Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä (PCA) kuolleisuus ohjaa erittäin aggressiivinen kasvaimia ominaista etäpesäkkeiden ja kestävyys hoitoa, ja tämä aggressiivisuus välittävät monet tekijät, mukaan lukien aktivoituminen stressin eloonjäämisreittejä että proinflammatoristen kasvain microenvironment. LEDGF /p75, joka tunnetaan myös nimellä DFS70 autoantigeeni, on stressiä transkription koaktivaattori osallisina syövän, HIV-AIDS, ja autoimmuniteetin. Tämä proteiini on kohdistettu autovasta tietyissä potilasryhmissä PCA ja tulehdustiloja, sekä joillakin ilmeisesti terveet yksilöt. LEDGF /p75 yli-ilmennetään PCa ja muiden syöpien, ja edistää vastustuskykyä kemoterapian indusoiman solukuoleman kautta transaktivaation selviytymisen proteiineja. Raportoimme tässä tutkimuksessa, että yli-ilmentyminen LEDGF /p75 PCA soluissa vaimentaa oksidatiivisen stressin aiheuttama nekroosi mutta ei staurosporiinille indusoiman apoptoosin. Tämä havainto oli yhdenmukainen havainto, että vaikka LEDGF /p75 oli voimakkaasti pilkkoutuu apoptoottisten solujen osaksi p65-fragmentti, joka puuttuu stressi selviytyminen toimintaa, se pysyi suhteellisen koskemattomana nekroottisia soluja. Yliekspressio LEDGF /p75 PCA-soluissa johti säätelyä transkriptin ja proteiinin tasot tioli-oksidoreduktaasi ERp57 (tunnetaan myös nimellä GRP58 ja PDIA3), kun taas sen loppuminen johti ERp57 transkriptin downregulation. Chromatin immunosaostus ja transkriptio toimittaja analyysit osoittivat LEDGF /p75 sitoutumisen ja transakti- ERp57 promoottori, vastaavasti. Immunohistokemiallinen analyysi paljasti merkittävästi kohonnut koekspressio näiden kahden proteiinin kliinisissä eturauhassyövän kudoksissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että LEDGF /p75 ei ole apoptoosi-inhibiittori vaan antagonisti oksidatiivisen stressin aiheuttama nekroosi, ja että sen yli-ilmentymisen PCa johtaa ERp57 säätelyä. Nämä havainnot on merkitystä selvitettäessä rooli LEDGF /p75 stressi selviytymisreittiin PCA.

Citation: Basu A, Cajigas-Du Ross CK, Rios-Colon L, Mediavilla-Varela M, Daniels-Wells TR, Leoh LS, et ai. (2016) LEDGF /p75-ilmentymän vaimentaa Oksidatiivinen stressi aiheuttama kuolion ja ylössäätelee oksidoreduktaasi ERP57 /PDIA3 /GRP58 eturauhassyövässä. PLoS ONE 11 (1): e0146549. doi: 10,1371 /journal.pone.0146549

Editor: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 08 syyskuu 2015; Hyväksytty: 19 joulukuu 2015; Julkaistu: 15 tammikuu 2016

Copyright: © 2016 Basu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat NIH avustuksia 5R25GM060507, 5P20MD001632 ja 5P20MD006988 sekä Loma Linda University School of Medicine Terveydenhuollon erot ja molekulaarisen lääketieteen. CKCD, MMV, LRC ja SRM tuettiin jatko koulutusapurahoihin alle apurahan R25GM060507. SAM tukivat lääketieteellistä tutkimusta koulutus työharjoittelun alle apurahan 5P20MD006988. HB työskentelee kaupallinen yritys-Novartis Pharmaceutical Oncology. Rahoittajat (NIH, Novartis) tukivat muodossa palkkojen tekijöille (CAC, CKCD, MMV, LRC, SRM, SAM, HB), mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tietojen keruu ja analysointi, päätös julkaista, tai valmisteen käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat nivelletty ”kirjoittaja maksut” -osiossa.

Kilpailevat edut: Yksi kirjoittajista, HB, työskentelee kaupallinen yritys-Novartis Pharmaceutical Oncology. Novartis tuettiin muodossa palkan HB, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Tämä kaupallinen kuuluminen ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on toiseksi suurin syy syövän kuolleisuus miesten United States, jotka vaikuttavat suhteettoman Afrikkalainen American men verrattuna muihin rotuun /etnistä ryhmää [1]. Eturauhassyövän aloittamista ja etenemistä on yhdistetty krooninen tulehdus ja lisääntynyt hapettumista tällä rauhanen [2,3]. Koska mekanismi selviytymistä tässä stressaavaa ympäristössä PCA solut aktivoi stressin eloonjäämisreittejä jotka edistävät kasvaimen aggressiivinen ominaisuuksia, kuten vastustuskykyä solukuolemaa ja kemoterapiaa [4-6]. Lens epiteelin kasvutekijä 75 kD (LEDGF /p75) on syntymässä onkoproteiinia joka edistää nisäkkään solu eloonjääminen läsnäollessa ympäristön stressitekijöitä, jotka lisäävät solujen hapettumista [7-14]. Tunnetaan myös transkriptio koaktivaattoria p75, PC4 ja SFRS1 vuorovaikutuksessa proteiinin (PSIP1), ja tiheä hieno pilkullinen autoantigeeni 70 kD (DFS70), tämä monitoiminen proteiini on saanut merkitystä tutkimuksessa syövän, HIV-AIDS, autoimmuniteetin, ja silmien tauti (tarkistetaan. viitteet [9,10]). Koska keskeiset solu kofaktori HIV integroitumisen vastaanottavaan kromatiinin, LEDGF /p75 on herättänyt paljon huomiota viime vuosikymmenen aikana, ja tarmokkaasti ovat parhaillaan käynnissä kohdistaa tätä proteiinia HIV-AIDS [15].

syntymässä rooli LEDGF /p75 rasittavana onkoproteiinia on paljastettu useissa tutkimuksissa ryhmämme ym dokumentointia sen yli-ilmentymisen ihmisen erilaisiin syöpätyyppien, ja sen kyky aiheuttaa piirteitä liittyy kasvaimen aggressiivisuus syöpäsoluja [10 -14,16-19]. Lisäksi, LEDGF /p75 on poikkeuksellisesti ilmaistaan ​​ihmisen leukemioiden ja vuorovaikutuksessa Menin-MLL (mixed leukemia linjaa) transkription monimutkainen aktivoida ilmentymistä syöpään liittyvien geenien ja leukemogenesis [20,21]. Mahdollisuuksia LEDGF /p75 on lupaava kohde syövän hoidossa on korostettu tutkimukset osoittavat, että sen estäminen tai alisäätely vaimentaa aggressiivinen ominaisuuksia syöpäsolujen [14,17,19,21,22].

ryhmä ja muut osoittivat aiemmin, että LEDGF /p75 on tavoite autovasta vasteen osajoukko PCa potilaiden, samoin kuin ilmeisesti terveet yksilöt ja potilaat monipuolista kroonisia tulehdustiloja ([23], myös tarkistetaan. viitteet [9, 10]). Olemme myös raportoitu, että LEDGF /p75 yli-ilmennetään eturauhasen kasvaimia ja että tämä yli-ilmentyminen edistää PCa solun resistentiksi kaspaasi-riippumaton lysosomaalisen solukuoleman aiheuttama taksaani lääke doketakseli (DTX), kultakantaan PCA kemoterapiaa [11,13,23] . Mielenkiintoista on, LEDGF /p75 säätelyä esiintyy luonnossa valinnan aikana DTX-resistenttien PCa soluihin [24]. Yhdenmukaiset Näiden havaintojen, useat tutkimukset osoittivat, että LEDGF /p75 yli-ilmentymisen syöpäsoluissa edistää vastustuskyky lääkkeille, jotka aiheuttavat oksidatiivista DNA-vaurioita ja lysosomaalisen solukuolemaa [12-14,18,25], joka johtaa yksi ryhmä viitata tämän proteiinin ”valvojana lysosomaalisen vakauden ihmisen syövän” [14]. Stressi suojaavia tehtäviä LEDGF /p75 näyttävät välittyvän sen kyky osallistua DNA: n korjaukseen ja kopiointia aktivoida stressi selviytyminen proteiineja, kuten lämpöshokkiproteiini 27 (Hsp27), peroxiredoxin 6 (PRDX6), ja endoteelikasvutekijä C (VEGF -C) [18,26-30].

aiemmin havaittiin, että LEDGF /p75 yli-ilmentymisen PCa solut eivät suojaa kaspaasi-riippuvaista apoptoosia laukaisee TRAIL (tuumorinekroositekijä sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi), joka on hyvin tunnettu indusoija kuoleman reseptori apoptoottista koulutusjakson [13]. TRAIL, staurosporiini (STS), ja muut indusoijat apoptoosin lukemiin kaspaasi-3 -välitteisen pilkkomisen LEDGF /p75 osaksi näkyvä p65-fragmentti, josta puuttuu pro-elossapysymisvaikutuksen ja tehostaa solukuolemaan stressiolosuhteissa [22,23,30]. Lisäksi kaspaasi-3 -välitteisen pilkkomisen LEDGF /p52, lyhyen vaihtoehtoisia silmukointimuunnosta LEDGF /p75, tuottaa p35-fragmentti, joka kumoaa transkriptionaalista aktiivisuutta LEDGF /p75 [30].

Koska sen katkaisun ja inaktivaatio apoptoosin aikana, LEDGF /p75 voi toimia klassisen estäjä apoptoosin vaan ylävirran suojelija DNA ja lysosomaalisen koskemattomuus laajennetun tilan solun oksidatiivisen stressin. Siksi olemme keskittyneet tässä tutkimuksessa tutkimiseen kyky LEDGF /p75 suojata PCa soluja vastaan ​​oksidatiivisen stressin aiheuttamaa nekroosia ja edistää säätelyä endoplasmakalvoston proteiinin 57 kD (ERp57) PCA. ERp57, joka tunnetaan myös glukoosin säätelemä proteiini 58 kD (GRP58) ja proteiini-isomeraasin perheen jäsen 3 (PDIA3), on monikäyttöinen tioli-oksidoreduktaasi ja kaperoniproteiinina ylläpidosta vastaa asianmukaista laskostumista äskettäin syntetisoidut glykoproteiinien [31 , 32]. Tuloksemme osoittavat, että LEDGF /p75 yli-ilmentymisen vaimentaa oksidatiivisen stressin aiheuttama nekroottinen solukuolema ja edistää ERp57 säätelyyn ylöspäin yhteydessä PCa.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimuksissa, joissa käytetään ihmisen vasta-aineita, syöpäsolu linjat, ja eturauhaskudoksiin tehtiin alle hyväksyntää Loma Linda yliopiston Institutional Review Board.

solulinjat, vasta-aineet, ja reagenssit

metastaattinen eturauhassyöpä solulinjoissa DU145 (Cat. # HTB -81) ja PC3 (Cat. # CRL-1435), K-ras transformoitu eturauhasen epiteelisolujen linja RWPE-2 (Cat. # CRL-11610), joka on johdettu normaalista eturauhasen solulinja RWPE-1, ja luusarkoomasolulin- line U2OS (Cat. # HTB-96) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC). Soluja viljeltiin suosittelema toimittajien kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 37 ° C: ssa. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: hiiren monoklonaalisia anti-β-aktiini (1: 5000, Sigma-Aldrich) ja anti-ERp57 (1: 200, Enzo Life Sciences); kaniinin polyklonaalista anti-LEDGF /p75 (1: 1000, Bethyl laboratorioiden Inc); vuohen polyklonaalinen anti-Lamin B-vasta-aineen C-20 (1: 1000. Santa Cruz Biotechnology); ihmisen autovasta I-topoisomeraasin (1: 100, Topo I), ystävällinen lahja Dr. Eng M Tan (Scripps Research Institute, La Jolla, CA); anti-LEDGF /p75 kaniinin polyklonaalista vasta Scripps-Ab5087 (1: 1000), myös lahjoittaja Dr. Eng M. Tan; ja piparjuuriperoksidaasi (HRP) -leimattua toissijainen IgG-vasta-aineiden (1: 5000, ThermoFisher Scientific). Tert-butyyli vetyperoksidi (TBHP), orgaanista peroksidia, ostettiin Sigma-Aldrich. STS ja N-asetyyli-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-metyylikumariini (Ac-DEVD-AMC, fluorogeenisen kaspaasi-3/7 substraatti) hankittiin Axxora. Laaja kaspaasiestäjä benzylocarbonyl-Val-Ala-Asp-fluorimetyyli ketoni (z-VAD-fmk) hankittiin Biomol International.

Cell Death and Elinkykymääritykset

Solukuolema indusoitiin käsittelemällä jossa sytostaattien TBHP (50, 75, 100, ja 150 uM) tai STS (4 uM) enintään 24 tuntia. Joissakin kokeissa soluja esi-inkuboitiin 100 uM z-VAD-fmk: ssa 1 tunti ennen altistusta näille aineille. Solujen morfologia visualisoitiin Olympus IX70 mikroskooppi varustettu Hoffmann Modulation Contrast (Olympus amerikkalainen) ja digitaalisen Spot Imaging System (Diagnostic Instruments). Solujen elinvoimaisuuden määrittämiseen, solut siemennettiin 96-kuoppaisille levyille (3 x 10

4 solua kuoppaa kohti) käsiteltiin TBHP tai STS, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Sitten solut pestiin kolme kertaa tislatulla vedellä, ja Accustain Crystal Violet-liuosta (Sigma-Aldrich) (1: 4), lisättiin kuhunkin kuoppaan ja sen jälkeen inkuboitiin 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Solut pestiin tislatulla vedellä ylimääräisen väriaineen poistamiseksi ja kuivattiin sitten huoneenlämpötilassa. Etikkahappo (10% v /v), lisättiin kuhunkin kuoppaan 10 minuutin ajan ja absorbanssi mitattiin 570 nanometrissä (nm) käyttäen μQuant mikrolevylukijalla (Bio-Tek Instruments).

DAPI (4 ’, 6-diamino-2-fenyyli) värjäys käytettiin visualisoimaan kondensoitu tai hajanaiset kromatiinin käsitellyissä soluissa TBHP tai STS. Lyhyesti, solut ympättiin (3 x 10

4) 8-hyvin Lab-Tek

® permanox-

® kammio diat (ThermoFisher Scientific), käsiteltiin 24 tunnin jälkeen kanssa eri sytostaattien, pestään PBS: llä ja sitten kiinteä ja läpäiseviksi metanoli /asetoni-liuoksella (3: 1 v /v) 10 minuutin ajan -20 ° C: ssa. Vahvistaminen liuos poistettiin ja levyt inkuboitiin huoneen lämpötilassa 5-10 minuuttia kuivauksen. Peitelaseja asennettu käyttämällä Vectashield kiinnitysväliaine sisältävä DAPI (Vector Laboratories). DAPI värjäys visualisoitiin ja Olympus BX50 fluoresenssimikroskooppiin ja kuvat saatiin Spot Imaging System (Diagnostic Instruments).

kaspaasiaktiivisuus määritykset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [30]. Lyhyesti, solut ympättiin musta, kirkas pohja 96-kuoppaisille levyille (3 x 10

4 solua kuoppaa kohti). Päätteeksi hoidon TBHP tai STS, soluja inkuboitiin 50 ui 3X kaspaasi-puskuria [150 mM HEPES pH 7,4, 450 mM natriumkloridi, 150 mM kaliumkloridi, 30 mM magnesiumkloridia, 1,2 mM etyleeniglykoli-bis (2 -aminoethylether) –

N

,

N

,

N ’

,

N’

tetraetikkahappoa (EGTA), 30% sakkaroosia, 10% CHAPS, ja 1,5% NP-40], kun läsnä oli 30 mM ditiotreitolia (DTT), 3 mM phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF), ja 75 uM fluorogeenisen peptidisubstraatin Ac-DEVD-AMC (kaspaasi-3/7) 2 h 37 ° C: ssa. Tämän jälkeen inkuboimalla soluja huoneenlämpötilassa 12 tuntia, ja mittaamalla absorbanssi aallonpituudella magnetointi 360 nm ja emissio 460 nm: ssä FLX800 Microplate Fluorescent Reader (Bio-tek Instruments). Kertainen aktiivisuus määritettiin normalisoimalla yhteen absorbanssiarvot käsittelemättömän, kontrolli soluja.

mittaus reaktiivisia happiradikaaleja

sukupolvi reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) arvioitiin perustuen solunsisäisen hapetus 2 ’, 7′-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (DCFH-DA, Invitrogen), jolloin muodostuu fluoresoiva yhdiste 2′, 7’-dicholorofluorescein (DCF). Solut ympättiin 6-kuoppaiseen levyyn tiheydellä 3 x 10

4 solua kuoppaa kohti, viljeltiin 24 tuntia, ja sitten se käsiteltiin TBHP tai STS jopa 12 tuntia. DCFH-DA (0,5 uM) lisättiin sitten soluihin, minkä jälkeen inkuboitiin 20 minuuttia 37 ° C: ssa. Solut pestiin PBS: llä ja suspendoitiin sitten uudelleen 0,5 ml: aan PBS: ää. Fluoresenssi-intensiteetti määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä FACScalibur sytometriä (BD Biosciences).

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR) suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, kokonais-RNA uutettiin soluista käyttämällä RNeasy plus mini -kittiä (Qiagen). RNA: ta (0,5 ug) oli käänteinen trancribed cDNA käyttäen iScript cDNA-synteesi-kittiä (BioRad). qPCR suoritettiin MyiQ reaaliaikainen PCR tunnistusjärjestelmä alukkeilla käyttämällä iQ SYBR Green Supermixiä (BioRad) mukaan valmistajan suositusten. Alukesekvenssit LEDGF /p75 ja ERp57 suunniteltiin käyttäen Primer3-ohjelmiston ja kaupallisesti syntetisoida Integrated DNA Technologies (IDT) (taulukko 1). Kohde-mRNA-arvot normalisoitiin käyttäen glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) mRNA ja tiedot ilmaistiin suhteessa normalisoidut arvot vastaavien valvontaa. Näytteet analysoitiin kolmen erillisen kokeen, kukin kolmena rinnakkaisena.

Generation Eturauhassyövän solujen vakaa yliekspressio tai ehtyminen LEDGF /p75

LEDGF /p75-cDNA kloonattiin aiemmin laboratoriossamme nisäkkään ekspressioplasmidiin pcDNA3.1 (Invitrogen) [22]. Lyhyesti, molemmat pcDNA3.1 tyhjän vektorin ja pcDNA3.1-

ledgf /p75

transfektoitiin RWPE-2 ja PC3-soluissa käyttäen Fugene 6 (Roche) menetelmällä. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut trypsinoitiin ja ympättiin 6-kuoppaisille levyille. Valinta stabiilit transfektantit saatiin aikaan lisäämällä G418: aa (330μg /ml) (ThermoFisher Scientific) soluviljelmiin. Elossa pesäkkeet laajennettiin ja ilmaus LEDGF /p75 soluissa stabiilisti transfektoitu tyhjällä vektorilla tai pcDNA3.1-

ledgf /p75

vahvistettiin qPCR ja immunoblottauksella.

PC3 solujen vakaa yliekspressio tai ehtyminen LEDGFp75 käyttäen virusvektoreita oli antelias lahjoja Professorit Zeger Debyser ja Rik Gijsbers (Katholieke, Belgia). Yliekspressoivat PC3-solut syntyvät transdusoimalla niitä retrovirusvektoreilla koodaavat täyspitkää LEDGF /p75 cDNA kuten aiemmin on kuvattu [24,33] PC3-solujen stabiileja ehtyminen LEDGFp75 luotiin käyttäen tehostettiin lentivirusvektori-pohjainen RNA-interferenssi kuten aiemmin on kuvattu [34] . Lyhyesti, lyhyt hiusneula (sh), RNA: ta käytettiin stabiilisti pudotus LEDGFp75 kun shSCR toimi ei-häiritseviä shRNA ohjaus. Transdusoidut solut valittiin zeosiinin kanssa (200 ug /ml) ja LEDGF /p75 yli-ilmentymisen tai ehtyminen valikoitujen kloonien arvioitiin qPCR ja immunoblottauksella.

RNA-interferenssi-välitteisen knockdovvn LEDGF /p75 PCA-soluissa

ohimenevä knockdovvn LEDGF /p75 PCA soluissa aikaan toimitettava erityisiä lyhyitä estävä RNA: t (siRNA: t) soluihin käyttäen Oligofectamine menetelmää (Invitrogen, Life Technologies), mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, LEDGF /p75 siRNA (siLEDGF /p75) ja salattu siRNA duplex (siSD, negatiivinen kontrolli) suunniteltiin kuten aiemmin on kuvattu [24] ja syntetisoi IDT. SiLEDGF /p75-sekvenssin vastasi nukleotidejä 1340-1360 (5′-AGACAGCAUGAGGAAGCGAdTdT-3 ’) suhteen ensimmäisen nukleotidi aloituskodonista LEDGF /p75: n avoimen lukukehyksen. Tämä sekvenssi vastaa aluetta, C-terminaalista LEDGF /p75, joka ei ole jaettu sen lyhyen vaihtoehtoisia silmukointivariantti LEDGF /p52. Sekvenssin siSD oli 5’GCGCGCUUUGUAGGAUUCGdTdT-3 ’. Solut transfektoitiin 40 nM siRNA: t ja kasvatettiin 72 tuntia ennen analyysiä.

Doketakseli hylkivät PCa Cells

Doketakseli (DTX) -kestävistä PC3 (PC3-DR) ja DU145 (DU145-DR ) solulinjat kehitettiin viljelemällä PC3 ja DU145-solujen läsnä ollessa DTX annoksesta laajenemisen tavalla [35]. Solut, jotka selvisivät alkuperäisestä kulttuurin 1 nM DTX siirrostettiin 4 kertaa ennen pitoisuuden lisääminen DTX 5,5 nM ja sen jälkeen 11 nM. Resistentit solut pidettiin jatkuvasti 11 nM DTX.

Immunoblottaus analyysi

Immunoblottaus suoritettiin olennaisesti kuten aikaisemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, proteiinit kokosolulysaateista PCA solut erotettiin SDS-PAGE (NuPAGE 4-12%, ThermoFisher Scientific), jota seurasi siirto polyvinyylifluoridista (PVDF), (Millipore). Membraanit blokattiin 5% kuivamaitoa, joka oli valmistettu TBS-T-puskuria (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,1% Tween 20) ja tutkittiin primaaristen vasta-aineiden. Usean pesun jälkeen TBS-T, membraaneja inkuboitiin sopivilla piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundäärisiä vasta-aineita ja pestiin useita kertoja TBS-T: llä. Proteiini vyöhykkeet havaittiin tehostetulla kemiluminesenssin (ThermoFisher Scientific Pierce).

Kinetworks ™ Stressi /lämpösokkiproteiini Screen

Kinetworks ™ Stressi /Heat Shock Protein Screen (Kinexus bioinformatiikan Corporation) käytettiin määrittää ja verrata ekspressiotasot 25 eri stressiä ja lämpösokkiproteiinit immunobloteissa kokosolulysaateista päässä RWPE-2-soluissa stabiilisti yli-ilmentävät LEDGF /p75 ja ohjaus, jotka on vakaasti transfektoitu tyhjällä pcDNA vektori. Tämä alusta oli vasta-aineisiin perustuva array palvelu samanaikaiseen seulontaan useiden stressi proteiinien solulysaateista, joka oli kaupallisesti saatavissa aikaan aloitimme tämän tutkimuksen. Solulysaatit tutkittiin immunoblottauksella vasten stressi /lämpöshokkiproteiiniin vasta-paneelin [36]. Immunoblottauksella menettelyjä ja kvantifiointiin yksittäisten stressin proteiinin immunoreaktiivisuus suoritettiin Kinexus.

Luciferase-pohjainen transkriptio Reporter Analyysit

ERp57 promoottori (

ERp57pr

) lusiferaasi-pohjainen transkriptio toimittaja määritykset olivat suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [30]. Lyhyesti, RWPE-2, PC3 ja DU145 solut ko-transfektoitiin ekspressiovektorilla, joka koodaa LEDGF /p75 (pcDNA3.1-

ledgf /p75

) tai tyhjän vektorin (pcDNA3.1), ja reportteri vektori (pLightSwitch tyhjän vektorin tai pLightSwitch-

ERp57pr

) (Switchgear Genomics /Aktiivinen motiivi). 48 tuntia transfektion jälkeen solut lyysattiin ja lusiferaasin analyysit suoritettiin käyttäen LightSwitch Luciferase Assay Reagent (kytkentälaitteet Genomics /Active motiivi). U2OS solut transfektoitiin eri LEDGF /p75 ekspressiovektori, pCruzHA-

ledgf /p75

, tai tyhjä pCruzHA, ja lusiferaasianalyysissä näissä soluissa suoritettiin käyttäen Luciferase Assay System Promega. Suhteellisina valoyksiköinä saatiin on MicroLumatPlus Lb 96V luminometrillä (Berthold Tech), ja lusiferaasin arvot normalisoitiin proteiinin pitoisuus lysaatit soluista, co-transfektoitu tyhjällä vektoreilla ja pLightSwitch-

ERp57pr

. Opiskelijan

t

-testi analyysi suoritettiin käyttäen Microsoft Excel. Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa kolmena rinnakkaisena.

Kromatiini immunosaostusmäärityksissä

Nämä määritykset tehtiin oleellisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu [37]. Lyhyesti, PC3 ja U2OS solut kiinnitettiin 1% formaldehydiä 10 minuutin ajan ja altistettiin kromatiinin immunosaostus (chip) määritys käyttäen siru-IT Express Entsymaattinen Kit (Active motiivi). Anti-LEDGF /p75-vasta-aineita (A300-848A, Bethyl) käytettiin immunosaostamaan proteiini-chromatin komplekseja. Immunosaostettiin chromatin jälkeen entsymaattisesti. PCR suoritettiin käyttäen alukkeita monistamaan ERp57 promoottori (taulukko 1). Sekä epäspesifinen immunoglobuliini G (IgG) vasta-ainetta ja syöttää chromatin käytettiin kontrolleina.

immunohistokemiallinen (IHC) analyysi Eturauhassyöpä kudossiruina

Ihmisen PCa kudossiruina (TMA), kaupallisesti saatavilla alkaen Novus Biologicals ja US Biomax- Inc. käytettiin IHC analyysiin LEDGF /p75 ja ERp57. Kolme erilaista PCa TMA (kaksi USA Biomax- Inc. ja yksi Novus Biologicals) käytettiin lisäämään otoksen kokoa. Lyhyesti, ostimme Yhdysvaltain Biomax- PR807 ja PR807a TMA, joista kukin sisältää yhden ytimet 3 taudista vapaan normaalia kudosta tapauksissa 7 normaali viereinen kudos tapauksissa ja 50 PCa kudoksen tapauksessa. Olemme käyttäneet myös IMH-303 TMA (Novus Biologicals), joka sisältää 40 PCa kudoksen sydämiä ja 9 vastaaviin normaaleihin viereisten kudosten. Näissä valmistajien TMA tarjotaan vain rajoitetusti perustiedot kliinis tiedot (ikä, sukupuoli, kasvaimen vaiheessa joissakin tapauksissa), joka vastaa kudoksen ytimet ilman potilaan tunnistamista. Tietoa ei ollut saatavilla potilaiden rodun tai etnisen alkuperän, hoidon tyyppi, laitokset keränneen kudokset, seurannasta rutiineja, ja kudoksen käsittely tekniikoita. Rajoitetun Potilaan seuranta liittyvät tiedot TMA esti meitä suorittamalla Kaplan-Meier selviytymisen analyysi ja muut kliiniset korrelaatio analyysit.

TMA värjättiin käyttäen Biogeeniset i6000 automaattisen stainer (Biogenex Corporation), kuten aikaisemmin on kuvattu [11]. Lyhyesti, parafiiniin kudosleikkeiden että TMA dioja poistettiin parafiini ja dioja alistettiin antigeeni haku. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus pysäytettiin käsittelemällä 3% vetyperoksidia 10% metanolia, ja Power Block

© Universal esto-reagenssia (Biogenex Corp.) käytettiin estämään ei-spesifistä proteiinia sitova. IHC värjäys LEDGF /p75 tehtiin käyttämällä Scripps-Ab5087 kanin polyklonaalista vasta-ainetta, joka on spesifinen LEDGF /p75 ja ei reagoi lyhyt LEDGF /p52 silmukointivariantti [11]. IHC värjäys ERp57 tehtiin käyttämällä hiiren monoklonaalisia anti-ERp57 (Enzo Life Sciences). TMA laseja inkuboitiin yön yli primaarisilla vasta-aineilla, pestiin ja inkuboitiin sitten Multi-link

© biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen (Biogenex Corp.), jota seurasi inkubointi streptavidiini-kytketty peroksidaasiin superherkkien Label

© (Biogenex Corp.). Immunovärjäys havaittiin peroksidaasi aktivointi 3-amino-9-ethycarbazole (AEC) kromogeenina (biocare Medical). TMA vastavärjättiin kevyesti hematoksyliinillä (Sigma) ja peitettiin Per- mountilla (ThermoFisher Scientific). Sillä negatiivinen kontrolli näyte, ensisijainen vasta-aine pois ja substituoitu kanin tai hiiren pre-immuuni seerumi. Kudosleikkeet tutkittiin Olympus BX50 mikroskoopilla, ja kuvat hankittiin käyttämällä digitaalista Spot RT3

TM kamera (Diagnostic Instruments).

immunovärjättiin TMA pisteytettiin sokkona for LEDGF /p75 immunoreaktiivisuus jonka hallituksen sertifioitu patologi (HR). 4-tason pisteytystä (0 = negatiivinen, 1 = heikko, 2 = kohtalainen, 3 = voimakas) käytettiin arvioimaan värjäyksen intensiteettiä. Kudokset pistein 0-1 katsottiin olevan lievää värjäytymistä, kun taas kudoksissa pistein 2-3 katsottiin olevan korkean intensiteetin värjäystä. Kudosnäytteitä, jotka osoittivat huonolaatuisia jätettiin analyyseistä. Nämä tutkimukset suoritettiin hyväksyntää Institutional Review Board.

tilastollinen analyysi IHC tietojen ja niiden suhdetta potilaiden hoitotuloksia tehtiin käyttäen SAS-ohjelmiston pakettia (versio 9.2; SAS Institute). Helpottamiseksi tilastollisen analyysin, kudosnäytteitä jaettiin kahteen ryhmään perustuen niiden tulokset. ”Low” värjäytyminen määritettiin yhdistettiin värjäytymisen intensiteetti tulokset 0 ja 1, kun taas ”high” värjäys oli yhdistetty tulokset 2 ja 3. Korrelaatio ekspressiotasot LEDGF /p75 ja ERp57 kasvaimen ja ohjaus (taudista vapaan normaali + normaali viereinen ) kudoksiin määritettiin käyttäen Chi-square testi. Todennäköisyys arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

LEDGF /p75 yli-ilmentymisen vaimentaa oksidatiivisen stressin aiheuttama nekroosi mutta ei staurosporiinille indusoiman apoptoosin PCA soluissa

TBHP, entistä vakaa homologi vetyperoksidia, joka on laajalti käytetty mallien oksidatiivisen stressin aiheuttama nekroosi [38-40], ja apoptoosin indusoija STS altistettiin PCa solujen aktivoimiseksi nekroottisen ja apoptoottisen solukuoleman, vastaavasti. Molemmat aineet vähentää solujen elinkelpoisuus RWPE-2 eturauhasen solulinja (kuvio 1A). Vaikka STS-käsiteltyjä soluja esitteli klassisen apoptoottinen tunnusmerkkejä ominaista kupliminen ja kromatiinin tiivistyminen ja pirstoutumista, TBHP käsiteltyjä soluja esillä tyypillinen nekroottisen morfologia ominaista sytoplasman turpoamista ja kondensoitiin ytimet ilman chromatin pirstoutuminen (kuvio 1 B ja 1 C). Hoito STS johti aikariippuvainen lisäys kaspaasi-3: n aktiivisuuden, sopusoinnussa apoptoosin induktion, kun taas hoito TBHP ei johtanut kaspaasi-3 aktivaation (kuvio 1 D). Lamin B, klassinen kaspaasi-3-substraatti, pilkottiin osaksi allekirjoitus apoptoottista fragmenttia, 45 kD: n aikana STS: n indusoiman apoptoosin, mutta ei aikana TBHP-indusoitua solukuolemaa (kuvio 1 E), mikä on yhdenmukaista niiden aiempien havaintojen, että tämä proteiini ei lohkaista aikana nekroottinen solukuolema [41]. Yhdessä nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​saatavilla todisteita siitä, että TBHP on vahva laukaista oksidatiivisen stressin aiheuttama nekroottinen solukuolema [38-40].

. RWPE-2-soluja käsiteltiin 100 uM TBHP tai 4 uM STS aiheuttaa nekroosia tai apoptoosin, vastaavasti. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin Crystal Violet-määrityksellä. B. muutokset solun morfologiassa, jotka liittyvät kuolion tai apoptoosin RWPE-2: lla käsiteltyjen solujen TBHP tai STS, vastaavasti, 24 tunnin ajan. C. Nuclear morfologia RWPE-2-solut (käsitellään paneelissa B) näkyviksi DAPI-värjäyksellä. D. Caspase 3 aktiivisuus mitattiin hoidon jälkeen TBHP tai STS. E. katkaisu Lamin B osaksi allekirjoitus apoptoottinen 45 kD fragmentti havaittiin immunoblottauksella in RWPE-2-solut käsiteltiin STS, mutta ei TBHP-käsitellyissä soluissa. Viivat osoittavat vastaavia juovia proteiineille ja nuoli osoittaa pilkkomisfragmentin. F. Immunoblot vakiintunutta yliekspressio LEDGF /p75 in RWPE-2-

ledgf /p75

klooneja verrattuna RWPE-2

Vec

(tyhjä pcDNA3.1-vektori) klooneja ja transfektoimattomilla RWPE- 2-soluissa. G. Kristallivioletti elinkelpoisuuden määritys osoittaa, että yli-ilmentyminen LEDGF /p75 in RWPE-2-solujen edistää vastustuskykyä indusoima solukuolema TBHP muttei STS. Kukin kuvaaja edustaa keskiarvoa vähintään 3 itsenäistä koetta suoritettiin kolmena rinnakkaisena (*

P 0

.

05)

.

P

arvot määritettiin verrattuna ohjata Studentin

t

-testi. Data edustaa keskiarvoa vähintään riippumattomassa kokeessa.

Sen määrittämiseksi, LEDGF /p75 antagonisoi TBHP aiheuttama nekroosi, me syntyy RWPE-2-soluissa stabiilisti yli-ilmentävät tätä proteiinia (kuvio 1 F). Nämä solut näytetään heikentyi merkittävästi TBHP-indusoidun nekroottinen solukuolema verrattuna soluihin stabiilisti transfektoitu tyhjällä pcDNA3.1-vektoriin (kuvio 1G). Kuten odotettua, LEDGF /p75 yli-ilmentymisen ei vaimentanut STS-aiheuttaman apoptoosin (kuvio 1 G), todennäköisesti johtuu sen katkaisun caspases [22,23,30].

jäljentää ja laajennettiin nämä havainnot luussa metastaattinen PCa soluja, PC3. Samanlainen kuin meidän havainnot RWPE-2-soluissa, hoito PC3-solujen joko STS tai TBHP pienentää solujen elinkelpoisuuden ajassa riippuvaisella tavalla (kuvio 2A). Kuten odotettua, zVAD-fmk laaja estäjä caspases heikennettyä STS: n indusoiman apoptoosin, mutta ei ollut estovaikutusta TBHP aiheuttaman kuolion (kuvio 2A). Vaikka zVAD-fmk merkittävästi heikennetty STS-välitteisen apoptoosin, se ei täysin estää solukuolemaa ajan edennyt (kuvio 2A), yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen STS indusoi kaspaasi-riippumaton solukuoleman tai necroptosis alle kaspaasi vaarantunut olosuhteissa tietyissä solulinjoissa [ ,,,0],42,43]. Vastaa meidän havaintojen RWPE-2-solut, STS-käsiteltyjen PC3-solut osoittivat ominaisuus kupliminen ja laaja kromatiinin tiivistyminen ja pirstoutuminen liittyy apoptoosiin, kun taas TBHP käsiteltyjä soluja näytteillä sytoplasmista turvotusta ilman ydin- pirstoutuminen (kuvio 2B ja 2C). Kuten odotettua, hoidon STS, mutta ei TBHP, johti kaspaasi-3-aktivaation (kuvio 2D).

. PC3-soluja käsiteltiin 100 uM TBHP tai 4 uM STS aiheuttaa nekroottista tai apoptoottisen solukuoleman, vastaavasti, läsnä ollessa ja poissa ollessa laaja kaspaasiestäjä zVAD-fmk. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin 6, 12, 24 tuntia hoidon jälkeen ja kello 6 h hoidon plus 18 h elpymistä. B. Muutokset solumorfologialtaan liittyvät kuolion tai apoptoosin PC3-soluissa käsitelty TBHP ja STS vastaavasti 24 tuntia. C. Nuclear morfologia PC3-solujen visualisoitu DAPI-värjäyksellä. D. Caspase 3 aktiivisuus mitattiin hoidon jälkeen TBHP tai STS. E. katkaisu Topo I osaksi allekirjoitus apoptoottinen (70 kD) ja nekroottinen (70 kD ja 45 kD) fragmentteja havaittiin immunoblottauksella PC3-soluissa käsitelty STS tai TBHP, vastaavasti (ylempi paneeli). Pilkkominen LEDGF /p75 osaksi allekirjoitus apoptoottinen fragmentti (65 kD) havaittiin soluissa, joita käsiteltiin STS mutta ei soluissa käsitelty TBHP (alempi kuva). p-aktiini käytettiin latauskontrollina.