyy PI3K ja myöhemmät fosforylaation T308 ja S473 [12], [13]. Toisaalta, lipidi fosfataasi PTEN vaimentaa AKT aktivointi defosforyloimaan 3-asemassa fosfatidyyli [14].

Poikkeava AKT aktivointi vaikuttaa keuhkojen karsinogeneesi [9], [10]. Hyperactivation AKT: havaitaan useimmissa NSCLC solulinjoissa [15] – [17] ja 30-75% NSCLCs [18] – [22] ja edistää resistenssin kemoterapiaa ja sädehoitoa [16]. AKT aktivointi syövän parhaillaan arvioidaan käyttäen fosfospesifisiä vasta-aineiden S473 immunohistokemiallisessa analyyseissä kasvaimen yksilöitä. Vaikka fosforylaatiota AKT at S473 on korreloinut huono kliinisiä tuloksia monissa kasvaintyypit, tuloksia keuhkosyöpä ovat ilmeisesti ristiriidassa [7] – [10] jotka on liittynyt joko huono tai hyvä ennusteeseen [20] – [22]. AKT voidaan aktivoida useita mekanismeja, jotka johtuvat erillisiä ja usein toisensa poissulkevia tapahtumia, jotka sisältävät aktivoivat mutaatiot (KRAS, PIK3CA tai AKT1), lisääntyneen ekspression (PIK3CA, AKT1, AKT2) tai menetykseen PTEN [10]. Kuitenkin suhteellinen osuus yksittäisten komponenttien sisällä PI3K polku AKT aktivaation NSCLCs on vielä epäselvä. Tässä käsikirjoituksen olemme tutkineet suhde geneettisiä muutoksia läsnä näiden geenien ja aktivointi AKT NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Patient karttuminen oli mukaisesti toteutettiin sisäisen Review Board of INT Fondazione Pascale (Napoli, Italia) (CEI 556/10 of 12.03.2010). Tutkimuksen hyväksyi sisäisen Review Board on AOU Mater Domini /University Magna Graecia (Catanzaro, Italia) kokoukseen 16/3/2011. Kirjallinen suostumus saatiin kaikkia osallistujia tutkimukseen. Kaikki eläin työ tehtiin mukaan asiaa Italian suuntaviivat ja hyväksyi sisäisen komitean Animal Study (CESA) Institute for Genetic Research ”Gaetano Salvatore 7. huhtikuuta

th 2008 (CESA 10-08).

potilaat

Arkistomateriaalia 107 potilasta diagnosoitu NSCLC [3] saatiin INT Fondazione Pascale (Napoli, Italia). Mediaani-ikä oli 64 vuotta vanha (alue 28-82). Potilailla, joilla kliiniset tiedot, naiset olivat 18 ja miehiä 83. Stage tunnettiin 81 potilasta: 67 potilaalla oli vaihe I-II tauti ja 14 oli vaiheen III-IV sairaus. Grade tunnettiin 83 potilaalla: 35 tapausta olivat G1-G2 ja 48 olivat G3-G4. Katso taulukko S1, Taulukko S2 ja Taulukko S3 tarkempia kliinisiä ominaisuuksia kaikille potilaille.

TMA dioja poistettiin parafiini, kuumennettiin painekeitin 1 mM EDTA, pH 8,0 10 minuutin ajan, ja inkuboitiin pepsiinillä 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Levyjä pidettiin sitten dehydratoidaan lisäämällä etanolia pitoisuuksina, ja sitten kuivataan ilmassa. Koettimet denaturoitiin 96 ° C: ssa 5 minuutin ajan, ja hybridisaatio liuos levitettiin kukin dia ja inkuboitiin 75 ° C: ssa 1 min. Yön yli inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa kosteassa kammiossa, levyt pestiin 0,4 x SSC: ssä ja 0,3% NP40: tä 2 minuutin ajan 75 ° C: ssa, ilmakuivattiin pimeydessä, vastavärjättiin DAPI, ja peitelasi on sovellettu.

Tissue Microarray (TMA) ja immunohistokemia

TMA rakennettiin yhteistyössä yksikkö immunovärjäys Centro Nacional de Investigaciones Oncologicas (Madrid, Espanja) menetelmien mukaisesti [23] käyttäen Tissue ryhmittäjällä ( Beecher Instruments, Gene Micro-Array Technologies, Silver Spring, MD). Immunovärjäys suoritettiin käyttämällä avidiini-biotiini-peroksidaasi-menetelmä (LSAB kit, DAKO, Glostrup, Tanska), kuten aiemmin on kuvattu [24]. Vasta-aineita käytetään immuunivärjäysmenetelmällä valittiin mukaan aiemmin julkaistu työ [25] – [29]. Anti-pS473 (# 9277), anti-AKT1 (# 2938), anti-AKT2 (# 4057), anti-PIK3CA (# 4249), anti- PTEN (# 9559) olivat kaikki peräisin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA).

anti-Akt1 ja anti-Akt2 on osoitettu olevan isomuodon-spesifisten vasta-aineiden aikaisemman työn [25]. Lisäksi käyttämällä NCI-H460-soluissa haittasi Akt1: lle tai Akt2 vastaavasti me vahvisti, että anti-Akt1 vasta-aine tunnistaa vain Akt1- isoformia ja anti-Akt2 vasta-aine tunnistaa vain Akt2 isoformin (kuvio S1A).

Immuunihistokemialliset pisteet Pakt ja PTEN käytetään tässä työssä valittiin pohjalta laajalti asetetut kriteerit nykyisten kirjallisuudessa [28], [30], [31]: Pakt pisteytettiin positiiviseksi, kun 10% kasvainsolut olivat positiivisia voimakkaiden tai moniin immunopositivity. PTEN ilmentyminen oli luokiteltu (+), kun värjäys havaittiin 50% soluista, (+/-), kun värjäys havaittiin 25-50% soluista ja (-), kun värjäys havaittiin 0-25% soluja. Tilastollista analyysiä PTEN ilmaisua pidettiin kadonnut, kun näytteet luokiteltiin (-).

Myös Immunovärjäyksen tulokset AKT1, AKT2 ja PIK3CA, valitsimme kuvatut kriteerit aiemmissa raporteissa [27], [28], [32]. Kasvaimen näytteet jaettiin neljään ryhmään sen mukaan, positiivisten solujen prosenttiosuuden: (-) koostuvat kokonaan negatiivisia näytteitä; (+) Käsitti näytteitä jopa 10% positiivisia soluja; (++) Käsitti näytteiden 11-50% on positiivisia soluja; ja (+++) käsitti näytteiden 50% positiivisia soluja, tässä järjestyksessä. Tilastollisista syistä kasvaimet luokiteltiin alhaisen ilmentymisen ryhmässä, joka sisältää (-) ja (+) ja korkean ilmaisun ryhmä, joka käsittää (++) ja (+++).

Jokaiselle immunohistokemiallinen ympäri negatiivinen kontrolli on sisällytetty, korvaamalla primaarisen vasta-aineen kanssa liuottimessa samalla tilavuudella, että ensisijainen vasta-aine suspendoitiin siihen. Kaikki säätimet antoi tyydyttäviä tuloksia. Stained TMA kohdat arvioitiin kahdella asiantuntija patologit (RF, GB) käyttämällä yhtenäisiä perusteita. Poikkeamia ratkaistaan ​​samanaikaisesti tarkastus ja tulosten tarkastelu. Eroavuudet kaksi ydintä samasta asia oli ratkaistava yhteisen analyysin kaksi ydintä.

Fluoresenssi in situ hybridisaatio (FISH) B

FISH-analyysi suoritettiin TMA. BAC-klooneja suunniteltu mukaan Ensembl tietokantaan (www.ensembl.org). BAC-klooneja, jotka kattavat AKT1 geeni oli RP11-982M15, RP11-477I4 ja RP11-556J09. Ohjaus BAC koettimia, jotka kattavat kromosomin alueella 14q11 oli RP11-324B11. BAC-klooneja, jotka kattavat AKT2 geeni oli RP11-36B02, RP11-688J23, RP11-725P04. Ohjaus BAC-koettimia, jotka kattavat kromosomin alueen 19p13.1 olivat RP11-737I1, RP11-520G3. BAC-klooneja, jotka kattavat PIK3CA geeni oli RP11-360P21 ja RP11-245C23. Ohjaus BAC koettimia, jotka kattavat kromosomin alueen 3p14.1 olivat RP11-175F9 ja RP11-15B21. Kaikki BAC-kloonit leimattiin dUTP-Sprectrum Orange (Vysis Inc., DownersGrove, IL, USA). Kaikki Ohjaus koettimet leimattiin dUTP-Sprectrum Green (Vysis Inc., DownersGrove, IL, USA).

Kaksi erilaista tutkijoille, että ei ollut aikaisempaa tietoa geneettisestä, kliiniset ja IHC tuloksia arvioidaan FISH-analyysillä. Kaikki FISH pisteytettiin vuonna keskimäärin 130 (60-210) ytimet.

arviointia varten kopioluvun geenien koodaavat AKT1, AKT2 ja PIK3CA, geeni-to-ohjaus suhde 1.0 luokiteltiin disomia ; suhdelukua 1,0 ja 2,0 katsottiin geeni matalan tason voitot; suhteet 2,0 pidettiin korkealla polysomy ja /tai geenin monistaminen [33], [34].

Näin kasvaimet jaetaan eri luokkiin: disomia, trisomia (3 kopiota kromosomia 40% solujen), matala polysomy (≥3 kopiot kromosomien 40% soluista), korkea polysomy (≥4 kopiot kromosomia ≥40% soluista), ja geenin monistaminen (läsnäolo geeniryppäät suhteella geenin to-kromosomi ≥2 solua kohden ≥40% soluista tai pienet tai nonenumerable klustereita geenin signaali). Tämän ansiosta luokittelua potilaiden kahteen ryhmään: FISH-negatiivinen (disomia ja voitot) ja FISH-positiivisia (korkea polysomy ja /tai geenin monistaminen).

PCR, RT-PCR ja

mutaation analyysi

Kokonais-RNA: n ja genomisen DNA: ta valmistettiin, kuten on kuvattu [35], [36]. Q-RT-PCR ja Q-PCR suoritettiin käyttämällä Power SYBR Green PCR Master Mix ABI Prism 7300 lämpösyklilaitteessa (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). cDNA syntetisoitiin 1 ug kokonais-RNA: sta käyttämällä QuantiTect Reverse Trascription (Qiagen, Alankomaat, Venlo). Normalisointi tehtiin GAPDH mRNA sisältöä. Suhteellisia määriä mRNA: n tai DNA: n laskettiin vertaileva syklin kynnys (CT) menetelmää Livak ja Schmittgen [37]. Mutation analyysi PIK3CA käyttäen LightCycler suoritettiin DNA Master /Hybridisaatiokoettimet kit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Saksa). Suora sekvensointi suoritettiin käyttämällä BigDye v3.03 syklisekvensointireagenssipakkausta (Applied Biosystems), joka kapillaari automaattisen sekvensserin (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer; Applied Biosystems). Protokollia ja alukkeita Q-PCR, Q-RT-PCR ja sekvensointi KRAS (eksonit 2 ja 3) ja PIK3CA (eksonit 9 ja 20) raportoidaan lisäyksessä S1.

Vasta-aineet ja Western Blot

Western blot analyysi suoritettiin standardimenetelmillä [38]. Koko solu-uutteet valmistettiin homogenoimalla solut NP-40-hajotuspuskuria (10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP-40), joka sisältää proteaasi-inhibiittoreita. Lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla ja proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla. Vasta-aineita käytettiin Cell Signaling Technology: anti-AKT1 (# 2938); anti-S473 (# 9277), anti-PIK3CA (# 4249).

Solulinjat

NCI-H460 hankittiin ATCC-LGC Promochem (South West London, UK) ja ylläpidetään RPMI1640 (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia ja 100 U /ml penisilliiniä-streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). BEAS-2B-solut ostettiin Cambrex (Milano, Italia) ja kasvatettiin kuten valmistaja ehdottaa [39].

Virus sukupolvi ja Infection

Tuottaa p110α koodaus lentivirus koodaava cDNA ihmisen p110α (Addgene, Cambridge, MA, USA) kloonattiin pENTR1A vektoriin (Invitrogen) ja rekombinoituvat pLenti6.2 /C-Lumio ™ /V5-DEST Vector hyödyntämällä Gateway Technology (Invitrogen). Plenti vektoria käytettiin tuottamaan lentivirus- partikkeleita HEK293T pakkaus soluissa, kuten on kuvattu [40]. Transdusoidut BEAS-2B-soluja tehtiin kolme kierrosta infektion ja valittiin väliaineessa, joka sisälsi 5 ug /ml blastisidiinia (Invitrogen). Human PIK3CA (NM_006218), AKT1 (NM_005163) ja AKT2 (NM_001626) MISSION shRNA set (Sigma-Aldrich, St.Luis, MO) ja Mission muiden kuin kohde-ohjaus transduktion viruksia (SHC002V) käytettiin tuottamaan lentiviraalinen hiukkasia HEK293T- pakkaus soluihin [40]. Transfektion jälkeen supernatantit kerättiin 8 tunnin välein, suodatetaan ja käytetään kolme kierrosta transduktion NCI-H460-soluissa, kun läsnä oli 8 ug /ml polybreeniä (Sigma).

In vitro-proliferaatiokoe

Solut lisäkasvua tutkittiin MTT [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia; Sigma] vähentäminen. Solut maljattiin 96-kuoppaisille, tasapohjaisille mikrotiitterilevyille (200 ui solususpensiot, 2 x 10

3 /kuoppa NCI-H460), ja inkuboitiin MTT alustan (5 mg /ml) 4 tuntia. 24 tunnin välein, elatusaine poistettiin ja vedetöntä 2-propanolia lisättiin. Optinen tiheys mitattiin 570 nm: ssä.

kasvaimia määrityksissä

Solut (1 x 10

6) suspendoitiin 100 ml: aan 10% FBS: ää ja 100 ml: Matrigel (BD Biosciences, NJ , USA) ja ihon alle ruiskutetaan oikeaan kylkeen 6-viikon ikäisiä kateenkorvattomia nude-hiiriä (Charles River, Länsi-Saksa) kolmena kappaleena. 7 päivän välein kasvaimen koko mitattiin paksuus.

RNA profilointi analyysi

RNA-pitoisuus määritettiin kanssa Nanodrop (NanoDrop, Wilmington, Delaware, USA) spektrofotometrillä ja sen laatu arvioitiin kanssa Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Milano, Italia). Jokaisesta näytteestä, 500 ng kokonais-RNA: ta syntetisoitiin biotinyloitiin cRNA käyttäen Illumina RNA Amplification Kit (Ambion, Inc., Austin, TX). Synteesi suoritettiin valmistajan ohjeiden. cRNA pitoisuus ja laatu arvioitiin, kuten on kuvattu edellä. Kustakin näytteestä, tekninen rinnakkaisnäytteiden tuotettiin ja 750 ng cRNA hybridisoitiin 18 tunnin Human HT-12_V3_0_R1 Expression BeadChips (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) protokollan mukaisesti valmistajan antamia. Hybridisoituun sirut pestiin ja värjättiin streptavidiini-konjugoitua Cy3 (GE Healthcare Milano, Italia). BeadChips kuivattiin ja skannattu kanssa Illumina BeadArray Reader (Illumina Inc.).

mikrosirut data-analyysi: RNA profilointia, geenien karakterisointi, rikastettu polkuja ja bibliografiset verkkojen löytö

Expression tiedostoja normalisoituivat ja analysoitu GeneSpring 10,1 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Ilmentyvät differentiaalisesti (DEGS) geenien välinen BEAS-2B ja BEAS-PI3K-CA solut valittiin sen perusteella, että kertamuutos (suhde ekspressiotasot kahden olosuhteissa) ja tilastollisen merkitsevyyden. Me suodatettu luettelot käyttäen kertaiseksi muuttaa 1.5 ja T-testi (

p

-arvo (0,01) kuin kynnys. DEGS lista (säveltänyt 2126 probesets) käytettiin arvioimaan funktionaalisen käyttäytymisen kannalta biologisten prosessien ja Molecular Function, Development Function and Disease and Disorder ehdot. Rikastumisaste arvioitiin tilastollisesti onko havaitun tason merkintä ryhmälle geenejä on merkittävä. erityisesti kullekin termille,

q

– arvo laskettiin mukaan Hypergeometrisen testi (

p

≤0.05) ja korjattu käyttämällä False Discovery Rate (FDR) [41]. termit kanssa

q

-arvon ylittävä merkitys kynnyksen sitten valittuna edustajana. Pathway ja verkko analyysi suoritettiin käyttäen Ingenuity Pathway Analysis (IPA, kekseliäisyyttä Systems).

aineisto oli louhittu merkittäviä väyliä kanssa IPA kirjaston kanoninen polkuja, ja verkostoja synnytettiin käyttäen IPA graafinen esitys molekyylien väliset suhteet geenien ja geenituotteiden. Merkitys yhdistyksen välillä luettelo DEGS ja Canonical Pathway mitattiin käyttämällä Fisherin testiä laskea

p

-arvo (

p

≤0.05). Fisherin testitulokset oikaistiin myös useita testejä käyttäen FDR.

verkoissa, tai geenituotteiden ovat edustettuina solmuja, ja biologisen suhde kahden solmun on edustettuna reunan (viiva). Kaikki reunat tukevat ainakin yhden viite kirjallisuudesta, oppikirjasta, tai kanoninen tallennetut tiedot IPA Knowledge Base. Ihmisen, hiiren ja rotan ortologeja geenin tallennetaan erillisinä, mutta esittää yhtenä verkon solmuun. Verkoston Rakennuksen algoritmi määrittää tilastollinen pisteet kullekin verkkoon. Tämä tapahtuu vertaamalla määrä painopiste geenejä, jotka edistävät tietyn verkon suhteessa kokonaismäärään esiintymien näiden geenien kaikissa verkoissa tai reittejä tallennettu IPA Knowledge Base. Intensiteetti geenien (solmu) väri verkoissa ilmaisee aste downregulation (vihreä) tai säätelyä (punainen) geenien ilmentymisen. Solmut näytetään käyttäen erilaisia ​​muotoja, jotka edustavat toiminnalliseen luokkaan geenituotteiden.

Tulokset

AKT aktivaatio NSCLCs

Koska luku pois PI3K /AKT signalointia NSCLC määritimme fosforylaatiota asemaa jäämän S473 of AKT1 (Pakt). Pakt arvioitiin TMA sisältävien monistaa ydin koepaloja 107 NSCLCs. Kontrolleina 45 vastaaviin normaaleihin näytteitä käytettiin. Potilaiden kliinis-patologisia ominaisuudet on kuvattu Materiaalit ja menetelmät sekä yhteenveto taulukoissa S1, S2 ja S3. Saadut tulokset Pakt värjäytymistä NSCLC on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. Pakt värjäytyminen oli tuskin havaittavissa epiteelisolujen normaalista keuhkorakkuloiden epiteelin ja ylähengitysteiden (39 out of 45 näytettä) (Katso kuva S1). Sen sijaan, AKT aktivaatio havaittiin 60 ulos 97 NSCLC analysoitu (taulukko 1). Positiivinen Pakt värjäytyminen oli merkittävästi korkeampi karsinoomanäytteistä kuin joko normaali alveolaarinen tai keuhkoputken epiteelin (P 0,001; Chi square testi). Pakt värjäytyminen havaittiin 23/37 SCC ja 30/44 ADC (kuva 1A ja B, vastaavasti). Löysimme Merkitsevä yhteys Pakt värjäystä ja luokka tai vaiheessa tauti (taulukko 2): Pakt värjäys oli merkittävästi enemmän edustettuna potilaalla on laadut G3-G4 verrattuna potilaisiin, joilla laadut G1-G2 (p 0,05) ja potilaalla on TNM III verrattuna potilaisiin, vaiheen II tauti (p 0,05). Katso taulukot S4 ja S5 jakeluun potilaita SCC ja ADC. Nämä tulokset osoittavat, että yhteisymmärryksessä työssä muulla väestöllä, italiaksi pienisoluista keuhkosyöpää AKT aktivoituminen tapahtuu kasvainkudoksessa ja korreloi pitemmälle taudin [20] – [22]. Katso myös taulukko S9 ja S10 on yksityiskohtainen, potilas-by-potilas, luettelo Pakt positiivisuus.

, vasen: SCC negatiivisia Pakt fosforylaatioon; oikea: SCC positiivinen pS473 fosforylaatiota. B, vasen: ADC negatiivisia Pakt fosforylaatioon; oikea: ADC positiivinen pS473 fosforylaatiota. Suurennus 10 x 40 x, ​​vastaavasti.

mekanismit AKT aktivaation NSCLCs: immunohistokemia

Tutkiakseen molekyylitason mekanismit johtavat AKT aktivaation Italian potilailla vaikuttaa NSCLC suoritimme kattavan analyysin ilmentymisen ja /tai geneettisen tilan AKT1 ja AKT2 ja niiden lähimpien sääntelyviranomaisten (KRAS, PIK3CA ja PTEN). Niistä 107 tapauksessa läsnä TMA 96 voitaisiin kunnolla analysoida AKT1, 83 AKT2, 104 PTEN ja 92 varten PIK3CA.

Katso Materiaalit ja Menetelmät arviointikriteereinä AKT1. Lyhyesti, näytteet määritelty (-) olivat täysin negatiivisia AKT1; Näytteet on määritelty (+) sisälsi jopa 10% positiivisia soluja; Näytteet on määritelty, (++) käsitti 11-50% positiivisten solujen Näytteet on määritelty (+++) käsitti 50% positiivisia soluja, tässä järjestyksessä. Kuvassa S2 esitetään edustavat värjäykset of (+), (++) tai (+++) AKT1 ilmaisun SCC ja ADC. Kasvaimet luokiteltiin alhaisen ilmentymisen ryhmässä, joka sisältää (-) ja (+) ja korkean ilmaisun ryhmä, joka käsittää (++) ja (+++). Analyysi TMA 258,1 ja 258,2 osoitti AKT1 oli yli-ilmentynyt 17/96 NSCLC tapauksissa (~19%) (kuvio 2), jossa SCC ja ADC osoittavat samanlaisia ​​tuloksia: 7/37 AKT1 kasvaimia olivat SCC (19%) ja 7/44 AKT1 positiivisia kasvaimia ADC (16%). Katso kuva 2A ja B, vastaavasti. Yhdeksän 15 (60%) NSCLCs yli-ilmentävät AKT1 osoitti AKT aktivointia (taulukko 3).

, vasen: SCC negatiivisia AKT1 ilmaisun; oikea: SCC positiivinen AKT1 ilmaisua. B, vasen: ADC negatiivisia AKT1 ilmaisun; oikea: ADC positiivinen AKT1 ilmaisua. Suurennus 10 x 40 x, ​​vastaavasti. C. Dual-color fluoresenssi in situ -hybridisaatioanalyysi AKT1 geenin kopioluku. FISH-analyysi AKT1 (punainen signaalit) ja sentromeeriantigeenin kromosomin 14 (vihreä signaaleja). Vasen, NSCLC näytteen diploidisoluissa; oikea, NSCLC näyte useita ryhmittyneet täplät punainen signaalien AKT1 2 sentromeeriantigeenin signaaleja (geenimonistuman). Alkuperäinen suurennus 100 ×.

Sitten analysoimme ilmaus AKT2 in NSCLCs. Katso materiaalit ja menetelmät arviointia varten AKT2 värjäystä. Näytteet on määritelty (-) olivat täysin negatiivisia AKT2; Näytteet määritetty (+) oli jopa 10% positiivisia soluja; Näytteet on määritelty, (++) käsitti 11-50% positiivisten solujen ja näytteet on määritelty (+++) käsitti 50% positiivisia soluja, tässä järjestyksessä. Kuvio S3 esitetään edustavat värjäykset of (+), (++) tai (+++) AKT2 ilmaisun SCC ja ADC. Kasvaimet luokiteltiin alhaisen ilmentymisen ryhmässä, joka sisältää (-) ja (+) ja korkean ilmaisun ryhmä, joka käsittää (++) ja (+++). AKT2 yliekspressoitiin 18/83 NSCLCs (~22%) (kuvio 3). Klo ero AKT1, AKT2 yliekspressio havaittiin useammin SCC (10/31 SCC, 32%, 4/33 ADC, 12%). Katso kuva 3A ja B, vastaavasti. Lisäksi useimmat AKT2 kasvaimia (12/17, 71%) osoitti AKT aktivointi (taulukko 3).

, vasen: SCC negatiivisia AKT2 ilmaisun; oikea: SCC positiivinen AKT2 ilmaisua. B, vasen: ADC negatiivisia AKT2 ilmaisun; oikea: ADC positiivinen AKT2 ilmaisua. Suurennus 10 x 40 x, ​​vastaavasti. C. Dual-color fluoresenssi in situ -hybridisaatioanalyysi AKT2 geenin kopioluku. FISH-analyysi AKT2 (punainen signaalit) ja kromosomi alue 19p13.1 (vihreä signaaleja). Vasen, NSCLC näytteen diploidisoluissa; oikea, NSCLC näyte useita ryhmittyneet täplät punainen signaalien AKT2 2 kromosomi alueen 19p13.1 signaaleja (geenimonistuman). Alkuperäinen suurennus 100 ×.

Potilaat kertynyt tähän tutkimukseen oli jo karakterisoitu PTEN ilmaisun [38]: täydellinen menetys tapahtui 41 104 (39%) NSCLCs ja osittainen alassäätöä havaittiin 41 lisätapauksia. PTEN menetys oli useammin havaittiin SCC (22/40, 55%) kuin ADC (14/51, 27%) (Katso kuva S5). Kuitenkin, kun korreloi AKT aktivointi, menetys tai vähentäminen tasojen PTEN-proteiinin ei liittynyt AKT aktivointia (n = 95; p = 0,832) (taulukko 3).

Lopuksi olemme analysoineet ilmaus katalyyttisen alayksikön PI3K, p110α. Arvosteluperusteet ilmoitetaan Materiaalit ja menetelmät. Näytteet on määritelty (-) olivat täysin negatiivisia p110α; Näytteet on määritelty (+) sisälsi jopa 10% p110α positiivisia soluja; Näytteet on määritelty, (++) käsitti 11-50% of p110α positiivisia soluja; ja näytteet on määritelty (+++) käsitti 50% p110α positiivisia soluja. Kuva S4 esitetään edustavat värjäykset of (+), (++) tai (+++) AKT1 ilmaisun SCC ja ADC. Kasvaimet luokiteltiin alhaisen ilmentymisen ryhmässä, joka sisältää (-) ja (+) ja korkean ilmaisun ryhmä, joka käsittää (++) ja (+++). Havaitsimme p110α yli-ilmentymisen ~29% of NSCLCs (27/92): 12 ulos 34 oli SCC (35%) ja 12 ulos 43 oli ADC (28%) (kuvio 4A ja 4B). Klo ero muihin geenien sisällä polku, joka on analysoitu, huomasimme, että NSCLCs kanssa ilmentynyt p110α esitellään merkittävästi aktivoitu AKT (18 ulos 26; p = 0,02) (taulukko 3).

, vasen: SCC negatiivisia PIK3CA ilmaisun; oikea: SCC positiivinen PIK3CA ilmaisua. B, vasen: ADC negatiivisia PIK3CA ilmaisun; oikea: ADC positiivinen PI3KCA ilmaisua. Suurennus 10 x 40 x, ​​vastaavasti. C. Dual-color fluoresenssi in situ -hybridisaatioanalyysi PIK3CA geenin kopioluku. FISH-analyysi PIK3CA (punainen signaalit) ja kromosomi alue 3p14.1 (vihreä signaaleja). Vasen, NSCLC näytteen diploidisoluissa; oikea, NSCLC näyte useita ryhmittyneet täplät punainen signaalien PIK3CA 2 kromosomi alueen 3p14.1 signaaleja (geenimonistuman). Alkuperäinen suurennus 100 ×.

On huomattava, yhdennetyn analyysin TMA huomasimme, että AKT aktivaatio havaittiin useammin kasvaimissa osoittaa poikkeava ilmentymä enemmän kuin yhden geenin sisällä PI3K koulutusjakso (PTEN menetys tai yliekspressio AKT1, AKT2, p110α vastaavasti). Itse asiassa, AKT aktivaatio havaittiin 15-64% kasvainten osoittaa poikkeavuus yhden geenin, 44-89% kasvainten poikkeavan ilmentymisen kahta geeniä, 67-100% kasvainten poikkeavan ilmentymisen kolme geeniä ja 100% kasvainten poikkeava ilme kaikista neljästä geenistä. Toisaalta poikkeava ilmentymä jäsenten PI3K koulutusjakson harvinaisempi kasvaimissa osoittaa aktivoitumatta AKT signalointi (katso taulukko 4).

mekanismit proteiinin yli-ilmentymisen: FISH-analyysi

FISH analyysi NSCLCs suoritettiin AKT1, AKT2 ja PIK3CA määrittää molekyylitason mekanismeja yli-ilmentyminen vastaavan proteiineja. Katso materiaalit ja menetelmät luokittelun kasvainten FISH. Löysimme 20/82 NSCLC (24%) ja kopioi numero voitto AKT1 geenin kromosomissa 14, joista 16 oli korkean polysomy ( 4 kpl) ja 4 polttovälin vahvistusta (SCC-11, SCC-12, SCC-14 ja SCC-21) (kuvio 2C). Odotetusti, useat AKT1 FISH-positiivisia NSCLCs (12 ulos 20 tapausta, 60%) osoitti kohtalainen tai suuri AKT1 ilme. Katso taulukot S9 ja S10 on yksityiskohtainen luettelo geneettisiä muutoksia havaittiin yhden SCC ja ADC potilaita. Kun kyseessä on AKT2, havaitsimme 24/73 NSCLCs (31%), jossa kopioluvun vahvistus geenin kromosomissa 19, joista 23 potilasta oli korkea polysomy ja 1 potilaalla oli polttoväli vahvistusta (SCC-11). Katso kuva 3C, jotka toimivat edustavana esimerkkinä. Kuitenkin merkitys AKT2 amplifikaation keuhkosyöpä on edelleen epäselvä, koska 13/24 (54%) tapauksista AKT2 FISH-positiivisia kasvaimia ei näytä lisääntyneen ekspression vastaavan proteiinin.

FISH-analyysi kromosomi 3q26. 32 koettimia paljasti lisääntyminen PIK3CA geenin kopioluku 19 tapauksessa (noin 26%), jotka kaikki esitetään korkea polysomy, 7 tapauksissa osoittaa myös polttovälin vahvistusta (ADC-5, SCC-4, SCC-14, SCC-16, SCC-19, SCC-30, SCC-34) (kuvio 4C). Suurin osa NSCLCs lisääntynyt kopiomäärä PIK3CA (13 ulos 19 tapausta, 68%) osoitti, kohtalainen tai suuri ilmentymisen p110α.

Kuitenkin kaikki FISH-positiivisia NSCLCs johti aktivaatioon AKT-signalointia. Kuten taulukoissa S6, S7 ja S8, 11/18, 10/19 ja 14/23, joista olisi FISH-positiivisia PIK3CA, AKT1 ja AKT2 johtivat positiivinen Pakt, vastaavasti.

mekanismit AKT aktivointi : mutaatio analyysi PIK3CA ja KRAS

Potilaat kertynyt tähän tutkimukseen oli jo analysoitu AKT1 mutaatioita [24]. Potilaan SCC-29 esitetään somaattisen mutaation koodaavan geenin AKT1 tuloksena glutamiinihappoa ja lysiiniä substituution aminohapossa 17 (E17K) [24]. Kasvain tästä potilas oli kohonnut AKT ilmaisun ja toimintaa. Samoin missensemutaatioita vuonna PIK3CA on raportoitu harvoin [42] – [45]. Olemme löytäneet GAG1633 → AAG substituutio, joka johtaa aminohapposekvenssin muutokseen E545K yhden SCC (SCC-6) (kuvio 5A ja B). Toisaalta, 7 NSCLCs osoitti mutaatiot KRAS: G12A (GGT → GCT) (n = 1); G12C (GGT → TGT) (n = 4); G12V (GGT → GTT) (n = 1); G13C (GGC → TGC) (n = 1) (kuvio 5C). KRAS mutaatioita havaittiin pääasiassa ADC (6 32, 19%), kuten on kuvattu [46], [47]. Viidessä 7 tapauksissa mutaatiot KRAS osoitti merkittäviä AKT aktivointi (kuvio 5D).

. Mutaatio tunnistus eksoneissa 9 ja 20 PIK3CA peräisin NSCLC.