Krooninen sairaus

tiivistelmä

Antiproliferatiivistä toimintaa kaikkien kaksikymmentäviisi kohdistettuja estäjä lääkkeet, jotka ovat kliinisessä käytössä mitattiin kaksi suurta määrityksessä paneelit: (1) paneelin proliferaatiomäärityksillä neljäkymmentäneljä ihmisen syöpäsolun linjat erilaisista kasvainkudoksen alkuperää; ja (2) paneeliin yli 300 kinaasin entsyymiaktiivisuuden määrityksiä. Tämä tutkimus tarjoaa päineen vertailun kaikista estäjät huumeiden käytössä (asema marraskuu 2013), ja kuusi näistä lääkkeistä, ensimmäinen kinome profilointitiedot julkisia. Korrelaatio huumeita syövän geenimutaatioita paljasti uusia huumeiden herkkyys markkereita, mikä viittaa siihen, että syövät riippuvainen mutantti

CTNNB1

reagoivat trametinib ja muut MEK estäjiä, ja syövät riippuvainen

Smad4

on pienimolekyylinen EGFR estäjä huumeita. Vertailu solukohdistuskeskuksia efficacies paljastaa eniten kohdistettuja estäjien EGFR, ABL1 ja BRAF (V600E) -indusoituun solujen kasvua, ja osoittaa, että paras kohdennetut aineet yhdistyvät korkea biokemialliset teho hyvällä selektiivisyydellä. Sillä ABL1 estäjät, me laskennallisesti päätellä optimoitu kinaasi profiileja käytettäväksi seuraavan sukupolven huumeita. Tutkimuksemme osoittaa yhdistämisen voiman biokemiallisten ja matkapuhelinverkon profiloinnin tietojen arvioinnissa estäjä huumeiden toimia.

Citation: Uitdehaag JCM, de Roos JADM, van Doornmalen AM, Prinsen MBW, de Man J, Tanizawa Y, et ai. (2014) vertailu Cancer Gene Targeting ja biokemialliset selektiivisyys Kaikki Kohdennettu estäjät Hyväksytty kliinistä käyttöä. PLoS ONE 9 (3): e92146. doi: 10,1371 /journal.pone.0092146

Editor: Yiqun G. Shellman, University of Colorado, School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 joulukuu 2013; Hyväksytty: 17 helmikuu 2014; Julkaistu: 20 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Uitdehaag et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Innovation Office (Agentschap NL) ja talousministeriö Alankomaiden (INT 111039). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: RB ja GZ ovat perustajat ja osakkeenomistajat Netherlands Translational tutkimuskeskuksen B.V. (NTRC). KY on perustaja Carna Biosciences, Inc. (Carna). KY ja YK ovat osakkaina Carna. Kuvattu tasyöpäsolulinja profilointi tarjotaan kaupallisena palveluna, jonka NTRC tuotenimellä Oncolines. Kuvattu biokemiallinen kinaasi profilointi tarjotaan kaupallisena palveluna, jonka Carna tuotenimellä QuickScout. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Kohdennettu hoitojen merkittävästi tehostaa syövän hoidossa. Ne tuovat suurta hyötyä potilaille, koska ne parantavat eloonjäämisluvuissa paljon vähemmän sivuvaikutuksia kuin perinteiset sytotoksisia hoitoja. Pienmolekyylisalpaajilla proteiinikinaasien malliesimerkki onnistumisesta täsmähoitoihin. Tällä hetkellä (marraskuussa 2013) kaksikymmentäviisi kinaasiestäjän hyväksyttyjen lääkkeiden kliiniseen käyttöön, kaikki paitsi kaksi syövän (taulukko 1 ja kuvio 1). Vuonna 2012 proteiinikinaasien olivat suurin yksittäinen onnistunut tavoite luokan määrän perusteella hyväksyttyjen uusien lääkkeiden US Food and Drug Administration (FDA) ja tämä suuntaus jatkui vuonna 2013 [1]. Kuitenkin, kun otetaan huomioon korkea poistuma lääke-ehdokkaiden, rajoitettu selviytyminen edut ensimmäisen sukupolven hoitojen, ongelma lääkeresistenssin ja se, että kohdennettu hoito on hyötyä vain pieni murto-osa syöpäpotilailla, on olemassa tarve uuden ja parannetun kohdennettuja estäjät.

Kaikki ovat estäjät, jotka oli hyväksytty kliiniseen käyttöön marraskuu 2013.

Ratkaisevaa kehittämiseen kohdennettujen hoitomuotojen on kyky pari huumeiden vastauksena geneettinen markkeri, kuten mutaatio, translokaatio tai yliekspressio syövän geeni [2]. Siitä huolimatta on olemassa yli 500 kinaasien koodaa ihmisen genomin, nykyinen hyväksytty estäjät lääkkeet vaikuttavat pääasiassa vain noin kymmenen eri tavoitteet (taulukko 1 ja taulukko S1). Useimmat estäjät onkologian teosta estämällä kasvainsoluproliferaation, angiogeneesin, tai molemmat [3]. Drug herkkyys biomarkkerit Siksi tarvitaan tukemaan uusia kohdennettuja hoitomuotojen ja laajentaa hyödyllisyyttä markkinoidaan syöpälääkkeiden.

paremmin ennustamaan potilaan vasteen populaatioiden alkuvaiheessa lääkekehityksen ja ymmärtää paremmin kinaasi huumeiden toimintaa, olemme luoneet tasyöpäsolulinja paneeli neljäkymmentäneljä solulinjoja, jotka on johdettu monenlaisten ihmisen kasvaimissa (kuvio 2A). Syöpä geenimutaatioita että ajaa syöpä fenotyyppi useimpien solulinjat on tunnettu COSMIC Cell Lines (CCL) hanke [4]. Meidän paneeli sisältää edustajia kaikista tunnettujen onkogeenien ja tuumorisuppressoreilla, että suuressa solussa paneeli summa on yli 90% kaikista dokumentoitu geneettiset muutokset (taulukko S2) [4]. Kaksikymmentäkolme näistä usein geneettisiä muutoksia tapahtuu ainakin kahdella solulinjalla (kuvio 2B ja taulukko S3).

: Tissue alkuperä solulinjojen Oncolines paneelissa. B: Taajuus syöpä geenin muutokset solussa paneelissa,

ts.

, Mutaatiot, translokaatiot ja kopioluvun muutoksia COSMIC Cell Line Project [4]. C: Hierarkkinen klusterointi profilointitiedot kaupan estäjät huumeiden 44-solulinjan paneelista. Skaalaamaton

10logIC

50s käytettiin. Doxorubicin_123 on kolminkertaisessa profilointi valvontaa. Non-estäjät ovat punaisia. D: Kinase estäjät on parempi selektiivisyys solujen paneelissa kuin klassinen sytostaattien (5-fluorourasiili, sisplatiini, vinkristiini, doksorubisiini, etoposidi, doketakseli ja bortetsomibi).

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että solulinja paneelit voidaan käyttää tunnistamaan uusia markkereita lääkkeen herkkyyttä kytkemällä lääkkeen vaste syövän läsnäolon geenin mutaatioiden [4] – [7]. Näissä tutkimuksissa on käytetty solu paneelit jopa 400-1000 solulinjoihin, löytää uusia herkkyyksiä liittyvät harvinaisia ​​geneettisiä variantteja. Tällaiset paneelit ovat epäkäytännöllisiä rutiinikäyttöön [8]. Pienemmät paneelit ovat kokeellisesti helpommin ja voi myös antaa hyödyllistä tietoa, kuten on osoitettu kuudenkymmenen solulinjan paneelista National Cancer Institute (NCI60), jossa 1990-luvulta lähtien yli 300.000 yhdisteitä on ominaista [9], ja neljäkymmentäviisi solulinja paneelissa japani tutkimussäätiöksi [10].

Jos haluat vertailla antiproliferatiivista toimintaa kaikkien estäjät lääkkeitä, jotka on hyväksytty kliiniseen käyttöön, olemme profiloitu ne meidän neljäkymmentäneljä solulinja paneelissa. Olemme korreloi huumeita syövän geenimutaatioita ja tunnistaa uuden lääkkeen herkkyys merkkiaineita MEK ja EGFR: n estäjien. Lisäksi, solun paneeli tietoja käytettiin kvantitatiivisesti verrata suhteellinen kohdistaminen tehoa lääkkeiden tarkoituksena on estää saman kinaasia.

lisätutkimuksia biokemiallisia alkuperää ero vaikutuksia solun kohdentamisen me profiloitu kaikki estäjä lääkkeet on paneeli entsyymiaktiivisuuden määrityksiä yli 300 villityypin ja mutantti-kinaasien [11]. Kun taas laaja biokemialliset valikoivuus käytettävissä ovat monille estäjät [12] – [14], tämä on ensimmäinen laaja profiilit hyväksyttyjä lääkkeitä cabozantinib [15], dabrafenib [16], ponatinib [17], regorafenib [18], trametinib [19] ja vemurafenib [20] (taulukko 1). Yhdistelmä solun ja biokemiallisia aineistoja paljastaa, että biokemialliset tehokkuus ja selektiivisyys ovat riippumattomia tukijoita tehokkaampi kohdentaminen geneettistä kuljettajien kasvainsoluissa. Lisäksi erityinen off-tavoite toiminta voidaan myönteisesti edistää kohdistamista, kun osoitamme varten ABL1 estäjiä, jonka laskennallisesti yhdistää kinome profiilit solujen kohdentamiseen. Tutkimuksemme osoittaa, että solu paneeli profilointi yhdessä biokemiallinen paneeli profilointi on tehokas työkalu löytää uusia sovelluksia nykyisten estäjiä, ja suunnittelu optimaalisesti kohdennettuja estäjien.

Tulokset

Kokoonpano ja validointi Cell Panel

paneeli neljäkymmentäneljä ihmisen syövän solulinjoissa koottiin American Type Culture Collection (ATCC). Solulinjat valittiin edustamaan sekä laaja valikoima erilaisia ​​kudoksen kasvaintyypeissä (kuvio 2A), ja monia eri geneettisten muutosten onkogeenien ja kasvaimen synnyssä (kuvio 2B). Julkinen DNA-sekvenssi tietoja CCL hankkeen [4] sekä Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) [5] avulla valitaan solulinjat. Kaikkien solulinjoja, kehitimme proliferaatiomäärityksillä mittaus- solunsisäisten ATP sisältöä välillisenä lukemiselle solujen määrä. Verrattuna muihin solun paneelit, paneeli (Oncolines) on lisääntynyt geneettinen monimuotoisuus (kuva S1) ja testikonsentraatiot kattavat laajemman: yhdeksän pistettä 32 uM 3,2 nM. Emme Arvioimme yhdiste toimintaa ekstrapoloimalla ulkopuolella testaus alue, kuten tehtiin toisessa tutkimuksessa [4]. Sen sijaan varmistaa, että kaikki IC

50s kuului testaus alueella, se laajeni subnanomolaariset pitoisuudet tapauksessa hyvin voimakkaita yhdisteitä. Jos haluat säilyttää solulinja ominaisuudet, solulinjoja viljeltiin mediassa suosittelemia alkuperäisen tutkijat, jotka talletetaan solulinjoista, ja ATCC. Kaikki käytetyt solut olivat yhdeksän kohtia alkuperäisestä ATCC injektiopullossa.

tarkkuus soluvasteen data on tulossa yhä enemmän huomiota [21] – [23]. Noudattamalla standardoitu työnkulun ja toteuttamiseen tiukkoja laatuvaatimuksia, saimme aikaan maksimaalinen IC

50 siirtyminen kertoimella 2 ja keskihajonta 0,07 on

10logIC

50-arvot (kerroin 1,17), joka perustuu useita toisistaan ​​riippumattomia mittauksia samojen yhdisteiden koko paneelin (kuva S2). Vertailemaan tämän arvon, tutkimme toistettavuus julkisesti aineistoja. Huolimatta yleinen yksimielisyys siitä, että julkisen tiedon sarjaa yhdistettä profiloinnin kokeilut ovat arvokkaat lääkekehityksen yhteisö, tiedot toistettavuus data on harvaa. Sillä NCI60 paneeli vaihtelevat enintään IC

50 tekijän 11 ​​havaittiin, kun sama yhdiste mitattiin kahdella eri kertaa (kuva S2C) Lisäksi äskettäin analyysi chEMBL tietojen [21], kun kaksi ryhmien eri laboratoriossa mitata samalla vakio, keskihajonta 0,8

10logIC

50s todettiin. Tämä tarkoittaa kertoimella 10

0.8 = 6 keskihajontana IC

50s. Yhteenvetona toteamme, että meidän solulinja profilointitiedot ovat erittäin toistettavia.

onko paneeli on riittävän kokoinen, teimme vallan analyysi. Riippuen määrä solulinjoja, jotka kantavat tiettyä syöpää geenimutaatio, IC

50 siirtyminen 2-10 kertaa välillä vasteen ja ei-vastetta on tilastollisesti merkittävä (taulukko S4). Nämä rajoitukset jäävät selvästi sisällä vasteita havaitaan tavallisesti [4], ja siksi 44-solulinja paneeli on sopivasti suuri suorittaa huumeiden responder analyysejä.

profilointi Kliinisen kinaasiestäjinä Cell Panel

vertailevassa huume herkkyysanalyysi, me profiloitu kaikki kaksikymmentäviisi estäjät kliinisessä käytössä kaikilla neljäkymmentä neljä solulinjoissa, ja kuusi klassista sytostaattien ja proteasomin estäjä bortetsomibi (kuvio 2C, taulukko S5). Kaikki estäjä hyväksyttyjen lääkkeiden onkologian osoitti anti-proliferatiivista aktiivisuutta ainakin joidenkin solulinjojen. Vain tofacitinib ja fasudil, kahta lääkettä, jotka on hyväksytty muihin kuin syöpäindikaatioissa (taulukko 1), ei osoittanut mitään tai erittäin huono estävää vaikutusta.

klusterointi kaikkien solujen lisääntymistä tiedot (kuvio 2C) vahvistettiin, että sytostaattien on suhteellisen syrjimätön aktiivisuutta kaikissa solulinjoissa. Profiilia proteasomin estäjä bortetsomibia muistuttaa sytostaattien, mikä osoittaa, että estämällä hyvin määritelty tavoite ei johda täsmähoitoihin kun kohde on yleisiin fysiologista toimintaa. Kaikista solulinjat, SHP-77 oli vähiten herkkä doksorubisiini, sisplatiini, dosetakseli, etoposidi, vinkristiini ja bortetsomibi (kuvio 2C), joka on yhteneväinen sen ilmentyminen useiden monille lääkkeille-resistenssimekanismeja [24]. HCT-15 ja DLD-1 ovat erilaisia ​​karyotyyppi, mutta ovat peräisin samasta potilaasta [25]. Johdonmukaisesti, profiilit kahdessa solulinjassa klusterin yhteen. SW-620 ja SW-480 on myös peräisin samasta potilaasta, mutta eivät klusterin yhteen, pääasiassa siksi, SW-620, joka on peräisin etäpesäke, on huomattavasti herkempi MEK inhibiittorin trametinib (kuvio 2C).

Clear epäsuorat vaikutukset ovat osoittaneet estäjä lääkkeet, kuten monet inhiboida vain muutamia solulinjoja. Joka linjat riippuu niiden vaikutusmekanismista. Esimerkiksi EGFR-inhibiittorit lapatinibi, erlotinibi ja gefitinibi klusterin yhdessä, koska ne estävät saman alijoukon solulinjoja, erityisesti AU-565, Fadu, CAL 27 ja C-33A, jotka ovat peräisin eri kudoksissa ja ovat yhteinen piirre että ne yli-ilmentävät

EGFR

(taulukko S3). ABL1 estäjät imatinibin ja nilotinib klusterin yhdessä, koska ne selektiivisesti inhiboivat solu- linjoja A-204 ja K-562, jotka ovat riippuvaisia ​​ABL1 kasvua (kuvio 2C). Kuitenkin muut kinaasi lääkkeet estävät kasvua useiden solulinjojen, kuten axitinib, ponatinib, bosutinib, sunitinibi ja crizotinib, joka klusteri yhdessä lämmön kartta (kuvio 2C), The mTOR estäjät temsirolimuusin ja everolimuusi, sekä MEK estäjän trametinib (kuva 2C). Edelleen analysoitiin solujen selektiivisyyttä estäjät, vertasimme voimakkain solu IC

50 yhdisteen, mittana tietyn solujen toimintaa, jossa keskimääräinen IC

50 täydessä paneelissa mittana yleisen solutoksisuuteen. Classic sytotoksisten hoitojen ja bortetsomibilla esittävät 10-kertainen ero keskimääräinen IC

50 solussa paneelissa ja voimakkaimpia IC

50 (kuvio 2D). Sitä vastoin useimmat estäjät oli 100-kertainen ero, ja dasatinibi jopa yli 1000-kertainen ero (kuvio 2D), jotka osoittavat, että kinaasi-inhibiittorit todellakin aikaansaada entistä parempi selektiivisyys ikkunan verrattuna klassiseen kemoterapeuttiset aineet.

Biochemical Profilointi Kliininen estäjät

suhteuttaa antiproliferatiivista aktiivisuutta estäjät huumeiden inhibitioon erityisten kinaasin tavoitteiden, kaikki yhdisteet profiloitiin yhdellä pitoisuudella paneelissa yli 300 biokemiallisia kinaasimäärityksiä (kuvio 3A, taulukko S6) [11]. Lisäksi tärkeimpien tavoitteiden, IC

50-arvot määritettiin (taulukko 1). Sillä vemurafenib, dabrafenib, trametinib, regorafenib ja cabozantinib, tämä on ensimmäinen suuri kinome profiilin julkisia. Vertailu hyväksytyn RAF-inhibiittorit vemurafenib ja dabrafenib osoittaa, että dabrafenib on paljon tehokkaampi kuin vemurafenib villityypin BRAF ja mutantti BRAF (V600E). Dabrafenib estää myös huomattavasti kinaasien (taulukko 1, kuvio 3A). Ensimmäinen profiili trametinib käy ilmi, että, koska useimmat MEK-inhibiittoreita [26], se on kauniisti selektiivinen (kuvio 3A). Regorafenib on rakenteellinen analogia sorafenibin ja esittää samanlaista biokemiallinen profiili (kuvio 3A). Regorafenib on luokiteltu voimakkaampi [18]. Kuitenkin tiedot osoittavat, että tämä pätee sen inhibition VEGFR2 tavoite angiogeenisten lääkkeiden, mutta ei PDGFRα, kohde on maha-suolikanavan strooman tuumorit, indikaatio, joka regorafenib on hyväksytty sekä (taulukko 1). Biochemical esto TIE2, toinen reseptori osallistuu angiogeneesiin, oli vähäinen, sopusoinnussa aiemman raportin (taulukko S6) [18]. Sen sijaan, regorafenib on huomattavasti lisää estävä toiminta useilla kasvaimia synnyttävän kinaasien, mukaan lukien Efriini reseptoreihin ja p70S6K, joka saattaa aiheuttaa sen ero taudinkuva [27]. Cabozantinib on luonnehdittu yhdistetty VEGFR2 MET ja RET-inhibiittori, ja se on yksi voimakkaimmista VEGFR2 estäjät (taulukko 1). Se on hyväksytty käytettäväksi medullaarinen kilpirauhassyöpä, johdonmukainen sen voimakas esto RET [28]. Kuitenkin, tämä ei ole tunnusmerkki on cabozantinib, koska kaikki kasvutekijän kinaasi reseptorin salpaajat, ja monet ABL1 inhibiittorit ovat tehokkaita RET-inhibiittoreita (taulukko S6). Cabozantinib n toimintaa MET, toinen tärkeä lääke tavoite [29], on paljon enemmän erityistä, koska crizotinib on tällä hetkellä ainoa hyväksytty lääke, joka estää tämän kinaasin.

V: hierarkkinen klusterointi estoprofiileja kaikkien kinaasin lääkkeiden paneeli yli 300 biokemialliset kinaasimäärityksiä (% -inhibition 1 uM inhibiittorin pitoisuus). Trametinib everolimuusi ja temsirolimuusi vain vähäisiä esto, koska mTOR ja MEK kinaasimäärityksiä eivät sisälly paneelissa. B: Voimakkaat biokemialliset IC

50s biologiseen kohde korreloi voimakkaampi solun IC

50s. C: Biokemiallinen selektiivisyys johtaa valikoivampia vasteen solussa paneelissa. Biokemialliset valikoivuus kvantifioitiin valikoivuus entropian [33] ja selektiivisyys kohdistaminen solujen kasvua ilmaistiin keskiarvolla IC

50 solussa paneelissa. Non-onkologialääkkeistä fasudil ja tofacitinib poistettiin analyysistä puutteen vuoksi vastausta. Avoimet ympyrät: Tällä mTOR ja MEK estäjät everolimuusia temsirolimuusi ja trametinib, vastaavasti.

biokemiallinen profiilien kaksikymmentäviisi kinaasi lääkkeitä samassa määrityksessä paneelin avulla voimme tutkia, miten biokemialliset tehokkuus ja selektiivisyys vaikutus yleinen solun kohdentaminen. Tämä on tärkeää, kuten kinaasia alalla, valikoivuus uusien lääke-ehdokkaiden on paljon keskusteltu kysymys [30] – [32]. Parannettu biokemiallisia teho korreloi parannetun solun IC

50s, ja vahvuus tämä suhde on tavoitteen riippuva (kuvio 3B). Valvomaan biokemiallisia valikoivuus, me yhteenvedon kinome profiilit laskemalla selektiivisyys entropia (taulukko 1) [33]. Alempi tämä arvo on, sitä enemmän selektiivinen yhdiste. Alhaisempi biokemiallinen valikoivuus entropia odotetaan johtavan vähemmän yleisesti solutoksisuudesta määritetty keskimääräinen solu paneeli IC

50 ja tämä on todellakin asia monille estäjien (kuvio 3C). Axitinib, ponatinib, bosutinib, sunitinibin ja crizotinib on korkea entropia (taulukko 1) ja osoittaa laaja solujen aktiivisuutta (kuvio 3C). Solu myrkyllisyys EGFR, ABL1 ja BRAF (V600E) estäjät parantaa myös yhä selektiivisyyttä (kuvio 3C). Poikkeuksia ovat mTOR ja MEK-estäjiä, jotka ovat biokemiallisesti hyvin selektiivisiä inhibiittoreita (taulukko 1, kuvio 3A), mutta inhiboida monia soluja. Tämä vahvistaa, että MEK ja mTOR ajaa leviämisen monien solulinjojen, ja osoittaa, että selektiivisyys soluvastetta riippuu myös biologiseen kohteeseen.

Genetic merkkiaineet Drug Herkkyys

tutkia biologia taustalla soluvasteita, tutkimme geneettisen tekijöitä vastaus kaksikymmentäviisi estäjä huumeet puolueettomasti. Olemme korreloi mitään eroja IC

50 by ANOVA mutaatioita, translokaatiot, mRNA yli-ilmentymisen ja DNA kopioluvun muuttuu joukko erittäin usein ja validoitu syöpä geenit (taulukko S3 ja kuviot S3 S5). Useat tiedossa oleviin kohdennettuja hoitoja käytettiin vahvistamaan solujen paneelissa tutkimuslääkkeen välineenä löydettyään uuden lääkkeen herkkyys merkkiaineita. Esimerkiksi nutlin 3a, yhdisteen stabiloiva vuorovaikutusta p53 kanssa MDM2, inhiboivat solulinjojen villityypin varten

TP53

voimakkaammin kuin solulinjat ilmentävät mutantti

TP53

(kuvio S3 ). BRAF inhibiittorit vemurafenib ja dabrafenib edullisesti inhiboivat solulinjoja, jotka sisältävät

BRAF (V600E)

mutaatio. ABL1 inhibiittorit ja EGFR: n estäjien ensisijaisesti esti solulinjoja, jotka ovat riippuvaisia ​​

ABL1

ja

EGFR

onkogeenien, vastaavasti (kuviot S4 ja S5).

Kun ANOVA, me löydetty uusi lääke herkkyys merkkiaineita MEK ja EGFR: n estäjien. MEK estäjä trametinib edullisesti inhiboi solulinjoja mutaatioita

CTNNB1

, joka koodaa transkriptiotekijää β-kateniinin (kuvio 4A). Yhdistys vahvistettiin kahden muun MEK estäjiä,

ts.

AZD6244 ja PD0925301 (kuva S6). Keskimäärin MEK-inhibiittorit olivat välillä 12 ja 37 kertaa voimakkaampi, jotka ilmentävät mutantti β-kateniinin verrattuna, jotka ekspressoivat ainoastaan ​​villityypin proteiinin. Lisäksi mielenkiintoinen havainto on, että kaikki neljä EGFR: n estäjien, kuten afatinib, ovat aktiivisempia lisääntymismäärityksissä solulinjoissa mutaation sisältävillä

Smad4

(kuva 4B ja kuva S5). Yhdistys vahvistettiin kaksi muuta EGFR: n estäjien, jotka ovat vielä kliinisessä kehityksessä,

ts.

Pelitinib ja neratinib (kuvio S7). Ero aktiivisuus EGFR estäjien

Smad4

mutantti

verrattuna

villityyppisoluilla vaihteli 2-12 kertaa.

V: MEK-estäjää trametinib ja B : EGFR-inhibiittorin afatinib. Tulivuori tontteja osoittavat keskimääräinen IC

50 shift välillä mutanttien että ei-mutanttien solulinjoissa (x-akseli) ja merkityksestä päässä Anova testi (y-akseli). Merkitys korjattiin usean testausta ja kaikkien yhdistysten kynnystason yläpuolelle (pisteviiva) joko vihreitä. Ympyröiden alat verrannollinen määrä solulinjoja mutaatioita.

Vertaamalla kohdistaminen Tehoa sisällä Inhibitor luokkiin

analyysi perintötekijöistä soluvasteen mahdollistaa vertailun spesifisyys solun kohdistaminen eri lääkkeitä, jotka on suunniteltu estämään saman molekyylitasolla, kuten EGFR, ABL1 tai BRAF inhibiittorit (taulukko 1, kuvio 5).

Jokainen ympyrä edustaa kaupan estäjä ja sen kohdesolun kasvua esto. V: Solulinjat jotka yli-ilmentävät

EGFR

. B: Solulinjat, jotka sisältävät

BRAF (V600E)

mutaatio. C: Solulinjat sisältävä poikkeava

ABL1

signalointi. Yhdisteet vasemmassa yläkulmassa tonttien on ylivoimainen kohdentamista. Tilastollisesti alan yhdistykset korjauksen jälkeen useita testejä ovat värillisiä sininen. D: kvantitatiivinen vertailu estäjän kohdistamista standardisointi IC

50 välisten siirtymien herkkien ja ei-herkkien solulinjoissa.

EGFR estäjät ovat yksi varhaisimmista esimerkeistä kohdennettuja hoitoja (taulukko 1). Gefitinibi, erlotinibi ja afatinib on hyväksytty EGFR yli-ilmentäviä keuhkosyöpä. Myös lapatinib tehoaa EGFR (IC

50, 4,9 nM, taulukko 1). Nämä inhibiittorit ovat kaikki erittäin valikoivia (taulukko 1). Lisäksi taajuuksien selektiivisiä vandetanib, bosutinib, ponatinib ja dasatinibi ovat voimakkaita EGFR-inhibiittoreita (taulukko S6). Päällekkäin yksittäisten Anova analyysit EGFR osoittaa, että selektiiviset estäjät on parempi korrelaatio

EGFR

ekspressiotasot ja suurempi teho siirtyy kuin spektri-selektiiviset estäjät (kuvio 5A). Myös EGFR erityisiä estäjät, kuten gefitinibi ja erlotinibi, on parempi kohdistettu tehokkuus kuin kaksinkertaisesti valikoivan Her2 /EGFR: n estäjien lapatinibi ja afatinib, vaikka palautumaton estäjä afatinib on voimakkain päällä EGFR. Kaikkein kohdennettu EGFR estäjä on gefitinibi (useimmat ylhäältä vasemmalta puolelta katsottuna kuviossa 5A), joka on samanlainen biokemialliset ominaisuudet kuin erlotinibi (taulukko 1). Erinomaisen kohdentaminen liittyy todennäköisesti erityisiä off-tavoite toiminta:

eli

gefitinibi on vähemmän aktiivinen ABL1 ja aktiivisempi EGFR (T290M) mutantti ja Efriini reseptorit, jotka voivat estää EGFR ylikuulumisen [34].

havainto, että kasvu monien kasvainten ohjaa tietyn mutaation BRAF onkogeenin,

eli BRAF (V600E),

on johtanut kehitystä RAF inhibiittorit vemurafenib ja dabrafenib (taulukko 1). Trametinib on estäjä MEK, joka toimii alavirran BRAF ja on rekisteröity myös BRAF mutantti syöpien [19]. Sorafenibin on tunnettu estäjä BRAF [35], mutta sitä ei ole hyväksytty BRAF-mutantti syöpien ja huonosti estää BRAF biokemiallisesti (taulukko 1). ANOVA-solulinjan profilointitiedot paljastaa vahva yhdistys antiproliferatiivista aktiivisuutta dabrafenib mutantti

BRAF (V600E) B, jota seurasi etäältä vemurafenib (kuvio 5B). Dabrafenib esti BRAF mutantti solulinjojen kanssa 284 kertaa pienempi IC

50 kuin ei-mutantti solulinjoissa. Sillä vemurafenib ero oli 3-kertainen. Ei ollut korrelaatiota solujen toimintaa sorafenibin ja

BRAF (V600E)

. Kohdistaminen teho RAF estäjien liittyy parannetun biokemiallisten tehoa dabrafenib verrattuna vemurafenib, kuten dabrafenib on vähemmän selektiivinen (taulukko 1).

Toinen tärkeä luokka estäjät lääkkeitä ovat ne, jotka kohdistuvat ABL1, joista uudelleen järjestetty muotoon,

eli

BCR-ABL1, drives Philadelphia-kromosomi-positiivinen krooninen myelooinen leukemia (KML). Imatinibi, nilotinibi, dasatinibi, ponatinib ja bosutinib hyväksytään lääkkeitä tähän tarkoitukseen. Kuitenkin myös monet kasvutekijän estäjät, kuten crizotinib, vandetanib, axitinib ja sunitinibille ovat tehokkaita ABL1 inhibiittorit (kuvio 3A, taulukko S6). ANOVA tasyöpäsolulinja profilointitiedot paljastaa vahva yhdessä

ABL

-riippuvaisella solujen kasvua kaikissa KML-hyväksytty estäjät, paitsi bosutinib (kuvio 5C). Dasatinibi näyttää voimakkain IC

50 shift, joka voidaan osoittaa ylivoimaisen tehon. Koska dasatinibin spektri valikoiva ja estää niiden kasvun monista eri solulinjojen, merkitys (p-arvo) yhdistyksen on alhainen. Kaikkein kohdennettuja ABL1 estäjä kuviossa 4C on oikeastaan ​​kaikkein valikoiva ABL1 estäjä imatinibi (taulukko 1).

kvantifiointi Cancer Gene Targeting

Edelleen vertailla estäjät, kehitimme määrällinen mitta syöpä geenikohdistus pohjalta solun paneeliaineistoon ja vasteen analysointi. Keskimääräinen IC

50 shift (ΔIC

50) yhdisteen, että Anova analyysit otettiin perusteella, koska se tarkoittaa eroa teho yhdisteen välillä herkkä (mutantti) ja tunteeton (villityypin) solu linjat. Toinen tärkeä parametri on jäljellä välinen varianssi IC

50s villityypin tai onkogeeni kantavan ryhmän solulinjojen (σ

mut

tai

paino

), joka osoittaa muita vaikutuksia solujen kasvuun lisäksi pääasiassa inhibiittorin avulla. Yhdistää molemmat arvot valitsimme standardoidun keskimääräinen ero (SMD) kvantitatiivinen työkalu, joka lasketaan ΔIC

50 /. Sillä kliinisesti käytetty EGFR, ABL1 ja BRAF estäjä huumeet tämä määrä osoittaa selvästi, että dabrafenib ja imatinibi ovat poikkeuksellisen kohdennettuja ja että gefitinibi ja erlotinibi ovat lähellä yhtä (kuvio 5C), mikä viittaa siihen, että SMD IC

50s on hyvä työkalu listalla kohdistamista huumeiden ehdokkaiden ja olemassa oleviin hoitomuotoihin.

dedusoiminen Optimal Kinome Profiilit

on väitetty, että erityiset rajat reaktiivisuus lisäksi ensisijainen biokemiallisia toimintaa, voidaan myönteisesti edistää solun kohdentaminen estäjät estämällä vastustuskyky tai palautetta signalointi [32], [36], [37]. Monet tutkimusryhmät ovat yrittäneet suunnitella erityisiä, dual-aktiivisuutta, tai jopa usean aktiivisuuden estäjät [31], [38], [39]. Kuitenkin kysymys joka inhibiittoriprofiili on kaikkein paras määrittää erityistä geneettistä kuljettaja ei ole vastattu. Käyttämällä solun ja biokemiallisia tietoja, olemme alkaneet johtaa tällaisen ”optimaalisen” biokemiallisia profiileja solukohteita.

Kun otetaan huomioon ABL1 estäjien (taulukko 1), ensin etsittiin mitään biokemiallisia toimintaa, lisäksi eston of ABL1, jotka saattavat edistää kohdistaminen tehosta lääkkeen luokan. Kaksikymmentä asiaa kinaaseja, mukaan lukien kaikki kohteet tällä hetkellä hyväksytty estäjä huumeet, valittiin ehdokkaiksi, jotka saattavat antaa hyödyllisiä sivutoimintaa. Jos jokin näistä kinaasien inhiboi tahansa 25 estäjät lääkkeet ( 80% taulukossa S6), parin oli merkitty ”aktiivinen”, muuten ”aktiivinen”. Tuloksena biokemiallinen aktiivisuus matriisi käytetään ANOVA yhdessä solukohdistuskeskuksia SMDs (kuvio 5D) tunnistaa biokemiallisia toimintoja, jotka kohdistuvat solu- linjat, jotka kantavat

ABL1

onkogeeni. Sen lisäksi, että odotettavissa tunnistaminen ABL1, tämä analyysi paljasti yllättäen ABL2 (ARG), kuten merkittäviä sivuvaikutuksia-aktiivisuutta (kuvio 6A). Tämä havainto vahvistettiin käyttämällä joustava verkko regressioanalyysiä (ei kuvassa), ja ABL2 edelleen validoitu tutkimalla erillinen aineisto sitovien K

ds [12], jossa vahvistetaan, että ABL2 sitova augments kohdistaminen tehoa ABL1 estäjien solussa line paneeli (kuvio 6B). Osuus ABL2 selittää bosutinib, joka on voimakas inhibiittori ABL1 mutta siitä puuttuu ABL2 aktiivisuus, on suhteellisen heikko kohdistuksen teho on

ABL1

onkogeenin kuljettavien solujen verrattuna muihin ABL1 inhibiittorit (kuvio 5C).

: Biochemical osat kinaasin estäjiä, jotka edistävät kohdentaminen

ABL1

riippuvaista solukasvua. Ympyrä merkitty ABL1 viittaa biokemiallisia ABL1 esto. B: n estäjät yhtä ABL1 ja ABL2 affiniteetti riippumattomalla aineisto [12] ovat paremmat kohdistaminen

ABL1

-riippuvaisella solukasvua kuin estäjien kanssa ABL1 aktiviteetti yksin. Huono ABL2 affiniteetti tarkoittaa ryhmää sitova K

d eroja 4 ja 26-kertainen verrattuna ABL1. Equal affiniteetti tarkoittaa ryhmää sitova K

d erot 0,5 ja 4-kertainen.

Keskustelu

kehitys selektiivisten estäjien on johtanut useita läpimurto lääkkeiden geneettisesti hyvin -defined potilasryhmissä [2], [40]. Tukemaan seuraavan sukupolven kohdennettujen estäjät, olemme suorittaneet perusteellisen analyysin solu- ja biokemiallisten paikan tavoite tehosta kaikkien estäjät kliinisessä käytössä (marraskuu 2013), rinnakkaisilla profilointi kaikkien yhdisteiden paneeli neljäkymmentäneljä solulinjojen ja suuri kinaasimääritys paneeli (kuviot 2 ja 3).

Ensinnäkin analyysi huomaamme, että siellä on potentiaalia uusille sovelluksille hyväksyttyjen kohdennettujen estäjät (kuviot S4 ja S5). Havaitsimme uusi lääke herkkyys merkkiaineita MEK ja EGFR: n estäjien. MEK-inhibiittorit olivat 12-37 kertaa aktiivisempia soluissa kätkeminen mutatoitunut

CTNNB1

(kuvio 4A). Vaikka MEK inhibiittorit sisällytettiin solussa paneelissa profilointi tutkimuksissa Sanger Centre [4], ja Broad-instituutin [5], yhdistys MEK eston ja

CTNNB1

ei havaittu näissä tutkimuksissa. [54].