Krooninen sairaus

tiivistelmä

Six1 on yksi transkriptiotekijöiden, jotka toimivat isäntä säätelijöinä kehityksen ja usein väärin säädellystä syövissä. Kuitenkin rooli Six1 haimasyövän ei ole selvä. Täällä näytämme, että suhteellinen ilmentyminen Six1 mRNA lisääntyy haimasyövän ja korreloivat kehittynyt kasvain vaiheessa.

In vitro

toiminnalliset analyysit osoittavat, että pakko yliekspressio Six1 parantaa merkittävästi kasvua ja lisääntymistä kyky haiman syöpäsoluja. Pudotus endogeenisen Six1 vähentää näiden solujen dramaattisesti. Lisäksi Six1 edistää kasvua haiman syöpäsoluissa ksenograftin määrityksessä. Lisäksi osoitetaan, että geeni, joka koodaa sykliini D1 on suora transkription kohteena Six1 haiman syöpäsoluissa. Yliekspressio Six1 ylössäätelee sykliini D1 mRNA: ta ja proteiinia, ja merkittävästi parantaa aktiivisuutta sykliini D1-promoottorin PANC-1-soluissa. Osoitamme, että Six1 edistää solusyklin etenemisen ja lisääntymistä säätelyä sykliini D1. Nämä tiedot viittaavat siihen, että Six1 yliekspressoituu haimasyövän, ja se voi myötävaikuttaa lisääntyneeseen solujen lisääntymisen kautta säätelyä sykliini D1.

Citation: Li Z, Tian T, Lv F, Chang Y, Wang X, Zhang L, et ai. (2013) Six1 Edistää leviämisen haimasyöpäsoluissa kautta lisääntymisen merkkejä sykliini D1 Expression. PLoS ONE 8 (3): e59203. doi: 10,1371 /journal.pone.0059203

Editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 23 marraskuu 2012; Hyväksytty: 12 helmikuu 2013; Julkaistu: 20 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat varoja kansallisista Natural Science Foundation of China (NSFC, NO 81172118) ja avustuksina Kiinasta Postdoctoral Science Foundation (ja LZM). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvän kuolleisuuden eri puolilla maailmaa [1]. Se on usein huono ennuste puutteen vuoksi luotettavia varhaisen diagnostisten menetelmien ja tehokas hoito [2]. Siksi on välttämätöntä parantaa ymmärrystämme molekyylimekanismeja haimasyövän kasvaimen kehittymisen ja kehittää tehokkaita hoitomuotoja.

Six1 on nisäkkään homologi Drosophilan sini oculis geeni ja on hyvin konservoitunut Drosophila kohteeseen ihmisillä [3], [4]. Se ilmentyy laajasti monissa kudoksissa aikana varhaisessa kehitysvaiheessa, kun taas sen ilmentyminen on vähän tai ei ollenkaan useimmissa aikuisen kudoksissa [5]. Aikana varhaisessa kehitysvaiheessa, Six1 edistää kantasolujen lisääntymistä ja selviytymisen kautta aktivointia tai tukahduttaminen monipuoliset alavirran kohdegeenien [3], [6]. Se on myös tärkeä rooli solujen maahanmuuton ja invaasion alkionkehityksen aikana induktion epiteeli- mesenkymaalitransitioon (EMT) [7], [8]. Oikea tämän geenin ilmentyminen on kriittinen kehittämistä erilaisten elinten, kuten aivot, korva, silmä, lihas, munuaiset aistien rakenteita, ja kallon rakenteiden [7], [9], [10]. Sen lisäksi, että asema Six1 varhaisessa kehitysvaiheessa, se on usein misexpressed eri kasvainten, kuten rintasyövän [5], [11], Wilmsin kasvaimia [12], rabdomyosarkoomiin [13], maksasyövän [14], munasarjojen syöpä [15], [16], ja kohdunkaulan syöpä [17], [18]. Vielä tärkeämpää on, misexpression on Six1 syövän voi aiheuttaa kehitysohjelmiin asiayhteydestään, edistää kasvaimen syntyyn ja etenemiseen [19], [20]. Viime aikoina jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että yli-ilmentyminen Six1 helpottaa Rintasyövän metastaasin kautta TGF-β signalointia, epiteeli- mesenkymaalitransitioon [21], ja indusoimalla imusuonten kautta säätelyä VEGF-C: [22]. Esto endogeenisen Six1 ilmentymisen estää kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden maksasolusyövän [23].

Kuitenkin rooli Six1 haiman syöpää, on tuntematon. Kriittinen rooli Six1 käynnistymiseen ja etenemiseen lukuisten syöpien pakotti meidät tutkimaan toimintaa Six1 haimasyövän. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että Six1 yliekspressoituu haimasyövän ja korreloivat kehittynyt kasvain vaiheessa. Käyttämällä

in vitro

ja

in vivo

funktionaalisia määrityksiä osoitamme, että pakko yliekspressio Six1 poikkeavasti edistää leviämisen, edistää haiman kasvaimien syntyyn. Osoitamme myös, että geeni, joka koodaa sykliini D1 on suora transkription kohteena Six1 haiman syöpäsoluissa. Lisäksi osoitamme, että Six1 edistää solusyklin etenemisen ja lisääntymistä säätelyä sykliini D1.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

kerääminen kudosnäytteiden hyväksyttiin ja valvottu jonka Research eettisen komitean Zhengzhou yliopistosta. Kirjallinen suostumukset saatiin kaikille potilaille tarjotaan näytteitä. Eläinkokeet ja ksenografti kasvainmuoto hyväksyttiin ja valvoma Research Ethics komitea Zhengzhou yliopistosta.

Cell Culture

Ihmisen haiman sinoomasolulinjoja PANC-1 (CRL-1469) ja MIA PaCa-2 (CRL-1420) saatiin American Type Culture Collection ATCC: ltä (Rockville, MD, USA). Kaikkia solulinjoja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (Hyclone, Logan, UT, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone, Logan, UT, USA), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 0,1 mg /ml streptomysiiniä (Invitrogen , Kalifornia, USA), 5% CO

2 ilmakehässä 37 ° C: ssa.

ihmisestä otettujen kudosnäytteiden

Ensisijainen haiman kasvain (n = 51) ja viereisen ei-tuumorikudoksia (n = 13) kerättiin vuosina 2005 ja 2010 potilasta, joilla resektoidun ensisijainen haimatiehyen adenokarsinoomat First Affiliated sairaala Zhengzhou yliopistosta. Viereisen ei-kasvainkudoksessa saatiin segmentti resektoitua yksilöt oli kauimpana kasvain (yli 5 cm). Kudokset olivat flash jäädytetty heti leikkauksen jälkeen. Ei edellistä paikallista tai systeemistä hoitoa oli suoritettu näiden potilaiden ennen leikkausta. Kaikki tiedot kuten ikä, sukupuoli, kasvaimen koko, sijainti, vaihe, erilaistuminen, hermoa invaasio ja imusolmuke tila saatiin alkuperäisestä patologiaraporteista. Patologinen lavastus päivitettiin Yhdysvaltojen nykyistä sekakomitean Cancer suuntaviivoja. Geeniekspressioon Six1 saatiin kunkin haimakasvaimesta, ja kaikki näytteet tarkoita keskitetty. Sen jälkeen näytteet jaettiin kahteen ryhmään edelleen analyysi: Näytteet, joissa Six1 ilmentyminen oli keskimääräistä suurempi (Six1 ”korkea”), ja loput näytteet (Six1 ”alhainen”). Kirjallinen suostumukset saatiin kaikista potilaista ja tämän tutkimuksen hyväksyi Research Ethics komitean Zhengzhou University (Zhengzhou, Kiina).

Plasmidit valmistelu sekä vakaiden Solulinjat

Ihmisen Six1 cDNA oli monistettiin ihmisen luuston lihaksen RT-PCR (RT-PCR). Ihmisen luuston lihaskudosta saatiin normaalista ympäröivää kudosta marginaali sarkooma resektio yksilöitä. Yksityiskohtaiset reaktio-olosuhteet PCR suoritettiin edellisen raportin [5]. Six1 cDNA subkloonattiin sitten plasmidiin pcDNA4 /TO (Invitrogen, Kalifornia, USA). pCMV-sykliini D1 saatiin Sevicebio (Wuhan, Kiina). pcDNA4 /TO-Six1 ja pCMV-sykliini D1 puhdistettiin suuressa mittakaavassa käyttäen EndoFree Plasmid Maxi (Qiagen, Saksa) transfektioon. PANC-1 tai MIA PaCa-2-soluja siirrostettiin kuusi kuoppalevylle ja transfektoitu pcDNA4 /TO-Six1 käyttämällä Lipofectamine 2000 reagenssia valmistajan suosittelema (Invitrogen, Kalifornia, USA). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektioiden jälkeen solut siirrostettiin ja valitaan käyttämällä 100 ug /ml tseosiinia ja 2 viikkoa, ja sitten sai pcDNA4 /TO-Six1 stabiilit solulinjat.

RNA Interference

sirna (siRNA) -välitteisen säätelyä alaspäin Six1 tai sykliini D1, seuraavat siRNA sekvenssit hankittiin Ribobio Company, Guangzhou, PRChina). Sekvenssit Six1 kohdennetun siRNA ovat 5′-AGAACGAGAGCGUACUCAA-3 ’tai 5′-GGGAGAACACCGAAAACAA-3′; sekvenssi sykliini D1 suunnattu siRNA on 5’-GTTCATTTCCAATCCGCCC-3 ’tai 5′-GCCGAGAAGUUGUGCAUCUUU-3’. PANC-1 ja MIA PaCa-2-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille, kasvatettiin 50% konfluenssiin ja transfektoitiin siRNA: lla tai sekoituskoodin ohjaus siRNA (toimittanut Ribobio Company, Guangzhou, Kiina) dupleksit lipofektamiinia 2000 (Invitrogen, Kalifornia, USA ) mukaan valmistajan suositusten. 20 nM siRNA: t käytettiin kuoppaa kohti ja soluja inkuboitiin vielä 48-72 tuntia ennen korjatun proteiinin uutto ja immunoblot-analyysillä.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen RNeasy mini kit mukaan valmistajan ohjeiden (Qiagen, Saksa). Määrä ja puhtaus eristetyn RNA kvantifioitiin NanoDrop 1000 spektrofotometrillä (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) aallonpituuksilla 230, 260 ja 280 nm: ssä. Vain RNA näytteitä 260/280 suhde 1,9-2,1 ja 260/230 suhde 2,0-2,5 olivat hyväksyttäviä tarkempaa analysointia varten. Eheyden kokonais-RNA arvioitiin visualisoinnin 18S ja 28S ribosomaalinen RNA kuviot denaturoivalla agaroosigeelillä (Qiagen, Saksa). Ja terävä, selkeä 28S ja 18S rRNA bändejä ja 28S /18S suhde kaksi pidetään hyvälaatuista RNA. Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin käyttäen SuperScript® III Ensimmäisen Strand Synthesis mukainen järjestelmä valmistajan ohjeiden (Invitrogen, Kalifornia, USA). Kvantitatiivinen PCR tehtiin käyttämällä SYBR Green väriainetta Applied Biosystems 7300 Reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems, Foster City, CA). Lyhyesti, 10 ui RNA /aluke seos valmistettiin steriiliin 0,2 ml putkeen seuraavasti: 0,5 ug kokonais-RNA: ta, 1 ui Oligo (dT)

20 (50 uM), 1 ui 10 mM dNTP-seosta ja DEPC-käsiteltyä vettä siten, että lopullinen tilavuus on 10 ui. Seosta inkuboitiin sitten 85 ° C: ssa 5 minuutin ajan ja jäähdytettiin jäillä vähintään 1 minuutin ajan ennen kuin lisätään 10 ui cDNA Synthesis Mix (2 ui 10 x RT-puskuria, 4 ui 25 mM MgCl

2, 2 ui 0,1 M DTT, 1 ui RNaseOUT ™ ja 1 ui SuperScript® III käänteistranskriptaasi). 20 ui Käänteiskopiointireaktio inkuboitiin 50 ° C: ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen 85 ° C: ssa 5 min. RNA-templaatin poistettiin lisäämällä 1 ui RNaasi H: ta ja inkuboimalla 37 ° C: ssa 20 min. Kvantitatiivinen PCR tehtiin käyttämällä SYBR Green väriainetta Applied Biosystems 7300 Reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems, Foster City, CA). Määrällinen PCR suoritettiin 12,5 ui 2 x SYBR Green PCR perusseosta (Tiangen Biotech, Peking, Kiina), 1 ui templaatti-cDNA, 200 nM kutakin monistusalukkeen ja DEPC-käsiteltyä vettä siten, että lopullinen tilavuus on 25 ui. Reaktioita inkuboitiin 96-kuoppaisilla optinen levy 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 40 sykliä 94 ° C: ssa 15 s ja 60 ° C: ssa 30 s. Kynnyssykli (C

T) dataa määrätty käyttämällä oletus kynnysasetusten. C

T on määritelty murto-syklin, jossa fluoresenssi kulkee kiinteän kynnysarvon. Reaaliaikaisen PCR analysoitiin vertaileva C

T-menetelmä [24]. Kaikki reaktiot suoritettiin kahtena kappaleena ja steriiliä vettä testattiin yhdessä näytteen negatiivisena kontrollina. Geelielektroforeesi suoritettiin vahvistaa yksinomaan vahvistus odotetun PCR-tuotteen. Alukesarjat olivat seuraavat: geenien Glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3 ’ja 5′-GGCTG TTGTCATACTTCTCATGG-3′; ja Six1, 5’-AAGGAGAAGTCGAGGGG TGT-3 ’ja 5′-TGCTTGTTGGAGGAGGAGTT-3′; sykliini D1, 5’-GCTGCGAAGT GGAAACCATC-3 ’ja 5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3’.

analyysi Microarray Data

Oncomine Cancer Microarray tietokantaan [25] (http: //www .oncomine.org) käytettiin tutkimaan geenin ilmentymisen Six1 ihmisen haimasyövän näytteitä kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. Geenien ilmentyminen tietoja saatiin myös NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) tietokantaan (hakunumerot GSE15471, GSE32676 ja GSE28735; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) [27] – [29]. Expression tiedot Six1 ja sykliini D1 oli log-transformoituja, mediaani keskitetty ryhmää kohti, ja keskihajonta normalisoitiin yhtä ryhmää kohti.

Western Blot analyysi

Western blot -analyysi suoritettiin kuten me aikaisemmin kuvatulla tavalla [30]. Lyhyesti, solut hajotettiin kylmää hajotuspuskuria [Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl

2, 0,5% Triton X-100, fosfataasi-inhibiittori-seosta (1 mM NaF, 1 mM Na-

3Vo

4 ja 1 mM β-glyserofosfaatti), ja proteaasi-inhibiittorin seosta (1 mM PMSF, 2 ug /ml aprotiniinia, 1 ug /ml leupeptiiniä ja 1 ug /ml pepstatiini A: ta)]. Lysaatit clarifed sentrifugoimalla 10000 x g 20 min. Proteiinit (10-25 ug) erotettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin nitroselluloosakalvoille (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Membraani blokattiin TBS-T-puskuria (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl ja 0,05% Tween-20), joka sisälsi 5% (w /v) rasvatonta maitoa huoneenlämpötilassa 1 tunti ja sitten tutkittiin vasta-aineiden kanssa Six1, sykliini A, sykliini B1, sykliini E, GAPDH (kaikki Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA), Phospho-Rb (# 8516, Cell Signaling Technology), Rb (# 9313, Cell Signaling Technology ) ja sykliini D1 (# 2926, Cell Signaling Technology) 4 ° C: ssa yön yli. Detection suoritettiin SuperSignal West Femto Suurin herkkyys Alustan Trial Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Bändi Kuvat otettiin digitaalisesti ja määrällisesti kanssa FluorChem FC2 kuvantamisjärjestelmä (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

MTT ja solumäärämäärityksessä

Tuhat solut ympättiin 96 kuoppaiset soluviljelylevyille ja inkuboitiin 37 ° C: ssa eri aikoja. Sitten 20 ui MTT: tä (liumbromidi, 5 mg /ml, GE Healthcare), lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Elatusaine poistettiin ja 150 ui DMSO: ta lisättiin liuottamaan kiteet 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, ja absorbanssi 570 nm: ssä luettiin ELISA-levyn lukijaa (malli 680, Bio-Rad, CA). Solun laskenta, solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille inkuboitiin 37 ° C: ssa eri aikoja ja poistetaan sitten trypsinoimalla ja elävien solujen lukumäärä laskettiin hemosytometrillä käyttämällä trypan blue-värjäyksellä. Jokainen näyte mitattiin kolmena kappaleena ja toistettiin kolme kertaa.

BrdU

Soluja altistettiin 10 uM BrdU (BD Biosciences, Mountain View, CA) 30 minuutin ajan ja kiinnitetään 70% etanolilla , ja pestiin sitten PBS: llä, suspendoitiin uudelleen ja inkuboitiin 4 N HCl ja 0,5% Triton X-100: ssa 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. PBS-pesun jälkeen solut neutraloitiin 0,1 M natriumboraatti, ennen kuin leimattu FITC-konjugoitua BrdU-vasta-ainetta (BD Biosciences, Mountain View, CA) ja inkuboitiin 50 ug /ml propidiumjodidia (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO ) mukaan valmistajan protokollan ennen kuin analysoitiin Becton Dickinson FACStar Plus-virtaussytometrillä.

Colony muodostumisen määritys

kuusisataa solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle. 14 päivän jälkeen solut värjättiin 0,5% kristallivioletilla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) metanolissa 10 minuutin ajan. Pesäkkeet (yli 50 um halkaisijaltaan) laskettiin suoraan levyllä. Tilastollinen merkitsevyys laskettiin vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Reporter määritykset

Panc-1-soluja maljattiin 24-kuoppalevyille 100000 solua /kuoppa, ja annettiin kasvaa normaaleissa viljelyolosuhteissa. 80% con fl uency, solut transfektoitiin ekspressiovektoreilla (Six1 tai tyhjä vektori), täyspitkä ihmisen sykliini D1-promoottori (-1745D1 /LUC, -1745-155) [31] ja renilla reniformis lusiferaasin ekspressiovektori PRL-TK (Promega, Madison, WI, USA). Moolisuhde PRL-TK pGL3-reportterin vektori oli 1: 10. Sitten lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut hajotettiin 48 tunnin jälkeen 500 ui 1 x Passive Lysis Buffer (Promega) kuoppaa kohti, inkuboidaan 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja solujäte poistettiin sentrifugoimalla. 50 ui supernatanttia sekoitettiin 50 ui Dual-Glo reagenssia I (Promega) ja palo fl y lusiferaasin luminesenssi mitattiin GloMax® 20/20 Luminometer (Promega, Madison, WI, USA). 50 ui Dual-Glo-reagenssia II (Promega) lisättiin ja Renilla lusiferaasin luminesenssi määritettiin. Suhteellinen valoyksiköitä laskettiin Renillaa /fire fl y luminesenssi kolmesta kaivosta ja normalisoitu negatiiviseen kontrolliin.

Kromatiini Immunosaostaminen (chip) määritys

sirulle analyysit suoritettiin käyttäen sirun iinianalyysikitissä ( Upstate Biotechnology, Inc., Lake Placid, NY), kuten valmistaja ehdottaa. Brifely solut (15 cm viljelymalja, noin 1,0 x 10

7 solua) kiinnitettiin 1% formaldehydiin 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen pestään kaksi kertaa 20 ml: lla kylmää 1 x PBS: llä ja otettiin talteen kaapimalla. Sentrifugoinnin jälkeen solupelletit hajotettiin 1 ml: ssa SDS: ää Lysis Buffer sisältävät proteaasiestäjäseostabletit II. Solulysaatti sonikoitiin märällä jäällä neljä kertaa 15 sekuntia joka kerta välein 15 sekunnin saada chromatin fragmentteja noin 200-1000 bp nukleotidin. Sentrifugoitiin 12000 x g 4 ° C: ssa 10 minuutin ajan liukenemattoman materiaalin poistamiseksi, ja sitten poistetaan supernatantti tuoretta mikrofuugiputkiin 100 ul: n eriä. Kukin 100 ui supernatantteja laimennettiin 900 ui ChIP laimennus- puskuria ja esi-inkuboitiin proteiini G-agaroosia 4 ° C: ssa 1 tunnin ajan, ja sitten pelletoidaan agaroosi sentrifugoimalla lyhyen aikaa ja poistetaan 10 ui (1%) supernatantin Input. Supernatantit inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli 5 ug Six1 (sc-9709, Santa Cruz), RNA-polymeraasi II-vasta-aineen (Pol II, sc-56767, Santa Cruz), ja normaali IgG, (sc-2028, Santa Cruz) inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa pyörittämällä ja sitten lisättiin 60 ui proteiini G Agarose kuhunkin putkeen ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa rotaatiossa. Sentrifugoinnin jälkeen poistettiin supernatantti ja pestään proteiini G agaroosi-vasta-aine /chromatin kompleksin suspendoimalla helmet 1 ml kussakin Vähäsuolainen /Korkea Suola /LiCl immuunikompleksipesupuskuri Wash Bufferwash puskuri yhden kerran, minkä jälkeen pestään kahdesti TE-puskuria. Viimeisen pesun immunopresipitaatit eluoitiin ja kääntää silloitettu inkuboimalla yön yli 65 ° C: ssa eluutiopuskuria. Sitten DNA puhdistettiin PCR-puhdistuskittiä (Qiagen, Hilden, Saksa). Immunosaostettiin DNA: t analysoitiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä käyttäen seuraavia alukkeita: sykliini D1-promoottori (-1189–985), 5′-AGGAACCTT CGGTGGTCTTG-3 ’ja 5′-CCTTGACCAGTCGGTCCTTG-3′; sykliini D1-promoottori (-348–190), 5’-CTCAGGGATGGCTTTTGGGC-3 ’ja 5′-ACTCCCCTGTAGT CCGTGTG-3′; positiivisen kontrollin GAPDH-geenin proksimaalinen promoottori, 5’-TACTAGC GGTTTTACGGGCG-3 ’ja 5′-TCGAACAGGAGGAGCAG AGAGCGA-3’.

Hiiri ksenograftimallia

BALB /c (6-8 viikkoa vanha) kateenkorvattomia nude-hiiriä ostettiin Experimental Animal Center of Henanin maakunnassa (Zhengzhou, Kiina). Hiiret majoitettiin viidessä /häkin mikroisolaattorihäkkeihin yksiköissä alle kosteus ja lämpötila valvotuissa olosuhteissa 12 tunnin valo-pimeä jaksoissa. Siellä ruokittiin tavallisella steriilillä laboratoriossa ruokavalio (Zhengzhou University, Zhengzhou, Kiina) vähintään kolme päivää ennen käyttöä. Eläinten terveys tutkittiin ennen kasvaimen istutuksen ja satunnaistamisen varmistaa, että vain eläimiä ilman mitään sairauden oireita valittiin tulla testausmenetelmiä. Kokeiden aikana eläimet tarkkailtiin kahdesti päivässä koskien tuumorikuorma, yleiskunto, ruoka ja vesi. Hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään ja injektoidaan ihon alle kylkeen alueilla, joilla on 5,0 x 10

6 solua 0,1 ml: ssa PBS: ää. Ryhmä 1 (vektorisäätö) injektoitiin PANC-1-soluja, jotka oli stablely transfektoitu pcDNA4 /TO; ryhmä 2 (Six1) ruiskutettiin PANC-1-soluja, jotka oli stablely transfektoitu pcDNA4 /TO-Six1. Kun neula oli ruiskutetaan ihon alle, pidetään neula samansuuntainen eläimen kehon välttää lävistyksen olevat rakenteet ja aspiroitiin ruisku, jotta neula ei ole osunut verisuoneen. Kasvaimen koko mitattiin joka 5. päivän jarrusatulat. Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla: (pituus x leveys

2) /2. Viisi viikkoa istutuksen jälkeen, kasvain alkoi näkyä implantaatiokohdassa 400 ja 800 mm

3 tilavuudessa. Hiiret lopetettiin tukehtumisen on CO

2 kammioon ja tuumorit leikattiin tavallisilla pihdit, sakset, ja kirurgiset terät. Kaikki toimenpiteet suoritettiin mukaisesti Animal Care ja käyttö komitean ohjeiden Zhengzhou yliopistosta.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± s.e.m. Ryhmien välillä ja keskuudessa ryhmien vertailut tehtiin Studentin t-testi ja ANOVA, vastaavasti. U-testi käytetään epäparametrisia muuttujia. Yhdistys Six1 mRNA ilmaisun ja kliinis ominaisuudet kuten ikä, sukupuoli, kasvaimen koko, sijainti, vaihe, erilaistuminen, hermoa invaasio ja imusolmuke tila analysoitiin joko Chi-neliö tai Fisher kaksiosaisella tarkka testi. Spearmanin arvioitiin tarkastaa yhdistyksen välillä ekspressiotasot Six1 ja sykliini D1 log-muunnettuja arvoja. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen GraphPad Prism-ohjelmiston version 4.0 (PRISM4) (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA), ja

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Six1 yliekspressoituu haimasyövän ja korreloi Advanced kasvaimen vaihe

roolin tutkimiseksi Six1 haiman syövän kehittymisessä, testasimme ilmentyminen Six1 51 haimatiehyen adenokarsinoomia ja 13 vieressä ei-kasvain haiman kudosnäytteistä kvantitatiivisin Reaaliaikainen RT-PCR. Ekspression Six1 mRNA: haimatiehyen adenokarsinoomat näytteissä oli merkittävästi suurempi kuin viereisen ei-kasvain haiman kudoksista normalisoinnin jälkeen käyttämällä GAPDH (

P

0,01) (kuvio 1A). Tutkimme lisäksi ilmaus Six1 kyselemällä ONCOMINE tietokantaan. Neljässä microarray ilmaisun tutkimuksessa [28], [32] – [34], ilmentyminen Six1 mRNA on huomattavasti korkeampi haimasyövän kudoksissa kuin viereisen ei-kasvain haiman kudoksista; mRNA tasot nousevat välillä 1,5- ja 11,2-kertaisesti (kuvio 1 B). Voidaan todeta, että ei-kasvainkudoksessa vieressä pahanlaatuinen haimasyöpä ei ole normaalia haimakudos, ja sen vuoksi tulokset eivät välttämättä osoita todella ekspressiota normaalin haiman kudoksen.

(A) suhteellinen mRNA: n ekspression taso Six1 määritettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä 51 haimatiehyen adenokarsinoomia ja 13 vieressä ei-kasvain haiman kudosnäytteistä. Tulokset normalisoitiin ilmentymistason GAPDH mRNA: n kussakin näytteessä. *

P

0,05. (B) ONCOMINE tietokannan avulla analysoitiin aiemmin julkaistu microarray data. Tasot Six1 mRNA lisääntyvät haimasyövän verrattuna viereisen ei-kasvain haimakudoksesta. Kaikki tulokset, mukaan lukien

p

-arvoja, laskettiin ONCOMINE tiedot. N, vieressä ei ollut kasvainta haimakudoksesta; T, haimatiehyen adenokarsinoomat; *

P

0,05.

geeniekspressiomalli of Six1 vuonna haimatiehyen adenokarsinooman verrattiin niiden kliinis ominaisuudet (taulukko 1). Yliekspressio Six1 mRNA korreloi merkitsevästi kasvaimen vaiheessa (

P

= 0,018). Noin 67% (18 27) on edennyt pitkälle (III IV) haimatiehyen adenokarsinoomien havaittiin yli-ilmentää Six1. Ei ole mitään merkittävää yhdistyksen välillä Six1 ja ikä, sukupuoli, kasvaimen koko, sijainti, erilaistuminen, hermoa invaasio ja imusolmuke tila (kaikki

P

0,05, taulukko 1).

Six1 Edistää kasvu haimasyöpäsoluissa

in vitro

ja

in vivo

jotta tutkia toiminnallista roolia Six1 haimasyövän, tutkimme vaikutus Six1 ilmentymisen vaikutus leviämisen molempien PANC-1 ja MIA PaCa-2-soluissa. Solut transfektoitiin stabiilisti joko pcDNA4 /TO-Six1 tai valvontaa vektoriplasmideista. Western blot-analyysi vahvisti, että ilmentyminen Six1 kasvoi sekä PANC-1 ja MIA PaCa-2-solut transfektoitiin pcDNA4 /TO-Six1, verrattuna niihin, jotka oli transfektoitu kontrollivektorilla (kuvio 2G ja kuvio S1A).

Cell numerot (A), prosenttiosuus BrdU-positiivisten solujen (B) ja pesäkkeiden lukumäärä (C) PANC-1-solut transfektoitiin stabiilisti joko Six1 tai ohjaus plasmideja. Yhtenäinen viiva, valvonta; katkoviiva, Six1. D, lukumäärä PANC-1-solut transfektoitu Six1 siRNA ja ryntäily valvontaa. Yhtenäinen viiva, scramble ohjaus siRNA; katkoviiva, Six1 siRNA.

E, kasvaimen koko ihonalaisen ksenograftien mitattujen 5 päivän välein. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa: (pituus x leveys

2) /2. F, edustaja ihonalainen tuumoriksenografteja syntyy hiirillä

5 viikkoa

inokulaation jälkeen (ylempi paneeli), ja

paino kasvaimet (

alempi paneeli

). G, ilmentyminen Six1 sekä PANC-1 ja MIA PaCa-2-soluissa määritettiin western blot-analyysit. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena; baareja, SEM .; *

P

0,05.

Solulisääntyminen arvioitiin suoralla solujen määrä, MTT

kasvun määrityksessä

, BrdU, ja pesäkemuodostusta. Sekä MIA PaCa-2 ja Panc-1 soluja käytettiin. Mukaan solujen määrä tuloksia, leviämisen nopeus solut yli-ilmennetty Six1 oli merkittävästi korkeampi kuin kontrollisolujen; Lisää Six1-transfektoituja soluja, havaittiin 4, 5, ja 6 päivää sen jälkeen, kun pinnoitus (*

P 0,05

, kuvio 2A).

MTT kasvun määrityksissä

osoittivat, että solun kasvu lisäsi merkittävästi sen jälkeen, kun yli-ilmentyminen Six1 (*

P 0,05

, kuva S1B). Vuonna BrdU, numerot BrdU-positiivisten solujen kontrolli ja pcDNA4 /TO-Six1 ryhmässä oli 29,3% ± 1,7% ja 44,0% ± 1,1%, tässä järjestyksessä (*

P

0,05, kuva 2B ). Vuonna pesäkemuodostusta varten PANC-1 numerot muodostuneiden pesäkkeiden varten vektorisäädön ja pcDNA4 /TO-Six1 ryhmä olivat 84 ± 16 ja 184 ± 28, vastaavasti (*

P

0,05, kuvio 2C). Saimme samanlaisia ​​tuloksia

for

MIA PaCa-2 solujen pesäkemuodostusta (*

P

0,05, kuva S1C).

Voit testata, onko Six1 tarvitaan leviämisen haimasyöpäsoluissa, me vaiennettu Six1 molemmissa PANC-1 ja MIA PaCa-2-soluissa käyttäen siRNA menetelmällä. Solumäärä määrityksessä osoitti, että määrä Six1-knockdown-soluja oli huomattavasti pienempi kuin määrä sekä PANC-1 ja MIA PaCa-2-solut transfektoitiin sekoitetun ohjaus (kuvio 2D ja kuvio S1D). Esto endogeenisen Six1 in MIA PaCa-2-soluissa johti noin 1,8-kertainen pieneneminen BrdU positiivinen solu hinnat verrattuna salattu kontrolliryhmään. (Salatut siRNA vs. Six1 siRNA-1, 43% vs. 26%; Salatut siRNA vs. Six1 siRNA-2, 43% vs. 23%; *

P

0,05, kuva S1E). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, että PANC-1-soluissa (kuvio S1F). Vaiennettaisi Six1 ilmaisun varmistui Six1 siRNA hoitojen (20 nM 72 tuntia) sekä kvantitatiivinen PCR ja Western blot-analyysi (kuva S2). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että Six1 edistää solujen lisääntymistä haiman syöpäsoluja.

Vahvista edellä havainnoista, joka on

in vivo

-tuumoriksenografti mallilla. PANC-1-solut stabiilisti yli-ilmentävät Six1 tai valvontaa solua injektoitiin ihonalaisesti kahteen ryhmään nude-hiirten (n = 5). Kuten odotettua, kasvaimen kasvukäyrä osoittaa, että tuumorit, jotka ovat peräisin Six1 ryhmä kasvoi nopeammin kuin kontrolliryhmästä. Viisi viikkoa injektion jälkeen kasvaimen tilavuus Six1 ryhmässä oli 0,47 ± 0,26 cm

3, kun taas kasvaimen kontrolliryhmässä oli 0,08 ± 0,06 cm

3 (*

P 0,05

, kuva 2E). Lisäksi kasvaimen keskimääräinen painon kokeen lopussa oli merkittävästi korkeampi ryhmässä, joka yli-ilmentää Six1 (1,69 ± 0,44 g) verrattuna kontrolliryhmään (0,39 ± 0,25 g; *

P 0,05

, kuvio 2F ). Nämä tulokset osoittavat, että Six1 lisää kasvua haimasyövän

in vivo

.

Six1 transkriptionaalisesti Aktivoi Gene Encoding sykliini D1 haimasyöpäsoluissa

On raportoitu, että Six1 on solusyklin säädin ja vaikuttaa solusyklin etenemisen sekä normaalin kehityksen ja syövässä [3], [5], [20], [35]. Tutkia taustalla molekyylitason mekanismeja, joilla Six1 edistää solujen kasvua haimasyöpäsoluissa, analysoimme useita solusykliä sääntelyviranomaisten ja totesi, että sykliini D1-proteiinin tasot olivat merkittävästi korkeammat PANC-1 ja MIA PaCa-2-solujen transdu- Six1, kun taas solut Six1 knockdown osoitti alennettua sykliini D1 ilmentyminen (kuvio 3A ja kuvio S1A). Six1 on transkriptiotekijä, joka toimii yhtenä master säätelijöitä kehitystä. Sen määrittämiseksi, ovatko Six1 aiheuttama sykliini D1 ilmentyminen on transkriptio tasolla, analysoimme sykliini D1 ilmentyminen kvantitatiivisen PCR-analyysillä. Huomasimme, että sykliini D1 mRNA taso nousi vähintään 4-kertaisesti Six1 transdusoiduissa PANC-1-soluja (*

P 0,05

, kuvio 3B). Me seuraavaksi kysytään Six1 voisi suoraan säätelevät sykliini D1 promoottori. PANC-1-solut transfektoitiin ihmisen sykliini D1-promoottori reportteri, kun läsnä on kasvavia konsentraatioita ihmisen Six1-ekspressioplasmidin. Tiedot osoittivat, että Six1 merkittävästi parannettu lusiferaasiaktiivisuus sykliini D1-promoottorin reportteri annoksesta riippuvalla tavalla (*

P 0,05

, kuvio 3C). Seuraavaksi suoritimme ChlP tarkasteltaessa sitä, onko Six1 sitoutuu sykliini D1 promoottorin chromatin. Normaali IgG sitoutuu sykliini D1-promoottoriin käytettiin negatiivisena kontrollina. RNA-polymeraasi II-vasta-ainetta immunosaostettiin DNA monistettiin alukkeilla GAPDH-promoottorin, joka toimii positiivisena kontrollina. Kuvio 3D osoittaa, että Six1 voi sitoutua sykliini D1-promoottorin välillä -1189 ja -985, joka on alue, joka sisältää kaksi MEF3 n kaltaista motiivia (TCAGCTTTC ja TAATATTTC) [36]. Sen sijaan merkityksetön sekvenssikontrolli lähellä transkription aloituspaikan (-348–190) eivät sitoutuneet Six1. Yhteenvetona, Six1 säätää positiivisesti sykliini D1 ilmaisua sekä mRNA ja proteiini tasolla, mikä viittaa siihen, että sykliini D1 on

in vivo

tavoite Six1 haiman soluja.

A ja B, vaikutus