Krooninen sairaus

tiivistelmä

Yhä useampi pahanlaatuisia kasvaimia on osoitettu alkavan ja käyttövoimana pienten alaryhmien syövän kantasoluja (CSC). Kuitenkin onko kasvain aggressiivisuus ohjaavat CSC ja missä määrin tämä ominaisuus voi olla merkitystä sisällä kasvain massa on edelleen epävakaa. Ongelman ratkaisemiseksi, olemme eristäneet harvinainen tuumorisolupopulaatioon pohjalta sen CD44

+ CD24

– fenotyyppi ihmisen androgeenista riippumattoman eturauhaskarsinoomasolulinjaa linja DU145 ja vakiinnuttanut CSC ominaisuuksia. Käyttäytymistä valittu CSC tutkittiin suhteessa bulk DU145-soluja. Injektio CSC nude-hiirissä, syntyy erittäin verisuonittuneita kasvaimia tunkeutuu viereisiin kudoksiin, mikä osoittaa korkea tiheys neuroendokriinisoluissa ja ilmentävät alhainen E-kadheriinin ja β-kateniinin sekä korkea vimentiinista. Sitä vastoin, kun vertailukelpoinen määrä lajittelemattoman DU145 solua injektoitiin tuloksena kasvaimet olivat vähemmän aggressiivisia. Tutkia eri ominaisuuksia kasvaimia

in vivo

, vaikutus eriytetyn kasvainsolujen CSC tutkittiin

in vitro

kasvattamalla CSC puuttuessa tai läsnä kunnostetun alustan välillä DU145 soluista. CSC kasvanut sallivissa olosuhteissa erilaistuneet solupopulaatioiden ominaisuuksia kaltaisia ​​soluja pidettiin aggressiivinen kasvaimet syntyvät CSC injektion. Eri tavalla, väliaine indusoi CSC erilaistumaan soluun fenotyyppi on verrattavissa solujen tuskin aggressiivinen kasvainten peräisin irtotavarana DU145 solujen injektio. Nämä havainnot osoittavat ensimmäistä kertaa, että CSC pystyvät tuottamaan erilaistuneet solut ilmentävät joko erittäin tai tuskin aggressiivinen fenotyyppiin, siis vaikuttavat eturauhassyövän etenemistä. Kohtalo CSC määritettiin signaalit vapautuu kasvain ympäristössä. Lisäksi käytetään mikrosiruanalyysi valitsimme joitakin molekyylejä, jotka voivat olla mukana tässä solusta-soluun signaloinnin, mitä reittejä niiden mahdollinen vastine ennustetekijöitä tai terapeuttisia sovelluksia.

Citation: Salvatori L, Caporuscio F, Verdina A, Starace G, Crispi S, Nicotra MR, et ai. (2012) Cell-to-Cell Signaling vaikuttaa Fate of Eturauhassyöpä Kantasolut ja niiden mahdollinen tuottaa enemmän Aggressiivinen kasvaimia. PLoS ONE 7 (2): e31467. doi: 10,1371 /journal.pone.0031467

Editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerchen (CNR), Italia

vastaanotettu: 8. kesäkuuta, 2011; Hyväksytty: 9. tammikuuta 2012 Julkaistu: 06 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Salvatori et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain Italian terveysministeriön (PRIN 2006062242). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhasen adenokarsinooma (PCA) on johtava kuolinsyy miehillä Yhdysvalloissa ja Länsi-Euroopassa [1]. Koska sen androgeeniriippuvaisen kasvu, hormoniablaatiohoito edelleen tärkein metastaattisen sairauden. Vaikka aluksi tehokasta, tämä hoito seuraa muutaman vuoden kasvaimen uusiutumisen [2], jossa androgeeni-riippumaton neuroendokriinisten (NE) solujen ala- populaation ajatellaan olevan tärkeä rooli [3], [4]. NE-solut ovat lepotilassa, terminaalisesti erilaistuneet solut tunnettu dendriitin kaltaisia ​​prosesseja, joka ulottuu vierekkäisten solujen välillä, ja että ne ilmentävät hermosolujen: n kaltaisten proteiinien, kuten CD56 ja kromograniini A: n (CGA), jotka sisältyvät tiheä sytoplasman rakeita [5]. Kautta eritystä neuropeptidien NE-solujen aktiivisuuden moduloimiseksi normaalin eturauhasen epiteelissä, mutta ovat myös omiaan vaikuttamaan vierekkäisten transformoitujen epiteelisolujen kautta paracrine signaaleja, mikä puolestaan ​​edistää kasvaimen kasvua ja metastaattista kykyä [5] – [7]. Itse asiassa lisääntynyt NE solupopulaation PCA arvellaan liittyvän aggressiivisempi sairaus, kun taas pieni määrä NE solujen kasvainkudoksessa ei ole erityistä prognostista merkitystä [6], [8], [9]. Mielenkiintoista on, että sekä NE ja sekretorisen epiteelin linjaa ovat peräisin yhteisestä pluripotentti eturauhasen kantasolun [10].

Lisäksi perus-mekanismi, joka osallistuu etenemisen PCa on vähentynyt ilmentyminen E-kadheriinin, pääasiassa transmembraaninen adheesiomolekyyli vastuussa solu-solu-vuorovaikutuksiin ja kudosten organisaation epiteelisoluissa [11], [12]. Kautta sytoplasminen domeeni, se sitoo β-kateniinin, joka vaikuttaa solun tukirangan järjestely [13]. Tämän seurauksena menetys E-kadheriinin toiminto tai lauseke pidetään tärkeä tapahtuma häiriöitä solun soluadheesion ja solun tukirangan arkkitehtuurin ja hankinnan invasiivisen fenotyypin kasvainsoluissa [14]. Erityisesti PCA pienempi ilmentyminen E-kadheriinin liittyi kehittyneempien kasvaimen vaiheen ja laatu [15], [16]. Huonosti eriytetty eturauhasen kasvaimia osoitti myös korkeampia ilmentymisen vimentiinin, joka on solun tukirangan komponenttien tehtävänä on ylläpitää solujen eheyden, ja korkea vimentiinista korreloi invasiivisen kapasiteetti eturauhassyövän solulinjoissa, mukaan lukien DU145 [17].

Perinteisesti kasvaimia on katsottu koostuvan heterogeenisen solujen vertailukelpoisia rajoittamaton proliferatiivinen ja Tuumorigeenisuustutkimuksissa. Kuitenkin, äskettäin on oletettu, että vain harvoissa solujen kasvain, joka on nimetty syövän kantasoluja (CSC), pystyvät lisääntymään laajasti ja ne ovat tuumorigeenisia, kun taas suurin osa solujen kasvaimen massan osoittavat eriasteisia erilaistumista ja tehdään rajoitettu määrä rajapintoja. Niiden osuus kasvaimen kasvua ja metastatization pidetään melko rajallinen. Tärkeää on, tämä malli merkitsee tarvitaan uusi terapeuttinen lähestymistapa erityisesti kohdennettu CSC pyrittäessä lopullisesti poistamaan kasvain [18]. Kuitenkin onko kasvain aggressiivisuus ohjaavat CSC ja missä määrin tämä ominaisuus saattaa olla biologisesti merkityksellinen sisällä luonnossa esiintyvä kasvain massa on vielä selvittämättä.

Koska läsnäolo CSC PCA [19] ja eturauhassyövän solulinjoissa [20] äskettäin osoitettiin pohjalta pinnan antigeenisen profiilin CD44

+ /α

2β

1

hi /CD133

+ ja CD44

+ CD24

– vastaavasti esillä tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan osuus CSC kasvaimen etenemiseen. Me eristetty CD44

+ CD24

– varsi kaltaisia ​​syöpäsolujen androgeenisäädellyn riippumaton eturauhassyöpäsolulinja DU145 johdettu aivometastaasi ihmisen PCA osoittivat CSC ominaisuuksia, ja tutkitaan niiden fenotyyppi ja käyttäytymisen suhteen pääosa DU145 soluja. Tärkeää on, tässä mallissa eturauhassyövän havaitsimme, että CSC pystyivät tuottamaan erittäin aggressiivinen kasvaimia NOD /SCID-hiirissä ja että tätä potentiaalia rajoitti läsnäolo eriytetty DU145 solujen seurauksena kasvua vähemmän aggressiivisia kasvaimia. Johdonmukaisesti, kasvattamalla CSC kunnostetussa alustassa alkaen DU145 soluista

in vitro

, esittelimme että diffusible tekijöitä vapautuu eriytetty kasvainsolut pystyivät hillitä CSC alkaen erilaistumaan solupopulaatioiden osoittaa aggressiivista fenotyyppi ja ominaisuuksia kaltaisia solujen pidettiin kasvaimia syntyy hiiriä injektion CSC. Lopuksi toiminnallinen analyysi geenien löytyi differentiaalisesti ilmaistut CSC ja DU145 solut microarray-analyysi vahvisti keskeinen rooli solu-solusignalointimolekyylien määrittää käyttäytymistä CSC. Lisätutkimukset suoritetaan myös muissa malleissa eturauhassyövän saattaa antaa prognostista tai terapeuttista arvoa tämän allekirjoituksen.

Tulokset

eristäminen ja karakterisointi CSC peräisin DU145 syöpäsolujen

DU145 solut rikastettiin fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) populaatiota ilmentävien CD44

+ CD24

– [20], joka oli noin 10% bulk DU145 soluja (kuvio 1A). Testasimme varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia valittujen solujen kiistatta kuvata niitä eturauhasen CSC. Hyvin pieni osa CD44

+ CD24

– eristettyjä soluja pystyi aikaansaamaan tarttumattomia pallomainen klustereita, kutsutaan rakeita prostaspheres, seerumittomassa väliaineessa täydennettynä EGF, bFGF ja insuliini (Serum Replacement Medium, SRM ). Sferoidia kasvoivat hyvin hitaasti saavuttaen koko noin 300 mikrometriä 6-8 viikon kuluessa (kuvio 1 B). Kuten odotettua, sferoidit rikastettiin CD44

+ CD24

– soluja, määritettynä molemmat immunofluoresenssilla (IF) värjäys (tietoja ei esitetty) ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (Q-PCR) analyysi, jossa vertailukelpoiset tulokset. Itse asiassa pallosia CD44 mRNA ilmentyi tasoisena DU145 soluihin, kun taas ilmaus CD24 oli merkittävästi pienempi (kuvio 1 C).

(A) FACS-analyysi CD44 ja CD24 ilmentymisen DU145 soluissa. (B) Culture eristettyjen CD44

+ CD24

– kasvavien solujen SRM kuin tarttumaton prostaspheres (5 x tavoite). (C) Q-PCR CD44 ja CD24 ilmaisun sferoidiviljelmiä ja DU145 soluja. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM 3 kokeesta. *,

p

0,05

vs

DU145 soluja. (D) kyky uusiutua sferoidi-. Seerumin lisäravinteiden ja peruuttamisen kasvutekijöiden aiheuttaa kasvun pallomaisten solujen adherentteina solujen morfologia (E), proliferaationopeus (F) ja ilmaus vimentiinista (G) verrattavissa DU145 soluihin. Valokuvia pallomaisten solujen otettiin mukaisesti faasikontrastimikroskooppia 10 ja 20 päivää kasvun FBS sisältävässä väliaineessa (20 x). Edustaja western blotit osoittavat ilmentymistä vimentiinista ja β-aktiini on pallomainen soluja kasvatettiin FBS-täydennetty väliaine suhteen kontrolloida sferoideja ja DU145-soluissa. Histogrammi ilmaisee densitometristä määrällinen vimentiinista normalisoida p-aktiini tasot. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta. (H) Kasvaimen esiintyvyys ja latenssi injektion jälkeen 1 pallomainen, 5000 tai 3 x 10

6 DU145 soluja NOD /SCID-hiiriin.

Pallot sisälsivät pitkäaikaisia ​​itseuudistuvien soluja, kuten osoittaa kyky osa solujen erottaa sferoideja tuottaa uusia prostaspheres kestivät yli 5 kohdat (kuvio 1 D).

Havaitsimme, että pallomainen soluilla erilaistumista kapasiteettia. Itse asiassa, kun se poistetaan kasvutekijöiden ja altistettiin 10% FBS: ää sisältävässä väliaineessa, huomattava osa pallomaisten solujen tuli kiinnittynyt, kasvoi tasainen yksikerroksinen ja se osoitti heterogeeninen morfologia hyvin samanlainen DU145-soluissa sen jälkeen, kun 20 päivää (kuvio 1E). Vuonna alkuaikoina kasvu näillä sallivassa olosuhteissa, pallojakaantuminen solut osoitti kaksinkertaistaa aikaa noin 50 tuntia, joka vähitellen laski jopa leviämisen nopeus DU145 solujen eli 30 h, alkaen 15 vuorokauden viljelyn (kuvio 1 F). Lisäksi vahvistaa ulkonäkö fenotyypin DU145 eriytetyn syöpäsolujen olemme analysoineet ilmentymisen välissä hehkulangan proteiinin vimentiinista. Itse asiassa, vimentiinistä ilmentyminen on raportoitu moduloitu aikana solujen kypsymisen mukaan solulinjaan [21] ja sen havaittiin erittäin ilmaistu DU145 solulinjassa [17]. Oikeastaan, kun 20 päivää FBS-täydennetty medium, vimentiinistä-negatiivisia soluja, jotka ovat peräisin pallosia ilmaisi vimentiinista vastaavia määriä kuin DU145 soluihin (kuvio 1G).

Lopuksi määritetään kasvain tuottavien kyky pallomainen solujen suhteessa lajittelemattomien DU145 soluja immuunivajaisiin hiiriin. Injektio 1 pallomainen 300 um, joka sisälsi noin 5000 soluja, johti kasvaimia 80% hiirissä, kun taas injektio 5000 bulk DU145-soluja syntyy kasvaimia 40%: lla eläimistä (kuvio 1 H). Lisäksi kasvaimen latenssi oli lyhyempi sferoidi-hiiriin on injektoitu kuin hiirissä, joihin injektoitiin lajittelemattoman soluja (37 ja 54 päivää, vastaavasti). Injektio 3 x 10

6 DU145-solut, joita käytettiin kontrolleina, syntyy kasvainten, jolla on pienin viive kaikkien hiirissä. Yhdenmukainen aiemman raportin [20], kaikki yhdessä tuloksemme osoittavat, että CD44

+ CD24

– sferoidiviljelmiä solujen läsnä keskeisiä biologisia ominaisuuksia CSC koska ne osoittivat kykyä itseuudistumisen, kykenivät erilaistumaan vanhempien DU145 soluihin ja olivat tuumorigeenisemmiksi kuin suurin DU145-solut, kun sama määrä soluja injektoitiin hiiriin.

heterogeeninen koostumus pallosia

Pallot jopa 300-400 um osoitti kompakti arkkitehtuuria (kuvio 2A), koska läsnä on erittäin tiukka solu-solu kontakteja, joita on nähty transmissioelektronimikroskopia (TEM). Suuritehoiset suurennus osoitti useiden liitoskohtien muodostamien kompleksien desmosomit ja kiinnittynyt liittymissä (kuvio 2B). Sferoidiviljelmiä solut esitti myös tumahuokonen komplekseja järjestetään annulate lamellit (kuvio 2C), joita pidetään esiasteita kokoonpanossa ydinvoiman kääriä. Ne ovat tyypillisesti läsnä alkion ja epäkypsiä soluja ja häviävät erilaistumisen [22]. Kuitenkin sferoidit myös pitää erilaistuneet solut, että näissä viljelyolosuhteet selektiivisiä kantasoluja, osoitti useita tasoja solun hajoamisen. Erityisesti ominaista sytoplasman blebs näkyivät (kuvio 2D), mikä osoittaa, että alentava vaihe lähestyi solunekroosia (kuvio 2F), kun taas ytimet ilmestyi enimmäkseen ennallaan (kuvio 2E). Nämä vahingot osoittavat terminaalin kohtalo erilaistuneita soluja.

(A) Faasikontrasti- arviointi sferoidiviljelmiä rakenteen (10 x). (B) TEM-analyysi osoittaa desmosomeja ja tarttuu risteyksissä (ylhäällä ja alhaalla, vastaavasti) sekä annulate lamellit (C) pallomainen soluissa. (D) Faasikontrasti- (20 x) fragmentin pallomaisten ympäröivät solut ominaista ulkonevat blebs tyhjien solulimassa, joka esittää ehjä ytimiä, kuten on esitetty DAPI värjäytymistä (40 x, ​​E). (F) Värjäys trypaanisinisellä osoittaa kuolleiden solujen pallosia (10 x). Immunofluoresenssi osan sferoidien ja DU145-soluja (alkuperäinen suurennos x 200), jotka osoittavat ilmentymisen E-kadheriinin (G), β-kateniinin (H) ja vimentiinin (I).

Pallot ja DU145-soluja arvioitiin myös ilmentymisen merkkiaineiden varren (E-kadheriinin ja β-kateniinin [23] – [25]) ja erilaistuneita soluja (vimentiinista). Immunofluoresenssivärjäyksen tunnistettu E-kadheriinin ja β-kateniinin ilmentymistä molemmissa solupopulaatioissa, mutta korkeammalla tasolla pallosia (kuviot 2G ja 2H, vastaavasti). Erityisesti, koska pallomainen soluissa E-kadheriinin ja β-kateniinin värjäys paikallistettiin solukalvon, kun taas DU145-soluissa se oli pääasiassa sytoplasmista, mikä osoittaa, että eriytetty kasvainsolut olivat melko riippumattomia solu-solu-vuorovaikutuksiin. Kypsä fenotyyppi DU145 solujen mukana korkea ilmentymä vimentiinista, joka, päinvastoin, oli ilmaista vain harvoissa soluja pallosia (kuvio 2I). Siksi voimme päätellä, että pallosia rikastetaan CSC mutta myös todennut jotkut vahingoittuneet erilaistuneita soluja tarkoitus kuolion.

Analyysi kasvaimia kasvanut hiirillä

vertailu kasvaimia syntyy NOD /SCID-hiiriin injektion jälkeen 1 sferoidi (joka sisälsi noin 5000 solua yhteensä, kun otetaan huomioon sekä CSC ja vaurioituneet erilaistuneita soluja) tai 5000 lajittelemattoman DU145 soluja (jotka sisältävät pääasiassa erilaistuneet solut ja hyvin pieni osa CSC), useat makroskooppisen erot näkyivät aikaan kasvaimen leikkaaminen. Kasvaimet alkaen sferoidia kasvoi syvästi injektiokohdassa, hyökkäsi viereisten kudosten ja osoitti selvästi vascularization. Toisin, kasvaimet ovat peräisin DU145 solun injektio kasvoi pinnallisesti ja näytti hyvin rajattua ja mobiili suhteessa ympäröiviin kudoksiin. Näkyvä alukset olivat harvinaisia ​​tai poissa (tuloksia ei ole esitetty).

Nämä erot varmistettiin histologista analyysiä varten. Sferoidiviljelmiä johdettu kasvaimia koostuu monomorfista solujen suurella tuma /sytoplasma-suhde ja esitetään selvästi infiltratiivinen kasvua ominaista bändejä tunkeutuvat ympäröivään lihasten ja rasvakudoksesta (kuvio 3A, vasen paneeli). Päinvastoin, kasvaimet syntyvät lajittelemattoman DU145 solut koostuvat morfologisesti heterogeeninen alaryhmien soluja ja osoittivat laaja kasvu, puristamalla sijaan tunkeutuu viereisen isännän kudoksiin (kuvio 3A, oikea paneeli). Mielenkiintoista on, että erittäin invasiivinen kasvaimet osoittivat pienempi ilmentyminen E-kadheriinin ja β-kateniinin ja korkeampi ilmentyminen vimentiinista verrattuna tuskin invasiiviset kasvaimet (kuvio 3B). Erityisesti, kunkin kasvaimen ekspressiokuvion näiden 3 markkereita on vastakkainen kuin solut, jotka ovat peräisin itse kasvain, eli CSC tai DU145-solut (kuviot 2G-2H).

(A) Histologinen värjäytyminen H 0,05 suhteessa kasvaimia syntyy pallomainen. (E) IHC anti-CD56-vasta-aine osoittaa suurempi tiheys NE oleviin soluihin syntyvät sferoidiviljelmiä niinkään DU145 soluista (20 x). (F) Q-PCR näyttämällä CGA mRNA tasolla kasvaimissa. Tulokset ilmaistaan ​​väliset suhteet kohdegeenin ja endogeenisen ohjaus GAPDH ja edustavat keskiarvoa ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta. *,

p

0,05 osalta kasvaimia syntyy pallomainen. (G) Edustava FACS-analyysi osoittaa läsnä CD44

+ CD24

– solujen kasvaimissa syntyvät injektio 1 sferoidiviljelmiä hiirillä. Kasvaimet, jotka ovat peräisin injektion 5000 DU145-solut osoittivat verrattavissa CD44

+ CD24

– solupopulaation (tietoja ei esitetty).

kasvaimet syntyvät pallosia osoitti myös merkittävä suurempi määrä verisuonia (

p

0,0001), kun seurattiin värjäämällä endoteelisolumarkkeri CD31 (kuvio 3C, vasemmalla), verrattuna tuumoreihin peräisin DU145-soluja (kuvio 3C, oikealla). Nämä tulokset vahvistettiin analyysi CD31 mRNA ekspressiotason (kuva 3D) ja osoittavat aktiivisen neoangiogeneesiin kasvaimissa syntyvät pallosia. Lisäksi, immunohistokemiallinen (IHC) analyysi osoitti suuremman määrän positiivisten solujen CD56, merkkiaine NE soluja, enemmän invasiiviset kasvaimet kuin vähemmän invasiivisia kasvaimissa (kuvio 3E). Tämä havainto vahvistettiin reaaliaikainen PCR-analyysi CGA, vielä markkeri NE soluja (kuvio 3F). Lisäksi FACS-analyysi tuumorit leikattiin ja hajotettiin paljasti, että molemmat neoplasian sisälsi vastaavan CD44

+ CD24

– solupopulaation (kuvio 3G). Että tulokset osoittivat, että CSC pystyivät tuottamaan erittäin invasiivisia kasvaimia nude-hiirissä. Kuitenkin injektio CSC DU145 eriytetty kasvainsolujen (eli injektio lajittelematonta DU145 solut) johti kasvaimien kasvua alhainen aggressiivisuuden asteen.

vaikutus kunnostettua alustaa alkaen DU145 solujen erilaistumista CSC

Kun otetaan huomioon edellä esitetyt toteamukset, tutkimme vaikutus DU145 erilaistuneita soluja valittuihin CD44

+ CD24

– eturauhasen CSC

in vitro

. Dissektoitujen sferoidit kasvatettiin DMEM täydennetty FBS (simuloida injektio rakeita hiirillä) tai DMEM täydennetty FBS jossa DU145 soluja aikaisemmin kasvatettiin 3 päivää (väliaine (CM), simuloida injektio irtotavarana DU145 solujen hiirillä). Molemmissa viljelyolosuhteet, CSC sisältyvät sferoideja kasvoi yksikerroksisessa, mutta niiden leviäminen väheni merkittävästi, kun he viljeltiin 20 päivää CM (-47%, kuvio 4A). Inhibointi pallomainen leviämisen edelleen parantaa lisäämällä pitoisuutta CM (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi kävi ilmi, hyvin selvää, että solut kasvatetaan FBS-sisältävässä väliaineessa olivat melko riippumattomia solu-solu-vuorovaikutuksiin, koska ne kasvoivat pääasiassa yksin tai vähän ryhmien muodoltaan epäsäännöllisiä, ja niiden morfologia ja kuvio kasvun olivat samanlaisia ​​kuin DU145 soluja (kuvio 4B, vasen paneeli). Päinvastoin, solut CM olivat tiukat toisiaan ja kasvoi lähinnä pyöreähkö saaret (kuvio 4B, oikea paneeli). Mielenkiintoista, 20 päivän jälkeen ja ainoastaan ​​sisältävät levyt FBS-täydennetty väliaine, havaitsimme ulkonäkö solujen näytteille dendrite kaltainen morfologia tyypillisiä NE solujen (kuvio 4B, vasen paneeli ja kuvio 4C). Identiteetti näiden solujen vahvistettiin arviointi CD56 ilmentymisen sytoplasman rakeet NE-solujen (kuvio 4C, oikea paneeli). Analyysi ilmentymisen merkkiaineiden kantasolujen ja erilaistuneita soluja korosti, että sen jälkeen, kun 20 päivää in FBS sisältävässä väliaineessa, soluilla tasoa E-kadheriinin, β-kateniinin ja vimentiinin verrattavissa esitetty DU145-soluja (kuvio 4D). Päinvastoin, soluja kasvatettiin 20 päivää CM esillä ekspressiotasot välimuoto näiden esitetty ohjaus CSC ja DU145-soluissa, mutta lähemmäksi tasoa CSC. Erityisesti ilmentyminen vähenee E-kadheriinin ja β-kateniinin ja lievästä kasvusta tason vimentiinista suhteen kontrolloida pallosia oli ilmeistä (kuvio 4D). On kiinnostavaa panna merkille, että sekä korkea adheesiomolekyylien ja alhaisen ilmentymisen vimentiinista osoitti vahvaa solu-solu-vuorovaikutuksiin ja vähentää solun liikkuvuus, vastaavasti, mikä sopi hyvin erikoinen solujen kasvua saarilla. Nämä tulokset osoittavat, että CSC viljeltiin sallivissa olosuhteissa pystyivät tuottamaan terminaalisesti erilaistuneita soluja, nimittäin DU145 ja NE soluihin. Kuitenkin diffusible tekijöitä vapautuu DU145 soluista esti erilaistumista CSC.

(A) yleistyminen CSC sisältämien sferoideja kasvatettu FBS sisältävässä väliaineessa tai CM peräisin DU145 soluista arvioitiin eri aikoina kulttuurin. Data on esitetty keskiarvona ± SEM 3 kokeesta. Tähdet osoittavat merkittävää estävää vaikutusta CM suhteen FBS-väliaineessa (*,

p

0,05). (B) Faasikontrasti- (10 x) soluja jälkeen 20 päivää FBS sisältävässä väliaineessa tai CM osoittaa eri mallia solujen kasvua. Vasemmassa paneelissa, suorakulmion korostetaan läsnäolo NE soluja. (C) Faasikontrasti- (vasen, 20 x) ja IF värjäys (oikealla, 40 x) haarautuneiden NE solujen syntyvät CSC kasvatettu FBS-alustassa. Erityisesti näkyy ruudun oikeassa reunassa ilmentymistä CD56 sytoplasmassa ja pitkällä solun prosesseja. (D) edustaja western blotit osoittavat muutoksia ilmaus E-kadheriinin, β-kateniinin, ja vimentiinistä vuonna sferoidiviljelmiä CSC kasvatettu eri viljelyolosuhteissa suhteen kontrolloida sferoideja ja DU145 soluja. Ilmentymistasojen 3 proteiineja määritettiin densitometrinen analyysi vastaavien nauhojen ja normalisoitiin p-aktiini-tasot. Raportoidut arvot histogrammit ovat keskiarvo ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta.

geeniekspressioprofiili CSC ja DU145-soluja

tutkimiseksi soluvasteen kasvaimien syntyyn liittyvien sekä tasolla geenien ilmentyminen ja edeltävässä mRNA tasolla, teimme koko genomin, silmukoinnin herkkä microarray analyysi DU145 solujen ja niiden valittu CSC. RNA-näytteet oli valmistettu kustakin solupopulaatiosta hybridisoitiin ihmisen eksoni 1.0 ST Arrays, jotka mahdollistavat määrittelyä sekä transkription kuviot (geeni-tason analyysi) ja vaihtoehtoisten pre-mRNA kypsymisen tapahtumien (eksoni-tason analyysi). Gene-ilmentymistä profilointi havaittiin lineaarista mallia tilastoja empiirinen Bayes menetelmän kohtalainen keskivirheet. Arvioida transkription muutokset, analysoimme geeniekspression muutoksia sferoidiviljelmiä CSC

vs

DU145 soluja. Tunnistaa ilmentyvät eri geenien, haimme ehdoton log

2-kertainen muutos ≥ +/- 1 ja P-value≤0.05 kuin cutoffs. Monimutkaisuus datajoukon pienennettiin poistamalla ei-merkitsevä koetinsarjojen (ne eivät ilmaisseet ja niitä ei muutu). Tällä tavoin, yli 400 geenit, joiden tasot olivat merkittävästi erilaisia ​​CSC ja DU145-soluja valittiin. Täydellinen luettelo differentiaalisesti ilmentyvien geenien löytyy taulukosta S1.

Analyysi valittujen geenien

ilmentyvät eri geenit analysoitiin niiden molekyyli- ja solutason toimintoihin ja niihin liittyviä reittejä käyttäen Ingenuity Pathways Analysis ohjelmistot (IPA 7.0, kekseliäisyyttä Systems). IPA analyysi tunnistettu yli 70 toiminnallisia luokkia, ja niiden joukossa, valitsimme 8 parhaiten yhteen luokkien löytyi rikastettua asetetun erilaisesti ilmaisi geenien (eli syöpä, huokoinen liike, solu ja kasvua solujen morfologia, solukuoleman, cellular kehitys, solusyklin, solu-solu-signaloinnin ja vuorovaikutus; kuvio 5A), jotka soveltuvat kuvaamaan CSC ja DU145-soluissa. Yhdistimme geenit 8 valitun toiminnallisiin luokkiin, havaitsemaan 22 yhteinen geenit esitetään vielä toiminnallisia yhteyksiä. Nämä erotettiin niiden sijainnista solussa. Mielenkiintoista, analysoida tarkemmin Saharan valitun geenin osoitti, että 17 pois 22 geenin tuotteita lokalisoitu solukalvon tai erittyi solunulkoiseen tilaan (kuvio 5B), vahvistamaan edellä esitetyt päätelmät, jotka osoittavat välistä vuorovaikutusta CSC ja microenvironment. Vaikka valitun geenin koodatut proteiinit, joilla on erilaisia ​​toimintoja, 4 pääryhmään voitiin tunnistaa: 1) Pro-angiogeenisten tekijöiden angiopoietiini 2 (ANGPT2), verisuonen endoteelin kasvutekijä C (VEGFC) ja kysteiini-rikas angiogeenisten indusoija 61 (Cyr61) löytyivät alassäädetty CSC suhteessa DU145 soluihin; 2) koodaavia geenejä adheesiomolekyylien E-kadheriinin (CDH1), integriinin beeta 6 (ITGB6) ja risteys plakoglobin (JUP) ilmennettiin enemmän CSC kanssa rinnakkaisen alas-säätely kaveoleja proteiinia (CAV1); 3) tuumorisuppressorigeeneille lipokaliini 2 (LCN2), dipeptidyylipeptidaasi-4 (DPP4), insuliinin kaltainen kasvutekijää sitova proteiini 3 (IGFBP3), tioredoksiini vuorovaikutuksessa proteiini (TXNIP) ja Kruppel kaltainen tekijä 4 (Klf4) on sääteli CSC; 4) Hitsiaineen merkityksellisiä ylläpidossa kantasolujen kapealla kuten epidermaalinen kasvutekijä (EGF), luun morfogeneettinen proteiini 4 (BMP4) ja transformoiva kasvutekijä beeta 2 (TGFB2) on myös eri ilmaistu CSC ja DU145 soluja. Huomionarvoista, 19 pois 22 geeniä, jotka olemme määritelleet joita ei aiemmin kuvattu poikkeuksellisen ilmaistaan ​​eturauhasen CSC. Nämä tiedot vahvistavat, että vuorovaikutus microenvironment on keskeinen rooli valvonnassa fenotyypin CSC ja ehdottaa rajallinen määrä geenejä, joiden merkitystä CSC signalointi täytyy tutkia. Lisäksi suurin osa 22 valitun geenit voivat olla uusia markkereita eturauhasen CSC.

(A) Valittu 8 top biologisiin toimintoihin löytyi rikastettua asetetun transkriptien moduloitu CSC suhteessa koko DU145 soluihin mikrosiruanalyysillä. (B) 22 vapautettu geenejä, määritettynä IPA, sijoitetaan subcellular ulkoasuja, ja suhteet on merkitty nuolilla: täytetty ja katkoviiva nuolet merkitsevät suoran ja välillisen vuorovaikutuksen, vastaavasti. Geenit punaisella oli kohonnut ilmentyminen CSC, kun geenit vihreä olivat alassäädetty. (C) erot geenien ilmentyminen määritettiin mikrosiruanalyysillä varmistettiin Q-PCR: llä, valitsemalla 7 tyypillinen geenien joukossa on valittu 22. Tulokset ilmaistaan ​​suhde kohde-geenin ja endogeenisen ohjaus GAPDH. Ekspressio CSC verrattiin siihen, mitä havaittiin DU145 soluissa, joihin arvoiset 1 mielivaltaisesti määritetty. Arvot ovat keskiarvo ± SEM 3 kokeita. *,

p

0,05 suhteessa DU145 soluihin.

Validation geenien ilmentymisen

Vahvista eroja geenien ilmentyminen saapuvat mikrosiruanalyysillä, Q- PCR suoritettiin 7 differentiaalisesti ilmentyvien geenien (CDH1, Cyr61, DPP4, IGFBP3, ITGB6, LCN2, TGFB2). Kaikissa tapauksissa, erot mRNA-tasot varmistettiin (kuvio 5C).

rooli reitin E-kadheriinin erilaistumisessa CSC

Q-PCR-analyysi osoitti, että mRNA: n ekspression of lipokaliini 2 ja E-kadheriinin seurasi vertailukelpoinen suuntaus CSC, DU145 soluissa ja CSC kasvatettiin 20 päivää FBS sisältävässä väliaineessa tai CM. Erityisesti mRNA-tasot sekä geenit olivat hyvin korkeat CSC sisältyvät palloset, vähenivät CSC kasvatettiin CM ja olivat huomattavasti alhaisemmat ja vertailukelpoisia CSC kasvatettiin FBS-väliaineessa ja DU145-soluissa (kuvio 6). Tämä suuntaus oli suostumuksella modulaatio β-kateniinin ilmentymisen aiemmin havaittu samassa viljelyolosuhteissa (kuvio 4D). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että polku on E-kadheriinin oli mukautettu aikana CSC erilaistumista.

Q-PCR joka osoittaa muutoksia mRNA-tasot lipokaliini-2 ja E-kadheriinin in DU145 soluissa, CSC sisältämä ohjaus pallosia, ja CSC kasvatettiin 20 päivää FBS-väliaineessa tai CM peräisin DU145 soluista. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM 3 yksittäisistä kokeista. Tähdet osoittavat merkittävää eroa (*,

p

0,05).

Keskustelu

tuumorigeenisyystesti eturauhasen CSC

CD44

+ CD24

– soluja eristettiin DU145 eturauhassyöpä-solulinjaa käyttämällä solun pinnan markkereita kykeni kasvamaan ei-tarttuva rakeita seerumittomassa väliaineessa, jota täydensi spesifisiä kasvutekijöitä. Seurauksena epäsymmetrisen kantasolujen jako sferoidit rikastuneet syövän kantasolut (CSC), mutta myös todennut prosentteina erilaistuneita soluja lähestyy kuolion. On huomattava, että CSC pystyivät läpi epäsymmetrinen jako myös

in vivo

koska injektion jälkeen hiirissä, ne molemmat on valmistettu erilaistuneita soluja, jotka muodostavat suurimman osan kasvaimen ja itsensä uusittu itsensä osoittaa läsnäolo CD44

+ CD24

– soluja kaikissa leikattiin kasvaimia.

silmiinpistävä ero tuumorigeenisia kapasiteettia osoitettiin eri esiintyvyys ja latenssi kasvainten peräisin sferoidiviljelmiä CSC tai DU145 solujen injektio, entisen solupopulaatio on tuumorigeenisemmiksi. Ehdotamme, että viive kasvainmuodostusta injektion jälkeen 5000 DU145 soluja voitaisiin katsoa johtuvan vähäinen määrä CSC pidettiin DU145 soluissa pistetään verrattuna rikastettu määrä CSC sisältyy kuhunkin pallomainen. Nämä havainnot ja tämä ehdotus varmistettiin vielä ruiskuttamalla 3 x 10

6 DU145 soluja, jolla oli suurempi määrä CSC kuin 1 sferoidiviljelmiä ja syntyy kasvaimia vain 1 viikko.

On tärkeää, että edelleen