Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Sädehoidon invasiivisia virtsarakon syövän sallii elinten säilytystä mutta myrkyllisyys ja paikallisen ohjauksen pysyvät ongelmallisia. Sinänsä parantaa hoidon tehokkuutta edellyttää säteilylle herkäksi syöpäsoluja. Tavoitteena on tutkia, jos nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR), alavirran kinaasin fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) /AKT selviytymisreittiin, voi olla tavoite säteilyn herkistymistä.

Experimental Suunnittelu

klonogeeninen analyysit suoritettiin käyttäen 6 virtsarakon syövän solulinjoissa (UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6, KU7, 253J-BV, ja 253-JP), jotta tutkia ionisoivan säteilyn vaikutuksista ( IR) yksinään ja yhdistettynä RAD001, joka on mTOR-estäjä. Solusyklin analyysi tehtiin käyttämällä virtaussytometria.

In vivo

, kateenkorvattomissa hiirissä injektoitiin subkutaanisti 2 virtsarakon syöpä solulinjoissa. Hoidon tehokkuuden RAD001 (1,5 mg /kg, päivittäin), fraktioitua IR (yhteensä 9Gy = 3GY x 3), ja yhdistelmä RAD001 ja IR seurasi yli 4 viikkoa. Tuumorin paino mitattiin koe-päätepisteen.

Tulokset

klonogeeninen määritykset paljastivat, että kaikki virtsarakon testatuissa solulinjoissa, additiivinen vaikutus havaittiin yhdistetyssä hoidossa verrattuna joko hoito yksinään. Tuloksemme osoittavat, että tämä vaikutus johtuu pidättämään sekä G1 ja G2 vaiheisiin solusyklin kun hoitoja yhdistetään. Lisäksi meidän tiedot osoittavat, että tämä pidätys säätelee pääasiassa muutoksista tasoilla sykliini D1, P27 ja p21 seuraavista tavoista.

In vivo

, merkittävä lasku kasvaimen painon havaittiin yhdistetyssä hoidossa verrattuna joko hoito yksinään tai valvontaa.

Johtopäätökset

muuttaminen solukierron estämällä mTOR signalointi polku yhdistettynä säteilyn suotuisia tuloksia ja on lupaava hoitomuoto virtsarakon syöpään.

Citation: Nassim R, Mansure JJ, Chevalier S, Cury F, Kassouf W (2013) yhdistäminen mTOR estäminen kanssa säteily Parantaa Antitumor aktiivisuus Virtsarakon syövän solut

in vitro

ja

in vivo

A Novel strategia hoito. PLoS ONE 8 (6): e65257. doi: 10,1371 /journal.pone.0065257

Editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 helmikuu 2013; Hyväksytty: 24 huhtikuu 2013; Julkaistu: 17 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Nassim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke rahoittavat avustusta Kanadan Institute of Health Research (CIHR) avustus MOP 89796. Dr. W. Kassouf on vastaanottaja kliinisen tutkimuksen tutkija palkinnon Fonds de recherche du Québec-Santé (FRSQ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tällä mTOR-estäjä RAD001 oli ystävällisesti sen valmistajan, Novartis. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on erittäin yleinen sairaus Pohjois-Amerikka. Vuonna 2012 55000 miestä ja 18000 naiset diagnosoitu virtsarakon syöpä; 1 5 miestä ja 1 4 naista kuolee sairauteensa [1]. . Radikaali cystectomy joka koostuu täydellistä poistamista virtsarakon, pysyy ”kultainen standardi” hoito invasiivisia virtsarakon syöpään [2]. Sädehoito on houkutteleva vaihtoehto, koska se säilyttää rakon ja mahdollistaa normaalin virtsan ja seksuaalisen toiminnot [3]. Kuitenkin puute paikallisen valvonnan taudin sekä merkittäviä haittavaikutuksia, joka liittyy sädehoitoon yhä ongelmallista [4] – [6]. Parantaa tehokkuutta, useissa kliinisissä tutkimuksissa elinten säästäviä hallinta tehtiin testaamaan vaikutukset ja kemoterapiaa ja säteily [7], [8]. Kuitenkin huolimatta lukuisista yrityksistä, chemoradiation tutkimukset ovat sidottuja optimaalinen paikallinen valvonta taudin ja vähentää eloonjäämisen verrattuna radikaaleja. Sinänsä on välttämätöntä tarvetta lisätä säteilylle herkäksi virtsarakon syövän lisätä tehokkuutta parantamalla paikallista valvontaa taudin ja mahdollistaa annoksen pienentäminen pienentää myrkyllisyyttä sädehoitoa.

signalointi molekyyli, joka on erittäin houkutteleva ja on äskettäin antanut paljon huomiota täsmähoitoihin on nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR). Tarkemmin sanottuna, mTOR on alavirran seriini /treoniini proteiinikinaasi, että fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) /AKT reitin, joka on kriittinen rooli syövän synnyssä [9], [10]. Vapauttaminen PI3K /AKT /mTOR-reitin luo suotuisan kasvaimia synnyttävän ympäristön ja on dokumentoitu erilaisissa ihmisen kasvaimissa, mukaan lukien virtsarakon syöpä [11]. mTOR esto tuli aktiivinen tutkimus- kehittää ja testata pieni estävä molekyylejä kuten rapamysiinianalogien -notably RAD001 (Everolimuusi, Novartis) ja CCI-779 (Torisol, Wyeth) hoitoon erilaisia ​​sairauksia, kuten syöpää. Äskettäin ensimmäinen onnistunut vaiheen kliinisessä tutkimuksessa, joihin liittyy mTOR-estäjä toteutettiin potilailla, joilla on edennyt munuaissyöpä, kokeneiden parannusta kokonaiselossaoloaikaa [12]. Olemme äskettäin julkaisi ensimmäisen raportin osoittavat merkittävää antituumorivaikutus

kautta

estämällä mTOR kanssa RAD001 virtsarakon syöpä malleissa

in vitro

ja

in vivo

[13]. Mielenkiintoista, huomattavia eroja herkkyydessä mTOR eston todettiin yhdeksästä ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa. Lisäksi ei ollut mitään korrelaatiota aktivoitu AKT ja mTOR tasoilla solun aggressiivinen ominaisuuksia. Kuitenkin tämä ei ollut aktivoituneen S6 joiden tasot esiintyi korkeampi RAD001 herkkä verrattuna suhteellisen resistenttejä solulinjoja. Kiinnostaa, jotkut tutkimukset ovat raportoineet, että mTOR esto voi herkistää kasvain eturauhasen, rinnan, ja aivojen ionisoivan säteilyn [14] – [16]. Koska säteily osoitettiin aktivoida PI3K /Akt selviytymistä /kasvun reitin, joka voi olla vastuussa solukuoleman paeta ja radioresistance [17], [18], samanaikainen mTOR esto saattavat voittaa Säteilynsietotestin virtsarakon syöpään. Seurata tämän hypoteesin, tässä tutkimuksessa tarkasteltiin vaikutuksia yhdistämällä RAD001 ja ionisoivaa säteilyä,

in vitro

ja

in vivo

, solujen eloonjäämistä ja kasvua joukko virtsarakon syöpäsolun linjat. Lisäksi olemme yrittäneet valottaa mekanismi, jonka tämä yhdistelmä hoitoja voisi estää kasvaimen kasvua.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eettiset vaatimukset liittyvät käyttää meidän eläimen ksenograftimallia oli täysin noudattanut ja arvostettu. McGill University Health Center Facility Animal Care hyväksyi meidän eläin protokollat ​​(protokolla # 5428) ennen tutkimuksen alussa. Lisäksi eläimet pidettiin ja pidetään state-of-the-art tilat, jotka noudattavat tiukkoja menettelytavat eläinten tutkimusta, johon kuuluu jatkuva seuranta ja eläinten tarkastamista ja käyttäjille.

Soluviljely

UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6, ja KU7 solulinjoja ominaista ja antamat malli ydin Urogenitaalinen Erikoistunut ohjelmat tutkimuksen huippuyksikkö virtsarakon syöpään MD Anderson Cancer Center [19]. 253-JP ja 253J-BV ystävällisesti toimitti Dr. Colin P.N. Dinney alkaen M. D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas [20]. Solulinjat viljeltiin rutiininomaisesti 37 ° C: ssa 5% CO

2 yrityshautomo, ylläpidetään Eaglen minimum essential keskipitkän (EMEM), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Wisent, Saint-Jean-Baptiste QC) ja kuljetettiin saavutettaessa 80% konfluenssiin. MTOR-estäjä RAD001 oli ystävällisesti sen valmistajan, Novartis.

klonogeeninen määritys

Solut ympättiin 6-kuoppaiseen levyyn tiheydellä 200 solua kuoppaa kohti ja ylläpidetään kasvualustaan . Kun kiinnittyvät, ne käsiteltiin RAD001 annoksilla vastaa GI50 kunkin solulinjan, kuten aiemmin on kuvattu [13]: UM-UC3 (75 nM), KU7 (50 nM), 253J-BV (8 nM), 253- JP (8 nM), UM-UC5 (0,5 nM) ja UM-UC6 (0,5 nM) ja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa 12 tunnin ajan. Tätä seurasi sädehoitoa eri annoksilla, ja ilman RAD001. Kontrollit mukana käsittelemättömät solut yhdessä solujen käsitelty jokaisen säteilyn ja RAD001 hoito yksinään. Soluja viljeltiin edelleen 37 ° C: ssa ja annettiin muodostaa pesäkkeitä 10-14 päivä. Likimääräinen sulku 50 elävää solua /pesäke valittiin. Solut pestiin fosfaatilla tasapainotetun suolaliuoksen (PBS) ja kiinnitettiin 15 minuutin ajan käyttäen 3,7% formaldehydiä PBS: ssä. Sen jälkeen toinen PBS pese solut värjättiin kristallivioletilla (0,4% w /v PBS: ssä, Fisher Scientific, Waltham, MA) ja jätettiin kuivua ennen laskemista pesäkkeiden. Kunkin käsittelyn koostui kahtena kuopissa 6-kuoppaiselle levylle ja koe suoritettiin kahdesti. Elossa fraktio laskettiin (keskimääräinen pesäkkeiden lukumäärää lopussa kokeen) /(solujen inokuloitiin alussa) x (plating tehokkuus). Maljaustehokkuus määriteltiin (keskiarvo pesäkelukua) /(solujen päällystetty ei-säteilyteho ohjaus). Ei-säteilytettyjä soluja käytettiin kontrollina.

Virtaussytometria

Solut ympättiin viljelmässä levyille ja niiden annetaan kiinnittyä. RAD001 lisättiin asianmukaiset näytteet 12 tuntia ennen säteilyn annos vastaa GI50 kunkin solulinjan. Tätä seurasi annos 4Gy ionisoivan säteilyn (perustuen aiemmin määritetty herkkyys koetta) ja soluja viljeltiin edelleen 48 tuntia. Sitten solut trypsinoitiin, pestiin kerran PBS: llä, ja kiinnitettiin 100% kylmää etanolia 60 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Sentrifugoinnin jälkeen solujen pelletit suspendoitiin uudelleen liuokseen, jossa oli propidiumjodidia (PI) (50 g /ml, Invitrogen, Carlsbad, CA) PBS: ssä, jota oli täydennetty RNaasi (100 g /ml, Invitrogen, Carlsbad, CA), siirrettiin sitten fluoresenssi- aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) putket ja inkuboitiin pimeässä 30 minuutin ajan 40 ° C: ssa, jotta propidiumjodidilla saanti tumassa. PI saanti arvioitiin sitten käyttäen Coulter -virtaussytometrillä (BD Biosciences, Franklin, NJ).

Western blot

Soluja kasvatettiin ja käsiteltiin kohti hoito edellä kuvatulla tavalla (RAD001, ionisoiva säteily, ja molemmat yhdessä), jossa käsittelemättömät solut palvelevat verrokkeina. Seuraavista käsittelyistä, solut kaavittiin jäissä ja suspendoitiin uudelleen 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa kylmässä RIPA (lysis), joka sisälsi cocktail fosfataasi ja proteaasinestäjien (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Solususpensiot sentrifugoitiin kerätä selkeä lysaatit supernatantissa. Proteiinipitoisuus mitattiin bikinkoniini- happo (BCA) -määrityksellä (Pierce Scientific-Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Proteiininäytteet (40 ug-60 ug) on ​​jätetty polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, kuten aiemmin on kuvattu [13]. Proteiinit geelit siirrettiin kalvoille, blokattiin 5% rasvatonta maitoa ja /tai 5% naudan seerumin albumiinia liuosta, ja immuno-blotattiin seuraavista monoklonaalisten primaaristen vasta-aineiden (kaikki kani): fosfo-AKT, yhteensä AKT fosfo S6, yhteensä S6, p21, p27kip1, ja sykliini D1 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) pitoisuuksina valmistajan suosittelemia. Membraanit inkuboitiin sitten sopivalla anti-kani-vasta-aineita ja ECL-kemiluminesenssidetektiolla (Amersham-GE Healthcare, Piscataway, NJ) käytettiin paljastaa proteiinin bändejä etujen röntgenfilmille. Kalvot skannattiin ja proteiinin tasot normalisoitiin vastaan ​​aktiini (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), ohjaus 42 kDa taloudenhoito proteiinin läsnä kaikissa näytteissä ja toimi meidän latauskontrollina.

In vivo-ksenograftimallissa

Kaikki protokolla hyväksynnät saatiin ennen puhkeamista tutkielma Animal Care komitean McGill University Health Center. Nainen kateenkorvattomissa hiirissä (Nu /Nu-kanta, 4-6 viikkoa vanhoja, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) käytettiin meidän ksenografti virtsarakon syövän mallia, kuten aiemmin on raportoitu [13]. Lyhyesti, hiiret injektoitiin subkutaanisti KU7 (10

6 solua per injektio). Toisessa kokeessa samaa menetelmää suoritettiin käyttäen 253J-BV virtsarakon syövän solulinjoissa. Helpottaa tarttumista, solut suspendoitiin 200 ul: Matrigel (BD Biosciences, Franklin, NJ), ennen injektiota. Kasvainten annettiin istuttaa ja kasvaa yhden viikon ajan ennen satunnaistamista 4 ryhmään, jotka vastaavat eri hoitoryhmissä, joissa kukin ryhmä koostuu 14 hiirillä. 1

st ryhmä käsiteltiin plasebolla (5% glukoosi-liuosta vedessä). 2

toinen ryhmä sai RAD001 suun kautta (mikroemulsio on laimennettu 5% glukoosiliuoksella) annoksena 1,5 mg /kg vuorokaudessa. Vuonna 3

rd ryhmä, kasvaimet olivat altistuneet säteilylle, jonka fraktioitu annostus yhteensä 9 Gy (3 x 3GY) joka toinen päivä ensimmäisen viikon aikana hoidon. Vuonna 4

th ryhmän hiirille annettiin RAD001 on edellä mainittu annostus 1 päivä ennen kasvaimen sädehoitoa. Hiiriä seurattiin 4 viikkoa puhkeamista hoitoja. Ruumiinpaino ja eläinten käyttäytymistä seurattiin koko kokeen ajan. Kasvaimet mitattiin (pituus ja leveys) kahdesti viikossa käyttäen mikrometrillä laskemiseksi tilavuudet (V = [(pituus x leveys

2) x (π /6)] kuten aikaisemmin raportoitu [13]. Hiiret lopetettiin on CO

2 kammiossa lopussa hoidon. Kasvaimet kerättiin, punnitaan välittömästi, ja konservoituneita kiinteät tai pakastaa myöhempää tutkimuksiin.

immunohistokemia

tuumorisektioiden saatiin hiirille lumelääkkeeseen, säteily, RAD001 ja yhdistelmä hoito. parafiini upotettu kasvaimia leikkeet kiinnitettiin lasilevyllä värjäyksessä. sen jälkeen de-paraffinization ja nesteytys, antigeeni haku suoritettiin kuumentamalla näytteissä 5% sitraattipuskurilla (pH 7,0). leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa p21 spesifisen vasta-aineen (laimennus 1:25). HRP-konjugoitua vuohen polyklonaalisen anti-kaniini-IgG sekundääristä vasta-ainetta lisättiin ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunti. 3,3′-diaminobentsidiini ( DAB) substraattia (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) käytettiin värin kehittymisen mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Objektilasit tarkasteltiin Leica Diaplan -käänteismikroskoopissa varustettu Leica DFC300FX Kamera (Leica, Wetzlar, Saksa). Kuvat otettiin käyttäen Leica Application Suite. Analyysi perustui keskimäärin 5 pesäkkeitä, 40-kertaisella suurennuksella, joka osoittaa eläviä soluja, ja lasketun H-pisteet on laskettu yhteen tuotteiden prosenttiosuuden soluista värjättiin tietyllä värjäytymisen intensiteetti (0-100) ja värjäyksen voimakkuuden (0 negatiivinen värjäystä, 1 matala ja 2 korkean värjäys).

tilastollinen

Opiskelijan T-testi (parittomia, kaksihäntäinen) käytettiin kaikissa tilastolliseen analyysiin. Merkitys asetettiin p 0,05.

Tulokset

suhteellinen herkkyys paneelin virtsarakon syövän solulinjojen RAD001 ja ionisoivaa säteilyä

viime aikoina osoittaneet, että paneeli yhdeksän virtsarakon syövän solulinjat osoittaa suhteellisia eroja niiden RAD001 herkkyyttä ja näin ollen, RAD001 hoito johti suhteelliset erot mTOR inhibition ja kasvun pysähtymisen, kun seurataan MTT määrityksissä. Näiden tietojen avulla pystyimme jakamaan soluillemme rivit 3 ryhmään niiden RAD001 herkkyys [13] seuraavasti: suhteellisen resistenttejä (UM-UC3, UM-UC13, KU7 (GI50≥50 nmol /l)), kohtalaisen herkkä (253J-P, 253J-BV, RT4 (GI50 50 nmol /l)) ja lopuksi erittäin herkkiä (UM-UC1, UM-UC5, UM-UC6 (GI50≤0.5 nmol /l). tässä tutkimuksessa tarkastellaan vaikutukset ja hoidot (RAD001 ja säteily), klonogeenisten määrityksissä käytettiin luokitella kuuteen solulinjat testattiin niiden suhteellisen herkkyys IR eri säteilyannosten (Fig. 1A). näiden suhteessa herkkyys säteilylle, solulinjoja jaetaan kolmeen ryhmään, kestävä, kohtalaisen kestävä, ja herkkä. resistentti ryhmään kuuluu UM-UC5 korkein eloonjääntifraktio, kohtalaisen kestävä mukana UM-UC13, KU7, UM-UC3, UM-UC6 taas 253J-BV oli alempi eloonjääntifraktio ja sen määritellään näin ollen säteilylle herkkä solulinja. Vertasimme vaste näiden kuuden solulinjojen kunkin RAD001 ja ionisoivaa säteilyä. Tietojen perusteella kuvassa 1B ja taulukko 1, päättelimme, että ei ole korrelaatiota herkkyyttä RAD001 ja herkkyys ionisoivaa säteilyä.

Päällystetty soluja altistetaan ionisoivalle säteilylle mitata vaikutuksia kasvuun klonogeenisten määritystä, kuten on kuvattu menetelmät. (A) perusteella kerättyjen tulosten pystyimme luokittelemaan nämä solulinjat säteilyherkästä, kohtalaisen herkkä ja -relatively kestävä. (B) toinen RAD001 IC50 piirrettiin käyrän kulmakerroin jokaisen solun rivin klonogeeniset määrityksessä hoidetuilla IR.

Ionisoiva säteily aktivoi AKT kun RAD001 estää S6 fosforylaation

on raportoitu, että ionisoiva säteily aktivoi AKT vuonna eloonjäänyt solufraktiosta [17], [21]. Koska tämä voi liittyä hoito ei tehoa, solukuolema paeta ja selviytymistä, etsimme onko säteilyaltistuksen virtsarakon syövän solujen johtaisi AKT aktivointia. Tätä tarkoitusta varten on suhteellisen resistentti solulinja, KU7, oli se altistetaan ionisoivalle säteilylle ajan (0-60 min) ja lyysattiin analysoida Pakt suoralla Western-blottauksella käyttämällä fosfospesifisiä AKT-vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja S473 fosforylaatiokohdan. Tulokset kuviossa 2A osoittavat, että todellakin AKT oli nopeasti aktivoitu seuraavien 15 min sädehoidon ja tämä aktivointi jatkui 30 ja 60 min. Nämä tulokset siis viittaavat siihen, että KU7 tehdään aktivoitumisen pro-onkogeenisen selviytymisreittiin altistus ionisoivalle säteilylle. Kaikissa kokeissa tasot Pakt seurausta esimerkiksi ionisoivalla säteilyllä enintään ja laski sen jälkeen. Samoin KU7 solut ovat myös suhteellisen RAD001 kestäviä, ne käsiteltiin RAD001 varmistaa, että sen tavoite, mTOR estyi. Tätä tarkoitusta varten tasot fosforyloitua S6 määritettiin käyttämällä spesifistä vasta-ainetta seriinitähteiksi 240/244 on S6-proteiinia. Kuten odotettua, RAD001 oli voimakas laskeva fosforylaatiota tasoa myös mTOR loppupään signalointi molekyyli ja kohde S6, kuten on esitetty kohdassa 30 minuuttia hoidon jälkeen (Kuva. 2B) ja tämä esto on jatkuva 24 tunnin hoidon jälkeen (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi samanlaisia ​​tuloksia saatiin muilla virtsarakon syövän solujen linjat (253J-BV, UM-UC3, ja UM-UC6) ovat saaneet sädehoitoa ja RAD001 (tietoja ei esitetty).

(A) KU7 soluja käsiteltiin 4 Gy ionisoivan säteilyn. Solut hajotettiin 15, 30 ja 60 minuuttia käsittelyn jälkeen analysoida AKT aktivointi (p-AKT, ylärivi) Western blot. Yhteensä tasot AKT näkyvät alarivillä. (B) KU7 soluja käsiteltiin 5 Gy säteilyn, 100 nM RAD001 tai molemmat, ja hajotettiin. Tasot Akt ja S6 fosforylaation analysoitiin Western blot. Yhteensä tasot Akt ja S6 ilme näkyvät. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun 253J-BV, UM-UC3, ja UM-UC6 käsiteltiin säteilyn ja RAD001 yksinään ja yhdistelmänä (tuloksia ei ole esitetty).

yhdistäminen RAD001 ionisoivalla säteilyllä vähentää merkittävästi pesäkkeitä muodostuminen

tarjoavat tietoa vaikutuksista yhdistää RAD001 ionisoivalla säteilyllä virtsarakon syövän solulinjoissa, me seurataan osa eloonjääneiden solujen ajan käyttäen klonogeeniset määrityksiä. Käsittelyn jälkeen päällystetty soluja tarkkailtiin ajan kuluessa ja pesäkkeiden lukumäärä laskettiin. RAD001 annos pidettiin GI50 kunkin solulinjan, kun säteilyannos oli vaihteleva. Kaikissa testatuissa solulinjoissa (253J-BV, UM-UC6, KU7, UM-UC3, UM-UC13, ja UM-UC5), merkittävä väheneminen pesäkkeiden havaittiin soluissa, joita käsiteltiin yhdistelmähoito verrattuna joko ionisoivan säteilyn yksin, tai käsittelemätön kontrolli (Fig. 3). Mielenkiintoista, vaikka tämä lasku eloonjääntifraktio nähtiin kaikissa testatuissa solulinjoissa, dramaattisin suhteellinen lasku, kun sekä hoitojen yhdistettiin nähtiin kaksi herkin solulinjat RAD001 (UM-UC5 ja UM-UC6). Kaikilla testatuilla solulinjoissa, tuloksemme osoittavat additiivinen vaikutus kasvuun, kun yhdistetään RAD001 ionisoivalla säteilyllä. On syytä huomata, että alemman esto paksusuolen muodostumisen havaittiin kahden solun riviä (UM-UC5 ja UM-UC6), joka oli tunnusomaista alunperin laboratoriossamme on herkin RAD001. Tämä on ensisijaisesti colonogenic määrityksen itse missä paksusuolen muodostuminen (joka määritetään yleisesti asetettu pesäkkeen koko), kun taas herkkyys RAD001 tehtiin entsymaattisella määritys (MTT). Tämä ristiriita herkkyydet määrityksissä pituus määritystä, yhdistettynä nopeasti kaksinkertaistumisen aika, voisi selittää klonogeenisten tulokset näiden kahden solulinjojen.

kuusi solulinjoja käsiteltiin RAD001 12 tuntia ennen altistusta ionisoivaa säteily ja edelleen kasvanut ilmoitettu Methods. Pesäkkeenmuodostusta mitattiin Solukiinnittämisen ja värjäys kidevioletilla 10-14 päivän kuluttua hoidon riippuen solulinjoissa. Tulokset olivat tilastollisesti merkitseviä (p 0,05) yhdistetyssä hoidossa verrattuna joko hoito yksinään kaikilla testatuilla solulinjoilla.

Käsittely RAD001 ja ionisoivaa säteilyä indusoi sekä kasvua prosenttiosuuden solujen G0 /G1 ja G2 vaiheet solusyklin

saada oivalluksia taustalla oleva mekanismi kasvuinhibitiosta, solusyklin analyysi suoritettiin virtaussytometrialla tutkia solujen jakauma kaikissa eri vaiheissa solusyklin 48 tuntia kunkin hoito yksinään ja yhdistelmänä. Soluja käsiteltiin annoksella RAD001 vastaa niiden GI50 (vaihtelee 0,5-75 nmol /l) sekä 4Gy ionisoivaa säteilyä. Tulokset on esitetty kuviossa 4. RAD001 indusoi G0 /G1 pidätyksen kaikissa virtsarakon syövän solulinjat testattiin: KU7 62% ± 4%, UM-UC3 71% ± 6%, UM-UC6 77% ± 3% ja 253J- BV 67% ± 4% verrattuna niiden käsittelemättömiin kontrolleihin, 54% ± 3%, 64% ± 2%, 66% ± 2% ja 55% ± 3%, vastaavasti. Prosenttiosuudet suhde solujen kunkin vaiheen suhteessa solujen kokonais- määrään. Kuten odotettua, ionisoiva säteily johti ensisijaisesti G2 pidätys, havainnollistaa merkittävä kasvu solujen prosenttiosuus tässä vaiheessa käsittelyn jälkeen ionisoivalla säteilyllä: KU7 38% ± 4%, UM-UC3 23% ± 4%, UM-UC6 19% ± 4% ja 253J-BV 22% ± 3% verrattuna niiden käsittelemättömien kontrollien: 23% ± 2%, 19% ± 3%, 14% ± 3% ja 4% ± 2%, vastaavasti. Yhdistettyyn varteen RAD001 ja ionisoivaa säteilyä, havaitsimme sekä kasvuun solujen prosenttiosuus on G0 /G1 ja G2 vaiheet (Fig. 4). Tarkemmin sanottuna, lasku solujen prosenttiosuus S-faasi havaittiin verrattuna joko hoito yksinään tai kontrolliin (ei käsittelyä) ja tämä oli rinnastettavissa kasvua prosenttiosuus solujen G0 /G1 ja G2 vaiheet. Yhdessä olemme tulleet siihen tulokseen, että sytostaattinen vaikutus RAD001 yhdessä ionisoivan säteilyn jolla on estävä additiivinen vaikutus etenemistä solujen kautta ajan.

solulinjoja viljeltiin ja käsiteltiin RAD001 yksin, ionisoivan säteilyn yksin, ja yhdistelmällä RAD001 ja säteilyn. Jälkimmäisen sarjan näytteet esikäsiteltiin RAD001 6 tuntia ennen säteilyä. Solut kiinnitettiin ja värjättiin propidiumjodidilla saanti 48 tuntia käsittelyn jälkeen, ja sitten mittaukset suoritettiin virtaussytometrialla. Osuus solupopulaatioiden eri vaiheissa solusyklin esitetään kullekin solulinjassa värilliset palkit (G0 /G1: Oranssi /sininen, S: Red ja G2: Yellow).

RAD001 ja ionisoivaa säteilyä muuttaa tasoilla solusyklin tarkastuspisteiden sykliini D1, p27kip1 ja p21

edellä esitetyn solusyklin analyysi datan ja edelleen ymmärtää mekanismia, jolla RAD001 ja ionisoivaa säteilyä toimivat yhdessä estävät solujen kasvun, testasimme todennäköisyys muutokset ekspressiotasoja erilaisia ​​säätelijöitä solusyklin, erityisesti liittyvät tarkistuspisteitä, kuten sykliini D1, P27, ja p21. Tulokset kuviossa 5 esittävät tapauksessa KU7, käytetään ryhmän edustaja solulinjojen havaittiin olevan suhteellisen resistenttejä sekä ionisoivan säteilyn ja RAD001. Tästä huolimatta annoksen RAD001 vastaa GI50 kyseisen solulinjaa käytettiin varmistamaan vastaus RAD001 hoitoon. Tuloksemme osoittavat, että taso sykliini D1, joka on proteiini tarvitaan G1 /S siirtyminen solusyklin läpi, oli vähentynyt seuraavat 24 tuntia hoidon RAD001 (Fig. 5), joka on havainto, joka tukee havaintomme solusyklin muutokset. Sitä vastoin tasoja p27, joka on proteiini liittyy myös G1 /S siirtymistä, muuttaa käänteinen korrelaatio (lisääntynyt) 24 tuntia sen jälkeen hoidon RAD001, ionisoivaa säteilyä, ja yhdistetty hoito kontrolliin verrattuna (kuvio. 5). Mielenkiintoista on, että tasot p21, joka liittyy myös estämällä solusyklin etenemistä, määrä väheni käsitellyissä soluissa RAD001 yksin verrattuna kontrolliin, tai säteilyä (Fig. 5). Tasot p21 kasvoi hoitovasteen säteilylle kontrolliin verrattuna, ja tasot p21 ovat korkeimmillaan, kun soluja käsitellään sekä RAD001 ja ionisoivaa säteilyä. On huomattava, että samankaltaisia ​​tuloksia saatiin sykliini D1, P27, ja p21, kaikilla testatuilla solulinjoissa: UM-UC3, UM-UC6 ja 253J-BV.

Virtsarakon syöpä soluja käsiteltiin RAD001, ionisoivalla säteilyn (IR) tai yhdistetyn hoidon. Ne hajotettiin 24 tuntia käsittelyn jälkeen, kuten on kuvattu menetelmät. Western blot analyysi sykliini D1, p27kip1 ja p21 KU7 soluissa ja normalisoitu alemmissa paneelien funktiona aktiini taso mitataan rinnakkain. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kaikilla testatuilla solulinjoilla, UM-UC3, UM-UC6 ja 253J-BV (ei esitetty).

yhdistäminen RAD001 ionisoivalla säteilyllä huomattavasti estää kasvaimen kasvua ihmisen virtsarakon syövän ksenografti- malli, verrattuna joko hoito yksinään

sen varmistamiseksi merkitys ja tarkistaa, onko

in vitro

tietojen suhteen vaikutuksiin yhdistyvät RAD001 ja ionisoivan säteilyn kasvuun virtsarakon syövän solulinjoja voidaan siirtää

in vivo

, käytimme KU7 virtsarakon syövän solulinja kasvaa ihonalainen tuumoriksenografteja kateenkorvattomissa hiirissä. Kaikki hiiret, kasvaimia ilmenee ensimmäisten 10 päivää implantaation jälkeen. Ei ollut mitään laihtuminen tai merkittävää myrkyllisyyttä liittyvät suoraan RAD001 ja ionisoivaa säteilyä hoitoja aikana koko tutkimuksen keston ajan (yhteensä 5 viikkoa). Hiirillä hoidettiin yhdistetyn RAD001 ja ionisoivaa säteilyä, oli maksimaalinen estävä vaikutus virtsarakon syövän etenemiseen, kuten on osoitettu huomattavaa laskua kasvaimen painoa verrattuna joko hoito yksinään tai plaseboryhmässä (keskimääräinen kasvaimen paino 31 mg yhdistelmähoitoa saaneilla vs. 117 mg RAD001 yksin, 80 mg IR, tai 340 mg lumelääke, P 0,05) (Fig. 6). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös käyttämällä 253J-BV solulinjoissa, jossa yhdistetty hoito saavutetaan maksimaalinen estävä vaikutus virtsarakon syövän etenemisen jälkeen 4 viikkoa hoidon verrattuna kontrolliin. Samat tulokset osoittivat, käyttäen kasvaimen kasvun kinetiikka, kun tuumorin tilavuus mitattiin koko hoidon keston ajan (tietoja ei esitetty). Meidän p21 immunohistokemia värjäytymisen ksenograftissa osissa vahvistaneet havainnot western blot-analyysi p21 tasot

in vitro

(Fig. 7). Tasot p21 merkitsevästi (p 0,05) lisääntyi sen jälkeen, kun hoidon säteilyn ja yhdistelmä hoito verrattuna lumelääkkeeseen. Lisäksi meidän tiedot osoittivat lievää laskua, vaikka tilastollisesti merkitsevä, p21 tasot RAD001 hoidetussa ryhmässä yksin.

kateenkorvattomissa hiirissä virtsarakon tuumorin mallin KU7 käytettiin, kuten on kuvattu menetelmät. Kasvaimen painot (grammoina) saavutettiin kokeellinen päätepisteen ja ilmaistaan ​​keskiarvona paino kasvainten korjattu kunkin ryhmän hiiret 4 hoitoryhmissä, kuten on osoitettu. Samanlaisia ​​tuloksia saadaan käyttämällä 253J-BV-soluja (tietoja ei esitetty).

(A) Immunohistokemia käytetään havaitsemaan tasoja p21 parafiiniin upotettu hiiren ksenografti virtsarakon syöpä kudoksia, joita hoidettiin plasebolla, IR, RAD001 ja yhdistelmänä. (B) kvantifiointi Immunohistokemian paljastivat merkittävän kasvun p21 ilmaus kuin havaittu kasvaimia käsitelty ionisoivalla säteilyllä ja yhdistelmänä verrattuna lumelääkkeeseen ja RAD001 hoitoa.

Keskustelu

sädehoitoa on keskeinen osa monia syövän hoito-ohjelmissa siten sen laajamittaista käyttöä. Kuitenkin ionisoiva säteily vaikuttaa osaltaan epäedulliseen kasvuun signalointi kautta PI3K /AKT /mTOR pro-selviytymisreittiin. Tässä tutkimuksessa havaitsimme eroja herkkyydessä paneelin kuusi virtsarakon solulinjat ionisoivan säteilyn, jotkut ovat olleet vastustuskykyisempiä kuin toiset. Olemme myös osoittaneet aktivoinnin AKT altistus ionisoivalle säteilylle. Useat tekijät saattavat olla ratkaisevia aktivointi mekanismeja PI3K /AKT-reitin seuraava ionisoivaa säteilyä ja sitten auttaa syöpäsoluja perustamista vastus [22]. Muun muassa parannettu aktiivisuus keskeisten entsyymien, kuten telomeraasiaktiivisuuden [23] sekä osallistumista signalointimolekyylien, kuten epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja RAS [24], [25], voidaan selittää, miksi jotkut kasvaimet eivät vastata säteilyä yhtä tehokkaasti kuin muut. Erityisesti, EGFR signalointi kautta PI3K /AKT raportoitiin säädellä DNA-riippuvaisen proteiinikinaasin katalyyttinen alayksiköt, jotka ovat osa DNA-korjauksen koneen päällä sädehoidon jälkeen [26]. Vaikka nämä havainnot korostavat tärkeää roolia, joka aktivoituminen PI3K /AKT pelaa syöpä radioresistance, osoitamme, että estämällä PI3K /AKT /mTOR polkuun RAD001 näkyy arvokkaana tarkoita tehostavat sädehoitoa virtsarakon syövän soluissa. Mekanismi, jolla RAD001 esittelee tämän parannetun vaikutuksen vielä lisäarviointia. Se voi yksinkertaisesti olla, että estää rebound aktivointi polun sädehoidon jälkeen on riittävä alentamaan radioresistance; uskottavaa mekanismi kuin kaksi hoidot eivät yhteisiä tavoitteita solussa, kuten hypoksian indusoituva transkriptiotekijä (HIF-1), molekyyli alavirtaan mTOR [27].

Lisäksi solusignalointi tehoa