Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Viime aikoina on ollut lisääntynyt kiinnostus farmakologisesti aktiivinen luonnontuotteet liittyy korjaustoimenpiteitä erilaisten sairauksien, kuten syövän. Fucoidan on polysakkaridi peräisin ruskeiden merilevien ja on pitkään käytetty ainesosana joissakin ravintolisä tuotteita. Vaikka fukoidaanista on tiedetty olevan syövän vastaista aktiivisuutta, anti-metastaattisen vaikutuksia ja sen yksityiskohtainen mekanismi toimet on huonosti ymmärretty. Siksi Tutkimuksen tarkoituksena oli osoittaa antimetastaattisia toimintojen fukoidaanista ja sen vaikutusmekanismi käyttäen A549, erittäin metastaattinen ihmisen keuhkosyövän solulinjassa.

menetelmät ja tärkeimmät havainnot

fucoidan estää niiden kasvun A549-soluja pitoisuudella 400 ug /ml. Fucoidan kohtelu toksisuusrajat (0-200 ug /ml) osoittaa pitoisuudesta riippuva estävää vaikutusta hyökkäyksen ja kulkeutumista syöpäsolun kautta alentamalla MMP-2: n aktiivisuuden. Jos haluat tietää mekanismi näiden inhiboivia vaikutuksia, Western blottaus suoritettiin. Fucoidan hoito down-regulation ekstrasellulaarisen signaalin liittyviä kinaasi 1 ja 2 (ERK1 /2) sekä fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K) -Akt-nisäkkään rapamysiinin kohde (PI3K-Akt-mTOR) reittejä. Lisäksi fukoidaanista vähenee sytosolin ja ydinvoima tasot Nuclear Factor-kappa B (p65).

Johtopäätökset /merkitys

Tämä tutkimus viittaa siihen, että fukoidaanista on anti-metastaattinen vaikutus A549 keuhkosyöpäsoluissa kautta alas-säätely ERK1 /2 ja Akt-mTOR sekä NF-kB signalointireitteihin. Näin ollen, fukoidaanista voidaan pitää potentiaalisen terapeuttisen reagenssin vastaan ​​etäpesäkkeiden invasiivisen ihmisen keuhkosyövän soluja.

Citation: Lee H, Kim JS, Kim E (2012) Fucoidan merilevästä

rakkolevä

Estää Muuttoliike ja Invasion of Human Lung Cancer Cell kautta PI3K-Akt-mTOR Pathways. PLoS ONE 7 (11): e50624. doi: 10,1371 /journal.pone.0050624

Editor: Renping Zhou, Rutgers University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 elokuu 2012; Hyväksytty: 23 lokakuu 2012; Julkaistu: 30 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Lee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

etäpesäke on johtava syy (jopa 90% ) syöpään liittyvien kuolemien. Kehittäminen Syöpämetastaasin koostuu useista prosesseista, joissa syöpäsolut ensin irrottaa primaarikasvaimen, hyökätä ympäröivien kudosten ja intravasate vereen ja /tai imusuonten järjestelmien ja ekstravasoitumaan päässä verisuonistoon ja sen jälkeen laskeutua ja asuttaa klo kohde-elimiin. Matriksin metalloproteinaasien (MMP: t) on keskeinen rooli kasvaimen etäpesäke, jossa MMP hajottavat soluväliaineen (ECM) proteiineja, kuten kollageenia, proteoglykaania, elastiini, laminiini ja fibronektiini [1], [2]. Niistä, MMP-2 (gelatinaasi A) ja MMP-9 (gelatinaasi B) ilmaistaan ​​runsaasti eri pahanlaatuisten syöpien ja hajottavat tyypin IV kollageenia, joka on tärkeä osa tyvikalvon. Yleisesti MMP-2 yli-ilmentyy konstitutiivisesti erittäin metastaattinen syöpä, kun taas MMP-9 indusoi joissakin stimuloiva tekijät, kuten tulehduksellisten sytokiinien, epidermaalinen kasvutekijä ja forboli-12-myristaatti-13-asetaatti [3]. Siksi MMP-2 voi olla tärkeämpi rooli syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota.

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä syövistä maailmassa sekä johtava syy syövän kuolema, osuus yli miljoonaa kuolemantapausta vuosittain maailmanlaajuisesti [4]. Erityisesti, se on erittäin aggressiivinen ja metastaattisen kasvaimen johtuu todennäköisesti erittävät korkeampi MMP verrataan muihin syöpiin. Näin ollen MMP-2: n syöpäsoluja näyttää olevan mielenkiintoinen terapeuttinen kohde erittäin metastaattisen keuhkosyövän soluja. MMP ilmentymistä säätelee transkriptiotekijöitä (AP-1 ja NF-kB) kautta ylävirtaan väyliä kuten mitogeeni aktivoitua kinaasien (MAPK) ja PI3K-Akt reittejä [5]. MAPK koostuu kolmesta kinaasien, mukaan lukien ekstrasellulaarisen signaalin liittyvät kinaasi 1 ja 2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminaalinen kinaasi /stressiä aktivoitu proteiinikinaasi (JNK /SAPK), ja p38. MAPK ovat osallisina erilaisissa solun toimintoja, kuten solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion [3]. Aktivointi PI3K voivat stimuloida sen loppupään tavoite, Akt, ja sitten säätelevät solujen kasvua, adheesio, ja hyökkäys [6].

On ollut lukuisia raportteja tutkivat syövän kemopreventiivisten tai terapeuttisia aineita luonnontuotteista. Monet lajit merilevä on pitkään käytetty elintarvikkeiden ruokavalio ja myös dokumentoitu käytetään perinteisessä itämaisen lääketieteen yli 1000 vuotta [7], [8]. Ne sisältävät erilaisia ​​toiminnallisia komponentteja, kuten porphyran, gepsin, algiinihappo, ja oligosakkaridia. Fukoidani, joiden keskimääräinen moolimassa on noin 20000, on sulfatoitunut polysakkaridi uutettu ruskea merilevä ja koostuu L-fukoosia ja sulfaatti esteriryhmiä. Aiemmin on ehdotettu, että fukoidaanista on erilaisia ​​biologisia toimintoja, kuten antibakteerisia [9], antioksidantti [10], anti-inflammatoriset [11], antikoagulanttia [12], ja kasvaimen vastaisia ​​aktiivisuuksia [2]. C57BL /6-hiiriä, joihin on siirretty Lewisin keuhko- adenokarsinooma soluja, fukoidaanista päässä

Fucus evanescens

tuotettu kohtalainen antitumor ja anti-metastaattisen vaikutuksia ja voimisti anti-metastaattinen, mutta ei antituumoriaktiivisuuksia syklofosfamidin [13]. Lisäksi, fukoidaanista esti MMP-2/9 toimintaa ja invasiivisuus HT-1080-solujen ja muodostumista verisuonten tubulusten kautta tukahduttamalla ilmentymisen ja erittymisen angiogeneesitekijää [14]. Kuitenkin molekyyli mekanismi sen toiminta on harvoin ymmärretty vielä.

(A) aliyhtyvät A549-soluja inkuboitiin 48 tunnin ajan ilman tai läsnä fukoidani (0, 12,5, 25, 50, 100, ja 200 ug /ml) seerumittomassa RPMI-elatusaineeseen. Esikäsitelty väliaine kerättiin, ja niiden MMP-2-aktiivisuus arvioitiin käyttäen gelatiinitsymografialla. (B) MMP-2 aktiivisuutta analyysi tsymografialla kvantifioitiin mittaamalla juovien voimakkuudet käyttämällä Image J ohjelmisto. (C) kokonaismäärä solulysaateista tehtiin Western blot -analyysi tutkittiin anti-MMP-2-vasta-aine. (D) Expression of MMP-2: n analyysi Western blot kvantitoitiin mittaamalla juovien voimakkuudet käyttämällä Image J ohjelmisto. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD ja kuusi koetta. Merkittävä ero kontrolliryhmään, * p 0,05 ** p 0,01.

Tässä tutkimuksessa tutkittiin vaikutusta fukoidani muuttoliikettä, invaasio ja MMP-2 ilmentymistä ihmisen A549 keuhkosyövän soluja ja sen taustalla antimetastaattisia vaikutusmekanismeja.

Materiaalit ja menetelmät

valmistaminen Fucoidan ja reagenssit

Fucoidan ote merilevää

rakkolevä

saatiin Sigma (Sigma, St. Louis, Mo, USA). Fukoidaanista jauhe liuotettiin PBS: ään, sitten se steriloitiin käyttäen 0,45 um suodattimen, jonka huokoset (Sartorius Biotech GmbH, Göttingen, Saksa) ja tallennetaan ”fukoidaanista uutetta (20 mg /ml) 4 ° C: ssa käyttöön asti. MTT reagenssit ja gelatiini (G8150) ostettiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). RPMI 1640-väliaine ilman fenolipunaista, trypsiini-EDTA, penisilliini-streptomysiini-amfoterisiini B liuosta (10000 U /ml, 10 mg /ml, ja 25 ug /ml), naudan sikiön seerumia (FBS), ja fosfaattipuskuriliuosta (PBS) olivat Gibco BRL, Life Technologies (USA). LY294002 (PI3K-estäjä), U0126 (ERK1 /2-inhibiittori), ja rapamysiini (mTOR-estäjä) saatiin Tocris Cookson Ltd (Bristol, UK). For ERK1 /2, p38, JNK, Akt, mTOR (Ser2448), ja NF-kB, kokonais- ja /tai fosforyloidun proteiinin vasta-aineita ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Invaasiomääritys kit oli peräisin BD Biosciences (San Jose, CA, USA).

(A) A549-soluja maljattiin 12-kaivo ja kasvatettiin 90% konfluenssiin RPMI, joka sisälsi 10% FBS: ää. Solut raaputettiin pipetin kärjen ja sitten käsiteltiin fukoidani (0, 50, 100, ja 200 ug /ml). (B) Solujen vaellusetäisyydet arvioitiin mittaamalla leveys haavan. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD ja kuusi koetta. Merkittävä ero kontrolliryhmään, * p 0,05 ** p 0,01.

(A) Vaikutukset fukoidaanista syöpäsoluihin hyökkäystä tutkittiin käyttäen Cell invaasiomääritys Kit (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Tätä varten A549-soluja ympättiin ylemmän kammion Matrigel-käsitelty suodatin, ja inkuboitiin ilman tai kun läsnä on fukoidani (0, 50, 100, ja 200 ug /ml) 48 tunnin ajan. Tunkeutuvat solut alapinnalle kalvon visualisoitiin kristallivioletilla värjäämällä ja havaittu valomikroskoopilla. (B) määrä hyökkäävän solujen määrä määritettiin käyttäen Image J ohjelmisto. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta kokeesta. Merkittävä ero kontrolliryhmään, * p 0,05 ja ** p 0,01.

Cell Culture

A549-soluja ATCC: ltä (American Type Culture Collection, Manassas, VA) kasvatettiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää, 100 ug /ml penisilliiniä-streptomysiiniä-amfoterisiini B liuokseen 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa kosteassa inkubaattorissa. Solut siirrostettiin kolme kertaa viikossa käsittelemällä trypsiini-EDTA: lla ja niille jälkeen viisi kanavaa käytettiin kokeita varten.

(A) A549-soluja käsiteltiin fukoidaanista 200 ug /ml jaksojen 0, 1 , 3, 6, ja 9 tuntia, vastaavasti. (B) A549-soluja inkuboitiin 6 tuntia, jossa fukoidaanista eri pitoisuuksina (0, 50, 100 ja 200 ug /ml). Tasot fosfo-JNK: 1/2, fosfo-ERK 1/2, ja fosfo-p38 analysoitiin Western-blottauksella käyttämällä spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (C ja D) fosfory- taso ERK1 /2 kvantifioitiin analyysi Image J ohjelmisto. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkittävä ero kontrolliryhmään, * p 0,05 ** p 0,01.

(A) A549-soluja käsiteltiin fukoidaanista 200 ug /ml jaksojen 0, 1, 3, 6 , ja 9 tuntia, vastaavasti. (B) A549-soluja inkuboitiin 6 tuntia, jossa fukoidaanista eri pitoisuuksina (0, 50, 100 ja 200 ug /ml). Tasot fosfo-PI3K ja fosfo-Akt analysoitiin Western-blottauksella käyttämällä spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. Fosforylointireaktio tasot PI3K (C ja D) ja Akt (E ja F) kvantitoitiin analyysi Image J ohjelmisto. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkittävä ero kontrolliryhmään, * p 0,05 ja ** p 0,01.

(A) A549-soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan, jossa fukoidaanista eri pitoisuuksina (0, 50, 100 ja 200 ug: /ml). Fosforylointireaktio tasot mTOR, p70S6K ja 4EBP1 kvantitoitiin analyysi Image J ohjelmisto. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (B, C ja D) Yhtye intensiteettiä (fosforylaatio tasot) kunkin signalointimolekyylien kvantifioitiin analyysi Image J ohjelmisto. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta kokeesta. Merkittävä ero kontrolliryhmään, * p 0,05 ja ** p 0,01.

(A) Soluja esikäsiteltiin U0126 (10 tai 20 uM) (A), LY294002 (10 tai 20 uM ) (B), tai rapamysiini (1 tai 2 uM) (C) 2 tunnin ajan ja sitten inkuboitiin puuttuessa tai läsnä ollessa fukoidaanista (25 ug /ml) 48 tunnin ajan. Muutostyöt MMP-2 toiminta kvantitoitiin mittaamalla juovien voimakkuudet käyttämällä Image J ohjelmisto. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkittävä ero kontrolliryhmään, * p 0,05 ja ** p 0,01.

A549-soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan, jossa fukoidaanista eri pitoisuuksina (0, 50, 100 ja 200 ug /ml) . (EN) sytosolin uutetta valmistettiin ja analysoitiin Western-blottauksella fosfo-IkB ja fosforia ja päätyen NF-kB (p65). (B, C ja D) taso fosfo-IkB ja fosfori- ja koko NF-kB kvantitoitiin analyysi Image J ohjelmisto. GAPDH käytettiin lastaus valvonta sytosolifraktion ja Lamin B lataamisen valvonta tumafraktios-. Yhtye voimakkuudet kunkin signalointimolekyylien kvantifioitiin analyysi Image J ohjelmisto. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta kokeesta. Merkittävä ero kontrolliryhmään, * p 0,05 ** p 0,01.

MTT-määritys elinkykyyn

Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT (3- (4,5 dimetyyli-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) väheneminen määrityksessä, kuten on kuvattu aiemmin [15]. Lyhyesti, A549-soluja inkuboitiin tiheydellä 4 x 10

4 solua /kuoppa 24-kuoppaisilla levyillä 24 tunnin ajan. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla fukoidaanista 48 tuntia. Sitten MTT-väriainetta (5 mg /ml) lisättiin soluihin ja niitä inkuboitiin vielä 3 tuntia. Jälkeen väliaine poistettiin, DMSO lisättiin soluihin liukenemisen syntyy formatsaanin suoloja. Formatsaanituotteen määrän suolaa määritettiin mittaamalla optinen tiheys (OD) 540 nm: ssä käyttäen GENios® mikrolevyspektrofotometrillä (PowerWave

TMXS, BioTek Instruments, Inc., Winooski, USA). Suhteellinen solujen elävyys hoidon laskettiin prosentteina apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään ([OD käsiteltyjen solujen – OD tyhjiä /OD valvonta – OD tyhjä] x 100).

Haavan migraatiokokeessa

Cell migraatiomääritys suoritettiin käyttämällä 12-kuoppalevyillä, kuten on aiemmin kuvattu [16]. A549-soluja ympättiin 12-kuoppalevyille (1 x 10

5 solua /ml) ja kasvatettiin 80~90% konfluenssiin kokeilua varten. Sen jälkeen imemällä väliaine, solut raaputetaan 200 ui steriiliä pipetin kärki luoda suora naarmu. Ne pestiin kahdesti PBS: llä solujätteen poistamiseksi, ja sen jälkeen korvattiin täydellistä RPMI-1640: A549-soluja käsiteltiin fukoidani (0, 50, 100, ja 200 ug /ml) ja inkuboitiin 48 tunnin ajan. Solumigraation haavaan alue oli valokuvattu vaiheissa 0 h ja 48 h, vastaavasti, että kuva-analyysi kunkin hoidon. Taso solumigraation määritettiin käyttäen Hewlett-Packard skanneri ja NIH Image ohjelmisto (Kuva J), ja sitten se ilmaistaan ​​prosentteina kunkin ohjaus keskiarvo haavansulkemiseen alueella.

Cell invaasiomääritys

invasiivisia käyttäytymistä A549-solut testattiin soluinvaasiota kammio kit (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) [17]. A549-solut suspendoitiin uudelleen seerumittomaan RPMI 1640-alustassa (5 x 10

4 solua /200 ui) ilman tai kun läsnä on fukoidani (0, 50, 100 ja 200 ug /ml). Solut ympättiin ylemmän kammion Matrigel-käsitelty suodatin, ja RPMI 1640, joka sisälsi 10% FBS: ää, lisättiin 500 ui alempaan kammioon. Sen jälkeen, kun 48 tunnin inkuboinnin, ei-tunkeutuvat solut poistettiin ylemmältä pinnalta suodatinkalvo. Tunkeutuvat solut alapinnan suodattimen kalvo värjättiin kristallivioletilla 1 tunnin ajan ja huuhdeltiin vedellä ja kuivattiin. Määrä tunkeutumaan solujen alapinnan suodattimen kalvon määritettiin valomikroskoopilla ja NIH Image-ohjelmiston (Kuva J).

gelatiinitsymografialla

MMP-2 aktiivisuus määritettiin gelatiinitsymografialla [18]. Lyhyesti, A549-soluja ympättiin (1 x 10

5 solua /kuoppa) ja annettiin kasvaa yhtenäisiksi 24 tunnin ajan ja pidettiin RPMI 1640, jossa oli 10% FBS: ää. Solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin erilaisten konsentraatioiden fukoidani (0, 50, 100, ja 200 ug /ml) seerumittomassa RPMI 1640: ssa 48 tunnin ajan. Supernatantti kerättiin ja sekoitettiin ei-pelkistävissä näytepuskuriin, elektroforeesi 10% polyakryyliamidigeelillä, joka sisälsi 0,1% (w /v) gelatiinia. Elektroforeesin jälkeen geeli pestiin 30 min kahdesti 2,5% Triton X-100, ja inkuboitiin vielä 18 tuntia 37 ° C: ssa entsymaattinen reaktio MMP: iden tsymografialla reaktiopuskuria (200 mM NaCl, 10 mM CaCl

2 , 50 mM Tris-HCl, pH 7,4). Sitten geeli värjättiin Coomassie-sinisellä R-250 (0,125% Coomassie Blue R-250, 50% metanolia, 10% etikkahappoa) ja väri poistettiin (metanoli /etikkahappo /vesi, 40/10/50, v /v /v ).

valmistaminen solulysaateista

jälkeen fukoidani hoitoja, A549-soluja huuhdeltiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä, ja sitten lisättiin 100 ui lyysipuskuria (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,25% natriumdeoksikolaatti, 150 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM natriumortovanadaattia, 1 mM NaF, 1 mM Na-

3Vo

4, 1 ug /ml aprotiniinia, 1 ug /ml leupeptiiniä, 1 ug /ml pepstatiinia). Lyysi Reaktio suoritettiin jäällä keinutuoli 3 min ja solut kaavittiin käyttämällä kumikaavinta Eppendorf mikrosentrifugiputkille. Kaavinlämmönvaihdinta Solujen annettiin hajottamiseksi vielä 30 minuutin ajan jäillä ajoittain vorteksoimalla. Solujätteet poistettiin sentrifugoimalla (22000 x

g

, 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan) ja saatu supernatantti otettiin talteen ja määritettiin sen proteiinipitoisuus käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä reagenssia (Bio-Rad, CA USA). Näytteitä keitettiin SDS-näytepuskurissa kiehuvassa vedessä 5 min.

Western-blottaus

proteiinin osat (50 ug) erotettiin 12% SDS-polyakryyliamidigeelissä, siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Bio-Rad, CA USA), ja tämän jälkeen alistettiin immunoblot-analyysillä käyttäen spesifisiä primaaristen vasta-aineiden yön yli 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Täplät visualisoitiin sitten käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin menetelmällä (ECL, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) sinisellä valoherkkiä kalvo (Fujifilm Corporation, Tokio, Japani). Tarvittaessa blotattiin kalvot irrotettiin ja uudelleenseulottiin muilla ensisijainen vasta-aineita. Densitometria analyysi suoritettiin Hewlett-Packard skanneri ja NIH Image ohjelmisto (Kuva J).

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta (S.D.). Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) käytettiin arvioimaan merkitystä ero näiden kahden keskiarvoa. *

P

0,05 ja **

P

0,01 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Fucoidan inhiboi MMP -2 A549 ihmisen Lung Cancer Cells

sen määrittämiseksi ei-sytotoksisia pitoisuus fukoidani, A549-soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien fukoidaanista (0-1000 ug /ml) 24 tunnin ajan tai 48 tunnin ajan, ja sitten solujen elinkyky määritettiin käyttämällä MTT-määritystä (tuloksia ei ole esitetty). Fukoidaanista ei osoittanut mitään merkittävää toksista vaikutusta A549-solujen konsentraatio 0-200 ug /ml. Suuremmilla pitoisuuksilla (400-1000 ug /ml), mutta fukoidaanista esti soluproliferaatiota ja laski solujen elinkelpoisuuden pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Näin ollen, esillä olevassa tutkimuksessa käytetään hoidettaessa fukoidaanista pitoisuuksina yhtä suuri tai pienempi kuin 200 ug /ml, jossa ei ole merkittävää sytotoksista vaikutusta A549-solujen havaittiin.

hajoamista soluväliaineen (ECM) on ratkaiseva solujen invaasio, osoittaa väistämätön osallistumista matriisin hajottavien proteinaasit prosessin. Näin ollen arvioitiin vaikutusta fukoidaanista on MMP-2-aktiivisuus, joka on keskeinen molekyyli ECM hajoamista, gelatiinitsymografialla. Kuten kuviossa 1A on esitetty, fukoidaanista vaimentaa MMP-2-aktiivisuuden konsentraatiosta riippuvaisella tavalla. Toisaalta, vaikutus fukoidaanista on MMP-9-aktiivisuus oli epäselvä, koska on vain hyvin alhainen sisäinen MMP-9 -aktiivisuuden havaittavissa A549-soluja (tietoja ei esitetty). MMP-2-aktiivisuus väheni 36%, 53% ja 72% 50, 100, ja 200 ug /ml, vastaavasti, sen jälkeen, kun hoidon fukoidaanista 48 tuntia (Fig. 1 B). Saadut tulokset tsymografialla varmistettiin vielä Western blot -analyysillä. MMP-2: n ilmentymisen vähitellen pieneni kasvavilla pitoisuuksilla fukoidaanista (Fig. 1 C). Proteiini taso väheni 38%, 48% ja 60% 50, 100, ja 200 ug /ml, vastaavasti. Vähentäminen MMP-2 aktiivisuus johtui todennäköisesti laskusta MMP-2: n ilmentymisen (Fig. 1B ja 1D).

Fucoidan estää Migration A549 Cells

Solun muuttoliike on mitta metastasoituneen mahdollisia syöpäsoluja. Vaikutukset fukoidaanista solun maahanmuuttoa tutkittiin käyttäen haavan paranemista määritystä. A549-soluja käsiteltiin fukoidaanista osoitti vähentäminen muuttoliikkeen (Fig. 2A). Kuten on esitetty kuviossa 2B, solumigraatio inhiboituu jopa 25%, 46%, ja 57% 48 h: n läsnä ollessa 50, 100, ja 200 ug /ml fukoidani, vastaavasti. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että fukoidaanista voi tukahduttaa muuttavien omaisuutta keuhkosyövän soluja.

Fucoidan Estää invaasiota A549 Cells

Valaistaan ​​estävä vaikutus fukoidaanista annetun hyökkäystä A549-solut, se oli testattu invaasio kammio kit (BD Bioscience, San Jose, CA, USA), jossa solut tunkeutuvat poikki soluväliaineen, kuten Matrigel-käsitelty suodatin kammiossa. Kuten kuvassa 3A, määrä solujen invaasiota (kristallin violetti värjäys) vähensi huomattavasti pitoisuudesta riippuvaisella tavalla, mikä viittaa fukoidaanista voi estää hyökkäyksen A549-soluja. Estovaikutukset fukoidaanista on syöpäsoluinvaasiota olivat 35%, 68% ja 86% pitoisuuksina 50, 100, ja 200 ug /ml fukoidani, vastaavasti (Fig. 3B). Nämä tulokset osoittivat, että fukoidaanista voi suoraan estää invasiivisia potentiaalia keuhkosyöpäsolua.

Fucoidan Estää MMP-2 Activity estämällä ERK1 /2 ja PI3K-Akt Pathways A549 Cells

Meidän tulokset osoittivat, että fukoidaanista dramaattisesti estää muuttoliike, invaasio ja MMP-2 aktiivisuus A549-soluja. Kuitenkin signaali -mekanismit estävää vaikutusta fukoidaanista on etäpesäkkeitä jäävät selvittämättä. Useat todisteet viittaavat siihen, että MAPK (JNK 1/2, ERK 1/2, ja p38) tärkeitä rooleja syöpäsolujen muuttoliike, invaasio, ja MMP-2 aktiivisuus [5]. Ottaen huomioon voimakas anti-metastaattisen potentiaalin fukoidani, se testattiin, onko se voi säädellä signaalin transductions ja MAPK metastaattisessa keuhkosyövän soluja. Tulokset Kuviossa 4 osoitti, että fukoidaanista vähensi fosforylaatiota ERK1 /2 on pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla, kun se oli lähes olematon tai vähäinen, jos lainkaan vaikutusta p38 ja JNK1 /2. Kuten kuviossa 4A ja 4C, ajasta riippuva tutkimus osoitti, että fukoidaanista alennetaan asteittain fosforylaation ERK1 /2 1 h ja 9 h käsittelyn jälkeen. Kuva 4B ja 4D osoitti fukoidaanista estivät merkittävästi fosfo-ERK1 /2 pitoisuudesta riippuvaisella tavalla enimmillään estävä vaikutus on suurin pitoisuus (200 ug /ml). Lisäksi MAPK, solun signalointi PI3K /Akt on myös ehdotettu keskeinen toimija säätelyssä MMP-2: n aktiivisuuden [19]. Nykyinen tutkimus osoitti, että fukoidaanista merkittävästi esti fosforylaatiot PI3K ja sen loppupään tavoite, Akt, joka pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (Kuva. 5). Näiden tulosten perusteella, fukoidaanista voimakkaasti inhiboi metastaattista aktiivisuutta ihmisen keuhko- syöpäsoluja, mahdollisesti mukaan suppressioita ERK1 /2 ja PI3K-Akt reittejä.

Fucoidan vaimentaa mTOR Signaling

Se on ollut raportoitu, että PI3K liittyy useita soluprosesseja, kuten proliferaatiota, erilaistumista, apoptoosia, solun liikkuvuus, invaasion ja angiogeneesin [20], [21]. Signalointi mTOR on noussut erityisen kriittinen tiedoksiannon PI3K signaalinvälitysreitin erilaisissa ihmisen syövissä [22]. Perustuen havaintoon, että fukoidaanista estää PI3K-Akt-reitin ihmisen keuhkosyövän soluja, tutkittiin fukoidaanista moduloi mTOR ja sen loppupään signalointi molekyylejä. Kuten kuviossa 6A ja 6B, fukoidaanista inhiboi fosforylaatiota mTOR konsentraatiosta riippuvaisella tavalla. Lisäksi 4E-BP1 ja p70S6K, kaksi välittömästi alavirtaan tavoitteet mTOR ja indikaattoreita mTOR aktiivisuuden, olivat myös merkittävästi tukahdutti (Fig. 6C ja 6D).

Fucoidan Estää MMP-2 Activity estämällä ERK1 /2 ja PI3K-Akt-mTOR Pathways A549 Cells

vahvista, onko MMP-2 aktiivisuutta fukoidaanista pääosin luottaa sen tukahduttamista ERK1 /2 ja PI3K-Akt-mTOR reittejä A549-soluja esikäsiteltiin vuonna läsnäolo tai puuttuminen U0126 (ERK-inhibiittoria), LY294002 (PI3K-estäjä) tai rapamysiini (mTOR-estäjä) 2 tunnin ajan, sitten tutkitaan vaikutuksia fukoidaanista hoidon (Fig. 7). Verrattuna vastaavaan ajoneuvon hallintalaitteita, yksittäisiä hoitoja U0126 (Fig. 7A, kaista 3 ja 4), LY294002 (Fig. 7B, kaista 3 ja 4) tai rapamysiiniä (Fig. 7C, kaista 3 ja 4) saatiin merkittävä väheneminen MMP-2: n aktiivisuutta. Tulokset ovat samansuuntaisia ​​kuin fukoidaanista kokeita esillä tutkimuksessa että MMP-2 eston voidaan välittyy modulaatiot ERK1 /2, PI3K-Akt ja /tai mTOR reittejä. Kuvataan Yksityiskohtaisemmin yhteiskäsittely ja U0126 (10 uM ja 20 uM) ja fukoidaanista edelleen vähentää MMP-2-aktiivisuuden 66% ja 75% verrattuna U0126 yksinään (46% ja 65%) (Fig. 7A). Samalla tavalla yhdistetty hoitoja LY294002 ja fukoidaanista lisäksi vaimentaa MMP-2-aktiivisuuden 65% ja 86% verrattuna LY294002 yksinään (27% ja 43%) (Fig. 7B). Kuitenkin toisin kuin muut, rapamysiinin ja fukoidaanista yhteiskäsittely ei anna ylimääräistä laskua MMP-2: n aktiivisuuden verrattuna rapamysiinin yksin (kuvio. 7C). Sitä ei ole vielä ymmärretty, miksi ei ollut additiivinen eikä synergiavaikutuksia rapamysiinin fukoidaanista. Yhteenvetona esto MMP2 by fukoidaanista hoito on mahdollisesti näytteillä porrastusten ERK1 /2 ja /tai PI3K-Akt-mTOR reittejä. Nämä tulokset ehdotti mahdollisesta terapeuttisesta fukoidaanista anti-metastaattisen aine ihmisen keuhkosyöpäpotilaiden.

Fucoidan Vähentää tumaansiirtymiseen NF-KB

NF-KB-reitin on osoitettu luottaa upon peräkkäin aktivoitu kinaasireaktiosarjojen [23]. Aktivointiin, NF-KB translokoituu päässä sytoplasmasta osaksi tumaan ja säätelee ilmentymistä erilaisia ​​kohdegeenien, kuten MMP [5]. Koska NF-KB voi olla keskeinen rooli MMP-2-geenin ilmentyminen, vaikutukset fukoidaanista arvioitiin IκBα ja NF-KB: n signaalitransduktion. Kuten kuviossa 8A ja 8B, fukoidaanista inhiboi fosforylaatiota IκBα konsentraatiosta riippuvalla tavalla, kun taas koko IκBα käänteisesti kasvoi fukoidaanista. Kun noudatetaan tämän, fosfo-p65, indikaattorina NF-KB: n aktivoitumisen kautta IκBα hajoamisen, pienennettiin käsittelemällä fukoidaanista (Fig. 8A ja 8C), joka on liitetty lisääntyminen koko p65 in sytosolifraktion ja sen pienentää ydin- osa (Fig. 8A ja 8D). Tulokset osoittivat, että fukoidaanista esti merkittävästi NF-KB: n A549-soluihin.

Keskustelu

On hyvin tunnettua, että MMP: t tarjoavat pääsyn kasvainsolujen verisuonten ja imusuonten, joka tuki kasvaimen kasvua ja muodostavat pakotien edelleen levitettäväksi [24]. Lisäksi MMP edistää pahanlaatuisiksi alkuvaiheessa syöpä ja estää syöpäsolujen apoptoosin ja parantaa angiogeneesiä sekä tuhota kemokiinien tasapaino isännän anti-kasvain puolustusjärjestelmä [25]. Niinpä estämällä MMP toimintaa ja ilmentyminen voi johtaa kehitystä tehokkaan hoidon metastaattisen syöpäpotilailla. Vaikka monet tutkijat ovat pyrkineet kehittämään mahdollisia syöpälääkkeiden MMP-inhibiittorit, useimmat kliinisissä tutkimuksissa ei ole saatu onnistuneesti päätökseen vielä [26].

Etsiessään tehokkaita metastaattisen vaimentimet, monenlaisia ​​luonnontuotteita ja niiden farmakologinen ainesosat voivat olla hyvä lähde löytää lupaavia ehdokkaita, joilla on useita etuja verrattuna synteettisiä kemikaaleja sivuvaikutuksia ja farmakoforin monimuotoisuuteen. Osa heistä eri luonnonvaroista on jo ominaista mahdollisina terapeuttisina anti-metastaattinen aktiivisuus [27]. Niistä fukoidaanista on paljastunut olevan antiproliferatiivisia ja sytotoksisia vaikutuksia MCF-7-rintasyöpäsolut, mutta ei ihmisen rintarauhasen epiteelisolut (HMECs) [28]. Äskettäin fukoidaanista on osoitettu estävän etäpesäkkeiden kautta MMP-2 /-9 suppressio sekä alistaa ilmentymistä ja erittymistä on vaskulaarinen endoteelikasvutekijä (VEGF) [14]. Anti-metastaattisen aktiivisuuden fukoidaanista on myös osoittautunut, että eläinmallissa kokeellisen siirrettyjen Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) [13]. Kuitenkin estävä mekanismi syövän etäpesäkkeitä ei ole selkeästi selvitetty yksityiskohtaisesti vielä. Ensimmäistä kertaa, tässä tutkimuksessa, se on ainakin osittain tunnistettu anti-metastaattisen molekyylimekanismi fukoidaanista.

tila solujen elinkykyisyys arvioitiin käyttäen MTT-määritystä puuttuessa tai läsnä ollessa eri pitoisuuksina fukoidaanista . Fukoidaanista inhiboi solun kasvua 400 ug /ml, mutta ei välillä 0-200 ug /ml, jossa se tehokkaasti inhiboivat maahanmuuttoa ja invaasiota ilman merkittävää sytotoksista vaikutusta. Näin ollen, anti-invasiivisen ja anti-muuttavien vaikutusten fukoidaanista havaittiin tässä tutkimuksessa ei ollut riippuvainen anti-leviämisen vaikutuksia. Tehostaminen MMP-2 aktiivisuus on hyvin tunnettu erittäin metastaattinen ihmisen keuhkosyövän soluihin [29]. Kuitenkin MMP-9 on edelleen epäselvä, koska on vain erittäin alhaiselle tasolle MMP-9 havaitut A549 ihmisen keuhko- syöpäsoluja. Perustuvat tämänhetkisiin tutkimuksessa antimetastaattisia vaikutuksia fukoidaanista näyttävät välittyvän sen inhiboiva vaikutus MMP-2. (Kuviot. 1, 2 ja 3). Tuloksemme osoittavat, että fukoidaanista vaikutus on enemmän kuin tukahduttaminen MMP-2: n eritystä ja /tai ekspressiota mieluummin kuin suora inhibitio sen toiminnan.

ERK1 /2 reitin on mukana invasiivisia tai vaeltavien käyttäytymistä numero maligniteetteja, kuten paksusuolen syöpä, melanooma, rintasyöpä, ja eturauhasen syöpä ja tämä on vakiintunut aiemmissa tutkimuksissa [30] – [32]. Lisäksi ERK1 /2 säätelee fokaalisen adheesion ja solun tukirangan uudelleenjärjestelyn kautta fosforylaatiot erityisten solun tukirangan ja polttovälin tarttuvuus proteiineja, kuten paksilliini, FAK, myosiinin kevytketju kinaasi [33]. Kuten kuviossa 4 on esitetty, anti-metastaattinen vaikutus fukoidaanista on koska sen inaktivoitumisen ERK1 /2 väylän A549 ihmisen keuhko- syöpäsoluja. Sen lisäksi, ERK1 /2, PI3K-Akt signaalireitin on osoitettu säädellä ja metastaasit ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) sekä kehitystä ja edistystä useita muita kasvaimia. Toisin sanoen, PI3K yli-ilmentyminen korreloi kehittämiseen, invaasio ja etäpesäkkeiden NSCLC [34]. Useat muut tutkimukset ovat myös osoittaneet, että kohdistaminen on PI3K-Akt signalointireitin antisensellä, siRNA tai pienmolekyylisalpaajien tuloksia säätely alaspäin kasvaimen invaasion ja tuumorigeneesiä pahanlaatuisten syöpäsolujen [6], [35].