Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä on yksi johtavista syistä syöpään liittyvien kuolemien takia aggressiivinen kasvu, korkea metastaattinen hinnat aikana varhaisessa vaiheessa ja puute tehokas terapeuttinen lähestymistapa. Olemme aiemmin osoittaneet, että Qingyihuaji (QYHJ), seitsemän yrtti kiinalaisen lääketieteen kaava, osoittivat merkittävää syövän vaikutuksia haimasyövän, joka liittyy muutoksia kasvaimen mikroympäristössä, erityisesti inhibitio syöpään liittyvän fibroblasti (CAF) aktivointi. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme syntyy CAF ja pariksi normaali fibroblasti (NF) viljelmät resektoitiin ihmisen haimasyövän kudoksiin. Havaitsimme, että valuuttalisiin näytteillä tehostettu kapasiteetti indusoimiseksi haimasyövän solumigraatioon ja invaasio verrattuna NFS taas QYHJ saaneista valuuttalisiin näytteillä väheni muuttoliike ja invaasio edistävää valmiuksia in vitro. Tulokset lisäanalyyseja osoittivat, että verrattuna NFS valuuttalisiin näytteille lisääntynyt CXCL1, 2 ja 8 lauseke, edistää tehostetun hyökkäyksen edistävää valmiuksia näiden solujen, kun taas QYHJ hoidon merkittävästi tukahdutti CAF ydinasevarustelusta ja tuotanto CAF johdettujen CXCL1, 2 ja 8. Nämä in vitro havainnot vahvistettiin hiirillä malleja ihmisen haimasyövän. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että tukahduttaa kasvaimen edistävää kapasiteetti valuuttalisiin kautta Kiinan kasviperäisten vaimentaa haiman syöpäsoluinvaasiota.

Citation: Chen L, Qu C, Chen H, Xu L, Qi Q, Luo J , et ai. (2014) Kiinan kasviperäisten lääkeaineiden vaimentaa Invasion-edistäminen Kapasiteetti syöpään liittyvien fibroblastien Haimasyöpä. PLoS ONE 9 (4): e96177. doi: 10,1371 /journal.pone.0096177

Editor: Donald Gullberg, University of Bergen, Norja

vastaanotettu: 31 lokakuu 2013; Hyväksytty: 04 huhtikuu 2014; Julkaistu: 29 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Science Fundation of China (81001061, 81370068, 81273953, 81173461); Shanghai Nature Science Fund, Shanghai, Kiina (09ZR1406800); Jatko-ohjelmat Säätiö Opetusministeriön Kiina (20090071120076); Shanghai Science and Technology komitea Rising Star Program (11QA1401300); Lääketieteellinen Talents Training Program of Health Bureau of Shanghai (XYQ2011008); ja Fudanin yliopiston Zhuo-Xue ohjelma. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Koska aggressiivista kasvua ja korkeaa metastaattinen nopeudella aikana varhaisessa vaiheessa, haimasyövän edelleen erittäin tappava pahanlaatuinen sairaus [1], ja vain noin 10-20% haimasyövän on kokoisen aikaan diagnoosi [ ,,,0],2]. Gemsitabiini on ollut tavanomaista hoitoa pitkälle haimasyövän; kuitenkin, mediaanielossaolosta 5-6 kuukautta, jossa usein kehitys kemiallis-vastuksen hoidon aikana [3]. Siten haimasyövän edelleen kauhea tauti, ja on olemassa kiireellinen tarve lisätutkimuksia paljastaa molekyylitason mekanismeja kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden kehittää tehokas terapeuttinen lähestymistapa ehkäisemiseksi ja /tai hoitoon haimasyövän.

liittyvän syövän fibroblasteissa (valuuttalisiin), pääasialliset komponentit kasvaimen strooman, jotka on erotettu useita invasiivisia ihmisen karsinoomien, kuten haimasyövän [4], [5], [6]. Haiman adenokarsinooma on ominaista laaja strooman vasteen kutsutaan desmoplasia [7]. Tuumorin sisällä strooman, valuuttalisiin ovat ensisijaisen solun tyyppi, joka on tärkeä rooli syövän etenemistä [5]. Valuuttalisiin erittää useita tekijöitä, kuten CXC, CC-kemokiinit, ja muut tulehduksen välittäjäaineita, jotka edistävät leviämistä, invaasio ja metastaasi syöpäsolujen. Lisäksi saatu todisteita on osoittanut, että valuuttalisiin avainasemassa hankinnassa lääkeresistenssin kasvaimen hoidossa [8], joka vaikuttaa negatiivisesti kliiniseen tulokseen [9], [10]. Näin ollen estämällä aktivointi valuuttalisiin voisi edustaa mahdollisesti terapeuttinen lähestymistapa haimasyövän hoitoon.

QYHJ, seitsemän yrtti Kiinan lääkkeiden kaavan käytetään hoitoon haimasyövän Kiinassa, estää sekä kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden nude-hiirissä malleja haimasyövän [11], [12], [13]. Lisäksi yhdistetty käyttö QYHJ tavanomaisten Länsi lääketieteen pidentää elinaika maksan etäpesäkkeiden haimasyöpä [14]. Kuitenkin taustalla molekyylitason mekanismi jää epäselväksi.

Täällä osoitimme, että valuuttalisiin näytteillä tehostettu kapasiteetti indusoimiseksi haimasyövän solumigraatioon ja invaasio verrattuna NFS taas QYHJ saaneista valuuttalisiin näytteillä laski maahanmuutto- ja invaasio edistävää valmiuksia in vitro. Lisäksi osoitimme, että verrattuna NFS valuuttalisiin ilmaista korkeita CXCL1, 2 ja 8, edistää tehostetun hyökkäyksen edistävää kapasiteetti näiden solujen. Siten QYHJ hoito voisi tukahduttaa ydinasevarustelusta ja CXCL1, 2 ja 8 ekspressiotasoja valuuttalisien. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että tukahduttaa kasvaimen edistävää kapasiteetti valuuttalisiin Kiinan kasviperäisten lääkeaineiden vaimentaa haiman syöpäsoluinvaasiota.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläin kokeet suoritettiin ohjeiden mukaisesti National Institutes of Health, että hoito ja käyttö Laboratory Animals. Tutkimuksen protokolla hyväksyttiin myös läpi valiokunnan elävien eläinten käyttö opetuksessa ja tutkimuksessa, Fudanin yliopiston Shanghai. Lopussa Tutkimuksen kaikki eläimet dekapitoitiin kautta selkäydin erottumista nuchae minimoida kärsimyksen. Fibroblastit eristettiin resektoitiin kudoksista kaksi potilasta, joilla haimatiehyen adenokarsinoomat (PDAC). Ennen Näytekokoelmatodistuksen, kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan mukaisesti institutionaalisten ohjeiden ja tutkimus hyväksyttiin läpi komiteoihin eettinen arviointi tutkimuksen Fudanin yliopiston Shanghai Cancer Center.

Solulinjat ja hiiret

ihmisen haimasyövän solulinja Capan1 ja BxPC3 saatiin American Type Culture Collection, ja niitä viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Gibco, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Gibco, Carlsbad, CA) 37 ° C: ssa 5% CO

2. Morfologia Capan1 solulinjan arvioidaan säännöllisesti, ja soluja testattiin puuttuminen mykoplasmakontaminaation (MycoAlert, Lonza, Rockland, ME, USA). Capan1 ja BxPC3 solulinjoja klo 30~40 kohtia käytettiin tutkimuksessamme.

BALB /c-nu /nu nude-hiirissä ikäinen 4-6 viikkoa saatiin Shanghai Institute of Materia Medica, Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina), joka sijaitsee laminaarivirtausmittaria kaappien erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa ja antoi ruokaa ja vettä

halun

.

eristäminen valuuttalisiin ja pariksi UE:

stroomakasvaimet fibrolasts eristettiin, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Lyhyesti, kirurgisesti resektoitiin haimasyöpä kudokset saatiin kahdelta potilaalta, joilla haiman adenokarsinooma. Kirjallinen suostumus on saatu ennen kudoksen keräämistä. Tuoretta haiman kasvainkudoksessa ja viereisen normaalin kudoksen (vähintään 2 cm: n päässä ulomman kasvain marginaali) on hakattu 1-3 mm

3 fragmentteja ja hajotettiin 0,25% trypsiiniä 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Tuloksena olevat fragmentit sentrifugoitiin 600 x g: ssä 5 min ajan ja pestiin kerran DMEM, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia. Kudoksen fragmentit myöhemmin maljattiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa. Viljelyväliaine vaihdettiin kahdesti viikossa 3-4 viikkoa. Näissä olosuhteissa, fibroblastit eksplantoitiin kudoksesta fragmentteja, kun taas muut solut enimmäkseen säilyttää kudoksessa. Fibroblastit muodostettu monikerroksinen pesäkkeiden leviäminen kulttuuriin lautasen. 3-4 viikon kuluttua viljellyt solut karkeasti trypsinoitiin ja uudelleen pinnoitettu T25 dosviljelypulloihin (passage yksi). Fibroblastit olivat sitten osa-viljeltiin toisen 2-3 kohtia, kunnes viljelmät olivat vapaita saastumisen epiteelisolujen ja sen jälkeen pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 2% penisilliiniä ja streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) . Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2.NF ja CAF-kantoja käytettiin 4-5 kohtia.

Immunohistokemia ja immunofluoresenssilla

Immunohistokemia (IHC) suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [16]. Lyhyesti, kasvaimen kudosnäytteet kiinnitettiin 10% formaliinilla ja upotettiin parafiinivahaan. Unstained 3-pm leikkeitä myöhemmin leikattiin parafiiniblokit IHC analyysiä. Leikkeet värjättiin seuraavilla vasta-aineilla: kanin anti-vimentiinista (1:200), kanin anti-α-SMA (1:100), kanin anti-CXCL1 (1:100), kanin anti-CXCL2 (1:200) , ja kanin anti-CXCL8 (1:25) 4 ° C: ssa yön yli. Leikkeet inkuboitiin toissijaisen vasta-aineita, ja avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksia käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Vector Laboratories, CA, USA). Immunoglobuliinin negatiivinen kontrolli käytettiin sulkea pois epäspesifisen sitoutumisen. Kaksi itsenäistä tutkijat ja yksi patologi, joista kaikki olivat sokaissut mallin /hoito tyyppiä sarjan yksilöiden, suoritetaan kaikki menettelyt. Kvantitatiivisesti arvioida CAF aiheuttama proliferatiivinen aktiivisuus kussakin ryhmässä, laskimme suhde alueen positiivinen vimentiinista ja α-SMA värjäykseen kokonaispinta-ala histologinen kohdissa kymmenestä alojen valomikroskoopilla (200 ×) [11].

Immunofluoresenssivärjäystä, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja niitä inkuboitiin anti-Pan-CK (1:100), anti-α-SMA (1:100), anti-vimentiinistä (1:100) , anti-E-kadheriini (1:100), anti-CD31 (1:200) ja anti-D2-40 (1:100) 4 ° C: ssa yön yli. Solut viljeltiin sen jälkeen fluoresenssi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella 1 tunti. Pesun jälkeen solut asentaa asennus elatusainetta, joka sisälsi DAPI (Vector Laboratories). Negatiivinen kontrolli, jossa primaarinen vasta-aine oli jätetty pois, käytettiin testaamaan vasta-aineen spesifisyyden. Kuvat otettiin käyttäen konfokaalisella Leica fluoresenssimikroskoopilla.

Lääkkeet ja reagenssit

QYHJ, seitsemän yrtti Kiinan lääkkeiden kaava, joka koostuu

Scutellria barbata

(Ban Zhi Lian)

Heydyotis diffusan

(Bai Hua hän hän caO),

Amorphophallus kiusianus

(hän ​​liu gu),

Coix lacryma-jobi

(Yi ren),

Gynostemma pentaphyllum

(Jiao gu LAN),

Ganoderma luncidum

(Ling zhi) ja

Amomum cardamomum

(Bai dou Kou), valmistettiin aikaisemmin decribed [11], [12], [13]. Lyhyesti, QYHJ jauhetta saatiin Jiang Yan Tianjiang Pharmaceutical Co, Ltd. varmistamiseksi standardoinnin ja ylläpitää erien välistä luotettavuus QYHJ, korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC) kromatografinen sormenjälki kehitettiin laadunvalvontaan. Sormenjälki kromatogrammit QYHJ kaava on esitetty edellisessä raportissa [17]. Lopullinen keittäminen QYHJ valmistettiin jälkeen liuottamalla kasviperäisten jauhe tislattua vettä vaadittuun pitoisuuteen. Päivittäinen annostus kanin ja paljaisiin hiiriin oli 15 g /kg ja 18 g /kg, vastaavasti, lasketaan seuraavan ihmisen kanin tai ihmisen-hiiren siirto kaava: Db = Da × (Rb /Ra) x (Wb /Wa ) 2/3, jossa D, R, ja W edustavat annostuksen, muoto kerroin, ja kehon painoa, vastaavasti, ja a ja b ovat ihmisen ja hiiren tai kanin, vastaavasti. Ihmisen rekombinantti CXCL1, 2 ja 8 saatiin PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA). Anti-CXCR1 estävää vasta-ainetta on saatu R Ascend Biotechnology, Guangzhou, Kiina), ja anti-CXCL2 (BIOSs, Peking, Kiina).

valmistaminen QYHJ sisältävien Serum

QYHJ sisältävien seerumi valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [18]. Lyhyesti, 20 naaraskaniinia, joiden paino 1800 ± 2200 g, jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään: QYHJ sisältävien Serum ryhmä ja vehikkelikontrolliryhmään. QYHJ-seerumia sisältävää ryhmä letkulla mahan QYHJ kerran päivässä 7 peräkkäisenä päivänä (12,5 g /kg kehon paino /aika), ja ajoneuvo kontrolliryhmään letkulla mahan deionisoitua vettä. Verta kerättiin kaulavaltimon sisällä 2 tuntia viimeisen annon jälkeen ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Seerumin kokoverestä sentrifugoitiin (4000 r /min 10 min ajan) ja inaktivoitu on 56 ° C: n vesihauteessa 30 minuuttia. Seerumi säilytettiin -80 ° C: ssa, ja toistuva jäädytys ja sulatus vältyttiin.

Muuttoliike ja invaasiomääritys

Solun maahanmuutto- ja invaasion määritettiin käyttäen transwell solujen vaeltamiseen levyt (Corning, NY, USA) ja matrigeelin invaasio kammiot (Matrigel-pinnoitettu kalvo, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) aikaisemmin kuvatulla [19]. Lyhyesti, solut (1,0 x 10

4) ympättiin seerumittomassa elatusaineessa ylempään kammioon ja sen annettiin tunkeutua kohti 10% FCS alemmassa kammio kemoattraktantti. 12 tunnin kuluttua (Siirrettävissä määrityksiin ilman matrigeeliä pinnoitetta) tai 48 h (varten invaasio testeissä, joissa matrigeelin pinnoite), solut, jotka olivat tunkeutuneet kalvon läpi ja kiinni alapintaan kalvo laskettiin kuten aiemmin kuvattu [16].

Western blot -analyysi

Yhteensä proteiini uutettiin viljellystä soluista ja kvantitoitiin käyttäen bikinkoniini- hapon määritystä (Pierce, Rockford, IL, USA). Western blottaus suoritettiin edellisessä raportissa [16]. Yhtä suuret määrät proteiinia, eri näytteistä erotettiin läpi 10% SDS-polyakrylaatti geelielektroforeesi ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvo. Estopuskurilla, joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa, on käytetty estämään ja inkuboi kalvot primaarisilla vasta-aineilla. Ilmaisu kohdeproteiinien tutkittiin käyttäen parantaa kemiluminesenssin (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Ruotsi), ja kvantitatiivinen analyysi suoritettiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

RNA: n eristys ja reaaliaikaisella PCR: llä

Kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä TRIzol reagenssia (Invitrogen, San Diego, CA, USA), ja käänteistranskriptio-PCR (RT-PCR) suoritettiin valmistajan ohjeiden (Takara). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR mittaukset suoritettiin käyttämällä SYBR vihreä I (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ, USA). Aluke sekvenssejä CXCL1, 2 ja 8 on lueteltu taulukossa 1. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kahdesti.

Vakioitu alusta (CM) valmisteen

CM päässä valuuttalisiin ja UE: saatiin kuten edellä on kuvattu, vähäisin muutoksin [20]. Lyhyesti, soluja pidettiin DMEM: ssä, 37 ° C: ssa 48 tuntia. Mukautettu elatusalusta valuuttalisiin tai NFS on korjattu. Esikäsitelty väliaine poistetaan sentrifugoimalla, minkä jälkeen 1:01 laimennus määritelty väliaineeseen ennen käsittelemällä Capan 1-solut; elatusaine oli juuri siirretty ilman varastointia.

saamiseksi CM päässä QYHJ-käsiteltyjen valuuttalisiin, eristetty valuuttalisiin maljattiin T25-pulloihin (1 x 10

6 solua), ja niitä viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% QYHJ- sisältävä seerumi tai Control sisältävien Serum. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, väliaine poistettiin ja solut pestiin kahdesti PBS: llä. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin 5 ml: lla tuoretta DMEM: ssa vielä 48 tuntia. CM myöhemmin kerättiin, kuten edellä on kuvattu.

Enzyme-Linked Immunosorbent (ELISA) määritys

seerumin CXCL1, 2 ja 8 mitattiin käyttäen ELISA kuten aikaisemmin on kuvattu [17]. Verinäyte oli varastoitu huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, sentrifugoitiin (12000 x g) 15 minuuttia, ja kryosäilöttiin -80 ° C: ssa. Pitoisuudet mitattiin käyttämällä sandwich-ELISA-kittiä (DuoSet; R 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 15.0 ohjelmistopaketti.

Tulokset

Generation syöpään liittyvien fibroblasti (CAF) viljelmät

uutettu fibroblasteista resektoitua yksilöitä kaksi haimatiehyen adenokarsinoomat. Kasvainmassat hajotettiin, ja erilaisia ​​solutyyppejä erotettiin, jolloin saatiin populaatioiden valuuttalisien. Meillä on myös eristetty toinen populaatio saadut fibroblastit noncancerous alueen haiman vähintään 2 cm: n päässä ulomman kasvain marginaali kussakin samat kaksi potilasta. Me kutsutaan nämä solut ”normaalien fibroblastien (NFS).” Kaikki kokeet suoritettiin kautta vertailuja valuuttalisiin ja vastaavien UE:, jolloin vältetään bias vuoksi yksilöiden välisiä eroja. Puhtaus viljeltyjen fibroblastisolujen varmistettiin kautta immunovärjäyksellä käyttäen vimentiinista ja PDGFR-β (mesenkyymisolun markkeri) ja E-kadheriinin ja sytokeratiini (CK) (epiteelisolujen markkeri). Lisäksi D31 ja D2-40 käytettiin jättää endoteelin alkuperää (kuvio 1A ja kuvio S1). Kaikki soluviljelmät olivat vimentiinista ja PDGFR-β positiivisia ja 91%: sta 100% E-kadheriinin, sytokeratiini, CD31 ja D2-40 negatiivinen. Verrattuna NFS vakiintuneiden valuuttalisiin ilmaisi korkeita alfa sileän lihaksen aktiini (α-SMA), merkkiaine aktivoitujen fibroblastien, tyypillisesti ilmaistu CAF mutta ei normaalissa lepotilassa fibroblasteissa. Nämä havainnot varmistettiin vielä läpi Western blot-analyysi (kuvio 1 B). Yhdessä tuloksemme osoittivat, että pystyimme pariksi CAF ja NF kulttuureissa ihmisen PDAC.

. Fibroblasteja uutettu resektoitua kudoksista kahden haimatiehyen adenokarsinooman. Puhtaus viljeltyjen fibroblastisolujen varmistettiin kautta immunofluoresenssilla havaita Pan-CK (punainen), E-kadheriinin (vihreä), vimentiinistä (punainen), α-SMA (punainen), PDGFR-β (punainen), CD31 (punainen) ja D2-40 (punainen). Solutumien vastavärjättiin DAPI (sininen). Positiivinen kontrolli kudosten CD31 ja D2-40 immunovärjäys on käytetty (kuva S1). B. Western blot-analyysi vahvisti ekspressiokuvion käytettäviä merkkiaineita A.

haimasyöpä käsiteltyjen solujen vakioitua elatusainetta QYHJ-käsiteltyjen valuuttalisiin oli vähentynyt invaasio

valuuttalisiin osaltaan invasiivisia ja metastaattinen prosessi ihmisen haimasyövän [5]. Tässä tutkimuksessa selvitimme muuttoliikettä ja invaasio aiheuttavia vaikutuksia CAF ihmisen haimasyövän soluja käyttäen siirtokuoppaan kammioita tai ilman Matrigel pinnoitetta. Transvvell- analyysit osoittivat, että väliaine (CM) kontrollista saaneilla valuuttalisiin osoitti parannettu kyky indusoimiseksi haimasyövän solumigraatioon ja invaasiota (kuva 2 ja kuva S2). Seuraavaksi arvioimme vaikutuksia QYHJ on CAF aiheuttaman solumigraation ja invaasio, CM alkaen QYHJ tai ohjaus saaneilla valuuttalisiin otettiin talteen ja tämän vaikutuksista väliaineen haimasyövän solumigraatioon ja invaasiota arvioitiin myös. Havaitsimme, että CM peräisin QYHJ saaneista valuuttalisiin näytteillä väheni muuttoliike ja invaasio edistävät valmiuksia verrattiin kontrolli-käsiteltyjen valuuttalisiin (kuva 2 ja kuva S2), nämä tulokset viittaavat siihen, että QYHJ hoito saattaa tukahduttaa haimasyöpä solumigraatioon ja invaasion kohdistamalla valuuttalisien .

solumigraatioon ja invaasiota kapasiteetti haimasyövän käsiteltyjen solujen elatusaineesta (CM) NFS Ctrl-käsiteltyjen valuuttalisiin ja QYHJ saaneilla valuuttalisiin verrattiin käyttäen siirtokuoppaan kammioita tai ilman Matrigel pinnoitetta. Numerot solujen kulkenut kalvon laskettiin 10 kenttää alle × 20 objektiivilinssin. Alkuperäinen suurennos, × 200. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD arvoista, jotka saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa. Tilastollinen merkittävyys laskettiin käyttäen ANOVA. *

P

0,05.

QYHJ inhiboi CXCL1, 2 ja 8 muodostavat valuuttalisiin

valuuttalisiin suoraan stimuloida kasvainsoluproliferaation läpi erilaisia ​​kasvutekijöitä, hormonit ja sytokiinien kontekstisidonnaisia ​​tavalla [5]. Olemme aiemmin osoittaneet, että valuuttalisiin edistävät muuttoliikkeen ja invaasion Capan1 soluja in vitro, ja tämä ominaisuus estyi jälkeen käsiteltiin QYHJ. Meidän vieressä pyritty tunnistamaan mahdolliset molekyylejä, jotka välittävät korrelaatio fibroblastien ja syöpäsoluja. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että jäsenet CXC-kemokiini subfamilies, mukaan lukien GRO1 (CXCL1), GRO2 (CXCL2) ja IL-8 (CXCL8), ovat yksi erittäin up-geenien tunnistettu valuuttalisiin verrattuna UE: haiman syöpä [21]. Siksi tutkimme ilmaus Näiden tekijöiden valuuttalisiin ja pariksi UE:. Havaitsimme, että valuuttalisiin näytteille lisääntynyt CXCL1, 2 ja 8-mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen verrattuna UE:. Lisäksi havaitsimme, että QYHJ hoito suppressoi merkitsevästi ilmaus CXCL1, 2 ja 8 sekä CAF solulinjoissa (kuvio 3A-B). ELISA-määritys vahvisti myös, että valuuttalisiin käsiteltiin QYHJ erittyy alhaisempi CXCL1, 2 ja 8 alustaan ​​(kuvio 3C). Täten nämä tulokset viittaavat siihen, että QYHJ estää ilmentymisen CXCL1, 2 ja 8 valuuttalisiin.

A-B. Valuuttalisiin käsiteltiin QYHJ sisältävien seerumi tai Control-seerumia sisältävää 48 tuntia. Sitten solut kerättiin, ja ilmaus CXCL1, 2 ja 8 arvioitiin käyttäen reaaliaikaista PCR: llä (A) ja Western blotting (B). C. Eristetty valuuttalisiin maljattiin T25-pulloihin (1 x 10

6 solua) ja viljeltiin DMEM, joka sisälsi 10% QYHJ sisältävien seerumi tai Control-seerumia sisältävää. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, media poistettiin, ja solut pestiin kahdesti PBS: llä. Solut viljeltiin sen jälkeen 5 ml: lla tuoretta DMEM-elatusainetta vielä 48 tuntia. Väliaine sen jälkeen talteen, ja CXCL1, 2 ja 8 pitoisuudet havaittiin ELISA: lla. ANOVA käytettiin tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi. *

P

0,05.

QYHJ esti CAF lisääntymistä in vitro

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että määrä valuuttalisiin stroomaan merkittävästi liittyy huono erilaistumista ja ennusteen syöpien [22], [23], [24], ja vähentää CAF numerot havaittiin myös silloin, kun kasvain oli käsitelty [11]. Siksi arveltu, että QYHJ vaikuttaa CAF lisääntymistä. In vitro leviämisen määritys osoitti, että QYHJ hoito inhiboivat valuuttalisiin molemmissa solulinjoissa (kuvio 4), mikä edesauttaa tukahdutti CXC-kemokiini eritystä valuuttalisiin.

Noin 5 x 10

3 valuuttalisien vuonna 0,1 ml maljattiin kahtena kappaleena kuoppiin 96-kuoppaisilla levyillä. Yön yli inkuboinnin jälkeen, suspensio poistettiin ja siirrettiin DMEM, joka sisälsi 10% QYHJ-seerumia sisältävää tai Control sisältävien seerumia. Solulisäkasvumäärityk- indeksit arvioitiin päivittäin käyttäen Cell Counting Kit-8. Tulokset esitetään keskiarvoina ± SD arvoista, jotka saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa. *

P

0.05.

CXCLs lisäsi muuttoa ja hyökkäys ihmisen haimasyövän soluja

CXC-kemokiinien on liittynyt syöpäsoluinvaasiota monenlaisissa ihmisen syövistä [25]. Kuten olemme havainneet, että CAF ilmeni kohonneita CXC-kemokiinien ilmaisun ja erittymisen, varmistimme onko ilmen- tymisen lisääntymisen eritystä CXC-kemokiinien edistää tehostettua kapasiteetti indusoimiseksi haimasyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Testasimme vaikutukset CXC-kemokiinien solun muuttoliikettä ja invaasiota käyttäen siirtokuoppaan kammioita tai ilman Matrigel pinnoitetta. Lisäys rekombinantin ihmisen CXCL1, 2 ja 8 lisäsi sekä muuttoliike ja invaasion Capan 1 solujen Transvvell- määrityksissä. Lisäksi esto CXC-kemokiini signalointi käyttämällä reseptoriantagonisteja merkittävästi estetty CXC-kemokiini-indusoitua solumigraation ja invaasiota (kuvio 5 ja kuvio S3).

Migration and invasion määritykset suoritettiin Capan1 soluissa, joita käsiteltiin vehikkelillä, 100 /ml CXCL1, 2 ja 8, tai niiden antognists 20 ug /ml anti-CXCR1-vasta-ainetta ja 400 nM SB 225002 kuten on osoitettu, käyttäen transwell solun kammioita. Solujen lukumäärä, jotka tunkeutuivat kalvo laskettiin 10 kenttää alle × 20 objektiivilinssin. Alkuperäinen suurennos, × 200. Tulokset esitetään keskiarvoina ± SD arvoista, jotka saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa. Tilastollinen merkittävyys laskettiin ANOVA. *

P

0.05.

QHYJ hoidon estävät kasvaimen kehittymisen ja ilmaus CXCL1, 2, 8 in vivo

edelleen varmistamiseksi vaikutuksia QYHJ valuuttalisäsopimus proliferaatioaktiivisuuden ja CXCLs tuotannon in vivo, loimme hiiret ksenograftimalleissa käyttäen Canpan1 soluja. Hiiret jaettiin satunnaisesti QYHJ ja kontrolliryhmissä, käsiteltiin QYHJ (0,2 ml, letkuruokinnalla päivittäin) tai normaalia suolaliuosta kontrollina, vastaavasti. Havaitsimme, että QYHJ hoito johti vähentyneeseen kasvaimen kasvua (kuvio 6A). Yhdenmukainen tulokset in vitro analyysit, QYHJ vähensi CAF lisääntymistä kasvaimissa (kuvio 6B). Lisäksi, IHC vahvisti, että käsitellyt kasvaimet QYHJ osoitti vähentynyt ilmentyminen CXCL1, 2 ja 8 (kuvio 6D). Näin ollen meidän tulokset viittaavat siihen, että QHYJ hoito esti CAF lisääntymistä ja ilmentymistä CXCL1, 2 ja 8, mahdollisesti heijastaa syövän vaikutukset QHYJ haimasyövän.

. Vaikutus QYHJ kasvaimen kasvuun on ihonalaisesti kasvaimen malli. Capan1 soluja (2 x 10

6cells 200 ml) ihonalaisesti oikeaan axilla jokaisen BALB /c-nu /nu nude mouse. Seuraavana päivänä hiiret käsiteltiin oraalisesti tai ilman QYHJ. Kasvaimen keskimääräinen tilavuutta ajoneuvon-käsitelty (suolaisen veden) ja QYHJ-käsitellyt tuumorit mitattiin. Keskiarvo ± keskihajonta määritettiin kummassakin hoitoryhmässä. Kasvaimen kasvukäyrät esitetään yläpaneeli, ja valokuvat ihonalaisesti kasvainten Molempien ryhmien on esitetty alemmassa paneelissa. Studentin t-testiä käytettiin tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi. *

P

0,05 verrattuna QYHJ hoidetussa ryhmässä. B. IHC värjäys vimentiinista ja α-SMA osuuksilla kasvainten arvioida CAF proliferatiivisten toimintaa. Nuoli osoittaa fibroblastien ja nuolenkärki osoittaa haimasyövän solu. Alkuperäinen suurennus, 200 ×. CAF proliferatiivinen toiminta (oikealla) kvantitatiivisesti arvioitiin laskemisen jälkeen suhde vimentiinista tai α-SMA-vasta-positiivista värjäytymistä alueen kokonaispinta-ala kunkin kentän, ja keskiarvo kymmenestä kentiltä 200 × mikroskoopilla on merkitty. *

P

0,05. C. IHC värjäys käyttäen anti-CXCL1, 2, ja 8-vasta-aineita suoritettiin käyttäen osia siirrettyjen kasvainten. Alkuperäinen suurennos, × 200. Positiivinen hinnat CXCL1, 2, ja 8 kasvaimissa näkyvät oikealla. Studentin t-testiä käytettiin tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi. *

P

0.05.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa ilmeni, että QYHJ estää haiman syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäkkeiden kohdistamalla valuuttalisiin, erityisesti tuotannon CXCL1, 2, ja 8. Nämä havainnot lisäksi vahvistetaan edellisessä keinottelun solujen kasvaimen mikroympäristössä voisi toimia keskeinen tavoitteet Kiinan kasviperäisten lääkeaineiden [11].

perinteinen kiinalainen lääketiede (TCM) perustuu ainutlaatuisen teorian muodostettu yksinäinen aikavälillä käytännön kokemusta. Viimeisen tuhannen vuoden TCM on laajalti harjoiteltu Kiinassa, ja yli 90% modernin kiinalaisen syöpäpotilaiden ovat saaneet TCM terapia hoidon aikana [26]. Äskettäin TCM on käytetty ulkomailla ja on hyvin vastaan ​​monissa maissa, erityisesti hoitoon onkologian [27]. TCM perustuu käsitteeseen holism, kun otetaan huomioon keskinäinen ihmiskehon ja ympäristön makrotasolla. Mikroskooppisella asteikolla, pidämme kokonaisvaltaista suhdetta syöpäsoluja ja microenvironment. Todellakin, viimeaikaiset tutkimukset ovat vahvistaneet, että kasvainsolut eivät toimi eristyksissä, vaan voimassa tähän rikkaan mikroympäristön säädetty kotimaisten fibroblastit, tulehdussolujen, endoteelisolujen, perisyyteissä, leukosyytit ja soluväliaineen [28]. Koska syöpä etenee, ympäröivä microenvironment aktivoidaan, coevolving jatkuvalla paracrine viestinnän tukemiseen karsinogeneesi [29]. Haimasyöpä on ominaista laaja strooman vastaus kutsutaan desmoplasia [7]. Valuuttalisiin ovat ensisijainen solutyyppi kasvain strooman ja merkitys rooli valuuttalisiin kasvaimen etenemistä on hyvin hyväksytty [5]. Näin ollen, kuten syöpä ei enää pidetä erillisenä kokonaisuutena määritelty vain piirteet syöpäsolujen sisällä kasvain, vaikuttaen lopulta koko elimistöön, TCM tarjoaa kokonaisvaltaista lähestymistapaa säännellä eheys kaikkien kehon toimintoja ja vuorovaikutusta ihmisten ja lähiympäristö.