Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Pään ja kaulan okasolusyöpä (HNSCC) on ihmisen tappava syövän kliinisiä, patologisia, fenotyyppiset ja biologiset heterogeenisyys. Caner aloittamista soluja (CIC), jotka ovat vastuussa kasvaimen kasvua ja yhdistettynä voitto epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), on tunnistettu. Aiemmin olemme rikastettu alapopulaatio pään ja kaulan alueen syöpä aloittamista solujen (HN-CIC) kanssa säätely ylöspäin CD133 ja parantaminen EMT. Toiset osoittavat, että Src vuorovaikutuksessa ja fosforyloi sytoplasmadomeenissa CD133. Kuitenkin fysiologista toimintaa CD133 /Src signalointia HNSCCs ei ole paljastunut.

Menetelmät /Principal löytäminen

Tässä päätimme kriittinen rooli CD133 /Src akseli moduloivan stemness, EMT ja tuumorigeenisyyteen of HNSCC ja HN-CIC. Aluksi alas-säätely CD133 vähensi merkitsevästi itseuudistumisen kyky ja ilmentyminen stemness geenien, ja edisti erilaistumista ja apoptoottista kykyä HN-CIC. Lisäksi knockdovvn CD133 in HN-CIC myös vähentynyt sekä

in vitro

pahanlaatuisten ominaisuuksia kuten solumigraatio /solu invasiivisuus /ankkurointi riippumatonta kasvua, ja

in vivo

kasvaimen kasvua nude-hiirissä ksenotransplantaatio määrityksessä. Vastakkaisiin, yliekspressio CD133 tehosti stemness ominaisuuksia ja tuumorigeenisia kyky HNSCCs. Lopuksi säätely ylöspäin CD133 lisääntynyt fosforylaation Src yhdistettynä EMT transformaatio HNSCCs, päinvastoin, hiljaisuus CD133 tai hoidettaessa Src-estäjällä kääntäen kumottu edellä fenotyyppivaikutukset, joka indusoitiin CD133 ylössäätöä in HNSCCs tai HN-CIC .

Päätelmä /merkitys

tulokset viittasivat siihen, että CD133 /Src signalointi on sääntelyn kytkin saada EMT ja stemness ominaisuuksia HNSCC. Lopuksi, CD133 /Src-akseli voi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde HNSCC poistamalla HN-CIC: t.

Citation: Chen Y-S, Wu M-J, Huang C-Y, Lin S-C, Chuang T-H, Yu C-C, et al. (2011) CD133 /Src Axis sovittelee Kasvain käynnistävän Property ja epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon pään ja kaulan syöpä. PLoS ONE 6 (11): e28053. doi: 10,1371 /journal.pone.0028053

Toimittaja: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 8. kesäkuuta, 2011; Hyväksytty: 31 lokakuu 2011; Julkaistu: 28 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukevat tutkimusmäärärahat National Science Council (NSC95N444, NSC97N456, NSC99N024 ja NSC100-2314-B-040-001), Taipei Veterans General Hospital (V97ER2018 ja V98ER2018) ja National Yang-Ming University (opetusministeriö, Aim varten Top University Plan: 97ACD113, 97ACT302 ja 98ACT302). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on yksi yleisimmistä syövistä maailmassa ja yksi syövän syiden liittyvä kuolema johtuu hoidon vastus [1]. Huolimatta parannuksia diagnosointiin ja hoitoon HNSCC, yleinen pysyvyyttä ovat parantuneet hieman viime vuosikymmenen aikana [2].

Kertyvät tiedot osoittavat, että kasvaimen muodostumisen taustalla on solujen ala- populaation, jotka osoittavat kyky uusiutua-väitetty syövän kantasolut (CSCS) tai syöpä aloittamisen soluja (CIC) [3], [4]. CIC on osoitettu on kyky edistää kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden, ja myös edistää radio-vastus ja Chemo-vastus [5]. Viime aikoina olemme ja muut ovat vahvistanut olemassaolon CIC vuonna HNSCC (HN-CIC) [6], [7], [8], [9]. On kuitenkin ei ole todisteita siitä, miten solun pinnan signaloinnin moduloimiseen solunsisäisen stemness ominaisuuksia tai tuumorigeenisyyden HN-CIC: t.

CD133 (prominin-1), 5-läpäisevä glykoproteiini, on alun perin tunnistettu hematopoieettisten kantasolujen merkki [10]. Niinpä CD133 on pidetty tärkeänä solunpintamarkkeria edustamaan alapopulaatio CIC vuonna aivokasvaimia, paksusuolen syöpä, eturauhassyöpä, hepatosellulaarinen karsinooma, kilpirauhasen syöpä ja pään ja kaulan alueen syöpä [8], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. Aikaisemmin olemme osoittaneet, että jopa sääntely CD133 in HN-CIC myös, että säätely ylöspäin C133 vuonna HNSCC syöpäkudoksen korreloi negatiivisesti selviytymisen ennustetta HNSCC potilaista [8]. Viimeaikaiset raportit viittaavat myös siihen, että ilmentyminen CD133 kasvainkudoksissa voisi toimia ennustetyövälineenä indikaattorina kasvaimen uudelleen kasvuun, pahanlaatuinen etenemiseen ja potilaan eloonjääminen [19], [20], [21]. Kuitenkin CD133 välittämä molekyylimekanismeihin säätelyssä CIC in HNSCC on vielä epäselvä.

EMT, solun transformaatio, joka muuntaa kiinnittyneet epiteelisolujen vaeltavia mesenkyymisolujen, on kriittinen alkion kehitykseen tuumorigeenisia etenemistä syöpäsoluja ja syöpä etäpesäke [22]. Tutkijat ovat osoittaneet, että EMT voisi edistää kantasolujen (SCS) ominaisuudet ja edelleen tuottaa solujen ominaisuuksia kasvaimen aloittamista omaisuuden [23], [24]. EMT ohjelmaan myös merkittävästi yllä kasvaimen aloittamista solujen kiinteistön HNSCC [6], [7], [25].

Src, klassinen ei-reseptori tyrosiinikinaasin, joka saattaa aiheuttaa solun muuntaminen kuten hallitsematon leviäminen ja tappio kontakti-inhibition, aktivoituu vuorovaikutuksessa stimuloituun kalvon reseptoreihin [26]. Solunulkoista signaali olisi edelleen vahvistetaan ja transdusoitiin vuorovaikutuksen kautta aktivoidun Src ja loppupään tavoitteita kuten Ras /MAPK, PI3K /AKT ja STAT3 reittejä [26]. Aktivaation Src häiritsee solu-solu risteykseen, edistää invasiivisuuden kautta fosforylaation β-kateniinin mikä aiheuttaa hajoamisen E-kadheriinin, ja sen jälkeen laukaisee EMT [27]. Edelleen, Boivin ym osoittavat, että CD133 on uusi sitova kumppani Src ja on phosporylated mukaan Src [28].

Yksityiskohtaiset molekyylitason mekanismit sääntelyn väliset EMT ja kantasolujen liittyviä geenejä, kuten CD133 ja Src tunnetaan edelleen huonosti. Tässä osoitamme kriittinen rooli CD133 voidaan vahvistaa stemness, voitto EMT, ja edistämällä tuumorigeenisuus HN-CIC. Lisäksi säätely alaspäin CD133 tai esto CD133 aiheuttama Src aktivointi vähentää stemness ominaisuuksia ja aiheuttavan kasvaimia HNSCCs sekä

in vitro

ja

in vivo.

Loppujen lopuksi osoittaa merkitys CD133 /Src signalointia EMT prosessiin HNSCC.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat viljely ja rikastaminen HN-CIC päässä HNSCCs

Kaksi HNSCC solulinjoissa, SAS [29] ja OECM1 [30], kasvatettiin DMEM tai RPMI, jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Grand Island, NY), vastaavasti. Yksi ensisijainen HNSCC solulinja saatiin HNSCC potilaan. Kaikki kliiniset näytteet tässä tutkimuksessa hyväksyttiin ja noudattaen Institutional Review Board of Chung Shan Medical University Hospital (CSMUH nro: CSI0249). Rikastamiseksi HN-CIC: t, kaksi solulinjoja viljeltiin kasvaimen alalla, joka koostui seerumitonta DMEM /F12-väliaineessa (GIBCO), N2 täydennys (GIBCO), 10 ng /ml ihmisen rekombinantti emäksinen fibroblastikasvutekijä-basic (FGF ) ja 10 ng /ml epidermaalinen kasvutekijä (EGF) (R San Diego, CA, USA) ja sitten kloonattiin pCDH1-MCS1-EF 1-copGFP (System Biosciences, Cat. No: CD511A-1, Mountain View, CA, USA). Sekvenssit oligoja käytetään CD133 PCR-monistukseen ovat 5′-ACCGTCTAGAATGGCCCTCGTACTCGGCTCCCTGTTGCTG-3 ’ja 5′-ATCAAAGCTTATTGAAGCTGTTCTGCAGGTGAAGAG- tgcc-3’. Lentivirus tuotanto suoritettiin kotransfektoimalla plasmidi-DNA seoksen lentivector plus auttaja plasmidit (VSVG ja Gag-Pol) 293T-soluihin (American Type Culture Collection, Manassas, VA) käyttäen Lipofectamine 2000 (LF2000, Invitrogen, Calsbad, CA, USA ). Lentivirus M.O.I tiitteri määritetään virtaussytometrialla (keskimäärin 5 x 10

4 ja 2 x 10

5 TU /ml). Tuottaa stabiileja solulinjoja, sub-konfluentteja HNSCC solut infektoitiin lentiviruksen, kun läsnä on 8 ug /ml polybreeniä (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Vihreä fluoresoiva proteiini (GFP), joka on yhteistyössä ilmaistu lentiviruksen-infektoiduissa soluissa, on toiminut selektiomarkkerina osoittamaan onnistuneesti tartunnan HNSCCs. Vakaa CD133-yli-ilmentävät HNSCC solulinjat puhdistettiin edelleen solulajittelulla GFP-positiivisten solujen (kuviot 1A ja 1B). PCDH1-MCS1-EF1-copGFP tyhjän vektorin yksin käytetään kokeellisiin valvontaa.

(A) Single solususpensiota HN-CIC: t, oli transdusoitu sh-Luc tai sh-CD133 lentivirus ja 3 päivää. Yhteensä valmistettujen proteiinien infektoituneista soluista valmistettiin ja analysoitiin. Vaientaa vaikutusta CD133 shRNA in HN-CIC validoitiin translaation Western blottauksella (OECM1 (

vasen paneeli

) ja SAS (

oikea paneeli

)). Immunoblot anti-Oct-4, anti-Nanog, tai anti-GAPDH-vasta-aineita suoritettiin kuten on osoitettu. Määrä GAPDH-proteiinin eri raakaa solu- uutteiden nimitystä latauskontrollina, ja edelleen kvantifiointiin. (B) Solun pinnan CD133 sh-CD133-1, sh-CD133-2 ja sh-Luc HN-CIC: t, analysoitiin virtaussytometrialla (C) HN-CIC: t, oli ensin infektoitu sh-CD133-1, sh-CD133- 2 tai sh-Luc lentivirus ja 3 päivää, ja sitten edelleen viljellään seerumittomassa määritelty valinta-alustalla. Solu morfologia HN-CIC käsitelty sh-Luc tai CD133-shRNA lentiviruksen tutkittiin. Nuolet merkitty pallosta soluja. Ilmaisu profiili CK18 (D) tai anneksiini V vs. PI positiivista värjäytymistä (E) HN-CIC: llä infektoidut solut sh-CD133-1, sh-CD133-2 tai sh-Luc lentivirus arvioitiin, vastaavasti, virtaussytometrialla . Prosenttiosuus anneksiini V

+ /PI

+ kaksinkertainen positiivisia soluja tallennettiin (E; oikea paneeli). Ohjaus IgG: tä käytetään määrittämään perustason signaalin (B) ja (D). Kokeet toistettiin kolme kertaa ja edustavia tuloksia on esitetty. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD (*, p 0,05; ***, p 0,001).

rakentaminen Lentivirusvektorikonstruktit välittämää RNAi hiljentää CD133

PLV-RNAi vektori , joka co-ilmentävät GFP-proteiinia infektoiduissa isäntäsoluissa, ostettiin Biosettia Inc. (Biosettia, San Diego, CA, USA). Menetelmän kloonaus kaksijuosteinen shRNA sekvenssi on kuvattu valmistajan protokollaa. Lentivirusvektoreita ilmentävät shRNA, joka kohdistuu ihmisen CD133 (oligonukleotidisekvenssiä: Sh-CD133-1: 5′-AAAAGGACAAGGCGTTCACAGATTTGGATCCAAATCTGTGAACGCCTTGTCC-3 ’; Sh-CD133-2: 5′-AAAAGGATACACCCTACTTACTATTGGATCCAATA GTAAGTAGGGTGTATCC-3′) syntetisoitiin ja kloonattiin pLVRNAi tuottaa lentiviraalinen ekspressiovektori. Sh-Luc: 5’-CCGGACTTACGCTGAGTACTTCGAA CTCGAGTTCGAAGTACTCAGCGTAAGTTTTTTG-3 ’käytettiin kokeellista valvontaa. Lentivirus tuotanto suoritettiin kuten edellä. Vakaa pLV-RNAi ilmaisi HNSCC solulinjat puhdistettiin edelleen solulaji GFP-positiivisten solujen (kuvio S1C).

Side Väestöanalyysi

puolella populaatioanalyysissä, yksi HNSCC solujen suspension 1 × 10

6 /ml valmistettiin esilämmitetyssä DMEM, jossa on 2% naudan sikiön seerumia (FBS). Hoechst 33342 väriaine lisättiin sitten lopulliseen konsentraatioon 5 ug /ml läsnä tai poissa ollessa fumitremorgin C (FTC) (10 uM; Sigma, St Louis, MO, USA) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 90 minuutin ajan ajoittainen ravistellen. Solut pestiin jääkylmällä HBSS, jossa on 2% FBS: ää, ja sentrifugoitiin 4 ° C: ssa, ja suspendoitiin uudelleen samaan puskuriin. Propidiumjodidia lopulliseen konsentraatioon 2 ug /ml, lisättiin salpaamiseksi eläviä soluja. Hoechst 33342 väriaine viritettiin 357 nm ja sen fluoresenssi oli dual-aallonpituus analysoitu (sininen, 402-446 nm; punainen, 650-670 nm). Analyysit tehtiin FACS Vantage (BD, San Diego, CA, USA) [6].

apoptoottinen Pitoisuus

Apoptoottiset solut havaittiin anneksiini V-APC kit (Calbiochem, Darmstadt , Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Värjäyksen jälkeen solut inkuboitiin 20 ug /ml propidum jodidia (PI) analysoitiin FACS Calibur laite (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA) [6].

In vitro Solujen migraation ja invaasiomääritys

siirtokuoppaan muuttoliike määrityksiä, 2 x 10

5 solua maljattiin yläosaan kammion transwell (Corning, Acton, MA), jossa on huokoinen kalvo (8,0 um huokoskoko). Solut maljattiin alustassa, jossa alempi seerumin (0,5% FBS), ja jota on täydennetty korkeampi seerumin (10% FBS: ää) käytettiin kemoattraktantti alemmassa kammiossa. Soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja solut, jotka eivät muuttaneet huokosten läpi poistettiin pumpulipuikolla. Solujen alapinnalle kalvon värjättiin Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich), tuman osoittamiseksi; fluoresenssi havaittiin suurennuksella 100x käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa). Määrän fluoresoivia soluja yhteensä viisi satunnaisesti valittua kenttää laskettiin. In vitro soluinvaasiota analyysi oli kuvattu aiemmin [8].

Soft agar pesäkkeenmuodostuskyvyn määrityksessä

Jokaisessa hyvin (35 mm) kuusikuoppaisessa viljelymaljalle päällystettiin 2 ml pohja agar ( Sigma-Aldrich) seosta (DMEM, 10% (v /v) FCS: ää, 0,6% (w /v) agaria). Sen jälkeen, kun pohja kerros kiinteytyi, 2 ml top-agar-väliaineessa seos (DMEM, 10% (v /v) FCS: ää, 0,3% (w /v) agaria), joka sisälsi 2 x 10

4-soluja lisättiin, ja astiat inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 viikkoa. Levyt värjättiin 0,005% Crystal Violet sitten pesäkkeet laskettiin. Määrä yhteensä pesäkkeiden, joiden halkaisija ≥100 pm laskettiin yli viisi kenttää per hyvin yhteensä 15 kenttien kolmena kappaleena kokeita.

ihonalainen nude-hiirissä

Kaikki eläimen käytännöt tässä tutkimuksessa hyväksyttiin ja noudattaen Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) National Yang-Ming University, Taipei, Taiwan (IACUC hyväksyntä nro 961230). Vakaa sh-Luc ja sh-CD133 HN-CIC tai valvontaa GFP ja CD133-overexpresiing HNSCCs sekoitettuna matrigeelin (BD biotieteiden, San Diego, CA, USA) (1: 1) injektoitiin subkutaanisesti BALB /c nude-hiirissä (6- 8 viikkoa). Kasvaimen tilavuus (TV) laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: TV (mm

3) = (pituus x leveys

2) /2.

Tilastollinen

Statistical Package Social Sciences (versio 13,0) (SPSS, Inc., Chicago, IL) käytettiin tilastolliseen analyysiin. Opiskelijan

t

testiä käytettiin määrittämään tilastollinen merkitsevyys eroja koeryhmien;

p

-arvot olivat alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Taso tilastollista merkitsevyyttä asetettiin 0,05 kaikissa testeissä.

Tulokset

Down-regulation of CD133 vähentää stemness ominaisuudet yhdistettynä lisääntyneeseen erilaistumiseen ja apoptoottisten valmiuksia HN-CIC

Olemme tunnistaneet alapopulaatio pään ja kaulan alueen syöpä aloittamista solujen (HN-CIC) tiiviimmän stemness ominaisuuksia HNSCC soluista (HNSCCs) by pallo muodostumisen määritys [8]. Lisäksi me ja muut näyttää säätely ylöspäin CD133 in HN-CIC [8], [31], [32]. Tutkia tarkemmin, ovatko CD133 on rooli ylläpitämisessä CIC ominaisuuksien HN-CIC, lähestymistapa menettämisestä funktio CD133 kulki ensiksi. Down-regulation CD133 in HN-CIC saavutettiin virustransduktio kanssa lentivirusvektorilla ilmentävät pieni hiusneula-RNA (shRNA) kohdistaminen CD133 (sh-CD133-1 ja sh-CD133-2), ja lentivirusvektorikirjastojen ilmentävien shRNA vastaan ​​lusiferaasia (SH- luc) käytettiin kontrollina. Immunoblottaus analyysit vahvistivat, että lentivirus ilmensivät sekä sh-CD133-1 ja sh-CD133-2 vähensi huomattavasti ekspressiotason CD133-proteiinin transdusoiduissa HN-CIC: t (kuvio 1A). Solupopulaation pinta CD133-positiivinen (CD133

+) väheni myös vuonna sh-CD133 tartunnan HN-CIC FACS-analyysit (kuvio 1 B). Lisäksi HN-CIC tartunnan sh-CD133 lentivirus ei yllä kelluvia palloja, mutta osoitti enemmän kiinnitetty epiteelin kaltaisia ​​soluja (kuvio 1 C). Havaitsimme myös vähentää ilmentymistä stemness geenien (Oct-4 ja Nanog) (kuvio 1A), mutta lisääntynyt ilmentyminen epiteelisolujen erilaistumisen markkerin, CK18 (kuvio 1 D) on CD133 pudotus HN-CIC: t. Edelleen onko vähennys kasvaimen alalla muodostumiseen tehokkuutta CD133 alassäätöä johtui vähentynyt HN-CIC selviytymisen, selvitimme apoptoottisten solujen avulla anneksiini V plus propidiumjodidi (PI) värjäys. HN-CIC tartunnan sh-CD133 ilmentävien lentivirus huomattavasti prosenttiosuutta anneksiini V

+ /PI

+ -soluista (kuvio 1 E). Yhdessä nämä tiedot tukevat edelleen, että alas-säätely CD133 johti vähenemiseen CIC ominaisuuksia ja solujen elinkykyä in HN-CIC.

kohdistaminen CD133 kumoaa in vitro ja in vivo pahanlaatuisia ominaisuuksien HN-CIC

Valaistaan ​​välitöntä vaikutusta CD133 knockdown on

in vitro

pahanlaatuisia ominaisuuksia kuten kyvyt solumigraation, matrigeeliä invaasion ja ankkurointi riippumatonta kasvua HN-CIC, yksisolususpension ohjaus- tai CD133

–

pudotus HN-CIC: t maljattiin Transwell kammion (kuvio 2A), Transwell kammio päällystetty matrigeeliä (kuvio 2B) tai pehmeään agar (kuvio 2C), ja analysoitiin. Vaeltavien /invaasio /pesäkkeiden muodostumisen kyvyt CD133 Knockdown HN-CIC vähensi merkittävästi (kuviot 2A, 2B ja 2C). Meidän vieressä pyrittiin määrittämään, jos alas-säätely CD133 ilmaisun voisi lieventää kasvaimia kykyä HN-CIC

in vivo

. Huomattavaa on, että esto CD133 ilmentymisen merkittävästi hidastanut kasvaimen kasvua välittämää HN-CIC (kuviot 2D ja 2E; p 0,05; p 0,01). Lisäksi immunohistologinen värjäys kasvainten peräisin sh-CD133 HN-CIC näkyvissä laskua Oct4 ja lisättäessä CK18 verrattuna niihin kontrollista HN-CIC kasvaimet (kuvio S2A ja S2B). Kaiken kaikkiaan meidän tiedot osoittavat, että ehtyminen CD133 estää kasvaimen aloittamaan toiminnan HN-CIC

in vivo

.

Valaistaan ​​valmiudet solumigraation (A), solu invasiivisuus (B) ja ankkurointi riippumaton kasvu (C) HN-CIC (OECM1 (

yläpaneeli

), SAS (

alempi paneeli

)), jossa CD133 alassäätöä, yksisolususpensioon HN-CIC tartunnan CD133 erityisiä shRNA tai ohjaus sh-Luc lentivirus kolme päivää maljattiin siirtokuoppaan, siirtokuoppaan päällystetty matrigeelin ja pehmeä agar, vastaavasti, ja analysoitiin kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD kolmesta näytteestä kolmen kokeen. (D) edustaja kasvaimet ohjaus HN-CIC ja CD133-Knockdown SAS-johdettu HN-CIC luotiin, ja kasvaimet sitten leikattiin ihonalainen tilaa saajahiiret (n = 3) (Faasikontrasti-:

jäljellä kaksi paneelia

; GFP kuvantamisen

: oikea kaksi paneelia

) (Red nuolet: sh-Luc HN-CIC, Yellow nuolet: sh-CD133-1 HN-CIC). (E) Kasvaimen tilavuus mitattiin vastaavasti jälkeen inokulaation CD133-Knockdown tai sh-Luc ilmentävien SAS-johdettu HN-CIC. Virhepalkkien vastaavat SD. (*, P 0,05; ***, p 0,001)

yli-ilmentyminen CD133 parantaa stemness ominaisuuksia ja tuumorigeenisia potentiaalit HNSCCs

tutkimiseksi edelleen vaikutuksen CD133 ylä- asetus biologisia ominaisuuksia HNSCCs, me syntyy vakaa CD133-yliekspressoivia HNSCCs kautta lentiviraalinen välittämän transduktion. Onnistunut tartuntojen määrä valvonnan-GFP ja CD133-yliekspressoivia HNSCCs, jälkeenpäin solun lajittelu, vaihteli 93-94% (OECM1) ja 97 91% (SAS), vastaavasti (kuviot S1A ja S1B). Kaksi CD133-yli-ilmentävät HNSCCs (OECM1 ja SAS), oli kohonnut ilmentyminen CD133 Western blot analyysit (kuvio 3A). Lisäksi olemme huomanneet, että verrattuna GFP ilmentävät ohjaus solujen CD133-yli-ilmentävät HNSCCs osoitti merkittävää lisääminen CD133

+ solujen FACS-analyysit (kuvio 3B). Lisäksi CD133-yli-ilmentävät HNSCCs osoitti parannettu kasvaimen palloja muodostavan kapasiteetin (kuvio 3C) ja merkittävä lisääminen puolella väestöstä (SP) soluja (kuvio 3D). Havaitsimme myös, että lisääntynyt proteiinin taso Oct-4 ja Nanog of CD133-yli-ilmentävät HNSCCs viljelyksessä kanssa määriteltyjen seerumia (kuvio 3E). Seuraavaksi osoitettiin, että yli-ilmentyminen CD133 kasvattanut myös kyky solun invasiivisuus ja pesäkkeiden muodostuminen HNSCCs (kuviot 4A ja 4B). Huomattavaa on, että CD133-yliekspressoivia HNSCCs osoittivat myös merkittävästi kohonnut kasvainten muodostumiseen verrattuna ohjata HNSCCs by ksenotransplantaatio analysoi

in vivo

(kuviot 4C; p 0,05; p 0,01). Lisäksi IHC analyysit osoittivat, että kasvaimia peräisin CD133-yliekspressoivia SAS soluilla enemmän Oct4 mutta vähemmän CK18 värjäyksen (kuvio S2C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen CD133 edistää stemness ominaisuuksia ja tuumorigeenisyyden HNSCCs.

(A) ilmentyminen CD133-proteiinin HNSCCs infektoitu joko CD133-yliekspressoiva tai ohjata GFP lentiviruse tutkittiin Western blot. Määrä GAPDH proteiinin nimitystä latauskontrollina. (B) Solun pinnan CD133 ilmentyminen CD133-yliekspressoiva tai valvontaa HNSCCs analysoitiin virtaussytometrialla. (C) Kuvat ovat kasvaimen pallo muodostumisen kyky ohjaus-GFP tai CD133-yliekspressoivia HNSCCs. (D) Yksisolususpensiot vakaa CD133 yli-ilmentyvä ja ohjaamaan GFP-proteiinia ekspressoivien HNSCCs inkuboitiin Hoechst 33342: n läsnä tai poissa ollessa 10 uM fumitremorgin C (FTC), sitten analysoitiin virtaussytometrialla tunnistaa SP-soluissa. (E) Yhteensä raakaa soluista erotettuna proteiinien ohjaus-GFP tai CD133-yliekspressoivia HNSCCs viljelyksessä kanssa määriteltyjen seerumia 2 viikkoa valmistettiin ja immunoblotattiin vastaisesta-Oct-4, anti-Nanog, anti-CK18 tai anti-GAPDH vasta-aineet, kuten on ilmoitettu. Määrä GAPDH-proteiinin eri solujen raakauutteista kutsuttiin kuten latauskontrollina edelleen kvantifiointiin.

Src on alavirtaan modulaattori CD133 sääntelystä EMT vuonna HNSCC ja HN-CIC

HNSCC epiteelisolujen voi hankkia mesenkymaalisten piirteitä, jotka helpottavat maahanmuuttoa ja hyökkäyksen läpi EMT prosessin [7], [33]. Kuvioissa 4A, osoitimme, että CD133 edistää invasiivisia kykyä HNSCCs, me sitten halusimme tutkia onko CD133 olisi moduloivat EMT kautta. Morfologiset havainto osoitti, että yli-ilmentyminen CD133 epiteeli–tyypin OECM1 soluissa paljasti, mesenkymaaliset kaltainen muoto muutosta (kuvio 5A). Immunofluoresenssilla ja immunoblottauksella värjäys näkyy, että epiteelin kaltaisen proteiinin ekspressiokuvio (E-kadheriini) pieneni, mutta mesenkymaaliset kaltaisen proteiinin ekspressiokuvio (vimentiinista ja fibronektiinin) vahvistui CD133 yli-ilmentäviä HNSCCs (kuvio 5B). Toisaalta, vaimentaminen CD133 vähensi mesenkymaalisten merkki (vimentiinista), mutta indusoi epiteelin markkereita (E-kadheriinin) in HN-CIC (kuvio 5C).

(EN) invasiivisuus kyky ohjaus-GFP tai CD133 -overexpressing HNSCCs tutkittiin kuten kuvataan materiaalit ja menetelmät (*, p 0,05; ***, p 0,001). (B) Anchorage riippumaton kasvu kontrolli-GFP tai CD133-yliekspressoivia HNSCCs analysoitiin (**, p 0,01; ***, p 0,001). (C) edustaja kasvaimen kasvu kontrolli-GFP tai CD133-yliekspressoivia HNSCCs (1×10

5 solut) ihonalainen tilaa saajahiiret (Red nuolet: kontrolli-GFP HNSCCs; Keltainen nuolet: CD133-yliekspressoivia HNSCCs) (

vasen paneeli

). Kasvaimen tilavuus mitattiin siirrostuksen jälkeen valvonta-GFP (n = 3) tai CD133-yli-ilmentävät HNSCCs (n = 3), vastaavasti (

oikea paneeli

). Virhepalkkien vastaavat SD (*, p 0,05; **, p 0,01).

(A) Morfologiset ero valvonta-GFP ja CD133-yliekspressoivia HNSCCs. (B) Immunoblottaus analyysi (

oikea paneeli

) ja konfokaali immunofluoresenssivärjäyksellä (

vasen paneeli

) EMT liittyvien merkkiaineiden kontrolli-GFP tai CD133-yliekspressoivia HNSCCs analysoitiin. (C) proteiini tasot vimentiinista ja E-kadheriinin on merkitty HN-CIC: t, analysoitiin western-blotilla. (D) Protein taso Src tai p-Src valvonta-GFP tai CD133-yliekspressoivia HNSCCs analysoitiin immunoblottauksella. (E) Yksi solususpensiota HN-CIC: t infektoitiin sh-Luc-ilmentävät tai shRNAi CD133 lentirus, vastaavasti, ja ilmaus Src tai p-Src yllä HN-CIC: t, analysoitiin western-blotilla. (F) CD133-yli-ilmentävät HNSCCs käsiteltiin ensin 10 uM PP2 (Src-estäjällä) tai 10 uM U0126 (Erk-inhibiittori) 24 tuntia. Ilmentymisen Src, p-Src, Erk1 /2, p-Erk1 /2, vimentiinin, E-caherin tai CK-18 edellä käsiteltyjen solujen arvioitiin western blot -analyysillä, jossa GAPDH on sisäisen kuormituksen valvonta. (G) CD133-yli-ilmentävät HNSCCs olivat ensin viljeltiin määritelty seerumivapaassa väliaineessa 2 viikkoa yhdessä lisäämällä PP2, ja ilmaus Oct-4, Nanog, tai GAPDH proteiinien ohjaus (DMSO) tai PP2 käsitellyt solut analysoitiin immunoblottauksella.

Src signalointireitin on tärkeä välittäjäaine EMT vuonna HNSCC (kuva S3A) [34]. Fujimoto et al ovat osoittaneet, että tyrosiini-513 sisällä CD19 ei ole vain Lyn (Src-ryhmän kinaasin) sitoutumiskohtaan, mutta myös fosforylaation puolella, edelleen, vuorovaikutus CD19 ja Lyn olisi monistamaan Src-kinaasiaktiivisuutta ja loppupään Cascade [35]. Boivin ym ovat osoittaneet, että CD133 on uusi sitova kumppani Src ja on phosporylated mukaan Src [28]. Mutta miten vuorovaikutus CD133 ja Src aktivoi alavirran vaikutukset mukaan lukien monistaminen Src-vaikutuksen edelleen epäselviä? Täällä, osoitimme, että p-Src (aktivoitu Src kanssa fosforylaatio) nostettiin CD133 yliekspressoivia HNSCCs (kuvio 5D). Päinvastoin, CD133 hiljentäminen rajoitettua aktiivista Src in HN-CIC (kuvio 5E). Tasaisen, hoito Src-estäjällä (PP2), mutta ei Erk1 /2-estäjä (U0126) merkittävästi käänteinen mesenkymaaliset kaltaisen proteiinin ilmentymistä pattern epiteelin kaltainen yksi, ja lisäsi ilmaisun sytokeratiinin 18 (CK18), joka on differentiaatiomarkkeri, vuonna CD133-yli-ilmentävät OECM1 soluissa (kuvio 5F). Yli-ilmentyminen CD133 edistää fosforylaation Erk1 /2 ihmisen glioblastoomasoluissa [36], mutta meidän CD133-yliekspressoivia HNSCCs, hoito Erk1 /2-estäjä (U0126) aiheuttivat vain vähäinen vaikutus CD133-yliekspressoivia aiheuttama EMT (kuvio 5F ja data ei näytetty). Lopuksi PP2 vähensi stemness markkereita (Oct4 ja Nanog) sekä heikentynyt pallo muodostumista kykyä CD133-yli-ilmentävät HNSCCs viljelyksessä kanssa määriteltyjen seerumia (kuvio 5G ja tietoja ei näytetty).

CD133 downregulation ja Src esto lakkauttaa p-Src-vaikutuksen ja pallo muodostumista kyky ensisijainen HN-CIC

edelleen todentamiseksi fysiologista toimintaa CD133 /Src akseli välitteistä signalointia ensisijainen HN-CIC, HN-CIC johdetut HNSCC potilaan soluja syntyy. Lisäksi ilmaus CD133 in HN-CIC säädeltiin vähentävästi by lentiviral-sh-RNAi. Johdonmukaisesti, p-Src-aktiivisuus myös vaimentua (kuvio 6A). Lisäksi alalla muodostumista kykyä sh-CD133 ensisijainen HN-CIC vähennettiin verrattiin kontrolli (sh-Luc) ensisijainen HN-CIC (kuvio 6B). Lopuksi PP2 (estäjä Src-vaikutuksen) hoidon ensisijainen HN-CIC myös poisti alalla kykyä muodostaa (kuvio 6C).

(A) Protein taso CD133 ja p-Src of lentivius välittämä CD133 pudotus ensisijainen HN -CICs analysoitiin western-blotilla. (B) Ensisijainen HN-CIC ensin tartunnan sh-Luc tai CD133-shRNA lentivirus. Kolme päivää sen jälkeen lentiviruksen infektion alalla muodostumista kyky viruksen infektoimissa soluissa sitten viljellään valinta-alustassa rekisteröitiin. (C) Vasta rikastettu ensisijainen HN-CIC käsiteltiin PP2 (10 uM) 72 tunnin ajan ja alalla muodostumista kykyä PP2 käsitellyn HN-CIC soluja tutkittiin. Nuolet merkitty alalla soluja.

Yhteenvetona tuloksemme ehdotti, että CD133 /Src signalointi on keskeinen kytkin sääntelystä CIC ominaisuuksista, EMT transformaatio ja aiheuttavan kasvaimia HNSCCs (kuva 7).

Up-regulation CD133 siten aktivoi Src signalointi (p-Src), sitten, edistää voitto EMT, parantaminen stemness ominaisuuksia ja kasvainten muodostumiseen in HNSCC.

keskustelu

kasvain muodostuu heterogeeninen populaatio soluja, ja sitä on havaittu, että solujen alapopulaation, ns syövän kantasoluja (CSCS) tai syövän aloittamisesta solut (CIC), kasvainkudosten sisällä omaavansa stemness ominaisuudet [37]. CSCS tai CIC katsotaan olevan vastuussa aloittamisesta, leviämistä ja etäpesäkkeiden kasvainten [38], [39], [40]. Tärkeää on, että on olemassa CIC saattaisi selittää syövän uusiutumisen vuoksi radioresistance tai chemoresistance kliinisen hoidon syöpäpotilailla [5].

CD133, solun pinnan merkkiaine hematopoieettisten kantasolujen ja endoteelisolujen esiasteita, on ehdotettu olevan osallistuvat angiogeneesiin sekä syövän kasvainten muodostumiseen [41]. CD133 on äskettäin tunnistettu yhteiseksi CIC markkeri monien kasvainten tyypit, mukaan lukien HNSCC [8], [31]. Bao et ai. huomaavat alapopulaatio CD133

+ soluja eristettiin aivokasvainten näytteille CIC ominaisuuksia, reagoivat huonosti kemo- tai sädehoitoa, ja edistävät angiogeneesiä helpottaa aivokasvain kasvua [42]. Samaan aikaan, CD133

+ CIC kiinteissä tuumoreissa tunnettu resistenssin kemoterapiaa [43]. Päinvastoin, CD133 ehtyminen tukahduttaa pesäkkeitä muodostavien kyky paksusuolen syöpä [44]. Siksi paremmin ymmärtämään biologisia ominaisuuksia CD133

+ CIC saattaa selittää epäonnistumisen syövän hallinnan, ja antaa meille uusia hoitomenetelmiä [45].

Tässä arvioimme rooli CD133 vuonna ylläpito stemness ominaisuudet ja Tuumorigeenisuustutkimuksissa HNSCCs ja HN-CIC: t, joita lentiviruksen-välitteisen knockdovvn tai yliekspressio CD133 (kuviot 1 ja 3). Ehtyminen CD133 edisti erilaistumista ja laski i

n vivo

tuumorigeenisia ominaisuudet HN-CIC (kuviot 1 ja 2). Ottaa huomioon, että yli-ilmentyminen CD133 parantaa kasvaimen palloja muodostavan ominaisuus, puoli populaation soluja, stemness geenien ilmentymistä (Oct4 ja Nanog) ja edistää tuumorigeenisen kyvyn HNSCC (kuviot 3 ja 4).