Krooninen sairaus

tiivistelmä

On hyvin tunnettua, että monet potilaat jatkavat polttaa savukkeita jälkeen diagnosoitu syöpä. Vaikka tupakoinnin lopettaminen on tyypillisesti olettaa olevan vähän terapeuttista arvoa syövän, kasvava määrä todisteita siitä, että jatkuva tupakointi liittyy alentunut hoidon tehokkuus ja suurempi ilmaantuvuus toistumisen. Siksi tutkittiin vaikutusta tupakansavun lauhde (CSC) lääkeherkkyyksistä että keuhkosyöpä ja pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja A549 ja UMSCC-10B. Tuloksemme osoittivat, että CSC lisäsi merkittävästi solujen ulosvirtausta doksorubisiinin ja mitoksantronia. Tähän liittyi membraanilokalisaatiota ja lisääntynyt ilmentyminen monille lääkkeille transporter ABCG2. Indusoitujen ulosvirtaus Doksorubisiinin oli päinvastainen lisättäessä erityisiä ABCG2 estäjä Fumitremorgin C, vahvistaa tehtävän ABCG2. Hoito CSC lisääntynyt pitoisuus fosforyloidun Akt, kun taas lisäys PI3K estäjän LY294002 tukossa doksorubisiini puristamiseen, mikä viittaa siihen, että Akt aktivoitumista tarvitaan CSC aiheuttama lääkevuoto-. Lisäksi CSC havaittiin resistenssiä doksorubisiinille määritettynä MTS määrityksiä. Tämä CSC aiheuttama doxurbicin vastus lievensi mekamyyliamiinia, joka on asetyylikoliinin nikotiinireseptorin estäjä, mikä viittaa siihen, että nikotiini on ainakin osittain vastuussa vaikutusta CSC. Lopuksi, CSC kasvattaneet puolella väestöstä (SP), joka on yhdistetty syöpään kantasolun fenotyyppi. Yhteenvetona CSC edistää chemoresistance kautta AKT-välitteinen säätely ABCG2 aktiivisuuden, ja ne voivat myös lisätä osuus syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja, edistää kasvaimen sietokykyä. Nämä löydökset korostavat tupakoinnin lopettamisen jälkeen diagnoosi syöpä, ja valaista edelleen tupakoinnin, jotka voivat olla haitallisia hoitoon.

Citation: an Y, Kiang A, Lopez JP, Kuo SZ, Yu MA , Abhold EL, et ai. (2012) Cigarette Smoke Edistää Drug Resistance ja laajeneminen Cancer Stem Cell-Like Side Väestö. PLoS ONE 7 (11): e47919. doi: 10,1371 /journal.pone.0047919

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 17 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 24 syyskuu 2012; Julkaistu: 5. marraskuuta 2012

Copyright: © 2012 An et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat puolustusministeriön (CDMRP) WO ja NCI /NIH 5 U01 CA114810-03 on JWR. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tupakointi on suurin riskitekijä pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), yhteiset maligniteetit jotka yhdessä vaikuttavat yli 150000 uutta potilasta Yhdysvalloissa vuosittain [1 ]. Kemiallinen analyysi osoittaa, että joukossa ~4800 yhdisteitä esiintyy tupakansavun lauhde (CSC), noin 100 mutageenista vaikutusta [2]. Runsas sisällä CSC ovat N-nitrosamiinien, kuten 4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridyyli) -1-butanonia (NKK), ja polyaromaattiset hiilivedyt, kuten bentso [α] pyreeni (B [α] P), mikä johtaa muodostumiseen DNA additiotuotteiden. Kaikkien uskotaan olevan merkittäviä tekijöitä tupakoinnin aiheuttamien karsinoomien [3]. CSC aiheuttama mutaatioita kriittisissä kasvaimeen synnyssä

p53 ja p16

tulos kasvainten synnyssä [4]. Biokemialliset tutkimukset ovat myös paljastaneet, että CSC voi aktivoida proinflammatoristen proteiini NF-KB yhdessä esikasvaintekijät kuten ERK1 /2, EGFR ja Akt [5], [6], [7], [8].

huolimatta tällaisia ​​vaikutuksia tupakansavun, on puute painotetaan tupakoinnin lopettamiseen aikana syövän hoidossa, koska on vallitseva, että hoitoon tupakan riippuvuutta ei juurikaan ole vaikutusta hoitotulokseen. Kuitenkin meneillään oleva tutkimus osoittaa, että jatkuva tupakointi seuraava diagnoosi voi rajoittaa hoidon tehoa ja lisäävät kuolleisuutta joidenkin syöpien. Hiljattain osoitettiin, että tupakointi aikana sädehoidon liittyi epäedullinen tulosten pään ja kaulan alueen syöpä [9]. Lisäksi jatkettiin tupakoinnin aikana Keuhkosyövän hoidossa johtaa suurempi ilmaantuvuus toistumisen, ja liittyy merkittävästi suurempi riski kuolleisuusriskiä [10], [11], [12]. Tupakoinnin lopettaminen jälkeen onnistuneen hoidon keuhkosyövän liittyi myös harvemmin toisen primäärisyövästä [12].

arveltu, että tupakansavun on suora rooli chemoresistance, jolloin heikentyneet hoitotuloksia. Lisäksi, korkeampi esiintyvyys pahenemisvaiheen, johon liittyi edelleen tupakointi voi olla osoitus syövän kantasolujen aktiivisuutta. Siksi kääntyi huomiomme ATP-sitova kasetti kuljettaja ABCG2 /BCRP1, jolla on tärkeä rooli lääkeresistenssin ja sitä on käytetty joissakin kudoksissa kantasoluja merkki. ABCG2 suo resistenssin kohti useita sytotoksisten lääkkeiden, kuten topetcan, bisantreeni, mitoksantroni, ja doksorubisiini, joista viimeinen on yleisesti käytetty hoitoon sekä HNSCC ja NSCLC [13], [14]. ABCG2 ilmentyminen on konservoitunut kantasolujen monenlaisia ​​alkuperää, ja se on myös molekyyli determinantti puolella väestöstä, solut, jotka osoittavat kohonneita ulosvirtaus Hoechst 33342 DNA: ta sitova väriaine [15]. On osoitettu, että ilmentyminen ABCG2 yhdistettynä CD133 ennustaa uusiutumisen vaiheessa 1 NSCLC [16]. Ruokatorven okasolusyöpä, ABCG2 ilmentyminen yksin liittyi epäedullinen ennusteet [17].

Yhteys jatkui tupakointi ja chemoresistance on epäselvä. Nikotiinin aiheuttaman säätelyä surviviinin ja XIAP voi suojata soluja kemoterapian aiheuttaman kuoleman [18], mutta ei tiedetä, onko tupakansavun voisi edistää chemoresistance moduloimalla lääkkeen kuljettajan toimintaa. Siksi pyrimme onko hoito CSC käytössä solujen

in vitro

lisäämiseksi ABCG2 ilmaisun ja toimintaa, ja onko tämä muutos johtaa tiiviimpään solujen elinkelpoisuuden läsnäollessa doksorubisiinin. Myös tutki CSC voisi laajentaa puolella väestöstä, joka on osoitettu olevan syöpää kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia [19]. Tulokset Tämän tutkimuksen auttaisi selventää rooli tupakan käytön syövän etenemiseen, mikä aiheuttaa lisää tehokasta hoitoa ja hoidon tupakointiin liittyvät karsinoomia.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja kemikaalit

Monoklonaalinen hiiren vasta-aine vastaan ​​ABCG2 hankittiin Chemicon International (Temecula, CA). ß-Actin hiiren monoklonaalinen vasta-aine saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Kanin p-Akt ja hiiren Akt vasta-aineet olivat peräisin Cell Signaling (Beverly, MA). PI3K-inhibiittori LY294002 hankittiin Calbiochem (San Diego, CA). Doksorubisiini saatiin Ortho Biotech (Bridgewater, NJ) ja tupakansavun lauhde saatiin Murty Pharmaceuticals (Lexington, KY).

Solulinjat ja Cell Culture

Ihmisen pään ja kaulan levyepiteelisyöpä karsinooma solulinja, UMSCC10B oli ystävällisesti toimittanut Dr. Thomas E. Carey (University of Michigan). Käytetään myös oli ei-pienisoluinen keuhkosyöpä A549, aloittama Giard et al [20]. Nämä solulinjat viljeltiin ja ylläpidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini streptomysiiniä.

Doksorubisiini hoito

lopullinen doksorubisiinin pitoisuus 2,5 ug /ml, käytettiin tässä tutkimuksessa . Soluja inkuboitiin doksorubisiinin 1 tunnin ajan 37 C: ssa ravistellen 15-20 minuutin välein. Sitten puristamiseen Näytteet laitettiin DMEM: 2% BSA: ssa 3 tunnin ajan 37degrees, jälleen ravisteltiin 15-20 minuutin välein. Ei-puristamiseen näytteet sijoitettiin Hanks puskuriin ja laitettiin jäihin aikana kestosta puristamiseen.

virtaussytometria analyysi Doxorubicin ulosvirtausaika.

virtaussytometrianalyysin doksorubisiinin ulosvirtaus suoritettiin aiemmassa tutkimuksessa [21]. Soluja inkuboitiin doksorubisiinin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, joka sisälsi 2% vasikan sikiön seerumia (FCS). Sen jälkeen solut pestiin Hanks ’Balanced Salt liuoksella ja suspendoitiin uudelleen doksorubisiini viljelyalusta. Sitten solut annetaan suulakepuristaa huumeiden 2,5 tuntia 37 C: ssa, lukuun ottamatta ei puristamiseen säätimiä pidettiin jäillä, ennen analyysia virtaussytometrialla. Kuolleet solut suljettiin pois samanaikaisella värjäys PI. Sekä Hoechst värjäys ja doksorubisiinin efflux analysoitiin fluoresenssi-solulajittelijaa (FACSvantage SE, BD Biosciences, San Jose, CA) CellQuest (Largo, FL) -ohjelmistoa. Ero prosenteissa doksorubisiinin ulosvirtaus oli calcualted seuraavalla kaavalla:% muutos = [(CSC

ei suulakepuhallettiin CSC

puristamalla) – (ohjaus

ei suulakepuhallettiin ohjaus

puristamalla)] /(Ohjaus

ei suulakepuhallettiin ohjaus

puristamalla) * 100. doksorubisiinin ulosvirtaus on määritelty käänteisesti liittyvän solu- fluoresenssi mitattiin FACS.

Western Blot analyysi

15 ug /ml tai 30 ug /ml CSC lisättiin soluihin 24 tuntia ennen lyysausta. Solut lyysattiin jäillä 10 minuutin ajan puskurilla (0,1 M Tris, 2% SDS, 20% glyserolia, ja proteaasi-inhibiittorin tabletit Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Elektroforeesilla käyttäen 10% NuPage Bis-Tris geeli erotetut proteiinit (20 ng per kuoppa), joka siirrettiin sitten PVDF-membraanille. Membraani blokattiin yhden tunnin ajan ja inkuboitiin yön yli primaarisen vasta-aineen laimennetaan 1:100 blokkausliuoksessa. Lisäämisen jälkeen vuohen sekundaarisen vasta-aineen hiiren vasta-ainetta (1:1000 laimennos blokkausliuoksessa), erityiset proteiinit visualisoitiin käyttäen SuperSignal West Pico Luminol (Pierce, Rockford, IL). Kaistaintensiteettejä kvantitoitiin densitometrillä käyttäen avoimen lähdekoodin ohjelmistoja ImageJ (http: //rsbweb.nih.govi/ij/) käyttäen menetelmää hahmoteltiin https://lukemiller.org/index.php/2010/11/analyzing- geelit-ja-western-blotit-with-image-j /.

MTS solunelinkykyisyysmääritys

MTS-määritys suoritettiin käyttämällä CellTiter 96 vesipitoista ei-radioaktiivista soluproleferaatiomäärityksessä (Promega, Madison , WI) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solut trypsinoitiin ja maljattiin 100 ui normaalin keski- tai CSC (15 ug /ml) -alustassa 96-kuopan formaatissa. Sen jälkeen, kun 24 tunnin inkuboinnin 37 ° C ja 5% CO

2, doksorubisiini lisättiin kuoppiin, mitä seurasi toinen 48 tunnin inkubaation jälkeen. Sitten 20 ui MTS-reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan, jota seuraa 4 tunnin inkubointijakson aikana. Levynlukijalaitteella käytettiin sitten tallentaa absorbanssia 490 nm: ssä.

Immunofluoresenssikoe

CSC lisättiin soluihin 24 ennen kiinnittämistä. Solut pestiin toive PBS ja sitten kiinnitettiin 4% paraformaldehydi. 10% normaalia vuohen seerumia käytettiin estoaine. Primääristä vasta-ainetta (laimennettu 1:100) lisättiin sitten yön yli kosteassa kammiossa. Toissijainen vasta-aineita (laimennettu 1:1000) Alexa Fluor 488 Molecular Probes (Carlsbad, CA) tai vuohen anti-hiiri-IgG Chemicon International (Temecula, CA) lisättiin myöhemmin tahra soluihin. Näytteet pestiin peräkkäin PBS: llä, H

2O, ja etanolia. Stained solut kiinnitettiin ja visualisoidaan konfokaalimikroskopialla.

Virtaussytometrianalyysi Hoechstin ulosvirtausaika (Side Väestö määritys) B

Solut värjättiin 5 ug /ml Hoechst 33342 (Sigma) 4 ml Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, joka sisälsi 2% naudan seerumin albumiinia (BSA) 37 ° C: ssa 90 min. Inkuboinnin jälkeen solut pestiin Hanks ’Balanced Salt liuosta ja inkuboitiin edelleen 15 ug /ml tai 30 ug /ml CSC 24 tuntia. Lisäksi 2 ug /ml propidiumjodidia (PI) lisättiin kuolleiden solujen syrjinnästä. Hoechst ulosvirtaus analysoitiin fluoresenssi-solulajittelijaa (FACSvantage SE, BD Biosciences, San Jose, CA) CellQuest (Largo, FL) -ohjelmistoa. Pinta-ala puolella väestöstä määritettiin käyttämällä erillistä näytettä (ei esitetty), joka Hoecsht ulosvirtaus ei CSC-käsitellyissä soluissa esti lääkeaineen verapamiili. Alueella, jolla solut häviävät hoidon verapamiilin määriteltiin alue, joka sisälsi oletetun puoli väestöstä, ja pidettiin vakiona kaikkien kolmen näytteen (kontrolli, 15 ug /ml, 30 ug /ml).

tulokset

CSC hoito kasvattaa doksorubisiinin ulosvirtaus kautta ABCG2

Voit selvittää CSC hoito voisi säädellä lääkeaineen transporter toimintaa, ensin mitataan muutokset doksorubisiini puristamiseen havaittu lisättäessä CSC. Annokset CSC (15 ug /ml, 30 ug /ml) valittiin perustuu käytettyjen annosten aiemmissa tutkimuksissa [22], [23], [24]. Solunsisäiset doksorubisiini-tasot määritettiin käyttämällä virtaussytometria mitata lääkkeen fluoresenssin yksittäisissä soluissa. Optimaalinen puristamiseen ajassa (2,5 tuntia) valittiin tasapainottamaan vaikutuksia sytotoksisuutta havaittavia muutoksia doksorubisiini ulosvirtausta. Jotta huomioon taustan fluoresenssin aiheuttamia CSC, erot mediaani fluoresenssin välillä puristamiseen näyte (säilytetään 37C) eikä puristamiseen näytettä (pidettiin jäillä) verrattiin eikä absoluuttisina fluoresenssin tasoa. Tulokset osoittivat, että CSC kasvoi doksorubisiini ulosvirtaus annoksesta riippuvalla tavalla (kuva 1a, b). Erityinen inhibiittoria ABCG2 harjoitetun liikenteen Fumitremorgin C (FTC), otettiin käyttöön solujen määrä tarkastella doksorubisiinin ulosvirtausta määrityksessä. Lisääminen FTC käänteinen vaikutus CSC, mikä viittaa siihen, että ABCG2 on kuljettaja vastaa CSC aiheuttama doksorubisiini ulosvirtausta. Tiedot esitetään tässä kuvassa edustavat vähintään kaksi toisistaan ​​riippumatonta tutkimuksissa.

(A) 15 ja 30 ug /ml tupakansavun lauhde (CSC) kasvaa doksorubisiinin ulosvirtaus molemmissa solulinjoissa 10B ja A549 on annoksesta riippuvainen kuvio. Erityinen ABCG2 estäjä fumitremorgin C (FTC) pystyy kääntämään CSC välittämää kasvu doksorubisiini ulosvirtausta. Prosentuaalinen muutos oli peräisin virtaussytometrianalyysin mediaani solunsisäisten doksorubisiinin tasoja ja laskea kaavalla kuvattuja menetelmiä osiossa. (B) CSC kasvattaa doksorubisiinin ulosvirtaus annosvasteisesti. Suhteellinen ulosvirtaus mitataan vertaamalla erot mediaani doksorubisiinin fluoresenssikanavan puristamiseen eikä puristamiseen näytteitä. Numeerinen etiketti heijastavat mediaani kanava doksorubisiinin fluoresenssia mitattuna yksi näyte virtaussytometrianalyysin solunsisäisten doksorubisiinin tasoa 10B. Vaikka täydellistä fluoresenssi tasot käsitellyissä näytteissä ovat korkeammat johtuen fluoresenssiin CSC, vähenemistä ei puristamiseen ekstruusiota on suurempi näissä näytteissä verrattuna kontrolliin.

CSC indusoi membraanilokalisaatiota ja ilmaus ABCG2

Vain ABCG2 lokalisoitu solukalvon voivat pumpata doksorubisiini. Voit tarkistaa, että CSC edistää lääkeresistenssi säätelemällä ABCG2 toimintaa varten, jolloin immunofluoresenssilla koe suoritettiin sen vaikutuksen määrittämiseksi CSC ABCG2 lokalisointi. Valokuvia verrataan kontrollisolujen CSC-käsitellyissä soluissa osoitti, että CSC lisäsi solukalvon pitoisuudet ABCG2 (kuvio 2a). Mielenkiintoista, sytoplasmaproteiinin tasot ABCG2 eivät olleet näkyvästi pienempi siirtämisen jälkeinen, mikä viittaa siihen, että CSC ehkä myös ylössäätelee yhteensä tasoja ABCG2. Todellakin, western-blottaus kokosolu-lysaattia paljasti, että CSC myös lisääntynyt koko ilmentymistä ABCG2 annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2b). ABCG2 ilmentyminen oli pienempi suurimman annoksen, todennäköisesti seurauksena CSC sytotoksisuuden. Immunofluoresenssimääritykset toistettiin myös ei-läpäiseviksi solujen jotta edelleen visualisoida translokaation ABCG2, koska vain proteiineja solun pinnalla otetaan värjätään tässä tapauksessa. Yhdenmukainen hypoteesia, ABCG2 värjäytyminen oli tuskin näkyvä ei-läpäiseviksi kontrollisoluja, mutta oli selvästi läsnä pinnalla CSC-käsiteltyjen solujen (kuvio 3). Valokuvat kuvassa edustavat vähintään kaksi toisistaan ​​riippumatonta tutkimuksissa.

(A) Immunofluoresenssimikroskopia tunnistaa solun lokalisaatio ABCG2 ja ilman CSC. Tulokset osoittavat, että CSC altistuminen aiheuttaa translokaatiota ABCG2 solukalvoon in 10B ja A549. (B) Western blot analyysi osoittaa annosriippuvainen lisääntyminen ABCG2 ilmentyminen vasteena CSC hoitoon.

Immunofluoresenssikoe toistettiin ei-läpäiseviksi solujen osoittamiseksi kasvu kalvo pitoisuuksien ABCG2. Tulokset osoittavat heikkoa värjäytymistä ABCG2 pinnalla ei-käsiteltyjä soluja, kun taas paljon vahvempi värjäytyminen havaittiin pinnalla CSC käsiteltyjä soluja.

CSC aiheuttama doksorubisiinin ulosvirtausta ja ABCG2 translokaation välittyvät PI3K /Akt signalointi

Olemme aiemmin osoittaneet, että Akt säätelee toiminta ABCG2 in HSNCC [25]. Siksi arveltu, että CSC edisti doksorubisiini ulosvirtaus aktivoitumisen Akt. Tämän hypoteesin testaamiseksi, me uudelleen analysoitu määrä doksorubisiinin ulosvirtaus läsnäollessa PI3K estäjän LY294002. Lisäämällä LY päinvastaiseksi CSC-indusoitu kasvu doksorubisiini ulosvirtaus (kuvio 4a). Western blot -analyysi paljasti, että CSC nostivat fosfo-Akt annoksesta riippuvasti (kuvio 4b). Kuten odotettua, lisäys PI3K estäjän LY294002 tukossa CSC aiheuttaman aktivaation Akt (kuvio 4c). Mielenkiintoista on, että hoito LY yksinään ei merkittävästi tason alentamiseksi ABCG2 kontrolliin verrattuna (kuvio 4c). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että PI3K /Akt on yksi tärkeimmistä mekanismeista säätelyyn ABCG2 toiminto, mutta ei voi olla kriittisesti mukana moduloinnissa ABCG2 ilme.

(A) PI3K estäjä LY294002 (LY) pienenee doksorubisiini ulosvirtaus solulinjoissa 10B ja A549. Arvot on johdettu virtaussytometria-analyysi intraceulluar doksorubisiinin tasoilla, ja lasketaan suhteessa ei-LY käsiteltyihin kontrolleihin. (B) Western blot -analyysi, joka esittää tasojen fosfo-Akt ja Akt annostus kasvaa CSC. (C) Western blot-analyysi osoittaa käänteinen Akt aktivointi käsittelemällä LY, ja ilmaus ABCG2 läsnäollessa LY.

CSC hoito kasvattaa mitoksantronilla ulosvirtaus

Jos CSC -välitteisen doksorubisiiniresistenssiä lopullisesti mukana ABCG2, niin CSC pitäisi myös pystyä suojaamaan muita ABCG2 alustoille. Näin ollen testasimme CSC voitaisiin lisätä myös solujen ulosvirtausta mitoksantroni, substraattia ABCG2 [26]. Vastaa meidän Ehdotetun mekanismin CSC lisäsi merkittävästi solujen ulosvirtausta mitoksantronin, vahvistaa osallistumista ABCG2 (kuva 5).

virtaussytometrianalyysin solunsisäisten mitoksantronia tasoilla paljastanut huomattavasti suurempia puristamiseen CSC-käsitellyissä soluissa. Arvot ovat prosentuaaliset erot verrattuna ei-käsiteltyjen näytteiden.

CSC hoito edistää solujen elinkelpoisuuden aikana doksorubisiinille valotuksen

Vaikka CSC selvästi aikaansaa suuremman lääkevuoto-, kysyimme, onko tämä käännetty havaittavan muutoksen lääkeresistenssin. MTS-määritys, joka mittaa elinkelpoisten solujen osuus, suoritettiin vertaamaan eloonjäämiskäyrät välillä ohjaus solujen ja CSC-käsitellyt solut, kun läsnä on kasvava doksorubisiinin (kuvio 6). Jotta huomioon eroja solujen lisääntymisen, kaikki absorbanssit arvot näytteessä oli jaettuna absorbanssilla niiden 0 uM doksorubisiini valvontaa. Tulokset osoittivat, että merkittävästi suurempi osuus CSC-käsiteltyjen solujen pysyi kannattavaa verrattuna ei-käsitellyissä soluissa, mikä viittaa siihen, että CSC lopulta suojaa soluja doksorubisiini aiheuttama kuolema. Kuvio 6 esittää edustavia kokeita suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

MTS solujen elinkelpoisuuden määritykset testaus elinkelpoisuuden ohjaus vs. CSC-käsitelty 10B ja A549-soluja, kun läsnä oli doksorubisiinia. Absorbanssi (Y-akseli) arvot normalisoitiin jakamalla yli absorbanssi 0 uM doksorubisiini näytteitä. Tulokset osoittavat, että CSC on suojaava vaikutus doksorubisiini-solukuolema. Virhe palkit edustavat SEM.

CSC hoito kasvattaa puolella väestöstä

Side väestöstä (SP) solut määritellään solut, jotka osoittavat suuremmat ulosvirtaus Hoechst 33342 väriaine, erityinen substraatti ABCG2 suhteessa valtaväestöön. Testasimme ovatko CSC voisi kasvattaa aloitushintaa 10B soluissa. Todellakin, Hoechst-puristamiseen määritys paljasti, että koko SP oli suurempi CSC-käsitellyissä soluissa verrattuna ei-käsiteltyjen solujen (kuvio 7). Läsnäollessa verapamiilin, kasvu SP osittain kumottu, mikä viittaa siihen, että ABCG2 on ainakin osittain vastuussa kasvun puolella väestöstä, mutta se on edelleen mahdollista, että muut lääkeainepumpuissa voisi olla rooli CSC aiheuttama puolella väestöstä. Nämä tulokset vahvistavat osallistumista ABCG2 CSC aiheuttama lääkeresistenssin ja ehdottaa mahdollisuutta, että CSC voi säädellä syövän kantasolujen ominaisuuksia, koska SP-solujen on osoitettu olevan paljon solunsalpaajaresistentti ja tuumorigeeniset kuin ei-SP-solujen [15], [19 ], [27].

FACS-pohjainen Hoechst puristamiseen määritys osoittaa koko puolen väestöstä (SP) in 10B soluja inkuboitiin kaksi annosta CSC. Koko SP suurenee annostus CSC. Soluja inkuboitiin 5 ug /ml Hoechst 90 minuutin ajan ja sen jälkeen DMEM w /CSC tai normaali DMEM 24 tuntia.

Nikotiini hoito edistää solujen elinkelpoisuuden aikana doksorubisiinille valotuksen

koska tupakansavu lauhde on sekoitus lukemattomia yhdisteitä, olisi hyödyllistä määrittää erityisen yhdisteen sisällä CSC joka voisi olla vastuussa edistämisestä lääkeresistenssin. Siksi tavoitteena oli määrittää, onko nikotiinia, tietty osa CSC, voisi olla vastuussa CSC aiheuttama lääkeresistenssin. MTS-määritys suoritettiin vertailua eloonjäämiskäyriä välillä valvonta-solujen ja 10 uM nikotiini-käsitellyt solut, kun läsnä on kasvava doksorubisiinin (kuvio 8a). Tulokset Tämän kokeen osoittivat, että nikotiinin aikaansaatu merkittävä etu solujen elinkelpoisuuden altistumisen aikana doksorubisiinille. Sen vahvistamiseksi, että nikotiini on tärkeää CSC aiheuttama lääkeresistenssi, MTS-määritys suoritettiin sen määrittämiseksi, onko mekamyyliamiinia, joka on ei-selektiivinen asetyylikoliinin nikotiinireseptorin estäjä, voi kääntyä lääkettä suojaavan vaikutuksen CSC. Tulokset osoittivat selviytymisen etu CSC-käsitellyissä soluissa, jotka oli lieventää käsittelemällä 1 uM mekamyyliamiinia (kuvio 8b).

(A) MTS lisääntymisen määrityksessä testattaessa elinkelpoisuuden ohjaus vs. nikotiini-käsitellyissä soluissa läsnä doksorubisiinin. Absorbanssi (Y-akseli) arvot normalisoitiin jakamalla yli absorbanssi 0 uM doksorubisiini näytteitä. (B) MTS luelinkykymäärityksillä osoittaa käänteinen CSC aiheuttaman doksorubisiiniresistenssiä mukaan nAChR estäjä mekamyyliamiinia. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että nikotiini on ainakin osittain vastuussa suojaava vaikutus CSC doksorubisiinille solukuolema. Virhe palkit edustavat SEM.

Keskustelu

Vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että CSC on mahdollista edistää chemoresistance [18], [28], [29], tunnistaa sen mekanismi toiminta on edelleen tärkeä havainto. Meidän tiedot tukevat mallin, jossa CSC: n aktivoi Akt indusoida translokaatiota ABCG2 solukalvoon, mikä parantaa lääkeaineen puristamiseen ja chemoresistance. Havaitsimme myös, että CSC pystyy aiheuttamaan ilmentymisen ABCG2 lisäksi säännellä translokaatio. Mielenkiintoista, korkeimmalla annoksella CSC (30 uM), ABCG2 ilmentyminen laskettiin kenties sytotoksisuuden vuoksi, vaikka doksorubisiini efflux pysyi korkeana. Tämä viittaa siihen, että ABCG2 translokaation yksin on enemmän kuin riittävä osuus CSC aiheuttama doksorubisiinin ulosvirtaus.

Vaikka osallistuminen Akt vuonna ABCG2 translokaatio hyvin tuettu tietomme ja toisten työn [30], [31], on epäselvää, onko CSC indusoima ABCG2 välittävät myös Akt. Meidän western blot data (kuva 4C) näyttäisi viittaavan siihen, että CSC voi säätelemään ABCG2 riippumatta PI3K /Akt signalointi. Tämä on sopusoinnussa havaintojen Bleau et ai, jotka havaitsivat, että Akt säätelee toiminto (eli translokaatio) ja ABCG2, mutta ei sen ilme [32]. Tuore tutkimus osoitti, että aryylihiilivetyreseptori (Ahr) on suora transkriptionaalinen aktivaattori ABCG2 rintasyövässä [33]. Bentso [α] pyreeni (B [a] P), yksi tärkeimmistä syöpää tupakansavun, on voimakas aktivaattori Ahr [34]. Siten on todennäköistä, että B [a] P sitoutuu Ahr, joka sitten aktivoi transkription ABCG2 ja selittää havaitun kasvu ABCG2 proteiinia. Toinen mahdollisuus on, että CSC toimii läpi microRNA sääntelyn lisäämiseksi ABCG2 proteiinin tasoja. CSC on osoitettu ilmentymisen moduloimiseksi eri MikroRNA [35], [36]. On mahdollista, että miR-519c, joka on osoitettu tukahduttaa käännös ABCG2 [37], on joukossa MikroRNA jotka vaimentua altistamalla CSC. Vaikka nämä teoriat on vielä vahvistettava tulevaisuudessa työtä, on selvää, että ABCG2 on keskeinen osa CSC aiheuttama chemoresistance, joten se on potentiaalinen terapeuttinen kohde tupakoinnin aiheuttamien syöpien. Hoidot yhdistyvät hallinnon ABCG2 estäjien ja tavanomaisten kemoterapia voi osoittautua tehokkaaksi hävittämisessä niin irtotavarana ja solunsalpaajaresistentti populaatiot kasvain, mikä vähentää toistumisen todennäköisyyttä.

Havaitsimme, että CSC on kyky laajentaa puolelle väestöstä . Määritelmän mukaan solut populaatiossa, jotka näyttävät suuremmat ulosvirtaus DNA-sitovan väriaine Hoechst 33342 kautta ABCG2 muodostavat SP. Useita syöpiä näiden solujen on havaittu olevan syövän kantasolun luonteeltaan, eli ne ovat tuumorigeenisemmiksi kuin ei-SP-soluissa. Teoriassa syövän kantasolut ovat vastuussa sairauden uusiutumisen koska niiden kyky selviytyä kemoterapiaa ja sen jälkeen kerrata alkuperäisestä kasvaimesta kautta itseuudistumisen ja erilaistumista. Havainto, että SP solut osoittavat korkeampia ulosvirtaus DNA-sitovan väriaine ja niillä kantasolujen kaltaisia ​​käyttäytyminen on sopusoinnussa ajatus, että syöpä kantasolut olisi muodostettava solunsalpaajaresistentti väestön sisällä kasvain. On myös ollut todisteita siitä, että syöpä kantasolut ovat vastuussa ja metastaasit. Siten CSC aiheuttama laajeneminen SP voisi toimia todisteena mahdollisesti uusi paradigma, jossa tupakansavun aiheuttaa syöpää edistämällä syövän kantasolujen fenotyyppiä nykyisten syöpäsoluja. Aluksi nämä solut ovat hyvänlaatuisia ja erittäin pitkälle, mutta saada pahanlaatuinen, erilaistumaton ”syöpä kantasolu” fenotyypin jatkuva altistuminen tupakansavulle. Lisätutkimisesta tämä malli antaisi kriittinen ymmärrys miten tupakoinnin aloittaa syöpä.

Vaikka joitakin vaikutuksia CSC optio lisätutkimuksia, vaikutukset Tutkimuksen pysyvät kirkkaina: syöpäpotilailla, jotka jatkavat polttaa savukkeita aikana kemoterapia voi seistä kantavat paljon huonompi ennuste. Siksi tupakoinnin lopettamisen jälkeenkin hoidon aikana voi olla merkittävä rooli maksimoimaan onnistumisen todennäköisyys. Lisäksi olemme tunnistaneet nikotiini välittäjänä lääkeresistenssin edistävää vaikutusta CSC. Tämä havainto viittaa siihen, että nikotiini, yhdiste, joka on ollut mukana oncogenesis voi myös olla rooli lääkeresistenssin, mahdollisesti kautta sääntelyn ABCG2. On tärkeää tutkia tarkemmin yksityiskohtaisia ​​mekanismeja, jotka säätelevät CSC välittämän ABCG2 ilmaisun ja tehokkuuden arvioimiseksi ABCG2 mahdollisena huume kohde. Olisi myös hyödyllistä määritellä muita vaikutuksia CSC jotka voivat auttaa syövän etenemisen, erityisesti ne, jotka kohdistuvat syövän kantasolujen ominaisuuksia.