Krooninen sairaus

tiivistelmä

Epigeneettiset muutoksia, kuten poikkeava DNA: n metylaatio, johtaa muunnetun geenin ilmentyminen ja on tärkeä rooli syövän synnyssä. Phytochemicals kuten sulforafaani (SFN) ja 3,3′-di-indolyylimetaani (DIM) ovat lupaavia kemopreventiivisten aineina eturauhassyövän. Molemmat on osoitettu indusoivan uudelleen geenien ilmentymistä, mukaan lukien tuumorisuppressorigeeneille vaiennettu syöpäsoluissa, modulaation kautta epigenetic merkkien mukaan lukien DNA: n metylaation. Kuitenkin se jäi epäselväksi vaikutuksia SFN ja DIM DNA metylaatio genomista mittakaavassa. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää genominlaajuisten vaikutukset SFN ja DIM promoottori metylaatio normaalissa eturauhasessa epiteelisoluissa ja syöpäsolujen. Sekä SFN ja DIM käsittely laski DNA-metyylitransferaasin ekspression normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen (PrEC), ja androgeeniriippuvainen (LnCAP) ja androgeenista riippumaton (PC3) eturauhasen syöpäsoluja. Vaikutukset SFN ja DIM promoottori metylaatio profiileista normaaleissa PrEC LNCaP ja PC3 eturauhassyövän solut määritettiin metyyli-DNA immunosaostus ja sitä seuraava genominlaajuisten DNA: n metylaatio array. Osoitimme laajaa muutoksia promoottori metylaation, mukaan lukien sekä lisätä ja vähentää metylaation, kaikissa kolmessa eturauhasen solulinjoissa vasteena SFN tai DIM hoitoja. Erityisesti SFN ja DIM muuttunut promoottori metylaatio erillisiin sarjaa geenien PrEC LNCaP, ja PC3-soluissa, mutta siinä samoilla geenikohteet yhden solun sisällä linja. Olemme lisäksi osoittaneet, että SFN ja DIM käänteinen monet syöpään liittyvän metylaatio muutoksia, mukaan lukien poikkeavasti metyloituja geenejä, jotka väärin säädellystä tai ovat erittäin osallisina syövän etenemiseen. Kaiken kaikkiaan meidän tiedot osoittivat, että molemmat SFN ja DIM ovat epigeneettiset modulaattorit, jotka ovat laajoja ja monimutkaisia ​​vaikutuksia DNA: n metylaation profiileja sekä normaalissa ja syöpä- eturauhasen epiteelisolujen. Tulokset Tutkimuksemme voi tarjota uusia oivalluksia epigeneettiset mekanismeja, joilla SFN ja DIM saavat aikaan syövän chemopreventive vaikutuksia.

Citation: Wong CP, Hsu A, Buchanan A Palomera-Sanchez Z, Beaver LM, Houseman EA , et ai. (2014) vaikutukset Sulforaphane ja 3,3′-di-indolyylimetaani on genominlaajuisten Promoottori metylointi normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen ja syöpäsolujen. PLoS ONE 9 (1): e86787. doi: 10,1371 /journal.pone.0086787

Editor: Bernard W. Futscher, University of Arizona, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 elokuu 2013; Hyväksytty: 13 joulukuu 2013; Julkaistu: 22 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Wong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NIH myöntää CA90890, CA65525, CA122906, CA122959, CA80176, R01GM104977 sekä NIEHS Centerin avustuksen P30 ES00210. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epigeneettiset mekanismit ovat olennaisia ​​säännellä ja ylläpitämiseksi geeniekspressiomalleja. Säädeltyyn epigeneettiset prosessit, kuten poikkeava DNA: n metylaatio, histonimodifikaation, ja microRNA profiilit, johtavat muuttuneeseen geenin ilmentymistä ja toimintaa ja on tärkeä rooli syövän synnyssä. Erityisesti laajaa muutokset DNA: n metylaatio kuvioita havaittu syövän taudin alkamisen ja etenemisen, tyypillistä maailmanlaajuinen ja paikkasidonnainen DNA hypometylaatio sekä geenin promoottori hypermetylaation [1], [2]. DNA hypometylaatio syövän voidaan edistää genomiin epävakautta ja lisääntyneen ilmentymisen onkogeenien. Toisaalta, DNA hypermetylaation voi johtaa hiljentäminen kasvainten synnyssä, transkriptiotekijät, sekä geenien solukierron säätelyssä ja apoptoosin. Perustaminen ja ylläpito DNA metylaation välittyvät DNA metyylitransferaaseja (DNMTs) [3]. Yliekspressio DNMTs havaitaan moniin syöpiin, mukaan lukien leukemia [4], haimasyöpä [5], mahasyöpä [6], keuhkosyöpä [7], ja eturauhassyövän [8], ja säädeltyyn DNMT ilmentyminen todennäköisesti on yksi vaikuttavista johtavat tekijät poikkeava DNA metylaation aikana syövän etenemisen. Toisin kuin geneettisiä mutaatioita, epigeneettiset muutokset ovat potentiaalisesti palautuvia ja edustaa houkutteleva ja lupaava kohde syövän kemopreventiossa strategioita. Monet epigeneettisellä lääkkeet kehitetty kääntää DNA metylaatio ja histonimodifikaation poikkeamat syöpä ovat parhaillaan tutkittavana. Lisäksi farmakologisia aineita, yhä useammat olennaisia ​​mikroravinteita ja ravinnon phytochemicals on osoitettu toimivan epigenetiikka modulaattorit, ja ovat houkuttelevia ehdokkaita käytettäviksi epigeneettisellä terapiassa [9], [10]. Kyky ruokavaliotekijät käyttämään epigeneettiset vaikutuksia korostaa mahdollista merkitystä tiettyjen ravintoaineiden ja bioaktiivisten fytokemikaalit epigeneettisellä sääntelyn ja syövän kemopreventiossa strategioita.

Eturauhassyöpä on toiseksi yleisin diagnosoitu syöpä miehillä Yhdysvalloissa [11 ]. Ruokavalio on muunneltavissa riskitekijä ja voi vaikuttaa alttiuteen eturauhassyövän kehitykseen. Eturauhassyöpä riskin on osoitettu korreloivan käänteisesti kulutuksen kanssa cruciferous vihannekset [12], [13]. Erityisesti, sulforaphane (SFN), ja 3,3′-di-indolyylimetaani (DIM), kaksi fytokemikaaleista johdettu glukosinolaattien cruciferous vihannekset on osoitettu olevan tehokkaita kemopreventiivisiä aineita, eturauhassyöpää vastaan ​​[14], [15]. SFN on isotiosyanaatin johdettu hydrolysoimalla Glucoraphanin, ja DIM on suuri hapon kondensaatiotuote indoli-3-karbinoli (I3C), hydrolyysituote glucobrassicin. Anti-syöpä vaikutuksia sekä SFN ja DIM ovat monitahoinen, eri chemopreventive mekanismit, mukaan lukien induktio vaihe 2 entsyymejä, apoptoosin lisääntyminen, solusyklin pidätyksen, ja soluproliferaation inhibointi. Viime aikoina yhä näyttöä siitä, että SFN ja DIM voi toimia myös epigenetiikka modulaattorit ja aiheuttavat syövän ominaisuuksia kohdistamalla epigeneettiset tavaramerkkien eturauhassyövän soluissa. Esimerkiksi SFN ja DIM voi estää histonideasetylaasi (HDAC) toimintaa, muuttaa HDAC ilme, ja johtaa uudelleen ilmentyminen tuumorisuppressorigeeneille [16], [17]. Me ja muut ovat osoittaneet, että SFN voi estää DNMT ilmaisun ja muuttaa DNA: n metylaation eturauhasen ja rintasyövän soluja, jotka edustavat uutta kemopreventiossa mekanismi, jonka SFN epigeneettiseltä säätelee geenin ilmentymistä [18] – [20]. Dual vaikutukset SFN on HDAC esto ja DNA: n metylaatio tekevät siitä houkuttelevan ravinnon kemopreventiota agentti. Kuitenkin hyvin vähän tiedetään vaikutuksista SFN muihin poikkeavasti metyloitua geenikohteet, ja onko SFN on ero vaikutuksia DNA: n metylaation normaalissa ja syöpä- eturauhasen soluja. Lisäksi on vielä määriteltävä jos DIM voidaan vastaavasti käyttää dual epigeneettisellä vaikutuksia ja moduloivat DNA: n metylaation eturauhasen syöpäsoluja.

Tämä nykyinen tutkimus tehtiin määrittää genominlaajuisten vaikutukset SFN ja DIM promoottori metylaatio normaalissa eturauhasessa epiteelisoluissa ja eturauhasen syöpäsoluja. Oletamme, että molemmat SFN ja DIM ovat tehokkaita ruokavalion modulaattoreita DNA: n metylaatio johtuu niiden estovaikutusta DNMT ilme. Olemme lisäksi hypoteesina, että SFN ja DIM voi differentiaalisesti vaikuttaa promoottorin metylaation profiilit normaalissa ja syöpä- eturauhasen epiteelisolujen ja kääntää poikkeava metyloidut geenien eturauhassyövän soluissa. Tutkimuksemme lisäävät ymmärrystämme metylaation tavoitteiden SFN ja DIM, ja antaa oivalluksia epigeneettiset mekanismeja, joilla SFN ja DIM saavat aikaan syövän chemopreventive vaikutuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture ja hoito olosuhteet

Normaalit ihmisen eturauhasen epiteelisolut (PrEC) saatiin Lonza (Allendale, NJ) ja niitä viljeltiin PrEC pohjapinta väliaineessa, joka sisälsi PrEGM SingleQuot Kit täydentää ja kasvutekijät (Lonza, Allendale, NJ). Ihmisen androgeeniriippuvaisissa eturauhassyövän epiteelisolut (LnCAP) ja androgeenista riippumaton eturauhassyöpä epiteelisolut (PC3) hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja niitä viljeltiin RPMI1640-alusta täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia. Kaikki solut viljeltiin kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 ja 37 ° C: ssa. SFN (LKT Laboratories, St. Paul, MN) ja DIM (Sigma, St. Louis, MO) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO). PrEC, LnCAP, ja PC3-soluja käsiteltiin ajoneuvon ohjaus (0,03% DMSO), 15 uM SFN, tai 15 uM DIM biologisissa kolmena rinnakkaisena käytettäväksi DNA: n metylaatio taulukot. Hoito annos valittiin heijastamaan fysiologisesti asiaankuuluvien pitoisuuksien SFN ja DIM [21], [22]. Solut kerättiin 48 tuntia jälkikäsittelyjen käytettäväksi metylaation määrityksissä tai Kromatiini Immunosaostaminen (chip) määritykset. Geeniekspression määrityksiä, solut kerättiin 72 tuntia käsittelyn jälkeen. Ryhmissä käsiteltiin DNA demetyloivan aineen, 5-atsa-2′-deoksisytidiini (AZA), 5 uM AZA käytettiin ja solut kerättiin 48 tuntia käsittelyn jälkeen.

Näytteiden valmistelu DNA Metylointi Array

yhteensä 27 näytettä jätettiin DNA: n metylaatio erilaisia ​​analyysi, mukaan lukien näytteet jokaisesta kolmesta solulinjojen käsitelty vehikkelikontrollit (n = 3 per solulinja), DIM (n = 3 per solulinja), ja SFN (n = 3 per solulinja). Genomi-DNA eristettiin käyttäen DNeasy Veren Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA). Genomisen DNA: n fragmentoituminen, puhdistettu DNA pilkottiin MseI restriktioentsyymillä (New England Biolabs, Ipswich, MA) yön yli 37 ° C: ssa, jolloin saatiin DNA-fragmenttien välillä 200 1000 bp. Metyloitua DNA rikastettiin käyttämällä metyyli-DNA immunosaostuksella (MeDIP) valmistajan protokollan mukaisesti (Roche NimbleGen, Madison, WI). MeDIP rikastetun DNA: n sekä tulo DNA monistettiin GenomePlex Complete kaikkiaan Genome Amplification Kit (Sigma). Amplified MeDIP ja tulo DNA-näytteet jätettiin Center for Genome Research Biocomputing ydin laitos (Oregon State University, Corvallis, OR) näytteen merkintöjä, näyte hybridisaatio, ja array skannaus. Näyte hybridisaatio ja array skannaus tehtiin käyttäen NimbleGen hybridisaatiosysteemiä 4 (Roche) ja Axon GenePix Pro 4200 A (Molecular Device, Sunnyvale, CA), vastaavasti.

DNA Metylointi Array Data Analysis

NimbleGen ihmisen DNA metylointi 3 × 720 K CpG Island Plus RefSeq Promoottori Array (Roche), joka perustuu HG18 genomin vapautumista käytettiin. Array sisälsi 720000 koettimet 50-75 bp: n pituinen mediaani koettimen välinen etäisyys on 104 bp: n, joka kattaa 30848 selostukset, 22532 promoottorit, ja 27728-CpG-saarekkeiden. Raaka intensiteetit skannatun kuvan sekä Cy5 ja Cy3 kanavat eristettiin käyttäen NimbleScan (Roche). Raaka intensiteetti Pari tiedostot tuotiin R tilastollinen ohjelmointiympäristö käyttämällä mukautettuja R ohjelmistoa.

tunnistaminen antureista merkittäviä skaalattu log

2-suhde.

Signaalin voimakkuus suhde, syntyi vähentämällä log muuttaneet IP-kanavan intensiteetit lokista muuttaneet Tulokanava intensiteettiä. Suhdeluvut olivat keskittynyt näytettä kohti pohjalta Tukey biweight toiminto. Koettimet merkittäviä skaalattu log

2 suhde tunnistettiin NimbleScan ohjelmiston Oletusparametrit valmistajan antamia.

Differential metylaatio kertamuutosta välillä solulinjoja ja /tai hoitoja.

pareittain vertailut tehtiin kautta uudelleen parametrointi määrittää solulinjaa ja hoito vaikutuksia. Keskivirheet ja astetta-of-vapauden uutettiin ja määrittämiseksi käytetyt t-tilastoja ja määrittäminen merkitys.

Metylointi array tietoja talletetaan NCBI Gene Expression Omnibus, hakunumero GSE47017.

luettelon antureista merkittäviä log2 kertamuutosta (p-arvo 0,05) verrataan välillä käsittely (SFN tai DIM) vs. ajoneuvon hallintaan, tai vertaamalla välillä syöpäsolujen (ajoneuvon hallinnan) ja normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen (ajoneuvon hallinnan) tuli . Koettimet merkittäviä kertamuutosta oli kartoitettu selityksin ominaisuuksia ihmisen genomin (HG18) ja värjätään Generic Genome Browser (GBrowse) [23]. Koettimet kuluessa 2 kb ylävirtaan ja 1 kb alavirtaan transkription aloituskohdasta (TSS) sisällytettiin analyyseihin tässä raportissa. Hierarkkinen klusterointi analyysit tehtiin käyttäen MeV ohjelmistojen [24]. Venn kaaviot verrataan päällekkäisyys eri geenin luettelot tuotettiin BioVenn [25]. Gene rikastamiseen ja toiminnallinen merkintä analyysit tehtiin käyttäen Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery v6.7 (DAVID) [26]. Toiminnallinen merkintä klustereiden työkalua käytettiin määrittämään merkittävästi rikastettu Gene ontologia (GO) ehdot kussakin huomautusta klustereita. Epigenome kartoitus merkittävästi differentiaalisesti metyloidut antureista koodata histonimodifikaation tietokantaan tehtiin käyttäen EpiExplorer [27].

Validation DNA Metylointi Data

Valitse erilaisesti metyloituja geenejä määritettynä NimbleGen metylaation array todensi pyrosekvensointi. Genomi-DNA: ta käsiteltiin natriumbisulfiitin avulla EpiTech bisulfiittimodifiointi Kit (Qiagen). Pyrosekvensointi PCR ja sekvensointialukkeita Valittujen erilaisesti metyloidut geenit suunniteltiin käyttäen PyroMark Pitoisuus suunnittelu 2.0.1 ohjelmistot (Qiagen) (taulukko S1). PCR-monistus bisulfiitti-muunnetaan genomista DNA: ta tehtiin käyttäen PyroMark PCR-pakkausta (Qiagen) olosuhteissa, jotka on määritelty valmistajan toimesta. PCR-tuotteet toimitettiin Stanfordin yliopiston Proteiini ja Nucleic Acid Facility (Palo Alto, CA) pyrosekvensointi. Kvantitatiivinen metylaatio analyysit tehtiin käyttäen PyroMark Q23 versio 2.0.6 ohjelmisto (Qiagen).

Gene Expression Analyysit

Kokonais-RNA käsitellyistä soluista eristettiin käyttäen Trizol (Life Technologies). Kokonais-RNA käänteiskopioitiin cDNA käyttäen SuperScript III Ensimmäisen Strand Synthesis SuperMix ja qRT-PCR: llä (Life Technologies). Geenien ilmentyminen kvantifioitiin qPCR käyttäen seuraavia qPCR alukkeita: ihmisen DNMT1 (eteenpäin: 5′-GTGGGGGACTGTGTCTCTGT-3 ’, käänteinen: 5′-TGAAAGCTGCATGTCCTCAC-3′), DNMT3A (eteenpäin: 5’-CACACAGAAGCATATCCAGGAGTG-3 ’, käänteinen: 5’-AGTGGACTGGGAAACCAAATACCC-3 ’), DNMT3B (eteenpäin: 5′-AATGTGAATCCAGCCAGGAAAGGC-3′, käänteinen: 5’-ACTGGATTACACTCCAGGAACCGT-3 ’), GAPDH (eteenpäin: 5′-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3′, käänteinen: 5’-TTCACACCCATGACGAACAT 3 ’), CCR4 (eteenpäin: 5′-AATTGTGCACGCGGTGTTTT-3′, käänteinen: 5’-TCCAGGGAGCTGAGAACCTT-3 ’), CXCR4 (eteenpäin: 5′-GAACTTCCTATGCAAGGCAGTCC-3′, käänteinen: 5’-CCATGATGTGCTGAAACTGGAAC-3 ’) , Cyr61 (eteenpäin: 5’-CTTAGTCGTCACCCTTCTCCAC-3 ’, käänteinen: 5′-CAGGGTCTGCCCTCTGACT-3′), ja TGFBR1 (eteenpäin: 5’-CCTCGAGATAGGCCGTTTGT-3 ’, käänteinen: 5′-ATGGTGAATGACAGTGCGGT-3’). Kaikki qPCR reaktiot tehtiin käyttäen Fast SYBR Green Mastermix (Life Technologies) on 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Geenien ilmentyminen normalisoitiin GAPDH ja suhteellinen kvantitointi määritettiin käyttäen ΔΔCt menetelmää RQ Manager 1.2.1 ohjelmisto (Applied Biosystems).

Kromatiini Immunosaostaminen (chip) Analyysit

ChIP analyysit tehtiin kuten aiemmin kuvattu pienin muutoksin [28]. Lyhyesti, käsiteltyjen solut kiinnitettiin formaldehydillä ja chromatin hajotettiin sonikoimalla. Proteiini /DNA-kompleksit immunosaostettiin spesifisillä vasta-aineilla vastaan ​​H3K4me3 (Abcam, Cambridge, MA). Negatiivinen kontrolli ChIP tehtiin käyttäen normaalia IgG: tä. Immunosaostuksen, ristisidoksia kääntyminen, ja proteinaasi K, ChIP DNA puhdistettiin fenoli-kloroformiuutolla. ChIP-qPCR alukkeita suunniteltiin monistamaan tiettyjä TGFBR1 ja Cyr61 promoottorialueet, jotka osoittivat ero metylaatio vuoksi DIM hoitoon (TGFBR1 eteenpäin: 5′-GGATCGGGAAGGGGTTTGAG-3 ’, käänteinen: 5′-CCCTTCACATGCGACTCACT-3′; Cyr61 eteenpäin: 5’- CTCCCACCCCTAACCCTCTA-3 ’, käänteinen: 5′-GGCCCTTAGTGCTAATGCTGA-3’). ChIP-qPCR reaktiot tehtiin kolminkertaisina, ja määrän Immunopresipitoidun DNA-näytteiden tehtiin käyttämällä standardikäyrää syntyvät sarjalaimennoksia puhdistetusta tulo DNA. Tulokset laskettiin prosenttiosuutena tulo DNA (% tulo) ja esitetty suhteellisena kertamuutosta verrattuna DMSO ajoneuvon hallinnan.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen testaus EpiExplorer päällekkäisiä arvojen onko valitse metylaatio antureista limittyvät merkittävästi enemmän kuin sattumalta odotettua (satunnaistettu kontrolli) kanssa H3K4me3 ja H3K9ac piikkien ENCODE tietokantaan tehtiin käyttäen peräkkäinen Monte Carlo useita testaus (MCFDR) algoritmin Perimän HyperBrowser [29], [30]. Tilastollinen ero DNA-koettimet liittyvät DIM välittämä lisääntynyt tai vähentynyt metylaatio ja niiden päällekkäisyys histonimerkkien määritettiin kahden otoksen osuus t-testi SciPy (https://scipy.org). Jäljellä tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad Prism versio 5.02 (GraphPad, La Jolla, CA), jossa tiedot on ilmoitettu keskiarvona ± SEM, ja p-arvot määritettiin käyttämällä paritonta t-testiä tai yksisuuntaista ANOVA seurata by Tukey-Krammer Multiple Vertailu testaa tarvittaessa. Tilastollinen merkitsevyystaso määriteltiin α 0,05.

Tulokset

SFN ja DIM Laskua DNMT Gene Expression ja aiheutti Distinct DNA Metylointi Profiili muutostyöt Riippuen Eturauhassolupinnan Line

arvioidaan vaikutukset SFN ja DIM ekspressioon DNMT1, DNMT3A, ja DNMT3B normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen (PrEC), androgeeniriippuvainen (LnCAP) ja androgeenista riippumaton (PC3) eturauhasen syöpäsoluja. LnCAP ja PC3-soluissa oli merkittävästi korkeampi lähtötilanteessa ilmentymisen DNMT1, DNMT3A, ja DNMT3B verrattuna PrEC-soluissa (kuvio. 1A). Vuonna PrEC ja LNCaP, sekä SFN ja DIM hoitoja laski DNMT1 ja DNMT3B geenin ilmentymistä (Fig. 1 B ja 1 C). PC3-soluissa, SFN merkittävästi vähentynyt ilmaus kaikkien kolmen DNMTs tutkitaan, ja DIM vähentynyt ilmentyminen DNMT1 (Fig. 1 D). Tämän perusteella tulos, sekä meidän aikaisempia havaintoja, SFN voi välittää promoottori de-metylaatio eturauhassyöpäsoluissa [18], teimme genomin laajuisen tutkimuksen määrittämiseksi globaaleja vaikutuksia SFN ja DIM promoottori-DNA-metylaation PrEC, LnCAP, ja PC3-soluissa.

(A) Gene ilmentymä DNMT1, DNMT3A, ja DNMT3B käsittelemättömästä PrEC LNCaP, ja PC3-solut (n = 3-5 ryhmää kohden). Data edustaa keskiarvoa normalisoitu kertamuutosta ± SEM verrattuna PrEC. (B-D) vaikutukset SFN ja DIM on DNMT geenin ilmentymisen PrEC-soluissa (B), LNCaP (C), ja PC3-solut (D). Soluja käsiteltiin ajoneuvon ohjaus (DMSO), 15 uM SFN, tai 15 uM DIM (n = 6 per ryhmä B-D). DNMT1, DNMT3A, ja DNMT3B geenin ilmentyminen analysoitiin 48 h käsittelyn jälkeen. Data edustaa keskiarvoa normalisoitu kertamuutosta ± SEM verrattuna DMSO. * P-arvo 0,05.

metylaatiostatuksen yksittäisten koettimien tunnistettiin ensin kunkin kolmen solulinjojen vertaamalla MeDIP rikastetun versus tulonäytteiden (skaalattu log2 suhde). Hierarkkinen klusterointi analyysi osoitti, että PrEC LNCaP ja PC3 oli selvä metylaatio profiileja (Fig. 2A). Seuraavaksi ero metylaation välinen syöpäsolujen ja normaalien eturauhasen epiteelisolujen määritettiin. Koettimet merkittäviä skaalattu log

2 suhde tunnistettu LNCaP ja PC3-soluja verrattiin tunnistettu PrEC soluihin pareittain vertailu määrätä merkitykselliset log2 taitettava erot syöpäsolujen ja normaalien eturauhasen epiteelisolujen (LnCAP vs. PrEC, ja PC3 vs. PrEC). Kaikki myöhemmät analyysit solulinjan ja /tai hoitoon tarkoitettujen vaikutusten merkittäviä metylaatiomuutokset perustuu log2 kertamuutosta vertailuja. LnCAP-soluihin ja PC3-solut oli 78272 koettimet ja 54876 koettimia, vastaavasti, jotka olivat merkittävästi differentiaalisesti metyloidut verrattuna normaaliin PrEC-soluissa (kuvio. 2B). PC3-soluja, 64% koettimista oli lisääntynyt metylaatio, verrattuna 49% koettimista on LnCAP-soluja, jotka oli kasvanut metylaatio suhteessa PrEC. Koska metylaatio profiilia kunkin geenin arvioitiin useita koettimia, päätimme keskimääräinen metylaation tason geeniä kohti keskiarvoistamalla merkittäviä log2 kertamuutosta kaikkien koettimien annetaan yksittäisten geenien. Tämä edusti 10315 ja 8013 differentiaalisesti metyloitu geenien LNCaP ja PC3-soluissa, vastaavasti, suhteessa PrEC soluihin (Fig. 2C). Havaitsimme, että suurin osa koettimia kunkin geenin oli sama metylaatiomuutokset, jossa on yli 92% joko ollut lisääntynyt tai vähentynyt metylointi. Vain 7,4% koettimista LNCaP-soluissa ja 4,2% koettimista PC3-soluissa oli sekoitettu metylaation profiilin kunkin geenin (tuloksia ei ole esitetty). Log2 kertamuutosta per geeni vaihteli -3,322-+2,893 LNCaP-soluissa, ja -2,411-+2,941 PC3-soluissa. Toiminnallinen merkintä analyysit osoittivat, että geenit, joilla on muuttunut metylaation profiili eturauhassyövän solut rikastuneet geenejä, jotka väärin säädellystä tai osallisina syövän etenemiseen, kuten GO luokat liittyy solujen vaeltamiseen, soluadheesion, solu-solu signalointi, samoin kuin transkription asetuksen (data ei näytetty). Valitse geenejä ero metylaation perustuu NimbleGen metylointi array todensi pyrosekvensointi (kuva S1).

(A) hierarkinen ryhmittely analyysi antureista merkittäviä skaalattu log

2 suhde PrEC LNCaP ja PC3 solut. Vihreä ja punainen palkit edustavat yksittäisiä koettimia merkittäviä vähentynyt ja lisääntynyt metylaatio, vastaavasti MeDIP DNA-näytteitä suhteessa tuloon DNA-näytteitä. Data edustaa alkuun 1000 merkittävin antureista kussakin solulinjassa. (B) vertailu metylaatiomuutokset LNCaP ja PC3-solujen suhteen PrEC soluihin. Merkittävät metyloitu antureista LNCaP ja PC3-soluja verrattuna PrEC ja jakelu koettimien merkittäviä log2 taitettava muutokset näkyvät. (C) Keskimääräinen metylaatio tasolla yksittäisten geenien LNCaP ja PC3-soluissa verrattuna PrEC. Log2 kertamuutosta per geeni määritettiin keskiarvo log2 kertamuutosta kaikkien differentiaalisesti metyloidut koettimia kullekin geeniä, ja edustettuina laatikko ja hiuksenhienosti tontteja. Numero baarin yläpuolella tarkoittaa joukko geenejä kussakin ryhmässä. Whiskers edustaa suurin ja pienin arvo, ja ”+” edustaa keskiarvoa.

vieressä tutki vaikutuksia SFN ja DIM promoottorista metylaation profiilit kunkin eturauhasen solulinjaan. Log2 kertamuutosta verrattiin välillä SFN tai DIM hoitoja verrattuna DMSO ajoneuvon valvonnan PrEC LNCaP, ja PC3-soluissa. SFN hoidot aiheuttaen merkittäviä log2 taittuva muutos 6154 koettimen PrEC soluissa, 9302 koettimet LNCaP-soluissa, ja 20783 koettimien PC3-soluissa (kuvio. 3A), joka edustaa 2472, 3508, ja 6778 differentiaalisesti metyloidut geenejä, tässä järjestyksessä (Kuva. 3B ). DIM hoidot indusoi merkittäviä log2 taittuva muutos 8970 koettimen PrEC soluissa, 15237 koettimet LNCaP-soluissa, ja 7386 koettimet PC3-soluissa, jotka edustavat 3224, 4404, ja 2394 differentiaalisesti metyloidut geenejä, tässä järjestyksessä (Kuva. 3B). Yksittäiset koettimet kunkin geenin oli sama metylaatiomuutokset, jossa yli 95% koettimista on joko ollut lisääntynyt tai vähentynyt metylaatio, ja hyvin harvat geenit oli sekoitettu metylaatio profiili (alle 5% koettimista on SFN-käsitellyissä soluissa ja 2,5 % koettimista on DIM käsitellyissä soluissa) (tuloksia ei ole esitetty). Valikoima kertamuutosta takia SFN ja DIM hoidot olivat välillä -1,380-1,243, ja oli kapeampi suhteessa havaittuun verrattaessa syöpäsolujen verrattuna normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen (Fig. 2B). Jakelu differentiaalisesti metyloitua antureista sisällä promoottori tutkittiin ja osoittanut mitään suosivista bias promoottori alueille (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Vaikutukset SFN ja DIM sen metylointi profiilin PrEC LNCaP, ja PC3-soluissa verrattuna vehikkelikontrolliin. Kunkin kolmen solulinjojen merkittäviä metyloituja koettimien SFN tai DIM-käsiteltyjen ryhmien verrattiin niiden ajoneuvon ohjaus määrittää, koetin-spesifisen log2 kertamuutokselle. Jakauma antureista merkittäviä log2 kertamuutosta näytetään. (B) Keskimääräinen metylaatio tasolla yksittäisissä geenien SFN ja DIM käsitellyn PrEC LNCaP, ja PC3-solut verrattuna vehikkelikontrolliin. Log2 kertamuutosta per geeni määritettiin keskiarvo log2 kertamuutosta kaikkien differentiaalisesti metyloidut koettimia kullekin geeniä, ja edustettuina laatikko ja hiuksenhienosti tontteja. Numero baarin yläpuolella tarkoittaa joukko geenejä kussakin ryhmässä. Whiskers ovat maksimi- ja minimiarvot, ja ”+” edustaa keskiarvoa.

Venn-kaavio-analyysit osoittivat, että SFN ja DIM kukin muuttaa metylaation erillistä sarjaa geenejä kussakin solulinjoissa. Vertailu sarjaa geenejä on muutettu SFN tai DIM osoitti, että vain pieni määrä geenejä (219 ja 209-geenien, vastaavasti) on jaettava kaikkien kolmen solulinjoissa, jotka edustavat välillä 3% ja 9% erilaisesti metyloitua geenien kustakin solulinjasta (Fig. 4A). Tästä ydinjoukko geenejä, oli -30% päällekkäisyys SFN ja DIM hoitoja. Sen sijaan, oli korkea päällekkäisiä geenien vaikuttavat sekä SFN ja DIM hoidoista PrEC ja LNCaP (1926 geenit ja 2671 geenejä, tässä järjestyksessä), ja vähemmässä määrin PC3-solut (1408 geenejä) (Fig. 4B) . Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun me jakaa aineistoja lisäämiseksi geeneihin lisääntynyt metylaatio tai vähentynyt metylointi (tuloksia ei ole esitetty). Toiminnallinen merkintä-analyysit osoittivat erilaista rikastettu geenien normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen verrattuna eturauhasen syöpäsoluja, mutta samanlaisia ​​sarjaa geenejä rikastettu verrattaessa SFN ja DIM hoitoa kussakin solulinjassa (Fig. 5). Vuonna PrEC-soluissa, geenien transkription, apoptoosin ja kromatiinin organisaation /muutos oli täydennetty sekä SFN ja DIM hoitoja. LNCaP-solut, kaksi yleistä luokkaa geenejä rikastunut. Ensimmäinen mukana liittyviä geenejä soluun liikkeen, kuten solujen vaeltamiseen, tarttuvuus ja lokalisointi. Toinen mukana geenit liittyvät immuunivasteeseen, kuten tulehdus ja puolustus, leukosyyttiaktivaation ja immuuni sääntelyn. Toiminnallinen merkintä analyysi PC3-solut osoittivat rikastettua geenin luokkia yhteinen samankaltaisuus sekä PrEC ja LnCAP, mukaan lukien geenien mukana transkriptio, apoptoosin, solujen vaeltamiseen, ja immuunivastetta.

(A) Venn kaavioita, jotka esittävät useita geenejä, jotka oli differentiaalisesti metyloitavaa PrEC LNCaP, ja PC3-solujen päälle hoitojen SFN tai himmentää verrattuna vehikkelikontrolliin. (B) Venn kaavioita, jotka esittävät useita erilaisesti metyloitua geenikohteet SFN ja DIM kussakin solulinjassa.

toiminnallinen merkinnästä erilaisesti metyloitua geenikohteet SFN ja HIMMENNYS PrEC LNCaP, ja PC3-solut tutkittiin ja määrä osallistuvien geenien valitse biologisten prosessien ja toimintojen näytettiin. Tiedot on ilmaistu lukumäärä geenejä kussakin merkittävästi rikastettu GO luokkaan.

SFN ja DIM Vastakkainen Cancer liittyvä DNA Metylointi Muutokset LNCaP

Seuraavaksi, koska enemmän merkittävä väheneminen in DNMT1 ja DNMT3B sekä SFN ja DIM hoitoa LNCaP, päätimme keskittyä luonteenomaiset osajoukko geenien oli differentiaalisesti metyloitu LNCaP suhteessa PrEC soluihin, ja purettiin SFN ja /tai DIM hoitoja. Niistä 10315 geenit, jotka oli ero metylaatio LNCaP-soluissa (kuvio. 2C), SFN ja DIM hoitoja kääntänyt metylaatio profiilit 1509 (14,6%) ja 2219 (21,5%) geenejä, tässä järjestyksessä (Kuva. 6A). Nämä geenit kuuluivat kahteen ryhmään: 1) geenit, jotka olivat kasvaneet promoottori metylaatio LNCaP-soluissa suhteessa PrEC soluihin, ja vähensi metylointi päälle SFN ja /tai DIM hoitoa, ja 2) geenit, jotka oli vähentynyt promoottori metylaatio LNCaP-soluissa verrattuna PrEC soluihin , ja lisääntynyt metylointi päälle SFN ja /tai DIM hoitoon. Esimerkki geenin, joka kuuluu kuhunkin luokkaan, C-C-kemokiinireseptori tyypin 4 (CCR4: n) ja transformoivan kasvutekijä-β1-reseptorin tyypin I (TGFBR1), on esitetty kuviossa. 6B. Toiminnallinen merkintä analyysit osoittivat GO rikastamiseen monien geenien tiedetään väärin säädellystä tai ovat erittäin osallisina syövän etenemiseen. Tämä aineisto sisältyvät geenit liittyi solun tarttumiseen ja kemotaksista, sekä immuunijärjestelmän liittyviä geenejä mukana tulehdus ja puolustus, sytokiinien sitova, ja immuunijärjestelmän kehitys (Fig. 6C). Venn-kaavio vertailu osoitti, että 86%: n geenien SFN geeni listan (1309 out of 1509) on jaettu DIM geenin luettelosta (Fig. 6D). Koska suurin osa geenien vaikuttaa SFN sisällytettiin DIM geenin luettelosta, myöhemmät geeniekspressio kohdennettiin valittuja geenejä missä DIM käsittely kääntänyt säädeltyyn metylaation profiilin LNCaP.

(A) määrä erilaisesti metyloitua geenien LNCaP-soluissa verrattuna PrEC soluja, jotka olivat päinvastaiset SFN tai DIM hoitoja. Musta palkki edustaa geenejä, jotka oli vähentynyt metylaatio LNCaP-soluissa, jotka nostettaisiin SFN /DIM hoitoja. Valkoinen palkki edustaa geenejä, jotka olivat kasvaneet metylaatio LNCaP-soluissa, jotka oli väheni SFN /DIM hoitoja. (B) Kaksi geeniä esimerkkiä, CCR4 ja TGFBR1, väärin säädeltyyn metylointi profiileja LNCaP jotka oli päinvastainen SFN ja /tai DIM hoitoja. Värilliset palkit edustavat perimän asemaa DNA metylaatio koettimien että oli vähentynyt metylaatio (sininen) tai lisätä metylointi (punainen), kun verrataan anturi-specific log2 kertamuutosta LNCaP-soluissa verrattuna PrEC, tai DIM verrattuna DMSO ajoneuvon hallinnan LNCaP-soluissa. TSS (sininen ympyrä) edustaa transkription aloituskohdasta kunkin geenin. (C) Toiminnallinen merkinnästä differentiaalisesti metyloitu geenikohteet LNCaP-soluissa, jotka oli päinvastainen SFN tai DIM hoitoja. (D) Venn-kaavio näyttää kuinka monta geenikohteet kanssa promoottorin metylaation jotka väärin säädellystä LNCaP-soluissa ja käänteinen SFN tai DIM.

neljä geenejä (TGFBR1, kysteiinirikas angiogeenisten indusoijan 61 (Cyr61) , CCR4, ja CXC kemokiinireseptori tyypin 4 (CXCR4)) valittiin edelleen tutkia suhdetta muutoksen promoottorin metylaation profiilin ja geenien ilmentymiseen LNCaP. Promoottori metylaatio profiilit kuhunkin näistä neljästä geenit muutettu LNCaP verrattuna PrEC-soluissa, ja DIM hoito kumosi syöpään liittyvän metylaatio profiileja. Jokaisen näistä neljästä kandidaattigeenien on raportoitu väärin säädellystä syövän, ja korreloi syövän etenemisessä.