Krooninen sairaus

tiivistelmä

plasma jet on ehdotettu uutena terapeuttinen menetelmä syövän. Syövän vastainen aktiivisuus plasmassa on raportoitu mukaan mitokondrioiden. Kuitenkin mitä ainesosia syntyy plasmaa liittyy tähän syövän vastaisia ​​prosessia ja sen vaikutusmekanismi jää epäselväksi. Täällä raportoimme että terapeuttiset vaikutukset ilman plasma johtuvat sukupolven reaktiivisen hapen /typen muotoja (ROS /RNS) sisältäen H

2O

2, Ox, OH

-, • O

2 , NOx, mikä depolarisaation mitokondrion kalvon potentiaalia ja mitokondrioiden ROS kertymistä. Samanaikaisesti ROS /RNS aktivoida c-Jun NH

2-terminaali kinaasin (JNK) ja p38-kinaasi. Tämän seurauksena käsittely ilman plasma suihkujen indusoi apoptoottista kuolemaa ihmisen kohdunkaulan syövän HeLa-soluissa. Solujen esikäsittely antioksidantteja, JNK ja p38-estäjien tai JNK ja p38 siRNA kumoaa depolarisaation mitokondrion kalvon potentiaalia ja heikentää ilman plasma aiheuttama apoptoottisen solukuoleman, mikä viittaa siihen, että ROS /RNS tuottama plasman laukaista signalointipolkujen liittyy JNK ja p38 ja edistää mitokondrioiden häiritseekin, mikä johtaa apoptoosin. Siksi anto ilman plasma voi olla toteuttamiskelpoinen strategia poistamiseksi syöpäsoluja.

Citation: Ahn HJ, Kim KI, Hoan NN, Kim CH, Moon E, Choi KS, et al. (2014) kohdistaminen Syöpäsolut kanssa reaktiivisten hapen ja typen lajien Syntyy Atmospheric-Pressure Air Plasma. PLoS ONE 9 (1): e86173. doi: 10,1371 /journal.pone.0086173

Editor: Xianglin Shi, University of Kentucky, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 syyskuu 2013; Hyväksytty: 06 joulukuu 2013; Julkaistu: 21. 2014

Copyright: © 2014 Ahn et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Research Foundation Korean tuet, jotka rahoitetaan Korean hallitus (MSIP) (2012M3A9B2052871, 2010-0018546, 2011-0030043). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Plasma on usein kutsutaan neljännessä olomuoto lisäksi kiinteiden, nestemäisten, ja kaasun. Plasma on melko samanlainen kaasun joissa osa hiukkasista on ionisoidun ja veloitetaan, jotkut hiukkaset ovat sähköisesti neutraaleja, ja jotkut ovat kemiallisesti aktivoitu radikaaleja. Plasma voidaan luokitella joko ”lämpö- (tai kuumaa) plasma” tai ”ei-terminen (tai kylmä) plasmassa.” Lukuisia tekniikoita käyttäen plasma on tutkittu ja toteutettu onnistuneesti tietyissä teollisissa sovelluksissa. Viime aikoina plasma sovelluksia on käytetty biologisten ja lääketieteen, kuten veren hyytymisen [1], syövän hoitoon [2], pinta sterilointi [3], ja hampaiden pesillä käsittely [4]. Erityisesti kasvava plasma translaatiotutkimusta syövän hoidossa voidaan kehittää uusia terapeuttisia vaikutuksia. Lisäksi on mielenkiintoista, että kylmä plasma syntyy ilmakehän paineessa kasvattaa toteutettavuus lääketieteellisiä sovelluksia.

Vaikka biologisesti tehokas materiaali (t) syntyy plasmasta ja sen solu- tavoitteet ovat tuntemattomia, useita rivejä todisteita linkin reaktiivisen hapen /typpi laji (ROS /RNS) sen biologisia vaikutuksia. Hoito plasma aiheutti depolarisaation mitokondrion kalvon potentiaalia ja sukupolven ROS ihmissoluissa [2]. Lisäksi antioksidantteja korjaantua plasma aiheuttama mitokondrioiden, tukee käsitystä, että hapettavat lajit, kuten ROS voi välittää plasma aiheuttamaa vaikutuksia nisäkässoluissa [2]. Monenlaisia ​​näennäisesti toisiinsa ja eri syistä mitokondriohäiriöitä on yhteisiä taustalla patofysiologisia mekanismeja: ROS tuotanto ja kertymistä mitokondriovaurioita, mikä lisää oksidatiivista stressiä, menetys ATP, mitophagy laadunvalvontaa ja poistaminen vahingoittuneiden mitokondrioiden, ja lopulta solun kuolemaan [5].

nyt on selvää, että ROS on soluviestitykseen rooli monissa biologisissa järjestelmissä bakteereista nisäkässoluista [6]. ROS voi aktivoida solujen signa-, joiden tarkoituksena on esimerkiksi monia erilaisia ​​mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) laskeutuu [7], [8]. Näitä ovat stressi kinaasien, c-Jun N-terminaalinen kinaasien (JNK) ja stressi-aktivoidun proteiinikinaasin (SAPK). JNK tunnistettiin kinaasi, joka sitoo ja fosforyloi c-Jun on Ser-63 ja Ser-73 sen transkription aktivaatiodomeeni. JNK aktivoidaan solujen käsittely sytokiinien (esim, tuumorinekroositekijä (TNF) ja interleukiini (IL) -1), ja että solujen altistaminen monia muotoja ympäristön stressin (esim osmoottinen stressi, redox stressiä, ja säteily ) [9]. On hyvin tunnettua, että ROS indusoivat JNK. Useimmat raportit ROS aiheuttaman JNK aktivaation seurausta ulkoisista ROS, enimmäkseen H

2O

2. Lisäksi ROS kertymistä aiheuttama apoptoottiset ärsykkeitä voi aktivoida SAPK p38 [10]. JNK ja p38 MAPK reittejä on useita samoja ylävirtaan sääntelyviranomaisten, ja sen mukaisesti on useita ärsykkeitä, jotka samanaikaisesti aktivoida sekä reittejä.

väliset ROS signalointi ja apoptoosin ehdotetaan välittyvän mitokondrioita. Tällä hetkellä monet tutkimukset ovat osoittaneet, että mitokondriot ovat tärkeimmät työkohteen varten JNK apoptoosin. Sekä JNK1- ja JNK-poistettu ensisijainen hiiren alkion fibroblasteja ovat osoittaneet UV aiheuttama apoptoosin vian vuoksi mitokondrion kuolema signalointireitin, mukaan lukien epäonnistuminen vapauttamaan sytokromi c [11]. Mitokondrioiden translokaatio JNK tapahtuu olosuhteissa stressin kuten altistuminen UV, ionisoiva säteily, ROS ja RNS, ja näin mitokondrioiden-lokalisoitu JNK tarjoaa läheisyys mitokondrioiden luomaa ROS [12], [13]. Lisäksi apoptoottiset ärsykkeille joskus laukaista p38a aktivoinnin toissijainen reitti, kuten tuotannon ROS [13].

ja useat muut ryhmät ovat raportoineet, että ilmakehän paine plasma [2], [14] – [19] ja typen plasman suihkujen mikro-suuttimen array [20] apoptoosin syöpäsoluissa. Viime aikoina, plasma on osoitettu edistää apoptoosia syöpäsolujen sukupolven ROS, häiriöitä mitokondrion kalvon potentiaalia, ja kaspaasi proteiinit [2]. Kuitenkin mitä komponentti (s) syntyy ilman plasma tuottaa sen syöpää ehkäisevistä vaikutuksista ja molekyylitason mekanismi, jolla plasma indusoi apoptoosin jää epäselväksi. Tässä raportissa, yritimme löytää efektorikomponenttina (t) tuotetaan ilman plasma ja sen tavoitteen ja selvittämiseksi molekyylimekanismin ja biokemiallinen reitti, jolla se aiheuttaa syövän vastainen terapeuttinen hyöty. Olemme tunnistaneet ROS /RNS keskeisinä efektoreina ilman plasmaa, joiden kohteena mitokondrioita ja johtaa aktivoitumiseen JNK ja p38 signalointireitteihin.

Tulokset

Air mikro plasma jet voi tuottaa reaktiivisia hapen ja typen lajit

mikro plasma jet järjestelmä toimi ilmakehän paineessa voi tuottaa kemiallisesti aktiivisia lajeja, erityisesti happi- ja typpiatomien [21]. Tässä tutkimuksessa ensin palveluksessa optinen emissio spektrin analyysi tunnistaa hiukkaset ja radikaaleja syntyy ilman plasma (kuva 1a-b), joka voi välittää vaikutuksia ilman plasma syöpäsoluissa [2], [22]. Optinen emissiospektroskopia (OES) suoritettiin laajalla aallonpituusalueella 280 nm: stä 920 nm ja optinen emissio spektroskoopin (SV 2100, K-MAC) (Kuva 1c). Hallitseva emissioviivoja kuvaavat läsnäolo innoissaan happi-ionit (O

2

+) 500-600 nm ja atomi happi (O I) 777 ja 844 nm (kuvio 1 c). Lisäksi havaittiin reaktiivisia lajeja, jotka liittyvät typen ovat innoissaan typpimolekyyliksi (N

2 Toinen myönteinen järjestelmän ja N

2 ensimmäinen positiivinen järjestelmä) valikoimia 300-390 ja 610-710 nm ja ionisoitua typpimolekyyliksi (N

2

+ ensimmäinen negatiivinen järjestelmä) on alueella 390-480 nm, ja atomityppi (NI) at 747, 822, ja 868 nm (kuvio 1 c). Nämä OES tulokset osoittavat, että ilma mikro plasma jet voi olla tärkeä rooli tuottaa eri reaktiivisia hapen ja typen lajien (ROS ja RNS, vastaavasti).

(a) valokuva tekaistu mikroplasma jet järjestelmä. Insertti on kaavamainen esitys mikro- plasman suihkutussuuttimen. (B) valokuva ilman mikro plasma jet syntyy ilmakehän paineessa. (C) optinen valonemissiospektri ilman mikro plasma jet purkamisen aikana.

Solunulkoisilla ja solunsisäisten ROS ja RNS kertyi ilmaplasmaa altistus

vihje että ROS ja RNS voi välittää syöpää ehkäisevistä vaikutuksista ilman plasma ehdotti edellisessä tutkimuksessa raportoi, että ilma plasma indusoi apoptoosin, mukana sukupolven ROS ja RNS ja vähentämällä mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) kohdunkaulan syöpäsolut [2]. Lisäksi tuotanto ROS ja RNS plasmalla jet on tutkittu viime aikoina [23], ja on sopusoinnussa emissiospektreissä aiheuttama ilman plasma (kuva 1c). Siksi me biokemiallisesti analysoitiin tuotannon ROS ja RNS, niiden viemiseksi nestefaasi soluviljelyväliaineessa, ja juokseva migraation ROS ja RNS soluihin (kuvio 2).

(a) tasot ekstrasellulaarinen H

2O

2 määritettiin kulttuuriin tai ei-kulttuuri (Medium vain) supernatantit, jossa (AP) tai ilman (non-käsitelty) ilma plasmakäsittely. Viljelmän supernatantti kerättiin ilmoitettuina ajankohtina ilman plasma käsittely (AP). AP 0 (min) osoittaa supernatantista heti plasmakäsittely. Pitoisuus H

2O

2 Viljelysupernatantissa määritettiin vertaamalla H

2O

2 standardin kalibrointikäyrän jälkeen inkubaation Amplex Ultrared reagenssilla (

n

= 5). (B) Generation ja /tai tunkeutumisen poikki solukalvon ROS lukien H

2O

2, OH

-, ja • O

2 solunsisäisessä matriisissa seuraavat ilman plasma jet (AP) oli määritetään ROS-herkkä koetin H

2DCFDA (

n

= 5). Fluoresenssi käsittelemättömien solujen (Non-käsitelty) on mielivaltaisesti asetettu 1. (c) tasot solunulkoisen NO määritettiin ei-kulttuuri (ilman HeLa-solujen, ylempi) ja kulttuuri (läsnä ollessa HeLa-solut, alhaalta ) supernatantit osoitettuina aikoina jälkeen ilman plasma jet altistus Griessin mitattuna (

n

= 10). (D) Solunsisäiset NO arvioitiin käyttäen DAF-FM. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.E.M. (

n

= 10).

ensimmäinen tutki hoito ilman plasma voisi aiheuttaa sukupolven H

2O

2 Viljelysupernatantissa (kuva 2a ). Viljelmän supernatantti kerättiin ilmoitettuina ajankohtina ilman plasma hoidon ja pitoisuus H

2O

2 Viljelysupernatantissa analysoitiin verrattuna H

2O

2 standardin kalibrointikäyrän. H

2O

2 kertyi noin 26,93 uM heti hoidon jälkeen ilman plasmasuihkujen ja pitoisuus viljelmän supernatantissa laski nopeasti 1 tunnin kuluessa. Kuitenkin H

2O

2 ei-pelkästään viljelyalustassa väheni hitaammin kunnes 1h seuraavat plasmakäsittely verrattuna taso viljelmän supernatantissa. 3 h, tasot H

2O

2 olivat samanlaisia ​​supernatanteista HeLa soluviljelmissä ja keskisuurten vain. H

2O

2 oli tuskin havaittiin viljelmän supernatantissa, 3 h seuraavissa plasmakäsittely (kuva 2a). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ilman plasma voi tuottaa ja peräkkäin toimittaa H

2O

2 alustaan. Lisäksi syy alkuperäisen nopea lasku H

2O

2 syntyy ilman plasma Viljelysupernatantissa verrattuna ei-viljelyalustassa voisi olla, että solut edistävät huuhteluilman H

2O

2. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, me seurataan tasot H

2O

2 viljelmän supernatantista ja ei-pelkästään viljelyalustassa seuraavat H

2O

2 käsittelyä (kuva S1a). Kun HeLa-soluja käsiteltiin 2 mM H

2O

2, H

2O

2 oli niinikään havaittiin sekä viljelmän supernatantista ja ei-viljelyväliaineessa välittömästi käsittelyn jälkeen. Kuitenkin 3 h seuraavissa H

2O

2 hoitoa, H

2O

2 oli tuskin havaittiin (noin 100 uM) Viljelysupernatantissa, mutta taso pysyi noin 670 uM ei- alustaa (kuva S1a). Perustuen tähän tulokseen, on spekuloitu, että solut voivat kaivella H

2O

2 syntyy ilman plasma, mikä nopeutettua lasku H

2O

2 viljelmäsupernatantissa.

seuraavan valvoi sukupolven solunsisäisten ROS lukien H

2O

2, hydroksyyliradikaaleja (OH

-), ja singlettihappea (• O

2), seuraava plasmakäsittely käyttäen H

2DCFDA (kuvio 2b). Sen jälkeen ilma plasmakäsittely, solunsisäisten ROS nousivat noin 2,7-kertainen (2,73 ± 0,13). Tämä kohonnut taso laski vasta 3 h kuluttua plasma hoidon ja talteen lähes ei-käsitellyn perustason 24 h (kuva 2b). Nämä tiedot viittaavat siihen, että plasman käsittely indusoi sukupolven solunsisäisten ROS.

Seuraavaksi arvioidaan, onko ilman plasma voi johtaa sukupolven solunulkoisten ja solunsisäisten RNS (kuvio 2c ja d, vastaavasti). Välittömästi sen jälkeen plasmakäsittely, solunulkoiset NO tasot olivat koholla noin 13.28 mm sekä ei-kulttuuriin ja media (kuva 2c). 3 h seuraavat plasmakäsittely, solunulkoiset NO tasot kuin kulttuuriin ja median väheni nopeasti noin 8,26 tai 5,8 mM, vastaavasti (kuva 2c). Ajankohtina viimeistään 3 h, solunulkoisen NO tasolla ei-elatusaineessa säilyi, kun solunulkoinen NO tasolla viljelyalusta jatkuvasti pienentää noin 1,28 mM 24 h jälkeen, plasmakäsittely (kuvio 2c), mikä osoittaa, että solut voivat ottoa tai poistaa solunulkoinen NO syntyy plasmaa.

Samoin solunsisäisiä NO plasmassa käsiteltyjä soluja nousivat noin 1,8-kertainen (1,75 ± 0,20) tai 2,3-kertaisesti (2,28 ± 0,07) 1 h ja 18 h seuraavissa ilma plasmakäsittely vastaavasti verrattuna ei-käsitellyissä soluissa. Kohonnut solunsisäinen NO taso pidettiin yllä kunnes 24 h (tuloksia ei ole esitetty) sen jälkeen, plasmakäsittely ja talteen lähellä käsittelemättömän perustasolle 48 h (kuvio 2d ja kuvio S1B), joka on samanlainen ROS tasoilla jälkeen plasmakäsittelyn (kuvio 2b). Ilman plasma indusoi suuremman ja kestävämpi kasvu NO kuin aiheuttama H

2O

2 (Kuva 2d ja Kuva S1B-c). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että plasman käsittely indusoi sukupolven solunulkoisen ja solunsisäisen NO.

Tukeakseen että ilma plasma tuotti ROS ja RNS tasoja nisäkässoluissa, me tutki antioksidantteja vaimentavat plasman aiheuttamaa ROS /RNS sukupolven mittaamalla ROS ja RNS tasot HeLa-soluissa käsittelyn jälkeen plasman läsnäollessa antioksidantteja. Ensiksi testasimme ovatko tunnettu tioli antioksidantti NAC [24] voi vaikuttaa pitoisuus H

2O

2 viljelmäsupernatanteissa seuraavissa ilmaplasmaa hoidon (kuva 3a). Yhdessä plasma jet, HeLa soluviljelmissä tai keskipitkällä ainoastaan ​​esikäsiteltiin NAC. NAC aiheuttama nopea lasku H

2O

2 noin alle 4,13 ± 1,67 uM 15 min jälkeen plasmakäsittely, samanlainen havaitut pitoisuudet 2 tunnin kuluttua plasmassa hoidon ilman NAC (kuva 3a), mikä viittaa siihen, että NAC voi lievittää ilman plasma aiheuttama H

2O

2 sukupolvi. Tutkimme seuraavaksi, onko antioksidantteja voidaan lieventää ilman plasma-indusoidun solunsisäisen ROS (kuvio 3b). Voit tehdä tämän, arvioimme ROS tasoilla esikäsittelyn jälkeen antioksidantin NAC tai cPTIO ja altistuminen ilman plasma. Sekä NAC ja cPTIO voisi vaimentaa sukupolvi solunsisäisten ROS aiheuttama ilman plasma (kuva 3b). Mielenkiintoista, selkeä vaimennus solunsisäisten ROS synty cPTIO tehokas antioksidantti RNS kuten typpioksidin (NO

•), johti spekulointiin siitä, että ilma plasma voidaan tuottaa RNS sekä ROS ja solunsisäinen sukupolven ROS voi olla liittyvät sukupolven RNS.

(a) tasot solunulkoisen H

2O

2 määritettiin kulttuuriin tai ei-kulttuuri (Medium vain) supernatantit ilmalla plasmakäsittely läsnäollessa (AP + NAC) tai puuttumisen (AP) antioksidantti NAC (

n

= 5). NAC lisättiin 1 h ennen plasmakäsittely. Viljelmän supernatantti kerättiin ilmoitettuina ajankohtina ilman plasmakäsittely. AP 0 (min) osoittaa supernatantista heti plasmakäsittely. (B) Generation of ROS lukien H

2O

2, OH

-, ja • O

2 solunsisäisessä matriisissa seuraavat ilman plasma jet (AP) määritettiin käyttäen ROS-herkkä koetin H

2DCFDA (

n

= 5). Soluja esikäsiteltiin antioksidantteja NAC tai cPTIO 1 h ja sitten altistettiin ilman plasma (AP + NAC tai AP + cPTIO) tai H

2O

2 (H

2O

2 + NAC tai H

2O

2 + cPTIO). Merkityillä kertaa seuraavat ilma plasmakäsittely, solut kerättiin. Fluoresenssi käsittelemättömien solujen (Non-käsitelty) on mielivaltaisesti asetettu 1. (c) tasot solunulkoisen NO määritettiin ei-kulttuuri (ilman HeLa-solujen, ylempi) ja kulttuuri (läsnä ollessa HeLa-solut, alhaalta ) supernatantit osoitettuina aikoina jälkeen ilman plasma jet altistus Griessin mitattuna (

n

= 10). Väliaineessa läsnä tai poissa HeLa-solujen esikäsiteltiin NAC tai cPTIO 1 tunti ennen altistamista plasma tai H

2O

2. (D) Solunsisäiset NO arvioitiin käyttäen DAF-FM. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.E.M. (

n

= 10).

lisäksi tutkinut, onko antioksidantit voivat lieventää ilman plasma aiheuttama sukupolven RNS. Olemme havainneet, että NO antioksidantti cPTIO edistää pienenee solunulkoisessa NO tasolla aiheuttama plasman sekä viljelmän supernatantista ja ei-elatusaineessa (kuva 3c). Sen sijaan, NAC oli vain vähän vaikutusta plasman aiheuttama solunulkoisen NO tasot sekä kulttuurin ja ei-elatusaineessa (kuva 3c). Yhdenmukainen ekstrasellulaarisen NO tuloksia, c-PTIO mutta ei NAC voisi merkittävästi poistu sukupolven solunsisäisten RNS ilmateitse plasma (kuva 3d ja Kuva S1B). Erityinen vaimennus ilman plasma aiheuttama RNS mukaan cPTIO (tehollinen RNS antioksidantti) ja vaimennus H

2O

2 aiheuttamaa RNS sekä NAC (tehollinen ROS antioksidantti) ja cPTIO (kuvio 3d) ehdottaa että ilman plasma voidaan tuottaa RNS suoraan mutta H

2O

2 aiheuttama RNS sukupolven voi välittyvän reitin (t), joihin liittyy ROS välituotteita. Yhdessä kanssa ROS ja RNS sukupolven data (kuviot 2-3), meidän havainnot osoittavat, että ilman plasma voi tuottaa solunulkoisia ja solunsisäisiä ROS ja RNS viljelmäsupernatanteissa että matkapuhelinverkon ympäristö.

Air plasma aktivoi JNK ja p38 MAPK-välitteisen signalointireitin

voit selvittää ROS ja RNS syntyy ilman plasma voi toimia molekyylejä ja mitä signaalien kulkureiteillä ovat mukana tässä transduktion etsittiin MAPK cascades, joiden tiedetään olevan osallisena signalointipolkujen vastauksena oksidatiivisen stressiä, kuten ROS, RNS, UV ja ionisoiva säteilytys. Voit tehdä tämän, testasimme ovatko ROS /RNS syntyy ilman plasma indusoi JNK, p38, ja /tai ERK aktivointi. Immunofluoresenssi ja immunoblottauksella analyysit tehtiin arvioimaan fosforylaation näiden kinaasien aiheuttama H

2O

2 ja sen aktivointi vasteena ilman plasma käsittely (kuvio 4 ja kuvio S2). Altistuminen ilman plasma erittäin aiheuttama aktivointi JNK, verrattuna sen vaatimaton aktivoitumisen H

2O

2 (kuviot 4a ja S2a), mikä viittaa siihen, että signalointi voidaan herättämän ilman plasma ja voi näin ollen aktivoida JNK-välitteisen duktioreaktiotiessä. Kun soluja käsiteltiin plasma tai H

2O

2 läsnäollessa estäjä JNK (SP600125), JNK aktivointi kumottiin odotetusti, 1h käsittelyn jälkeen plasma tai H

2O

2 (kuvio 4a ja kuvio S2a). Lisäksi, NAC kykeni lieventämään JNK aktivaatio plasman tai H

2O

2 (kuvio 4a, alhainen paneeli), mikä osoittaa, että tietyntyyppinen oksidatiivisen stressin signaali voidaan herättämistä plasmassa.

(a) fosforylaatio JNK hoidon jälkeen ilman plasma jet tai H

2O

2 analysoitiin kautta immunofluoresenssivärjäyksen ja immunoblottauksella käyttäen anti-fosfo-JNK-aine. Vastaava määrä koko JNK-proteiinien on esitetty kvantitatiivisen lisäyksen ohjaus JNK fosforylaatiota. (B) fosforylaatio p38 aiheuttama ilman plasma tehtiin näkyväksi immunoblottauksella käyttäen anti-fosfo-p38-vasta-ainetta. Vertailukelpoinen yhteensä p38 proteiineja esitetään latauskontrollina p38 fosforylaatiota. (C) vaihtelu fosforylaation tilasta ERK ei havaittu hoidon jälkeen ilman plasma tai H

2O

2.

Seuraavaksi tutkimme aktivointi p38 plasman ja onko NAC voisi vaikuttaa p38 aktivaation aiheuttama plasman. Vuonna analogisella tavalla JNK, ilman plasma mieleen fosforylaatiota p38 ja tämän plasman aiheuttama fosforylaatio osittain lievittää NAC, mikä osoittaa, että ilma plasma aiheuttama signaali voi aktivoida p38-välitteisen signaalireitin ja se voi olla eräänlainen hapettava signaalin (Kuva 4b ja Kuva S2b). Sitä vastoin plasmassa oli vähän vaikutusta fosforylaation ERK1 /2 (kuvio 4c). Nämä tiedot yhdessä, viittaavat siihen, että ilma plasma voi herättää solunsisäisiä signaaleja ja peräkkäin aktivoivat solunsisäisiä signaalintransduktioreitteihin välittyvät JNK tai p38.

Air plasma indusoi mitokondrion ROS kertymistä ja mitokondrioiden

Mitochondria ovat pääasiallinen lähde solujen ROS [25] ja oksidatiivisen stressin lukien H

2O

2 voi aloittaa romahtaminen mitokondrion transmembraanisen potentiaali (Δψm) [26]. Aikaisemmassa raportissa, huomasimme, että romahdus mitokondrion transmembraanisen potentiaali (Δψm) indusoidaan N

2 tai ilman plasma [2]. Onko plasma voi aiheuttaa mitokondrion ROS kertymistä, mittasimme mitokondrioiden superoksidi seuraavat plasmakäsittely käyttäen MitoSox, joka on fluorogeenisen värin selektiivistä havaitsemista superoksidi, että elävien solujen mitokondrioissa (kuvio 5a). Mitokondrioiden superoksidi soluissa lisääntyi käsittelemällä ilman plasma tai H

2O

2. Lisäksi taso mitokondrioiden superoksidi käsitellyissä soluissa ilman plasma (4,32 ± 0,05) oli noin 2 kertaa korkeampi kuin H

2O

2-käsitellyt solut (2,36 ± 0,23) 6 h jälkeinen hoito plasmassa (kuvio 5a). Tämän ajan jälkeen (eli 6 h jälkikäsittely), kertyneet mitokondrioiden superoksidi plasman käsiteltyjä soluja väheni, kun taas kertynyt superoksidi mitokondrioissa H

2O

2-käsitellyt solut jatkuivat 24 tuntia (2,45 ± 0,39) (kuvio 5a). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ilman plasma voi aiheuttaa kertyminen ROS myös superoksidi mitokondrioita.

(a) Mitokondrioiden ROS tuotanto arvioitiin käyttämällä mitokondrioiden koetinta Mitosox seuraavat H

2O

2 tai ilman plasmakäsittely. Mitokondrioiden ROS käsittelemättömissä soluissa (Non-käsitelty) on mielivaltaisesti asetettu 1. Solut otettiin talteen osoitettuina ajankohtina ilman plasmakäsittely ja analysoitiin virtaussytometrialla. (B) Soluja esikäsiteltiin antioksidantteja (NAC tai cPTIO) tai estäjien (SP600125 tai SB203580) 1 h ja sitten altistettiin ilman plasma (AP + NAC, AP + cPTIO, AP + SP tai AP + SB) tai H

2O

2 (H

2O

2 + NAC, H

2O

2 + cPTIO, H

2O

2 + SP tai H

2O

2 + SB). Solut kerättiin osoitettuina ajankohtina plasmakäsittely, ja tasot mitokondrion ROS mitattiin (

n

= 5). Fluoresenssi käsittelemättömien solujen (Non-käsitelty) on mielivaltaisesti asetettu 1. (c) mitokondrion kalvon potentiaalia arvioitiin käyttäen mitokondriot-spesifinen koetin JC-1 kanssa tai ilman ilman plasma tai H

2O

2, (

n

= 5). Fluoresenssin käsittelemättömästä HeLa soluissa mielivaltaisesti asetettu 1.

Lisäksi olemme tutki antioksidantit voivat vaimentaa mitokondrioiden superoksidi kertymistä aiheuttama ilman plasma. NAC tai cPTIO pystyi poistu tuotannon mitokondrioiden superoksidi (kuvio 5b). Kuten ilman plasma aktivoi JNK: n ja p38-välitteisten signalointireittien (kuvio 4a-b ja kuvio S2), mahdollisuutta, että plasma-aktivoitu signaalitransduktioprosesseista ovat mukana mitokondrion ROS kertymistä tutkittiin. Huomasimme, että estäjät SB203580 ja SP600125 pystyivät heikentämään plasman aiheuttamaa mitokondrioiden superoksidi sukupolven (kuvio 5b), mikä tarkoittaa, että plasma voi aiheuttaa ROS tuotantoa mitokondrioissa on JNK- ja p38-riippuvainen tavalla.

Koska ilman plasma indusoi sukupolven matkapuhelinverkon ROS /RNS (kuva 2) ja mitokondrioiden ROS (kuvio 5a) ja romahdus mitokondrion transmembraanisen potentiaali (Δψm) [2], tutkimme onko ROS /RNS voitaisiin liittää ilman plasmasta aiheuttama mitokondrioiden käsittelemällä HeLa-solujen kanssa ilman plasma läsnäollessa antioksidantteja NAC tai cPTIO. Olemme seuranneet mitokondrion transmembraanisen potentiaalin (Δψm) seuraavat plasmakäsittely puuttuessa tai läsnä NAC tai cPTIO käyttäen mitokondriot-spesifinen koetin JC-1. Ilman plasma tai H

2O

2 indusoi lisäämällä intensiteetti vihreä /punainen fluoresenssi (noin 3,3-kertainen tai 2,1-kertainen 12 h ja 2,9-kertainen tai 3,6-kertainen 24 h, vastaavasti), joka vahvistaa, että molemmat plasma ja H

2O

2 voi aiheuttaa lasku Δψm (kuva 5c). NAC tai cPTIO osoittivat osittain parantava vaikutus laskuun Δψm aiheuttama plasma tai H

2O

2 käsittelyä (kuvio 5c), mikä viittaa siihen, että ilma plasma aiheuttama ROS /RNS voi olla rooli mitokondrioiden. Koska signaalitransduktioprosesseista taustalla plasma aiheuttama lasku Δψm ei tunneta, päätimme onko estäjiä JNK ja p38 voisi lieventää plasma aiheuttamaa mitokondrioiden vaurioita. Samalla tavalla, inhibiittorit JNK ja p38 (SP600125 tai SB203580) pystyivät lieventämään plasman ja H

2O

2 on Δψm lasku, vaikka ei ole johtanut normaalissa Δψm (kuvio 5c). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ilman plasma tuottaa ROS /RNS, aktivoitumiseen johtavat signaalin välittymistä JNK tai p38. Samanaikaisesti ROS /RNS näyttävät johtavan romahtaminen Δψm, joka on osittain välittyvät JNK ja p38 signaalitransduktion

ROS /RNS sukupolven indusoi plasman aiheuttama apoptoottisen solukuoleman aktivoimalla solun JNK ja p38-välitteisen signaali transductions ja mitokondrioiden

määrittämiseksi ilman plasma-solukuolema, me testattiin ensin sitä mahdollisuutta, että ROS /RNS olivat vastuussa ilman plasma aiheuttama syöpä solukuoleman käsittelemällä HeLa-solujen kanssa ilman plasma läsnäollessa antioksidantteja NAC tai cPTIO. Esikäsittely NAC ja cPTIO heikennettyjä plasma-solukuolema (49,5% ± 2,2% ja 38,86% ± 4,2%, vastaavasti, kuvio 6a ja kuvio S3), jotka vahvistavat, että ROS /RNS on sekaantunut plasma-solukuolema. Koska ei ole hyvä ohjaus RNS samanlainen käyttö H

2O

2 kuin kanoninen ohjaus ROS, testasimme myös NaNO

3 voisi apoptoosin, uskottavasti mukana NO ja RNS syntyvät NaNO

3. NaNO

3 edistettävä solukuolemaa suuremmilla pitoisuuksilla kuin teki H

2O

2 (kuva S3-S4). Tämän seurauksena syy NaNO

3 ei indusoi tehokasta solukuoleman on, että se ei luoda tehokas RNS /ROS toisin ilman plasma tai H

2O

2 (kuva S4).

(a) Antioxdizing aineet (NAC ja cPTIO) tai estäjät (SP600125 ja SB203580) osittain pelastettiin plasma-solukuolema. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.E.M. (

n

= 10). (B) Plasma-solukuolema osittain kumottiin JNK1 /2 (siJNK1 /2), tai p38 (sip38) pudotus soluja. Seurata plasma-solukuolema, ATP-pohjainen solujen elinkelpoisuuden määritys suoritettiin, kun läsnä on ohjaus, JNK1 /2, tai p38 siRNA. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.E.M. kolmena kappaleena kolmesta erillisellä kokeella (

n

= 3). Solujen elinkelpoisuus käsittelemättömän HeLa solupopulaatio mielivaltaisesti asetettu 100%. Immunoblottauksella anti-JNK ja p38-vasta-aineita tehtiin vahvista knockdown. * P 0,01, ** p 0,05. (C) – (d) Air plasma indusoi Bax translokaation mitokondriot. Veriplasmasta tai H

2O

2 käsiteltyjä soluja inkuboitiin edelleen 6-24 tuntia. Sen jälkeen 6-24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut kiinnitettiin 3,7% formaldehydiä. Bax (vihreä) värjättiin anti-Bax-vasta-aineen ja MitoTracker käytettiin värjäykseen mitokondrioita (punainen). Bax (vihreä) ja mitokondrioiden (punainen, MitoTracker) fluoresenssi arvioitiin, 6 h (d) ja 24 h ((c) ja (d)) altistumisen jälkeen ilman plasma 5 min fluoresenssilla konfokaalimikroskopialla. Bax on diffuusisti jaettu käsittelemättömissä soluissa (ei käsitelty). Kuitenkin hoidon jälkeen plasman kanssa, Bax paikallistettiin mitokondrioita, joka perustuu päällekkäisyyden Bax ja MitoTracker fluoresenssikuvia (yhdistäminen, keltainen). DAPI käytettiin tumavärjäystä (sininen). Valkoinen palkki oli keskimääräistä suurennos kuvan (10 uM). (E) Bid muodostivat proapoptoottiset kompleksin Bcl-x seuraavan plasmakäsittely. (F) Air plasma indusoi ero solukuolemaa ihmisen keuhkojen A549 ja normaaliin keuhkojen fibroblastien MRC5 solulinjoissa. A549 ja MRC5-soluja käsiteltiin ilman plasma suuttimet ja sitten inkuboitiin edelleen 24 tuntia. Sadonkorjuun jälkeen ja värjäämällä solut anti-anneksiini V-FITC: llä ja PI, solukuolemaa arvioitiin virtaussytometrialla. Arvot edustavat keskiarvoa (± SEM) kolmesta itsenäisestä kokeesta. (G) Ehdotettu malli ilman plasma jet aiheuttaman apoptoosin HeLa-soluissa kautta ROS /RNS tuotanto, läpikulkua soluihin, aktivointi signaalitransduktioreaktioteiden, ja mitokondriovaurioita.

tutkimiseksi roolin JNK ja p38 MAPK reittejä ilman plasma aiheuttama apoptoottisen solukuoleman, käytimme niiden erityisiä estäjät, SP600125 (estäjä JNK) ja SB203580 (estäjä p38 MAPK). Kun soluja esikäsiteltiin SP600125 tai SB203580 ennen ilman plasma jet altistuminen, apoptoottista solukuolemaa väestön laskettiin 59,3% ± 2,3% ja 52,0% ± 9,7%, vastaavasti, verrattuna indusoimaa solukuolemaa plasmalieskaan yksinään (85,4 ± 3,4%) (kuvio 6a ja kuvio S3), mikä viittaa siihen, että signaalin välittymistä JNK: n ja p38 on osittain mukana plasman indusoiman solukuoleman. Saada enemmän käsityksen roolit JNK ja p38 aikana plasma-solukuolema, solujen elinkelpoisuus JNK- tai p38-köyhdytettyä solut analysoitiin seuraavat plasmakäsittely mittaamalla ATP eläviä soluja. Olemme havainneet, että plasman aiheuttama väheneminen solujen elinkykyisyys vaimenee JNK1 /2 siRNA tai p38 siRNA (kuvio 6b).