Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sytokiiniagonistit ja kasvutekijän välittämiä signaalien kulkureittejä STST3 usein konstitutiivisesti aktivoitua monissa ihmisen primaarikasvaimia, ja ovat tunnettuja transkription niiden rooli säätelyssä solujen kasvuun ja solusyklin etenemisen. Kuitenkin laajuus STAT3: n ulottuvilla transkriptionaalisen säätelyn genomin koko on edelleen tärkeä kysymys. Olemme ennustaa, että tämä jatkuva STAT3 signalointi vaikuttaa monenlaisia ​​solun toimintoja, joista monet on edelleen ominaista. Otimme laaja lähestymistapa tunnistaa uusia STST3 geenien tarkastelemalla muutoksia genominlaajuisten geeniekspressioprofiili microarray, käyttämällä soluja, jotka ilmentävät konstitutiivisesti aktivoidun STAT3. Laskennallisen analyysin, pystyimme määrittämään geenien ilmentyminen, jotka sisältävät aktivoidun STAT3 ja tunnistaa ehdokas kohdegeenejä, jossa on laaja valikoima biologisia toimintoja. Näistä geeneistä tunnistettiin Necdin, negatiivisen kasvun säätelijänä, uutena STAT3 kohdegeenin, jonka ilmentyminen on alas-säädellä mRNA ja proteiini tasoilla, kun STAT3 on konstitutiivisesti aktiivinen. Tämä sorto on STAT3 riippuvainen, koska esto STAT3 käyttämällä siRNA palauttaa Necdin ilme. STAT3 DNA-sitoutumiskohtaan tunnistettu Necdin promoottori ja molemmat EMSA ja chromatin immunosaostus vahvistaa sitoutumista STAT3 tälle alueelle. Necdin ilme on aiemmin osoitettu olevan alassäädetty Melanoomaleesioissa ja lääkeresistentti munasarjasyövän solulinja. Lisäanalyysi Necdin ilmaisun osoitti tukahduttaminen on STST3 riippuvaisella tavalla ihmisen melanooman, eturauhas- ja rintasyövän solulinjoissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että STST3 koordinoi liittyvien geenien ekspressiota useita aineenvaihdunnan ja biosynteesireittejä, integroimalla signaalit, jotka johtavat maailmanlaajuiseen transkription muutosten ja syövän synnyn. STAT3 voi aiheuttaa sen kasvaimia synnyttävän vaikutuksen jopa säätelevä transkriptio geenien kasvun ja leviämisen, mutta myös alaspäin säätäminen ilmentymä alipaineensäätöventtiileillä saman solun prosesseja, kuten Necdin.

Citation: Haviland R , Eschrich S, Bloom G, Ma Y, Minton S, Jove R, et ai. (2011) Necdin, Negative kasvunsääde, on uusi STST3 Target Gene alassäädetty Human Cancer. PLoS ONE 6 (10): e24923. doi: 10,1371 /journal.pone.0024923

Editor: Toshi Shioda, Massachusetts General Hospital, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 elokuu 2010; Hyväksytty: 24 elokuu 2011; Julkaistu: 27 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Haviland et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Angela Musette Russo Foundation (https://www.russofoundation.com/), H. Lee Moffitt Cancer Center ja tutkimuslaitos (https://www.moffitt.org) ja National Cancer Institute (NCI) Grant R01-CA115674 (https://www.cancer.gov/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

STAT3 on piilevä sytoplasminen transkriptiotekijän, aiheuttama erilaisia ​​ylävirran signaalit, mukaan lukien kasvutekijät, sytokiinit ja ei-reseptorityrosiinikinaasien [1] – [7]. Aktivoitaessa tyrosiinifosforylaation, STAT3 muodostaa dimeerejä, jotka siirtyvät tumaan ja säätelevät kohdegeenien transkription. Normaaleissa fysiologisissa olosuhteissa, STST3 toiminta tiukasti kontrolloitua; kuitenkin, solunsisäisten signaalireittien, joihin STAT3 usein konstitutiivisesti aktivoitua monilla eri ihmisen primaaristen kasvainten [8] – [15]. Me ja muut ovat osoittaneet, että konstitutiivinen aktivaatio STAT3 tarjoaa syöpäsolujen kasvua ja selviytymistä edut [16] ja parantaa kasvaimen angiogeneesiä [17] ja etäpesäkkeiden [18]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös osoittaneet, että STAT3 aktivaatio edistää kasvaimen immuunijärjestelmän veronkierron [19], [20]. Nämä havainnot osoittavat, että poikkeava STST3 signalointi vaikuttaa monenlaisia ​​perustavanlaatuinen solutoiminnoille läpi useita mekanismeja.

Toistaiseksi sääteli ilmentymä lukuisia STAT3 kohdegeenien on tunnistettu, mukaan lukien VEGF [17], Bcl-2 Bcl-xL: [21], p21, sykliini D1 [22] ja surviviini [23]. Nämä STAT3 kohdegeenien on yleensä tunnistettu yksilöllisesti, kun taas harvat tutkimuksissa on pyritty tunnistamaan suuren määrän STAT3 säännellyn geenien [24] – [28]. Otimme laaja lähestymistapa tunnistaa uusia STST3 geenien mukana oncogenesis tutkimalla muutokset genominlaajuisten geeniekspressioprofiili microarray, käyttämällä soluja, jotka ilmentävät konstitutiivisesti aktiivisia STAT3. Yhdistämällä tämä lähestymistapa laskennallisen analyysin microarray tulosten pystyimme määrittelemään geeniekspressioprofiili ilmentävien solujen aktivoitua STAT3 ja tutkia roolia STAT3 sekä positiivisia että negatiivisia geenin ilmentymisen säätelyyn.

Pathway ja toiminnallinen analyysi osoittaa, että STST3 on tärkeä rooli säätelyssä, sekä myönteisesti että kielteisesti, monipuolista soluprosesseja lisäksi transkription. STAT3 koordinoi liittyvien geenien ekspressiota useita aineenvaihdunnan ja biosynteesireittejä, integroimalla signaalit, jotka johtavat maailmanlaajuiseen transkription muutosten ja syövän synnyn. Näitä ovat geenit liittyi solun tarttumiseen, solun tukirangan remodeling, nukleotidin, lipidi- ja proteiinien aineenvaihduntaa sekä signaalitransduktiota.

kautta laskennallisen analyysin meidän tiedot, olemme määritelleet Necdin, negatiivisen kasvun säätelijänä, uutena potentiaali STAT3 kohdegeenin. Necdin on voimakas kasvu vaimennin, joka ilmenee pääosin postmitoottisia neuronien [29] – [32]. Necdin ilmentyminen on osoitettu olevan alassäädetty molemmissa sinoomasolulinjoja ja ensisijainen kasvaimia [33], mikä viittaa siihen, että tukahduttaminen Necdin ilmentyminen voi olla rooli syövän synnyssä. Olemme varmistaneet, että Necdin mRNA ilmaisu kääntäen korreloi STST3 aktiivisuus soluissa, jotka ilmentävät konstitutiivisesti aktiivisten STAT3 ja että STAT3 suoraan säätelee ilmentymistä Necdin klo promoottori tasolla. Lisäksi, Necdin ilmentyminen ihmisen kasvainsolulinjoissa korreloi käänteisesti aktivointi endogeenisen STAT3. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy lisätodiste roolin Necdin kuin fysiologinen kohteena STAT3, jotka osoittavat, että laskennallinen analyysi microarray tietoja voidaan käyttää tunnistamaan potentiaalisia STST3 kohdegeenejä jatkotutkimuksia varten.

Tulokset

mahdollisten STAT3 kohdegeenien oligonukleotidigeenisirumenetelmää käyttäen

tunnistamaan mahdolliset uudet STST3 geenien, tutkimme globaali geeniekspressiomalleja solulinjoissa kätkeminen jatkuvasti aktiivinen STST3. Geeniekspressioprofiilien tällaisissa soluissa todennäköisesti edustava geneettisen profiilin syöpäsolun poikkeava STAT3 ilme, verrattuna asiakkuutta STST3 toimintaa väliaikaisesti käyttämällä eksogeenisen stimulaation, kuten IL-6 tai ohimenevän transfektion [25].

RNA kerättiin normaalista Balb /c-3T3-soluja, joilla on alhainen endogeenisen STAT3 toimintaa, joka toimii kontrollina. RNA uutetaan myös Balb /c-3T3-soluja, jotka on stabiilisti transfektoitu joko v-Src, tiedetään indusoivan jatkuva aktivaatio STAT3 [34], [35], tai konstitutiivisesti aktiivisen mutantin, STAT3-C [36]. Triplikaattinäytteet kerättiin, yksi kutakin kolmesta peräkkäisestä kohtia, ja jokainen RNA näyte hybridisoidaan yhteen Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 GeneChip-. Merkitys analyysi mikrosirut (SAM) [37], käytettiin tunnistamaan differentiaalisesti ilmentyvien geenien emo Balb /c-3T3-soluja ja soluja, jotka on stabiilisti transfektoitu joko v-Src tai STAT3-C. Me hyväksyi kaikki geenit tunnistaa SAM differentiaalisesti säädellään vähintään 1,5-kertainen [38].

päällekkäisyys Two Microarray Tietojoukot

mikrosiruanalyysi ja myöhemmät SAM syntyy kaksi luetteloa differentiaalisesti ilmaisi geenit: yksi lista tunnistaa geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä ohjaus Balb /c-3T3-soluja ja soluja, jotka on transfektoitu v-Src, ja toinen luettelo sisälsi geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä ohjaus Balb /c-3T3-soluja ja soluja, jotka on transfektoitu STAT3-C. Geenit yhteisiä sekä luettelot ovat todennäköisimmin suoraan säädellä STST3. Nämä geenit tunnistettiin ristiviittaukset tietoja kahden listan käyttäen Microsoft Excel PHAKU-toiminto.

Vaikka v-Src transformoitujen solujen on konstitutiivisesti aktiivinen STAT3, Src stimuloi myös muita STST3 riippumatonta reittejä [39] – [42]. Sen sijaan kohdegeenien aktivoidaan STST3-C rajoittuvat suoraan sitoutumisen aktivoitua proteiinin STST3 konsensus sivustoja DNA. Näin ollen, käyttämällä soluja, jotka on stabiilisti transfektoitu joko v-Src tai STAT3-C antoi meille mahdollisuuden hallita klonaalisia muunnelmia, sekä erot signalointireittejä riippuen mekanismi STAT3 aktivointi. Käyttää useita microarray replikoituu lähestymistapamme lisäkorotukset luottamusta tuloksiin. Tämä antoi meille mahdollisuuden tunnistaa yhteiset geenien kohteina STAT3. Aineisto vielä validoitu esille useita aiemmin tunnettu STST3 geenien, kuten CCND1, p21 [22], VEGFA [17], ja Mcl-1 [43]. Kaikkein huomattavasti-ilmaistuna (indusoitu) ja alle ilmaistuna (tukahdutettu) geenit on esitetty taulukossa 1 ja taulukossa 2, vastaavasti. Laajempi luettelo, mukaan lukien top 50 huomattavasti-ilmaistaan ​​ja alle ilmaisi geenit sisältyvät taulukoissa S1 ja S2.

Tähän mennessä suurin osa tutkimuksissa on tarkasteltu otaksuttu STAT3 kohdegeenien joita säädellään ylöspäin tai yli ilmaissut STST3 on aktiivinen. STAT3 on osoitettu aktivoivan monien geenien transkription mukana onkogeneesiin [8], solujen eloonjääminen [16], kasvaimen etenemiseen [23] ja etäpesäkkeiden [18]. STAT3 on myös aiemmin osoitettu tukahduttaa transkription muutamien geenien, mukaan lukien p53 [44] ja typpioksidisyntaasin [45] kuitenkin, tuloksemme osoittavat, että STAT3 kykenee tukahduttamiseen ilmentymistä paljon suurempi määrä geenejä. Tämä uusi löytö on potentiaalia syvällisesti vaikuttaa biologiaan solujen kätkeminen konstitutiivisesti aktiivinen STST3.

Yksi tällainen geeni, joka näyttää tukahdutettu STAT3 on negatiivinen kasvunsääde Necdin. Viisi Affymetrix probesets vastaavat NDN sijoituksesta luettelo alkuun 12 merkittävimmin tukahdutettu probesets (taulukko 2), mikä viittaa siihen, että Necdin merkittävästi tukahdutettu kun STST3 on konstitutiivisesti aktiivinen. Tämä osoittaa, että laskennallinen analyysi microarray tietoja voidaan käyttää tunnistamaan potentiaalisia STST3 kohdegeenejä jatkotutkimuksia varten.

Pathway Analyysi paljastaa tiedossa ja Novel toiminnot STAT3

mikrosirut arvioida samanaikaisesti muutoksia transkriptio tasoilla tapauskohtaisesti, jolloin pitkä luettelo geenejä, jotka ovat muuttuneet merkittävästi transkriptitasot verrattuna kontrollisoluihin. Nämä muutokset geenien ilmentyminen ei tapahdu itsenäisinä tapahtumia solussa, mutta ohjataan koordinoidusti ja usein toisiinsa. Pathway analyysi on puolueeton tapa selvittää ilmentyvät eri geenien ja proteiinien ne koodaavat, rikastetaan erityisesti polkuja, antaa käsityksen biologinen merkitys havaittujen muutosten.

alistetaan luettelo differentiaalisesti ilmentyvien geenien yhteistä on v-Src ja STAT3-C ilmentävien solujen MetaCore ™ Analysis Suite (GeneGO) ja verrattiin niitä tunnettuihin biologisiin reittejä metakantaa ™ tietokantaan. Käyttämällä tätä analyysiä pystyimme tunnistamaan tunnettujen STAT3 reittejä, kuten JAK /STAT-reitin ja angiotensiini /STAT-reitin. Tämä tukee tällaisten analyysien tunnistaa uusia polkuja, jotka voidaan myös säädellä STST3.

Soluadheesio ja cytoskeletal remodeling olivat merkittävimmin rikastettu väyliä tunnistaa differentiaalisesti ilmentyvien geenien (taulukko 3). Rooli STST3 in solun tukirangan remodeling on aiemmin kuvattu [46]. Toiminnallinen analyysi geenien me tunnistettu solun tukirangan remodeling prosesseissa, osoittaa, että STST3 säätelee geenien proteiinifosforylaatiotapahtumiin, signalointi (MAPKK ja Ras polkuja), sekä vastauksena hypoksia ja solujen vaeltamiseen.

tutki myös geenit säädellään STAT3 solun tarttumiseen, ja osoittivat, että proteiinit liittyvät soluväliaineen adheesiota ja solu-solu-adheesio, erityisesti fokaalisen adheesion muodostumista, ovat erityisen rikastettu kun STAT3 on konstitutiivisesti aktiivinen, sekä useita geenejä integriinin soluadheesion polku. Sinänsä osoitamme, että laskennallisen analyysin microarray tiedot voidaan tunnistaa sekä tiedossa uusia reittejä säätelee STST3.

toiminnot aiheuttama geenien

määrittämiseksi toiminnallinen luokitus differentiaalisesti ilmentyvien geenien tunnistaa SAM, suoritimme Functional Annotation avulla työkalun DAVID bioinformatiikan Database (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [47], [48]. Monenlaisia ​​kohdegeenien oli muutettu STAT3 aktivointi, mukaan lukien geenien mukana useita eri reittejä pitkin säännellä biologisia ja solutason prosesseja, proteiini lokalisointi ja liikenne, sekä elin ja -järjestelmien kehitys (taulukko 4). Geenit näihin luokkiin (taulukko S3. ”Affymetrix Probeset tunnuksia” sarake laajenee luetella kaikkia probeset tunnukset) ovat monet osallistuvat solujen kasvuun ja ylläpito, kuten lipidejä, nukleotidi- ja proteiinisynteesiä, aineenvaihduntaa ja /tai lokalisointi (mukaan lukien VLDLR, APOL6, AK5, MTAP, UPP1, POP5, NUPL1, SEC61B, VDP) sekä signaalitransduktiota, joita kaikkia tarvitaan edistämään solujen kasvua ja lisääntymistä.

STAT3 on hyvin tunnettu säätelijänä geenistä transkriptio kuitenkin myös näkyy läpi funktionaalianalyysi, että STAT3 ohjaa ilmentymistä liittyvien geenien soluprosesseissa tarvitaan kuljettamaan proteiinien ja säädellä niiden solunosasijaintia. Tämä tukee oletusta, että STST3 koordinoi useita reittejä solussa ja paljastaa, että STAT3 on laaja-alaiset vaikutukset, ohjaa useita solureiteillä mukana biologisia perusprosesseja. Tuloksemme viittaavat siihen, että STAT3 orchestrates transkriptio, translaatio, kuljetuksen ja lokalisointi johtaa laaja ulottuvia vaikutuksia solujen kasvuun, lisääntymistä ja selviytymistä.

Toisin kuin aiemmissa tutkimuksissa STAT3 kohdegeenien, osoitimme, että STST3 säätelee monipuolisista geenien sekä positiivisia että negatiivisia tavalla. Useimmat geenit säätelevät STAT3 jotka on tunnistettu tähän mennessä, osoittavat lisääntynyt ilmentyminen soluissa, joissa STST3 aktivoituu. Kuitenkin meidän tulokset osoittavat myös, että STST3 signalointi aiheuttaa tukahduttaminen monien geenien, kuten Necdin, jotka voivat syvästi vaikuttaa biologia solujen kätkeminen konstitutiivisesti aktiivinen STST3.

konstitutiivisesti aktivoitu STST3 Blocks Necdin mRNA Expression

sitten lähti tarkistaa laskennallisen analyysin ja vahvistaa, onko Necdin on itse asiassa STST3 kohdegeenin. NDN, koodaava geeni Necdin, negatiivinen kasvunsääde [31] ja jäsen MAGE perheen melanoomaan liittyvän kasvaimen antigeenejä, todettiin yksi ehdokas STST3-säännelty geeni. Viisi Affymetrix probesets vastaavat NDN sijoituksesta luettelo alkuun 12 merkittävimmin tukahdutettu probesets (taulukko 2). Verrattuna tavanomaisen ohjauksen soluja, analysointi microarray tiedot osoittivat, ettei NDN ilmentyminen johdonmukaisesti tukahdutettiin solulinjoissa ilmentävät v-Src tai STAT3-C, mikä osoittaa, että NDN on ehdokas STAT3-säädellään geenin molemmissa näistä solulinjoista (kuvio . 1A). Kuva 1B. vahvistaa, että NDN mRNA ilmaisu on dramaattisesti säädellä vähentävästi v-Src ja STAT3-C ilmentävien solujen mitattuna kvantitatiivisella Real-Time PCR.

. Microarray Analysis of Necdin mRNA: n ekspression tasoa. RNA Balb /c-3T3-soluja, jotka ilmentävät stabiilisti joko pMvSrc tai PRC-STAT3-C eristettiin, käsitelty ja hybridisoitiin Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 GeneChips. Valvomiseksi sekä biologisten ja kokeellinen vaihtelua, kunkin solulinjan solut kerättiin kolme peräkkäistä kohtia. Jokaisessa passage, viisi 10 cm levyt eksponentiaalisesti kasvavat solut yhdistettiin RNA ja RNA hybridisoidaan yhteen Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 GeneChip-. Taulukot skannattiin ja fluoresenssin mitattiin Affymetrix GeneArray 3000 GeneChip- skanneri ja kuvan käsiteltiin käyttäen GeneChip- Operating Software (GCOS) versio 1.1 tuottaa CEL sisältäviä tiedostoja koetin tason tiedot kustakin GeneChip-. Kaikki microarray kokeet tehtiin kolminkertaisina riippumattomasta kokeesta ja tulokset on esitetty kunkin koetin asetetaan keskimäärin kertaluokkamuutos RNA ilme. Data kaksi erilaista probesets on esitetty. Signaalin voimakkuus vanhempien Balb /c-3T3-soluja, oli asetettu 100%. B. Reaaliaikainen PCR-analyysi. RNA-näytteet, joita käytetään mikrosiruanalyysi mitattiin Necdin mRNA: n ekspression käyttämällä Reaaliaikainen PCR geenispesifisillä alukkeilla ja fluoresoivasti leimattu koetin (Taqman® Gene Expression Assays, Applied Biosystems). RNA ilmentyminen normalisoitu 18S rRNA. n = 3 riippumattoman kokeen. C. Länsi. NIH3T3-solut, jotka ekspressoivat stabiilisti v-Src ympättiin (2,5 x 10

5) 6 cm: n kudosviljelylevyillä täydellisessä elatusaineessa 24 h ennen transfektiota. Sitten solut transfektoitiin joko 125 nM ohjaus siRNA tai 100 nM tai 125 nM STST3 siRNA. 48 h transfektion jälkeen, yhteensä proteiini talteen ja yhtä suuret määrät kokonaisproteiinia (100 ug) ladattiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä, elektroforeesi ja immunoblotattiin ja Necdin (polyklonaalinen, Abcam ab18554), fosforyloitu STAT3 (p-STAT3, Cell Signaling 9131), yhteensä STAT3 (Santa Cruz, sc-482) ja anti-aktiini (monoklonaalinen, Sigma A-4551) proteiineja.

tukahduttaminen Necdin mRNA Expression on STST3 Dependent

NIH-3T3-soluja, jotka ilmentävät stabiilisti v-Src ilmentävät korkeita aktiivisen STAT3. Nämä v-Src 3T3-soluja käsiteltiin joko ohjaus siRNA tai kahden eri annosta STAT3-spesifisten siRNA. Solut käsiteltiin ohjaus siRNA ylläpitää korkeaa STAT3 ja on alhainen Necdin ilmentymisen (Fig. 1 C, kaista 1). Kuten odotettua, STAT3 siRNA estää tehokkaasti ilmentymisen yhteensä STAT3 (Fig. 1 C, kaistat 2 ja 3). Näissä soluissa ilmentymisen STAT3-proteiinin estyi annoksesta riippuvalla tavalla, ja Necdin ilmentyminen palautettiin tavalla, joka on STAT3 pudotus tässä solulinjassa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että tukahduttamisen Necdin riippuu aktivoituu STST3.

Aktivoidut STAT3 sitoutuu Necdin Järjestäjä

in vitro

Voit selvittää STST3 suoraan säätelee Necdin transkriptio, me analysoidaan sekvenssin hiiren NDN promoottori [32] mahdollisia STAT3 sitoutumiskohdista. STAT3 konsensus sivustot on määritelty palindromisiin sekvenssit yhteismarkkinoille sekvenssi 5′- TT (N

4-6) AA-3 ’[49]. Analyysimme tunnistettu useita ehdokas STST3 sitoutumiskohdista koko 1500 emäsparia ylävirtaan transkription aloituskohdasta. Kaksijuosteinen oligonukleotidi koettimet kaikkien mahdollisten sitoutumiskohtien ja testataan kilpailun EMSA (Fig. 2A) ja niiden kyky kilpailla sitoutumisesta STAT3 vastaan ​​korkean affiniteetin variantin STAT3 sitoutumiskohdan, että c-

fos

promoottori (hSIE) [50]. Oligonukleotidi, joka sisältää otaksutun sitoutumiskohdan asemassa -558 suhteessa transkription aloituskohtaan tunnistettiin pysty kilpailemaan tehokkaasti kanssa hSIE koettimen (Fig. 2A, kaista 9). Lisäksi testasimme kykyä kasvavia määriä ei-radioaktiivista NDN /-558 oligonukleotidi kilpailla radioleimatun hSIE koettimen sitoutumisen aktivoitujen STAT3. Kuten kuvassa 2B on esitetty, on korkea molaarinen ylimäärä leimaamatonta NDN /-558 pystyy kilpailemaan

32P-hSIE varten STAT3 sitoutumisen.

. Kilpailu EMSA. Oligonukleotidit sense- ja antisense-juosteet kaikki oletetun STAT3-sitoutumiskohdat Necdin promoottorin hehkutettu ja käytetään kilpailemaan STAT3 sitoutumisesta

32P-leimattua hSIE oligonukleotidia käyttäen 5 ug tumauutetta peräisin Balb /c-3T3-solut stabiilisti transfektoitu v-Src: n lähteenä aktivoitu STAT3. Ehdokas STAT3 DNA sitoutumispaikasta hiiren Necdin promoottori tunnistettiin (asema -558 suhteessa translaation aloituskohdan). Suuren affiniteetin STAT3 sitova oligonukleotidi, hSIE käytettiin positiivisena kontrollina. * ”Su-” saatiin aikaan käyttämällä anti-STAT3-vasta-aineita lisättiin reaktion vahvistaa läsnäoloa STAT3 monimutkainen. B. Kilpailu EMSA. 3T3 v-Src tumauutteesta inkuboitiin joko

32P-leimattua kaksijuosteista hSIE oligonukleotidiä (kaistat 1 ja 2) tai leimaamatonta villityypin NDN /-558 oligonukleotidin 10- 10

3-kertainen mooliylimäärä (kaistat 3-5) ennen lisäämistä

32P-leimattua hSIE oligonukleotidi, kilpailla hSIE varten STST3 sitovia. SS, supermuutoksena anti-STAT3 vasta-aineita. C. EMSA. 3T3 v-Src tumauutteesta inkuboitiin seuraavissa

32P-leimattua kaksijuosteista oligonukleotideja: hSIE (kaistat 1 ja 2), NDN /-558 (kaistat 3 ja 4), ja ilman anti-STAT3-vasta-aineita. D. Kromatiini immuunisaostustesti (chip). Balb /3T3 v-Src solut, jotka ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen STST3 käytettiin siru. Lyhyesti, sen jälkeen, kun ristisidoksia histonien ja DNA: formaldehydi 10 minuuttia, solut otettiin talteen ja käsiteltiin ultraäänellä leikkausvoimien DNA keskimääräinen pituus on 200-1000 bp. Osa tästä materiaalista käytettiin positiivisena kontrollina PCR (Input). Jäljellä Näytettä inkuboitiin joko anti-IgG- tai anti-STAT3 vasta yön yli ja sitten immunosaostettiin käyttämällä proteiini A-agaroosi. Histoni-DNA-kompleksi oli käänteinen silloitettu jälkeen useita pesuvaiheita, ja näytteille tehtiin PCR: llä käyttäen spesifisiä alukkeita ympäröivästä ehdokas STAT3-sitoutumiskohdan asemassa -558 että NDN promoottori.

kaksijuosteinen

32P-radioaktiivisesti DNA-oligonukleotidi, joka vastaa NDN /-558-sekvenssin tunnistettu NDN promoottori sitten käytetään EMSA havaitsemiseksi STAT3 DNA: ta sitova. NDN koetin, sekä positiivisena kontrollina koetin, hSIE, inkuboitiin 5 ug tumauutetta päässä v-Src 3T3-solut ja saatettiin natiivi geelielektroforeesi. Kuten kuviossa 2C on esitetty, aktivoitu STAT3 sitoutuu suurella affiniteetilla sekvenssin hSIE oligonukleotidi (kaista 1), sekä sekvenssin peräisin NDN promoottori (kaista 3). Voit varmistaa, että STST3 sisältyy proteiinikompleksi sitoutuminen oligonukleotidien, tumauutteen oli esi-inkuboitiin anti-STAT3 vasta ennen lisäämistä radioleimatun koettimen ( ”supershifted” bändejä, kaistat 2 ja 4). NDN /-558 esittää heikompi STAT3 DNA: ta sitova aktiivisuus verrattuna keinotekoinen korkean affiniteetin STAT3 sitova elementti hSIE ja lisäksi anti-STAT3-vasta-aine osittain estää sitoutumisen radioaktiivisen koettimen. Tämä voi johtaa, jos vasta-tunnistuskohdan ja DNA: ta sitova domeeni, STST3 oli lähellä, jolloin vasta-aine estää osittain sitoutumisen STAT3 koettimeen.

Sitovat STAT3 että NDN järjestäjälle

in vivo

sen määrittämiseksi, onko STAT3 voisi sitoa Necdin promoottori ehjien solujen, kromatiinin immunopresipitaatiomäärityksiä (ChIP) tehtiin 3T3 v-Src-soluissa käyttäen vasta-ainetta spesifinen STAT3. Kuten kuviossa 2D on esitetty, PCR tuotti Necdin promoottori-DNA immunosaostettiin anti-STAT3 vasta-aineen alueella -558 oletetun STAT3-sitoutumiskohdan, mutta ei ohjaus sijainti NDN promoottori. Spesifisyyttä tämän sitoutumisen vuorovaikutuksen on osoitettu puute signaalin syntyy, kun ohjaus vasta-ainetta käytetään (anti-kani-IgG). Nämä tiedot tarjoavat todisteita siitä, että STAT3 voi suoraan sitoa Necdin promoottorin ehjä 3T3 v-Src-soluissa.

Koska sekä EMSA ja ChIP määritykset viittaavat siihen, että STAT3 on kyky sitoutua NDN promoottorin sekä

vuonna vitro

ja

in vivo

, tämä antaa lisää todisteita siitä, että valvonta NDN ilmentymisen STST3 tapahtuu suoralla sitovan -tapahtumassa promoottorin ja että geenisäätelyn ensisijaisesti tapahtuu transkription tasoa.

Necdin Expression on tukahdutettu Human melanoomasoluissa

seuraava tutki alas-säätely Necdin esiintyi ihmisen kasvainsoluissa aktivoidulla STST3. Expression of Necdin on aiemmin osoitettu olevan tukahdutettu melanoomasoluissa [51], joten tutkimme, onko tämä oli korrelaatio STAT3 aktiivisuutta.

STAT3 fosforylaatio, STAT3 DNA: ta sitova aktiivisuus ja yhteensä STAT3 tasojen on osoitettu kasvaa A375-melanoomasoluja in tiheys riippuvalla tavalla ilman ligandia [52]. A375-solut maljattiin tiheys kasvaa, ja annettiin kasvaa 72 tuntia. Nuclear uutteet valmistettiin ja analysoitiin EMSA. Kuvio 3A osoittaa, että DNA: ta sitova ja STAT3 kasvaa solutiheyden odotetusti. Sitten analysoitiin kokonaisproteiinin Western blotilla varten Necdin ilme. Kuvio 3B esittää, että ilmentyminen koko STAT3 ja STAT3 fosforylaatio on säädellään ylöspäin tiheys riippuvaisesti. Toisaalta, kuten STAT3 aktivointi kasvaa, Necdin ilmentyminen säätyy alas proteiinitasolla.

A375-solut maljattiin eri tiheydet (Fig. 3A ja 3B: 1, 2,5, 5 tai 7,5 x 10

5-solut; Fig. 3C: 10

5 ja 10

6 solua) 10 cm: n maljoilla ja kasvatettiin 72 tuntia. Nuclear tiivisteet ja kokonaisproteiinin kerättiin. A. EMSA. Nuclear otteita A375-soluja inkuboitiin STST3 erityisiä hSIE

32P-leimattua kaksijuosteista oligonukleotidiä. B. Western blot. Kokonaisproteiinia uutteet kerättiin A375-solut maljattiin eri tiheydet ja yhtä suuret määrät kokonaisproteiinia (100 ug) ladattiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä, elektroforeesi ja immunoblotattiin varten Necdin, fosforyloidun STAT3 (p-STAT3) ja yhteensä STAT3 proteiineja . C. Western blot. A375-solut maljattiin kahteen eri tiheydet (10

5 ja 10

6 solua), ja annettiin kiinnittyä yön yli. Levyt ympättiin 10

6 Sitten soluja käsiteltiin joko DMSO: ssa tai CPA-7 (20 umol /l) ja kaikki solut kasvatettiin vielä 48 h. Kokonaisproteiinista kerättiin ja analysoitiin Western blot. Sillä densitometrian, kuvat olivat digitaalisesti skannattu ja optinen tiheys bändejä kvantifioitiin käyttäen Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD) ja normalisoitu valvoa. Suhde pSTAT3 kokonaismäärään STST3 laskettiin yksittäisten kaistojen.

Sen varmistamiseksi, että tukahduttaminen Necdin ilmaisu on STAT3-riippuvainen, A375-solut maljattiin korkea tiheys, ja annettiin kiinnittyä yön yli ennen kuin käsiteltiin joko DMSO tai STAT3-inhibiittori CPA-7 (20 umol /l) 24 tuntia. [53] Western blot-analyysi osoittaa, että kun A375-solut maljattiin alhaisella tiheydellä (10

5-solut), Necdin ilmentyminen on korkea, kun taas aktivoitu STAT3 on alhainen (Fig. 3C, kaista 1). Solut maljataan tiheää (10

6 solua), (Fig. 3C, kaista 3) osoittavat korkeampaa p-STAT3 ja vähentynyt ilmentyminen Necdin. Hoito korkea tiheys A375-solujen CPA-7 24 tuntia esti STAT3 aktivointi (Fig. 3C, kaista 2), ja Necdin tasoja näissä soluissa palautetaan korkea, verrattavissa soluja alhaisella tiheydellä.

IL-6 tukahduttaa Necdin Expression in Human eturauhassyöpä Cells

IL-6 toimii autokriinikasvutekijänä eturauhassyövässä [54] ja on yhdistetty etenemistä kasvaimia [55]. IL-6-signaalit välitetään JAK-STAT väylä reseptoreihin solun pinnalla ja kohdegeenien tumassa, joissa fosforylaation ja aktivaation STAT3 [56]. Siksi tutki aktivointi STAT3 kautta IL-6 stimulaatio johti tukahduttamisen Necdin ilmentymisen eturauhassyövän solulinjoissa DU145 ja PC3. Nämä solulinjat satama alhainen konstitutiivisesti aktiivisen STAT3 [57], [58], joka voidaan edelleen indusoitiin stimuloimalla IL-6. Solut seerumia 3 h ennen käsittelyä IL-6 (10 nmol /l) ja 12 tai 24 h. Kokonaisproteiinista valmistettiin ja analysoitiin Western blot. Kuvio 4A osoittaa, että IL-6 stimulaation lisännyt STAT3 toimintaa solujen ja osoitti vastaavaa alas-säätely Necdin ilmentymisen upon IL-6 stimulaation, molemmissa solulinjoissa. Tämä osoittaa, että IL-6 kykenee tukahduttamiseen Necdin ilmentymisen kautta STAT3 eturauhassyöpäsoluissa.

. Western blot. Yhteensä proteiinin DU145 ja PC3-soluja käsiteltiin IL-6 (10 nmol /l) ja 12 tai 24 tunnin analysoitiin Western blot. B. Yhteensä proteiini kerättiin MDA-MB-468, MDA-MB-231 ja MCF-7-soluihin ja suoritettiin Western blot-analyysi. C. MCF-7-solut ympättiin ja annettiin kiinnittyä yön yli, ennen kuin se transfektoitiin ohimenevästi ohjaus (GFP), pMvSrc tai pRc /CMV-STAT3-C plasmideja käyttäen Lipofectamine PLUS. Yhteensä proteiini kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja altistettiin Western blot-analyysi. Sillä densitometrian, kuvat olivat digitaalisesti skannattu ja optinen tiheys bändejä kvantifioitiin käyttäen Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD) ja normalisoitu valvoa.

Necdin Expression korreloi STST3 vaikutus ihmisen rintasyöpä solut

Koska EGFR ja Src signalointireittejä osaltaan STST3 aktivaation rintasyöpiä [15], [34], arvioimme Necdin ekspressiotasot ihmisen rintasyövän solulinjoissa erilaisilla tasoilla endogeenisen STAT3 aktiivisuuden. Kuvio 4B osoittaa, että p-STAT3 proteiinin tasot olivat korkeita MDA-MB-468-solujen, hieman pienempi MDA-MB-231 ja hyvin alhainen MCF-7-soluissa. Necdin proteiinin ilmentyminen korreloi käänteisesti p-STAT3 tasoilla, ilmaistaan ​​alhaisella tasolla MDA-MB-468 ja MDA-MB-231-solujen, mutta näytteillä paljon korkeampi ilmentyminen MCF-7-soluissa.

Voit testata oletusta, että konstitutiivisesti aktivoitu STST3 on kausaalinen rooli tukahduttamaan Necdin ilmentyminen kasvainsoluissa, me tutki ohimenevä aktivoituminen STAT3 signalointi voisi alas-säädellä Necdin ilmentymistä. MCF7-solut ilmentävät korkeita tasoja Necdin (Fig. 4C, kaista 1 4), mutta kun transfektoitu tilapäisesti v-Src tai STAT3-C 48 tuntia, Necdin proteiinin ilmentyminen estyy. Tämä osoittaa, että jopa ohimenevää 2-kertainen nousu STAT3 aktivaatio näissä soluissa on riittävä tehokkaasti tukahduttaa ilmentymisen Necdin (Fig. 4C, kaista 3 6).

Keskustelu

transkriptionaalinen profiilia ilmentävän solun konstitutiivisesti aktiivinen STAT3 ennustetaan olevan hyvin erilainen verrattuna soluun, jossa STST3 on tiukan sääntelyn. Meidän ensimmäinen hypoteesi oli, että STST3 edistää laajaa muutoksia globaalissa geeniekspressiomalleja, mukaan lukien suora ja epäsuora tavoitteita. Otimme laajaa lähestymistapaa tutkimalla globaali geenin ilmentymisen muutokset käyttämällä mikrosiruanalyysi soluissa, jotka ilmentävät konstitutiivisesti aktivoidun STAT3.