Krooninen sairaus

tiivistelmä

EGFR-MEK-ERK signalointireitin on vakiintunut rooli pahanlaatuinen kasvain ja taudin etenemiseen ihmisen syövissä. Siksi tunnistaminen transkription tavoitteiden välittämisessä kasvaimia aiheuttavalle vaikutukselle EGFR-MEK-ERK-reitin olisivat erittäin tärkeitä. Syöpä estäjä proteiinia 2A (CIP2A-proteiinia) on hiljattain ominaista ihmisen onkoproteiini. CIP2A-proteiinia edistää pahanlaatuisten solujen kasvua, ja se on yli ilmentyy korkealla taajuudella (40-80%) useimmissa ihmisen syövän tyypit. Kuitenkin mekanismit asiakkuutta ilmaisunsa syövän edelleen paljolti hyödyntämättä. Tässä esittelemme järjestelmällisen analyysin osuus mahdollisten geenin sääntelymekanismeja korkean CIP2A-proteiinia ilmentyminen syövässä. Tuloksemme osoittavat, että evoluution konservoituneita CpG-saarekkeiden proksimaalisessa CIP2A-proteiinia promoottori eivät ole metyloituja sekä normaali- että syöpäsoluja. Lisäksi sekvensointi aktiivisen CIP2A-proteiinia promoottorialue yhteensä seitsemän normaalia ja pahanlaatuista solutyyppejä ei paljastunut jaksojen muutoksia, jotka lisäisivät CIP2A-proteiinia ilmentyminen erityisesti syöpäsoluja. Kuitenkin syövän solujen eri signalointireitin estäjät paljasti, että CIP2A-proteiinia mRNA: n ekspressio oli herkkä EGFR toiminnan sekä inhibition tai aktivaation MEK-ERK-reitin. Lisäksi, MEK1 /2-spesifisten siRNA: iden vähentynyt CIP2A-proteiinia proteiinin ilmentymisen. Sarja CIP2A-proteiinia promoottori-lusiferaasi konstrukteja luotiin tunnistaa proksimaaliseen -27–107 promoottorialue vastuussa MEK riippuvan stimulaation CIP2A-proteiinia ilmaisua. Muita mutageneesiä ja chromatin immuunisaostuskokeissa paljasti ETS1 kuin transkriptiotekijä välittävä stimulaation CIP2A-proteiinia ilmaisun EGFR-MEK reitin. Siten ETS1 on luultavasti välittäjänä korkea CIP2A-proteiinia ilmentyminen ihmisen syövissä lisääntynyt EGFR-MEK1 /2-ERK-reitin aktiivisuutta. Nämä tulokset viittaavat myös siihen, että sen lisäksi vakiintunut asema invaasio ja angiogeneesi, ETS1 voi tukea pahanlaatuisen solukasvun säätelemällä CIP2A-proteiinia ilmaisun ja proteiini 2A esto.

Citation: Khanna A, Okkeri J, Bilgen T, Tiirikka T, Vihinen M, Visakorpi T, et ai. (2011) ETS1 välittää MEK1 /2-Dependent yliekspressio syöpä Inhibitor proteiinifosfataasi 2A (CIP2A-proteiinia) in ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 6 (3): e17979. doi: 10,1371 /journal.pone.0017979

Editor: Robert Oshima, SanfordBurnham Medical Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 marraskuu 2010; Hyväksytty: 17 helmikuu 2011; Julkaistu: 22 maaliskuu 2011

Copyright: © 2011 Khanna et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Suomen Akatemia (projektit: 217676 ja 217675), Association for International Cancer Research (hanke 08-0614), säätiö Suomen Cancer Institute (JW), Emil Aaltosen säätiö, Sigrid Juseliuksen säätiö, kilpailukykyistä tutkimusta rahoitus Pirkanmaa sairaanhoitopiiri (projektit: 9K152 ja 9L115), Tampere Graduate Program biolääketieteen ja bioteknologian (AK), ja Tieteen ja tekniikan tutkimuksen toimikunta Turkin (TB). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu tai analysointi päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kertymä erilaisia ​​geneettisiä muutoksia on pidetty edellytyksenä syövän kehittymisen. Nämä geneettiset muutokset johtavat usein yli-ilmentyminen tai aktiivisuus proto-onkogeenien ja toiminnan estäminen on tuumorisuppressori- [1], [2] .Siksi mekanismien ymmärtämistä, jonka aktiivisuutta sekä proto-onkogeenien ja tuumorisuppressoreita on muuttunut syöpä on ratkaisevan tärkeää sekä akateemisesti, ja uusien lähestymistapojen kehittäminen kohdistaa syöpäsolujen hoitoa varten.

kasvutekijän reseptorin (EGFR) -välitteisen MEK1 /2-ERK MAPK-reitin aktiivisuus on osoitettu säätelevän lähes kaikki näkökohtia mukana tuumorigeneesiä. Näin ollen, lisääntynyt aktiivisuus ja yliekspressio sekä EGFR ja MEK1 /2-kinaasien on havaittu useissa erilaisissa ihmisen syövissä [3], [4], [5], [6]. Lisäksi estäjiä EGFR, Raf ja MEK1 /2-kinaasit ovat kliinisissä kokeissa vastaan ​​erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia [3], [4], [7], [8]. Mielenkiintoista on, että lisääntynyt MEK1 /2-reitin aktiivisuus johtuu yliaktiivisuus Ras ja Raf-proteiinien on myös osoitettu myötävaikuttavan kliinisen resistenssin EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittori [4], [9], [10]. Nämä tulokset yhdessä viittaavat siihen, että inhibitio reitin aktiivisuutta sekä tasolla reseptorin, ja sen alavirran efektoreja voidaan tarvita tehokas syövän hoitoon.

ETS perheen transkriptiotekijöiden, mukaan lukien Elk1, ETS1 ja ETS2 on joitakin tunnettuja tavoitteet EGFR-Ras-MEK1 /2-signalointireitin [11]. ETS1 ja ETS2 ovat molemmat fosforyloituu Ras signalointi [11], [12]. ETS1 on perustajajäsen perheenjäsen ETS-verkkotunnuksen transkriptiotekijöiden. Se on yhdistetty syöpään, koska toteamisesta onkogeenisessä fuusio tuote c-Myb esikasvaintekijän että E26 linnun leukemia virus [13], [14]. ETS1 tiedetään kohdistaa erilaisia ​​geenejä [11], [12], [15], joka puolestaan ​​määrää sen rooli solujen eri prosesseissa. Adjektiivit syöpä ETS1 tunnetaan parhaiten sen rooli tuumorisolun invasiivisuus, liikkuvuuteen ja etäpesäkkeiden [13], [16]. Invasion edistää rooli ETS1 uskotaan välittyvän transkriptionaalinen säätely geenejä, jotka osallistuvat solunulkoinen matriksi rappeutuu ja stimuloimalla angiogeneesiä [16]. Mielenkiintoista on, että vaikka ETS1 ja muut ETS-perheen transkriptiotekijöiden on pääasiassa liitetty kasvaimen invaasio, pian sen jälkeen kloonauksen ihmisen ETS1, Seth ja yhteistyökumppanit osoittivat, että ETS1 yliekspressio transformoituja NIH3T3-soluja, joten ne kykenevät kiinnittymisestä riippumattoman kasvun ja kasvaimen kasvua nude- hiirissä [17]. Viime aikoina osoitettiin myös, että ETS1 edistää transformoitu solu fenotyypin ihmisen soluissa sekä [18], [19]. Kuitenkin kohdegeenien mukana ETS1-välitteistä solun transformaation ovat huonosti tunnettuja.

syöpä Inhibitor of Protein Phosphatase 2A (CIP2A-proteiinia) on hiljattain tunnettu ihmisen onkoproteiini [20]. CIP2A-proteiinia vuorovaikutuksessa ja estää proteiinisynteesiä 2A (PP2A) tuumorisuppressoriproteiinia monimutkainen ja estää siten defosforyloinnilla ja tämän jälkeen proteolyyttisen hajoamisen MYC transkriptiotekijän [20], [21]. CIP2A-proteiinia edistää Ras-esiin pesäkkeitä muodostuminen hiiren alkion fibroblasteissa ja tukee muutosta ikuistettu ihmisen soluihin [20]. Menetys funktion tutkimukset, CIP2A-proteiinia ehtyminen on osoitettu vähentää yleistä -tuumoriksenografti koko nude-hiirissä [20], [22], ja heikentää kyky muodostaa klooneja ja kiinnittymisestä riippumaton kasvainsolujen kasvua [20], [22], [ ,,,0],23], [24], [25]. Äskettäin CIP2A-proteiinia osoitettiin myös estävän Akt-kinaasin liittyvän PP2A aktiivisuutta ja näillä keinoin ihmisten maksasolusyövän soluja bortetsomibihoidon-indusoidun apoptoosin [26]. CIP2A-proteiinia ekspressoituu vain hyvin harvat normaaleissa kudoksissa, mutta sitä on yli-ilmentynyt erittäin korkea esiintyvyys (40-80%) useissa erilaisissa ihmisen syövän tyyppejä, kuten pään ja kaulan okasolusyöpää (HNSCC), paksusuolen, mahakarsinoomat, rintasyövät ja ei -Pieni keuhkosyöpä [20], [22], [23], [24], [25]. Sen lisäksi yli-ilmentymisen syövissä, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että CIP2A-proteiinia immunopositivity korreloi aggressiivinen sairaus ja /tai huono potilaan selviytymistä useissa syöpätyypeissä [22], [23], [24]. Suhteen sääteleviä mekanismeja CIP2A-proteiinia ilmentyminen, olemme tähän asti havaittu MYC kiihotusaineena CIP2A-proteiinia ilmaisun [24]. Kuitenkin muita mekanismeja myötävaikuttaa lisääntynyt CIP2A-proteiinia ilmentyminen ihmisen syövissä edelleen vaikeasti.

Nykyisessä tutkimuksessa olemme kloonattu toiminnallinen CIP2A-proteiinia promoottorialue ja tunnistettu promoottorialueissa välittävä korkea CIP2A-proteiinia transkriptionaalisen aktiivisuuden. Lisäksi käytetään kemiallisia estäjiä eri signalointireittejä ja tavoite erityisiä siRNA, me leikellään rooli EGFR-MEK1 /2-reitin säätelyssä CIP2A-proteiinia ilme. Kromatiini immunosaostus, promoottori mutageneesiä ja tavoite erityisiä siRNA: ita käytettiin sitten tunnistamaan ETS1 transkription säätelee EGFR-MEK1 /2-riippuvaista CIP2A-proteiinia ilmentyminen ihmisen syövissä.

Tulokset

bioinformatiikka- analyysi ja metylointi tilan CIP2A-proteiinia Promoottori

Voit aloittaa järjestelmällisen analyysin sääntelymekanismeissa CIP2A-proteiinia ilme, 1,8 kb ylävirtaan ennustetun CIP2A-proteiinia geenin transkription aloituskohdasta analysoitiin käyttämällä Genomatix ohjelmistoa. Kuvio 1A esittää ennustetun transkriptiotekijän sitoutumiskohtia, joilla on matriisi samankaltaisuus 95% ja ytimen samankaltaisuus 100%, on, että genomin alueella. Genomatix ohjelmistoa käytettiin myös saada fylogeneettisen puun ja CIP2A-proteiinia promoottorin eri lajeissa (Fig. 1 B). Mielenkiintoista, analyysi -1500-450 emäsparin alueen MethPrimer ohjelmisto tunnistaa CpG saari nukleotidivälillä -150-400 emäsparia (sininen varjostettu alue kuviossa 1C). Tärkeää on, linjaus CIP2A-proteiinia promoottorit eri lajien paljasti myös säilyttämistä CpG rikas sekvenssit että alue (Fig. S1A). Metylaation CpG sivustoja säätelyalueita geenien ehdotetaan korreloivan transkription hiljentäminen. Sen vuoksi oletettiin, että CIP2A-proteiinia ilmentyminen normaaleissa kudoksissa ja solulinjoissa [20], [22], [23], [25], voidaan vaimennettu vuoksi promoottorin metylaation. Tätä varten metylaatiostatus -150-400 bp alueella analysoitiin bisulfiitin sekvensoinnilla. Genominen DNA-näytteitä kerätään Analyysin mukana vasta eristettyjä soluja normaalista ihmisen verestä, viljelty ihmisen ihon fibroblasteista ja viljellyt syöpäsolut (AGS ja HeLa). Bisulfiitti hoito genomisen DNA: n johti muuntaa kaikki sytosiinit sekvensoitu promoottori alueen tymidiineissä, kaikissa näytteissä (kuvio. 1D ja Fig. S1). Näin ollen, koska metylaatio CpG-saarekkeiden on CIP2A-proteiinia promoottori ei havaittu normaaleissa soluissa, on epätodennäköistä, että promoottori de-metylaatio selittää lisääntynyt CIP2A-proteiinia ilmentymistä syöpäsoluissa.

. Tunnistaminen transkriptiotekijän sitoutumiskohtien kanssa matriisi samankaltaisuus 95% ja ydin samankaltaisuus 100% enemmän -1802 emäsparin CIP2A-proteiinia promoottori avulla Genomatix ohjelmistoa. B. fylogeneettinen puu kuvaa evoluution säilyttämistä CIP2A-proteiinia promoottori. C. tunnistaminen otaksutun CpG Island -150 bp +400 bp (sininen varjostettu alue) on CIP2A-proteiinia promoottori avulla MethPrimer ohjelmistoa. D. Näyttää sekvensointi tulokset uutettu genomi-DNA normaalin ihmisen verestä. Kaikki CpG sivustot (edustaja musta suorakulmainen lohkojen) makaa sisällä CpG-saarekkeen muutettiin CG TG kun niitä käsitellään bisulfiitin, mikä merkitsee, että CIP2A-proteiinia promoottori näillä paikoilla on metyloitumaton.

Toiminnalliset ja SNP-analyysi of CIP2A-proteiinia promoottori

Yhden nukleotidin polymorfismien (SNP: t) on raportoitu luoda uusia transkriptiotekijän sitoutumiskohdat geenin promoottorit. Erityisesti aiemman tutkimus osoitti, että SNP on MMP-1: n promoottori luodaan uusi ETS sitoutumiskohtaan että lisätyn MMP-1 transkriptio syöpäsoluissa [27]. Jotta voitaisiin arvioida SNP tilan CIP2A-proteiinia promoottori, alue, joka sisältää CIP2A-proteiinia promoottorin kuviossa. 1A ja eksonin 1 (-1802 bp +182 bp) sekvensoitiin genomisesta DNA: ta normaalista ihmisen ääreisverenkierron, ihmisen hyvänlaatuisen mononukleaarisissa monosyyteissä (MN-50), normaali ihmisen ihon fibroblastit (NHDFc), ihmisen fibrosarkoomasolulinjoilla ( HT1080), levyepiteelisyöpä solulinja (SCC7), kohdunkaulan karsinooma solulinja (HeLa) ja mahalaukun adenokarsinooman solulinja (AGS). Tämä analyysi tunnistaneet useita SNP on analysoitu alueella, mutta vain kaksi niistä (T C -592 HeLa ja G A -1100 in SCC7) ei löydy mitään normaalista näytteistä (Fig. 2A). Koska kummankin SNP: löytyi vain yhdestä syövän solulinja, mutta ei muita analysoitu, on epätodennäköistä, että ne aiheuttaisivat transkriptiotekijän sitoutumiskohtia, joka laajentaa CIP2A-proteiinia transkription yleisesti syövän. Huomattavaa on, että T C -592 HeLa-soluissa ei ole aiemmin dokumentoitu tietokannoissa.

. Tunnistetut yhden emäksen monimuotoisuus on -1802-182 alueelle CIP2A-proteiinia promoottorin osoitettu soluista. Kaksi tasyöpäsolulinja erityisiä muutoksia havaittiin, eli G /A -1101 SCC-7 solulinja ja T /C -592 HeLa-solulinjassa. B. Suhteellinen Lusiferaasianalyysi esittää suhteellista aktiivisuutta -1802 bp CIP2A-proteiinia promoottorin verrattuna tunnettu onkogeenisen promoottoreita kuten EGFRLuc ja 5xJunLuc. C. lusiferaasianalyysissä esittää vertailun aktiivisuuden välillä villityypin (WT) CIP2A-proteiinia promoottori ja ilmoitetusta SNP mutantteja. D. lusiferaasianalyysissä joka ilmaisee aktiivisen ilmoitettu CIP2A-proteiinia promoottorien. Korkea perusaktiivisuutta välittyy ensin 392 emäsparin promoottorin, joista lähes kaksi kolmasosaa se johtui ensimmäinen 108 bp. B-D, Kuvassa on keskiarvo + SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

aloittamiseksi toiminnallisen kuvauksen CIP2A-proteiinia promoottori, -1802 bp +182 bp 5 ’ylävirtaan CIP2A-proteiinia geenin analysoitiin SNP: edellä, kloonattiin pGL4.10-vektoriin CIP2A-proteiinia promoottorin lusiferaasireportteri- konstrukti (-1802CIP2ALuc). Promoottorialue monistettiin genomisesta DNA: AGS soluja, ja tämä erityisesti klooni kanna nukleotidin A asentoon -98 ja T on asennossa -1487 (Fig. 2A). Jotta voitaisiin arvioida suhteellisen transkriptionaalisen aktiivisuuden kloonatun CIP2A-proteiinia promoottorifragmentti, vertasimme lusiferaasiaktiivisuus -1802CIP2ALuc promoottori /lusiferaasi-rakenteet, joiden tiedetään olevan aktiivisia syöpäsoluja. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, -1802CIP2ALuc aktiivisuus oli joko vastaava tai selvästi korkeampi kuin aktiivisuus EGFRLuc [28] tai minimaalinen 5xJunLuc [29] promoottorit vastaavasti. Tämän perusteella Tuloksena todettiin, että kloonattu -1802 bp +182 bp 5 ’ylävirtaan CIP2A-proteiinia geeni sisältää aktiivisen CIP2A-proteiinia promoottori.

Seuraavaksi -1802CIP2ALuc konstruktia käytettiin analysoimaan onko SNP 592 T C ja 1100g C ja 1100g mutaatioita tuotiin -1802CIP2ALuc paikkaspesifisellä mutageneesillä ja aktiivisuus mutantti-konstruktien verrattiin villityypin 1802CIP2ALuc in AGS-soluissa. Käytössä verrattuna villityyppiin, ei muuttunut nähty CIP2A-proteiinia lusiferaasiaktiivisuuden kanssa 1100 G Mutantti klooni, kun taas 592 T C mutanttikloonin osoittivat merkittävää vähenemistä lusiferaasiaktiivisuuden (Fig. 2C).

Lopuksi, jotta luonnehtimaan alueillaan CIP2A-proteiinia promoottori, joka välittää sen korkea transkriptionaalista aktiivisuutta, useita 5′-deleetioita promoottorin /reportterin kloonattiin. Vertailu pohjapinta toimintaa näiden deleetiorakenteita in AGS soluissa paljasti, että alueiden välillä -392 ja -1802 ei näyttänyt sisältävän transkriptiotekijän sitoutumiskohtia, jotka suuresti edistävät korkea perustason aktiivisuuden CIP2A-proteiinia promoottorin (Fig. 2D). Mielenkiintoista, korkea lusiferaasiaktiivisuus -392CIP2ALuc väheni merkittävästi, kun ylimääräinen 57 nukleotidia poistettiin tuloksena -335CIP2ALuc konstruktio (Fig. 2D). Tämä näytti johtuvan altistumisesta Transkriptionaalisen sorron verkkotunnuksen, kuten edelleen poistamista -335CIP2ALuc jotta -108CIP2ALuc johti jälleen huomattavasti lusiferaasiaktiivisuuden (Fig. 2D). Kiinnostavaa, tämä 108 bp: n CIP2A-proteiinia promoottorin osuus oli yli 50%: n lusiferaasiaktiivisuuden tuottaman -1802CIP2ALuc (Fig. 2D).

Yhdessä tämä data esitetään ensimmäisen toiminnallisen analyysin CIP2A-proteiinia promoottorialueen. Lisäksi nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että SNP on CIP2A-proteiinia promoottori ei merkittävästi lisää CIP2A-proteiinia yli-ilmentymisen syöpä.

asetukseen CIP2A-proteiinia ilmentymisen EGFR-MEK1 /2-reitin

Tulokset edellä esitetty, että CIP2A-proteiinia ilmentäminen voidaan säätää positiivisesti signalointireittejä jotka stimuloivat sen geenin promoottorin aktiivisuutta. Puuttumaan onko tiedossa kasvaimia synnyttävän signalointireitteihin oli säätelijänä CIP2A-proteiinia ilmentyminen, AGS soluja käsiteltiin hyvin määriteltyjä kemiallisia reitin inhibiittorit ja aktivaattorit. Vaikka estäminen joko p38 tai PI3-kinaasien by SB23580 tai LY294002, vastaavasti, ei säätelevät CIP2A-proteiinia mRNA tasoilla sekä MEK1 /2 ja EGFR: n estäjien (PD98059 ja AG1478) väheni CIP2A-proteiinia mRNA: n ilmentymisen (Fig. 3A). Lisäksi solujen käsittely forboliesterin TPA, hyvin tunnettu aktivaattori MEK1 /2-ERK signalointireitin, lisääntynyt CIP2A-proteiinia mRNA: n ekspressio yli kolminkertaiseksi (Fig. 3A). Kuten on esitetty kuviossa. 3B, vaikutukset sekä AG1478 ja TPA CIP2A-proteiinia mRNA ilmaisun olivat nähtävissä jo 6 tunnin kuluttua hoidon mikä viittaa suoran toimintatapa. Jotta kartoittaa alueen CIP2A-proteiinia promoottorin, joka reagoi EGFR-MEK1 /2-reitin aktiivisuus, solut transfektoitiin eri pituus CIP2A-proteiinia lusiferaasin promoottorikonstrukteja käsiteltiin AG1478 tai TPA, ja lusiferaasin aktiivisuus, verrattuna kont- DMSO hoitoon, mitattiin lukemisen pois promoottorin aktiivisuutta. Kuten kuvioissa. 3C ja D, AG1478 hoito vähentynyt, kun taas TPA hoito lisäsi lusiferaasiaktiivisuutta kaikilta paitsi lyhin -27CIP2ALuc konstruktio.

. Kvantitatiivinen PCR (qPCR) analyysi osoittaa tasoja CIP2A-proteiinia mRNA uutetaan AGS soluista käsitelty DMSO, SB23580 (20 uM), LY294002 (10 uM), PD98059 (20 uM), AG1478 (10 uM) ja TPA (100 nM) 24 h ajankohtana. Vaikka lasku CIP2A-proteiinia mRNA tasolla havaittiin PD98059 ja AG1478 hoitoja, TPA hoito täydensi CIP2A-proteiinia mRNA tasot AGS soluissa. B. qPCR analyysi osoittaa ajasta riippuva sääntely CIP2A-proteiinia mRNA tasojen AGS käsitellyissä soluissa DMSO, AG1478 (10 uM) ja TPA (100 nM) ilmoitettuina ajankohtina. C ja D Luciferase jotka osoittavat aktiivisuutta osoitetun CIP2A-proteiinia promoottorin deleetioiden soluissa, joita käsiteltiin joko DMSO: lla, AG1478 (10 uM) tai TPA (100 nM) 24 tuntia. (*,

P

0,05; ei riittävä = ei-merkitsevä). B-D. Näkyy on keskiarvo + SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että CIP2A-proteiinia ilmentyminen on positiivisesti regulated` EGFR-MEK1 /2 polku, ja että alue reagoi, että signalointia piilee välillä -27 bp ja -672 bp on CIP2A-proteiinia promoottori.

Characterization of MEK1 /2 kinaasin reagoiva alue on CIP2A-proteiinia promoottori

jotta vahvistaa osuus MEK1 /2 kinaasien positiivinen säätely CIP2A-proteiinia ilmaisun, AGS soluja käsiteltiin UO126, tarkempi ja voimakkaampi MEK1 /2-estäjä kuin aiemmin käytetty PD98059, ja CIP2A-proteiinia proteiinin ilmentyminen tutkittiin 48 tunnin kuluttua hoidon. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, UO126 annosriippuvaisesti laski CIP2A-proteiinia proteiinin ilmentymisen. Lisäksi kaksi eri siRNA vastaan ​​sekä MEK1 ja MEK2 laski CIP2A-proteiinia proteiinin ilmentymistä AGS soluissa (Kuva. 4B). Tärkeää vaikutukset eivät olleet joka on spesifinen joko kemiallisia tai siRNA-pohjainen MEK1 /2 inhibitio esti CIP2A-proteiinia proteiinin ilmentyminen myös PC-3 eturauhasen syövän solulinja (Fig. S2). Kaventamaan MEK1 /2-reagoiva alue on CIP2A-proteiinia promoottori, AGS transfektoitujen solujen sarja CIP2A-proteiinia lusiferaasireportteri konstruktioita käsiteltiin UO126 (20 uM) ja lusiferaasin aktiivisuudet mitattiin 48 tuntia käsittelyn jälkeen. Mukaisesti tulokset nähdään AG1478 ja TPA hoitoja, laski lusiferaasiaktiivisuutta kaikki muut konstruktit, paitsi -27CIP2ALuc havaittiin UO126 käsitellyissä soluissa (Fig. 5A). Edelleen rajata MEK1 /2-reagoiva alue on CIP2A-proteiinia promoottori, erilaisten lisä- CIP2A-proteiinia lusiferaasin promoottorikonstrukteja kloonattiin (Kuva. 5B). Vertailu pohjapinta toimintaa näiden uusien konstruktien yhdessä valittujen promoottorikonstrukteja jo analysoitu kuvassa. 2D, vahvistivat lisäksi, että on olemassa sekä tukahduttavia aktivoiva promoottori alueille CIP2A-proteiinia promoottori välillä -27 bp ja -400 bp (kuvio. 5B). Kuitenkin riippumatta pohjapinta aktiivisuuden reportteri, UO126 hoito inhiboi kaikkien toimittajat, mukaan lukien -108CIP2ALuc, jossa on merkittävä poikkeus on -27CIP2ALuc konstruktin (Fig. 5C). Näin ollen, nämä tulokset osoittavat, että MEK1 /2-kinaasien positiivisesti säädellä sekä CIP2A-proteiinia promoottorin aktiivisuus ja proteiinin ilmentymisen. Lisäksi nämä tulokset tunnistaa 81 bp välillä -108 bp ja -27 kuten MEK1 /2-reagoiva alueen CIP2A-proteiinia promoottori.

. Western blot, joka osoittaa pitoisuudesta riippuvaista vaikutusta tietyn MEK estäjä, U0126, on CIP2A-proteiinia proteiinin tasot AGS soluissa 48 tunnin aikapisteessä. B. Western blot, joka osoittaa molempien MEK1 ja MEK2 siRNA on CIP2A-proteiinia proteiinin tasot AGS soluilla 72 tunnin aikapisteessä.

. Lusiferaasianalyysi osoittaa aktiivisuutta eri pituisia CIP2A-proteiinia promoottoreita, kun niitä käsitellään DMSO: lla ja U0126 (10 uM) 24 tunnin ajan, yksilöidään MEK reagoivan alueen välissä -672 bp -27 bp CIP2A-proteiinia promoottorin. B. lusiferaasianalyysissä osoittaa perusaktiivisuutta ilmoitettu CIP2A-proteiinia promoottorit. C. Lusiferaasimäärityksiä osoittaa aktiivisuutta eri pituisia CIP2A-proteiinia promoottoreita, kun niitä käsitellään DMSO: lla ja U0126 (10 uM) 24 tunnin ajan, edelleen kaventamalla MEK reagoivan alueen olevan välillä -108 bp ja -27 bp CIP2A-proteiinia promoottorin (*,

P

0,05; **,

P

0,00; ns = ei-merkitsevä). Näkyy on Mean + SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

EGFR-MEK1 /2-reitin säätelee CIP2A-proteiinia ilmaisun ETS1

Jotta voitaisiin tunnistaa transkriptiotekijä (s) välittävä stimuloiva vaikutukset EGFR-MEK1 /2-reitin säätelyssä CIP2A-proteiinia ilmentyminen, me palasi takaisin bioinformatiikka tehty analyysi välisellä alueella -27 bp -108 bp (Fig. 1A). Niistä transkriptiotekijöiden ennustetaan sitoutuvan että alueelle, ETS1 on vakiintunut rooli alavirtavaikuttajainhibiittorit että MEK1 /2-reitin [11], [12]. Näin ollen, seuraavan kerran luotu mutantteja näiden ETS1 sivustoja ja verrataan lusiferaasin aktiivisuus -108CIP2ALuc konstrukteja kätkeminen mutaatiot kuin villityypin. Kaksi ETS sivustoja ja mutaatio strategian kuviossa. 6A, B. Kuten kuviossa. 6C, mutaatio joko ETS1 sivustojen dramaattisesti vähentynyt CIP2A-proteiinia promoottorin aktiivisuutta. Sen tutkimiseksi, ETS1 välittää MEK1 /2-riippuvaisen CIP2A-proteiinia sääntely, jotka on transfektoitu sekä villityypin ETS1 mutantti (site 1) -108CIP2ALuc konstruktioita hoidettiin joko AG1478, UO126 tai TPA. Kun taas villityypin -108CIP2ALuc aktiivisuus inhiboi merkittävästi AG1478 (Fig. 6D) tai UO126 (Fig. 6E), ja toisaalta aktivoidaan TPA (Fig. 6F), The ETS1 mutantti-promoottori ei merkittävästi reagoi näihin hoitoihin.

. Kaavakuva 108 bp fragmentti CIP2A-proteiinia promoottorin, joka esittää sijainnin kaksi päällekkäistä ennustetun ETS1 sitoutumiskohtia. B. sekven- ETS-1 sitoutumiskohdan mutanttien annetun CIP2A-proteiinia promoottori luotu mutageneesiä. Sekvenssin alkuun edustaa villityypin sekvenssi (luetaan 5 ’: sta 3′ päähän), kun taas sekvenssi alla on mutatoitu sekvenssi (luetaan 5′-3’-pää). Indusoitu muutos sekvenssi on esitetty sisällä suorakulmainen laatikko. C. Lusiferaasianalyysi, joka vertaa joko villityypin -108CIP2ALuc tai osoitettu ETS sitoutumiskohta mutantti -108CIP2ALuc rakentaa. D, E F. Lusiferaasimäärityksiä vertaamalla aktiivisuutta joko villityypin -108CIP2ALuc tai ETS1 site1 mutantti -108CIP2ALuc rakentaa hoidon jälkeen DMSO, AG1478 (10 uM, D), UO126 (10 uM, E) tai TPA (100 nM; F) 24 tuntia. (*,

P

0,05; **,

P

0,01; ei riittävä = ei-merkitsevä). Näkyy on Mean + SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Yhdessä nämä tulokset tunnistaa kaksi toiminnallista ETS1 sivustoja proksimaaliseen CIP2A-proteiinia promoottori. Lisäksi nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että MEK1 /2-riippuvaisen stimulaation CIP2A-proteiinia promoottorin aktiivisuus välittyy ETS-perheen transkriptiotekijöiden.

ETS1 sitoutuu CIP2A-proteiinia promoottori ja säätelee sen ilmentymistä syöpäsoluissa

Voit tarkistaa, että ETS proteiinit eivät sitoudu CIP2A-proteiinia promoottori MEK1 /2 aktiivisuus riippuvaisella tavalla, suoritimme kromatiinin immunosaostuskokeesta kanssa ETS1 vasta-ainetta ja monistus -66 ep + 20 emäsparin fragmentti CIP2A-proteiinia promoottori. Kuten on esitetty kuviossa. 7A, ETS1 immunosaostus johti noin 4-kertainen rikastus CIP2A-proteiinia promoottorin käyttöaste verrattuna kontrolli-lgG. Mielenkiintoista on, että samassa kokeessa CIP2A-proteiinia rikastus oli jopa voimakkaampi kuin UNQ9419, vakiintunut ETS1 tavoite, jota käytettiin positiivisena kontrollina [30]. Lisäksi rikastaminen CIP2A-proteiinia promoottorin inhiboitui merkittävästi käsittelemällä soluja U0126. Lisäksi, kun taas inhibitiota CIP2A-proteiinia väkevöimisen UO126 oli tilastollisesti merkitsevä, esto UNQ9419 rikastus ei ollut (Fig. 7A).

. Kromatiinin immunosaostus määritys ETS1 sitoutumisen CIP2A-proteiinia promoottori joko DMSO: ssa tai UO126 käsiteltyjä soluja. UNQ9419 promoottori on esitetty positiivisena kontrollina. (*,

P

0,05; **,

P

0,01; ei riittävä = ei-merkitsevä). B. Lusiferaasianalyysi, joka vertaa joko villityypin -1802CIP2ALuc tai osoitettu ETS sitoutumiskohta mutantti -1802CIP2ALuc rakentaa. C, D 0,01).

keskustelu

Tuore systemaattinen luonnehdinta somaattisten mutaatioiden 441 ihmisen kasvaimissa tunnistettu kasvutekijän reseptorin signalointi MEK1 /2-ERK-reitin olevan yksi kaikkein merkittävästi muuttunut polkuja poikki ihmisen syövissä [33]. Lisäksi esto onkogeenisiä muodon B-Raf ihmisen pahanlaatuisten ihosyövän jota pienimolekyylinen inhibiittori osoitti lupaavia kliininen teho jo vaiheen I kliinisen tutkimuksen [7]. Perustuen Näiden tutkimusten tulokset ja runsaasti aikaisempien tietojen osoittavat onkogeenisia toiminta EGFR-välitteisen MEK1 /2-ERK-reitin aktivaatio, on ilmeistä, että tunnistaminen onkogeenisiä efektorien koulutusjakson toiminta on tärkeää. Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että CIP2A-proteiinia on uusi kasvaimia synnyttävän tavoite voimistuvan EGFR-indusoidun MEK1 /2-ERK-reitin aktiivisuutta. Sen jälkeen, kun alkuperäinen kloonaus [34], ja edelleen toiminnallinen karakterisointi [20], CIP2A-proteiinia on osoitettu edistää pahanlaatuisten solujen kasvua käyttämällä erilaisia ​​ihmisen syöpäsolu mallit [20], [22], [23], [24], [25 ]. Lisäksi CIP2A-proteiinia proteiinin on osoitettu yli-ilmentyvän hyvin korkea taajuus eri tyyppisiä ihmisen syöpäsairauksia. Paitsi ihmisen rintasyöpä, jossa CIP2A-proteiinia yli-ilmennetään 40% potilaan näytteistä [22], ja kaikissa muissa tutkituissa syöpätyyppeihin taajuus on välillä 65-87%: lla potilaista [20], [23], [24], [25]. Tämä tekee CIP2A-proteiinia yli-ilmentyminen yhdessä MEK1 /2-ERK-reitin aktivaatio on yksi yleisimmistä muutoksia ihmisen syövissä. Kuitenkin ennen tämän tutkimuksen mekanismeja, joiden CIP2A-proteiinia ilmentyminen indusoituu ihmisen syöpäsoluja on erittäin huonosti.

tunnistamiseksi mekanismeja vastuussa korkea perusilmennystä CIP2A-proteiinia ihmisen syöpäsoluja, olemme tässä tutkimuksessa analysoitiin systemaattisesti osuutta useiden mahdollisten geenin sääntelymekanismeja, jotka on aikaisemmin osoitettu vaikuttavan geenin ilmentyminen ihmisen syövissä. Vaikka emme ole yksinomaan poissuljettua, että joko promoottori metylaatio tai toiminnallisia SNP tällä CIP2A-proteiinia promoottori voisi edistää korkean CIP2A-proteiinia ilmentyminen syövässä, meidän tiedot eivät osoittavat, että nämä mekanismit todennäköisesti eivät ole merkityksellisiä säätelyn CIP2A-proteiinia promoottorin aktiivisuutta. Jotta tiedettäisiin promoottorialueiden toiminnallisesti liitetty säätelyyn CIP2A-proteiinia ilmentymisen syöpäsoluissa, loimme yhteensä 10 promoottori poisto reportterirakenteet. Tiedot kuvioissa 2D ja 5B antanut meille mahdollisuuden päätellä, että promoottorialueen välillä -335 bp ja -392 bp sisältää vahvan aktivoiva promoottorielementin, kun taas alueen välillä -108 bp ja -204 bp sisältää vahvan repressori elementti. Lisäksi tiedot osoittavat, että promoottorialue ylävirtaan -417 bp eivät merkittävästi edistää suuren pohjapinta aktiivisuutta tutkittiin CIP2A-proteiinia promoottori AGS soluissa, kun taas, promoottorialueen välillä -27 bp ja -108 bp on erittäin vahva aktivoiva elementti osuus on vähintään 50% koko toiminnan -1802 bp promoottori. Lisäksi promoottori sääntelyä, toinen tärkeä mekanismi, joka edesauttaa proteiinin ilmentyminen on muunnos puolestaan ​​yli korko tai vakautta. CIP2A-proteiinia on aikaisemmin osoitettu olevan erittäin pitkäikäisen proteiinin maksasolukarsinoomassa solulinjassa [26]. Siksi mekanismien selvittämisessä myötävaikuttavan CIP2A-proteiinia vakautta syöpäsoluissa tulee olemaan olennainen kysymys on puututtava tulevaisuudessa.

myöhemmin kokeiluja CIP2A-proteiinia promoottori tunnistetaan kaksi osittain päällekkäistä ETS-sitoutumiskohtien välillä -60 bp -30 bp olevan suurelta osin vastuussa korkea aktiivisuus täysipituisen promoottorin.