Krooninen sairaus

tiivistelmä

tiatsoli antibiootti, tiostreptonille vasta tunnistettiin proteasomin estäjä. Olemme tutkineet terapeuttisten mahdollisuuksien yhdistelmä tiostreptonia ja proteasomin estäjä bortetsomibi (Velcade) eri ihmisen tuumorisolulinjoissa. Yhdistelmä subletaalisia pitoisuudet tiostreptonia ja bortetsomibihoidon indusoi voimakkaita apoptoosin ja eston pitkän aikavälin pesäkkeiden muodostumisen monenlaisia ​​ihmisen syöpäsolulinjoja. Synergistinen suhde tiostreptonille ja bortetsomibin yhdistelmä myös kvantitatiivisesti osoitettiin laskemalla niiden yhdistelmä indeksin arvot olivat paljon alhaisemmat kuin 1 kaikkiaan tutkittu solulinjoissa. Synergiaa näiden lääkkeiden perustui niiden proteasomin estovaikutuksista, koska tiostreptonille muutos, tiostreptonille metyyliesteri, joka ei ole ehjä kinaldiinihappoa rengas ja eivät estäneet proteasomiaktiivisuus ei todettu synergiaa yhdessä bortetsomibin.

Citation: Pandit B, Gartel AL (2011) tiatsoli Antibiootti tiostreptonille synergoida Bortetsomibi apoptoosin syöpäsoluissa. PLoS ONE 6 (2): e17110. doi: 10,1371 /journal.pone.0017110

Editor: Joseph Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 syyskuu 2010; Hyväksytty: 20 tammikuu 2011; Julkaistu: 18 helmikuu 2011

Copyright: © 2011 Pandit, Gartel. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli tarjoamia National Institutes of Health myöntää 1RO1CA1294414 ja 1R21CA134615 (AL Gartel). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Yhdistelmä täsmälääkkeet /aineet on saanut yksimielisyyteen siitä elinkelpoinen potentiaali strategia hoitoon maligniteetti. Hoito yhdessä aineita, joiden kohteena avain solumekanismin tai proteiinien kriittinen erilaisiin syöpiin tutkitaan vastaan ​​erilaisia ​​kasvaimia. Lääkeaineiden yhdistelmä mahdollistaa niiden käyttö subtoxic pitoisuuksien ja todennäköisyys pienenee kehityksen resistenttien syöpäsolujen.

Proteasomi on proteiinikompleksi, jotka on kohdistettu ubikitiini-merkittyjen proteiinien hajoamiselle ATP-riippuvaisella tavalla. Viimeaikaiset edistysaskeleet mekanismien ymmärtämistä proteasomiaktiivisuuden johti kehittämiseen proteasomiestäjät kun tehokkaita lääkkeitä vastaan ​​ihmisen syövän [1]. Koska tiettyjen syöpien luottaa toimiva proteasomin kasvun esto proteasomiaktiivisuuden voisi tappaa selektiivisesti näistä kasvaimista. Bortetsomibi (Velcade) on yksi ensimmäisen luokan proteasomiestäjät, joka estää 26S-proteasomin sitoutumalla N-pään treoniinitähteiden aktiiviseen kohtaan Proteasomin katalyyttisen alueen. Se on hyväksytty kliiniseen käyttöön tapauksissa uusiutunut multippeli myelooma, mutta on osoittanut vähän tai ei lainkaan aktiivisuutta kiinteiden kasvaimien hoitoon monoterapiana. Kuitenkin estämällä proteasomin polku ja myöhemmät vaikutukset tärkeitä reittejä, bortetsomibi osoittaa synergististä suhdetta yhdistettyinä muihin syöpälääkkeiden ja parantaa tehokkuutta huumeita vastaan ​​maligniteetti.

Aiemmissa tutkimuksissa osoitimme, että tiatsoli antibiootit Siomycin A ja tiostreptonia indusoida apoptoosia ihmisen syöpäsoluja [2], [3], ja toimivat proteasomiestäjät [4]. On osoitettu, ennen kahden proteasomiestäjät laktakystiini ja MG132 synergized eturauhassyöpää vastaan ​​in vitro [5]. Lisäksi synergia osoitettiin yhdistämällä Bortetsomibin kanssa curcumin (joka osoittaa proteasomaalista estoaktiivisuus lisäksi muita vaikutuksia) vastaan ​​useita myeloomasolut [6]. Samoin olemme osoittaneet, että yhdistelmä tiostreptonia ja bortetsomibin osoittanut voimakasta synergiaa eturauhassyöpää vastaan ​​[7]. Tässä tutkimuksessa vahvistettiin, että co-hoitoon eri kasvainsolulinjoissa eri alkuperää subletaalisia pitoisuudet proteasomiestäjät tiostreptonille ja bortetsomibilla paljastaa voimakas synergia on osoituksena apoptoosin induktion, yhdistelmänä indeksin arvot ja pitkän aikavälin klonogeeniset määrityksessä.

tulokset ja keskustelu

Osoitimme aikaisemmin, että proteasomin estäjä tiostreptonille esti kasvua erilaisten syöpäsolujen radoilla IC

50-arvot (1-5 uM /l) ja indusoi apoptoosin [2 ], [3]. Bortetsomibi on osoitettu estävän elinkelpoisuuden kasvainsolulinjojen IC

50-arvo 10-100 nM /l. Sen määrittämiseksi, ovatko tiostreptonille voi synergoida bortetsomibilla vastaan ​​ihmisen syövän solulinjoja eri alkuperää käsittelimme useita ihmisen syövän solulinjoissa joko sub-apoptoottisen pitoisuudet tiostreptonia tai bortetsomibia yksin tai näiden yhdistelmiä 24 tunnin ajan ja käytettiin kaspaasi-3 palvella indikaattorina apoptoottisen solukuoleman (kuvio 1). Kun taas käsittely tiostreptonia tai bortetsomibilla yksinään indusoi vähän tai ei kaspaasi-3-pilkkoutumisen näissä soluissa, hoito yhdistelmällä näiden lääkkeiden osoitti voimakkaita kaspaasi-3-pilkkoutumisen in U2OS-C3 osteosarkooma, MiaPaca-2 haiman, PA-1 munasarja-, HCT116 paksusuoli- ja MDA-MB-231-rintasyöpäsoluissa (kuvio 1), ja tasot apoptoosin korreloi käänteisesti FOXM1 ilmentymistä (kuvio S1). Koska loimme aikaisemmin synergiaa bortetsomibi ja tiostreptonille eturauhassyöpäsoluissa [7], nykyinen tiedot viittaavat siihen, että tämä vaikutus voi olla yleistä merkitystä syövän hoitoon.

. Osteosarkooma, U2OS-C3, B. MiaPaca-2 haiman, C. PA-1 munasarja-, D. HCT-116 koolonin, E. MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen käsiteltiin osa-apoptoottisen pitoisuudet tiostreptonia, bortetsomibiin tai molempia kuten on esitetty 24 tunnin, kokosoluliuotteista uutettiin ja immunoblotattiin vasta-aineita lohkaistaan ​​kaspaasi-3 ja β-aktiini.

osoittavat lisäksi, että yhdistelmä hoito tiostreptonia ja bortetsomibin indusoi synergistisiä apoptoosin, me värjätään nämä solut (DMSO käsitelty, tiostreptonille käsitelty, bortetsomibi käsitelty ja käsitellään yhdessä kahden lääkkeiden) kanssa anneksiini V-PE /7AAD ja analysoitiin ne virtaussytometrialla. Kuten kuviossa 2A on esitetty, hoito HCT-116-solujen kanssa, 0,75 uM tiostreptonia tai 10 nM bortetsomibia indusoi apoptoosia vain 6,1% ja 6,9% kontrolliin verrattuna, kun taas käsittely molempien lääkkeiden samoilla annoksilla aiheutti 35,2% solujen apoptoosiin . Samanlaisia ​​synergistinen vaikutus tiostreptonia /bortetsomibin yhdistelmä havaittiin anneksiini-VPE-7AAD värjäytymisen MDA-MB231 rinta- ja MiaPaca-2 haimasyöpäsoluissa (kuvio 2B ja C).

. HCT-116, paksusuoli, B. MDA-MB-231, rinta- ja C. MiaPaca-2, haimasyöpäsoluissa käsitelty osa-apoptoottisia pitoisuudet tiostreptonia bortetsomibi ja tiostreptonille /bortetsomibin yhdistelmä 24 tuntia, värjättiin anneksiiniV-PE ja 7-AAD ja analysoitiin virtaussytometrialla.

määrällisesti validoimiseksi synergistinen luonne vuorovaikutuksen tiostreptonille ja bortetsomibia, tutkimme solujen elävyyden jälkeen yhden ja yhdistelmän lääkehoitoon käyttämällä Chou-Talalay median- vaikutus yhtälö menetelmä [8]. Cl-arvot alle 1 osoittavat synergististä antiproliferatiivinen vaikutus, ja CI alue arvot yhdistettynä hoitojen tiostreptonille /bortetsomibihoitoon HCT-116, Mia-Paca-2, MDA-MB231 ja PA-1 ihmisen syövän solulinjat olivat 0,1 0,8 (kuvio 3A, B, C, D) ja murto-vaikutus, joka vastaa 0,3-0,9, mikä viittaa vahvasti synergistinen vaikutus. Pitkän aikavälin vaikutuksia yhdistelmän hoidon tiostreptonille ja bortetsomibilla arvioitiin klonogeeniset määrityksessä. Olemme havainneet, että pesäkkeiden muodostumista HCT-116 paksusuolen ja MDA-MB 231 rintasyövän soluissa, joita käsiteltiin yhdistämällä näitä lääkkeitä 24 tuntia, tukahdutettiin 5- 10-kertaiseksi (kuvio 4A ja B).

Yhdistelmä-indeksi kaavioon tiostreptonille /bortetsomibin lääkeyhdistelmä piirrettiin CI on y-akselilla ja suhteellinen vaikutus (FI) x-akselilla. Prosenttiosuus lisäkasvun estäminen määritettiin seuraava hoito monoterapiana tai tiostreptonille /bortetsomibin yhdistelmä. Yhdistelmä-indeksi (CI) arvot kahden aineen piirretty HCT-116 (A), MiaPaca-2 (B), MDA-MB231 (C) ja PA-1 munasarja- soluissa (D).

. Klonogeeniset määritys HCT-116-solut käsiteltiin DMSO tai tiostreptonille /bortetsomibilla yhdistelmä 24 tunnin yksityiskohtaiset; valokuva petrimaljoihin edustavassa kokeessa näytetään. B. klonogeeninen määritys MDA-MB231-solut käsiteltiin DMSO tai tiostreptonille /bortetsomibilla yhdistelmät 24 tuntia.

jälkeen osoitus synergiaa tiostreptonille ja bortetsomibin yhdistelmä, merkitys proteasomaalisten estoaktiivisuus tiostreptonia hyödynnetään yhdistelmähoitoa tutkittiin. Aktiivisuus yhdistelmän tiostreptonia metyyliesteriä (avoin rengas aktiivinen rakenteellinen analogi tiostreptonia) ja bortetsomibin yhdistelmä verrattiin tiostreptonille ja bortetsomibin. On osoitettu, aiemmin, että ehjän kinaldiinihappoa makrosyklirenkaan on tiostreptonia vaaditaan proteasomi estoaktiivisuus tiatsoli antibioottien [9]. Ilman tätä rengas tai esiintyminen avoimen renkaan sulatettu molekyylin aktiivinen [10]. Toisin kuin yhdistelmä tiostreptonia /bortetsomibin bortetsomibi ja tiostreptonia metyyliesteri ole osoittanut, apoptoosin induktion, vahvistaa merkitys proteasomin estoaktiivisuus tiostreptonia käytetään lääkkeen yhdistelmä (kuvio 5). Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet synergiaa seuraavien yhteistyössä hoidon proteasomiestäjät, laktakystiiniä ja MG132 [5], botezomib ja curcumin [6] syöpää vastaan. Tässä tutkimuksessa käytetään erilaisia ​​menetelmiä, me raportoimme että tiostreptonille synergoi bortetsomibilla seuraavat yhteistyössä hoidon subletaalisia pitoisuuksia kahden aineen, mikä viittaa siihen, että kahden proteasomiestäjät olevan mahdollisesti arvoa yleisen strategian syöpää vastaan.

hoito yhdistelmällä tiostreptonia /bortetsomibi johtaa ulkonäön Saharan G

0 piikin, joka vähentää fluoresenssin intensiteetti HCT-116-solujen vastakohtana käsittelemätön kontrolli soluihin johtuen pirstoutumista chromatin. Siirtyminen taajuusmuuttajan oli verrattavissa positiiviseen kontrolliin annetaan Kit (Staurosporiini, tuloksia ei ole esitetty). Tiostreptoniresistentti metyyliesteri avoimen B rengas ei vaikuta fluoresenssin intensiteetti verrattuna hoidettu (kontrolli) soluista.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

U2OS-C3 osteosarkooma, HCT116 paksusuoli-, PA1 munasarja- ja MiaPaca-2 haimasyövän soluja viljeltiin DMEM-alustassa (Invitrogen). MDA-MB231-soluja kasvatettiin RPMI-1640-alustassa (Invitrogen). Media oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (GIBCO), ja soluja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Solulinjat testattiin mykoplasmakontaminaation käyttäen MycoAlert Mycoplasma havaitseminen kit (Lonza Rockland) ja havaittiin olevan negatiivinen. Tiostreptonille ostettiin Sigma, bortetsomibin ystävällisesti Millennium Pharmaceuticals /Takeda. Avoin rengas analoginen tiostreptonia, tiostreptonille metyyliesteristä ystävällisesti Drs. Walsh ja Bowers (Harvard University).

Combination indeksin määritys

MTT-määritys suoritettiin mitata elinkelpoisuuden solujen käsittelyn jälkeen yksittäisinä aineina tai yhdistelmänä tiostreptonia ja bortetsomibin. Jokainen koe mukana käsittely eri pitoisuuksilla tiostreptonia bortetsomibi, yhdistelmä tiostreptonia ja bortetsomibi ja ilman lääkehoitoa. Lisäksi korkeimmat pitoisuudet tiostreptonia bortetsomibi ja lääkeyhdistelmän testattiin ilman solujen ja ei osoittanut mitään häiriöitä MTT määritysreagenssit.

3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli ) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidin (MTT) hankittiin Sigmalta. Solut maljattiin tiheydellä 1 x 10

4 kuoppaa kohti 200 ui täydellistä kasvatusalustaa ja käsitellään tiostreptonille yksin bortetsomibi yksin ja yhdistelmänä tiostreptonia ja bortetsomibia 96 kuopan mikro- tiitterilevyiltä. Inkuboinnin jälkeen 72 tuntia 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, 10 ui MTT: tä (5 mg /ml PBS: ssä) lisättiin kuhunkin kuoppaan, minkä jälkeen levy sentrifugoitiin lyhyesti. Varovaisen poiston jälkeen väliaineen, 0,1 ml puskuroitua DMSO: ta, lisättiin kuhunkin kuoppaan. Absorbanssi rekisteröitiin mikro-levylukijalla aallonpituudella 540 nm. Meidän kokeissa IC

30, IC

50, IC

70, IC

80, ja IC

90-arvot (eli lääkeaineen pitoisuus riittää aiheuttamaan 30%, 50% , 70%, 80%, ja 90% vähennykset solujen elinkelpoisuuden) valittiin vertailuun.

vaikutuksen arvioimiseksi yhdistelmän hoidon tiostreptonille ja bortetsomibin, yhdistelmä-indeksi (CI) isobologram- menetelmä Chou ja Talalay käytettiin [8]. Tässä menetelmässä piirtämistä annosvaikutuskuvaajia kullekin aineelle ja yhdistelmät useita laimentaa pitoisuuksia käyttämällä mediaani-vaikutus yhtälö ja yhdistelmä indeksi yhtälö. Yhdistelmä indeksin arvot 1, 1, ja 1 osoittavat se lisävaikutus, että synergia, ja vihamielisyys, vastaavasti. Yhdistelmä-indeksi arvot määritettiin eri vaikutuksia tasoilla, ja isobologrammit piirretty.

havaitseminen apoptoosin

anneksiiniV-PE -värjäyspakkausta (Roche Diagnostic Corp.) käytettiin havaitsemiseen apoptoottisten elimet seuraavat myyjän protokollaa. Tämä pakkaus käyttää dual-värjäysmenettelyä, jossa solut osoittavat fluoresenssia anneksiini V (apoptoottisia soluja) ja fluoresenssi 7AAD (nekroottisten solujen tai myöhäinen apoptoottisia soluja). Lyhyesti kasvainsoluja kasvatettiin tiheyteen 50% konfluenssiin 100 mm viljelymaljoihin ja käsiteltiin vaihtelevilla lääkeaineiden 24 tuntia. Solut trypsinoitiin, pestiin PBS: llä, ja käsiteltiin merkintään kanssa anneksiiniV-7AAD. Leimatut solut analysoitiin virtaussytometrialla.

immunoblottauksella

Aktiivisesti jakautuvat solut ympättiin 100 mm: n levy, jonka tiheys on 7,5 x 10

5-soluja. Soluja käsiteltiin bortetsomibilla yksin, tiostreptonille yksin ja yhdistelmänä tiostreptonia ja bortetsomibihoidon 24 tuntia, minkä jälkeen solut hajotettiin. Solut hajotettiin IP-puskurissa (20 mM HEPES, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM Na

4P

2O

7, 1 mM natriumortovanadaattia, 0,2 mM PMSF: ää, johon oli lisätty proteaasi-inhibiittorin tabletti (Roche Applied Sciences) ja proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bio-Rad proteiinimäärityksellä reagenssia. Viisikymmentä mikrogrammaa solulysaateista erotettiin elektroforeesilla SDS-polyakryyliamidi- mini geelillä ja siirrettiin PVDF-membraanille. Immunoblottaus suoritettiin spesifisiä vasta-aineita lohkaistaan ​​kaspaasi-3 (9664 solun signalointi), FOXM1 (ystävällinen lahjoitus tri Costa laboratoriossa) ja β-aktiini (A5441, Sigma).

ydin- ID Green Kromatiini tiivistyminen tunnistus

Solut värjättiin

in vitro

apoptoosin havaitseminen kit (Cat # ENZ-51021-K200 Enzo Life Sciences) mukaan valmistajan suositusten mukaisesti. Lyhyesti 3-4 × 10

5 solua maljattiin 60 mm viljelyastioihin ja annettiin kasvaa yön yli. solut käsiteltiin subletaalisia pitoisuudet tiostreptonia bortetsomibi tai tiostreptonille metyyliesteriä tai yhdistelmä tiostreptonia ja bortetsomibin ja tiostreptoniresistentti metyyliesteri ja bortetsomibia. Yön yli inkuboinnin lääkkeiden solut trypsinoitiin ja toimitettiin virtaussytometria-analyysi. Analyysi tehtiin käyttämällä FL-1 kanava-virtaussytometrillä virityksen aallonpituudella 488 nM. Staurosporiini, edellyttäen pakkauksessa käytettiin positiivisena kontrollina.

klonogeeninen -eloonjäämiskoe

HCT-116 ja MDA-MB231-solut maljattiin väliainelevyä 3 x 10

5 solua yhtymäkohdassa ja käsiteltiin yhdistelmällä tiostreptonia ja bortetsomibihoitoon 24 tuntia. Sitten solut trypsinoitiin, suspendoitiin uudelleen median ja laskettiin. Solut ympättiin uudelleen (750 solua per keski- levy) ja inkuboitiin 10 päivää. Lisättiin tuoretta elatusainetta viidentenä päivänä. Kymmenentenä päivänä, väliaine poistettiin maljoista ja pestiin kerran jääkylmällä PBS: llä. Pesäkkeet värjättiin 2 ml kukin 0,25% 1, 9-dimetyyli-metyleenisineä 50% etanolissa 45 minuuttia keinuvalla alustalla. Astiat huuhdottiin kolme kertaa PBS: llä ja kuivattiin ilmassa, ja pesäkkeet laskettiin.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin Microsoft Excel käyttäen Student

t

testata.

P

arvoja 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

tukeminen Information

Kuva S1.

suhteelliset tasot FOXM1 voi vaikuttaa herkkyys tiostreptonille /bortetsomibi yhdistelmän käyttöä ihmisen syöpäsoluja. U2OS-C3 osteosarkooma ja MIA PaCa-2 haimasyövän soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai osoitetut pitoisuudet tiostreptonia ja borteozomib yhdessä 24 tuntia. Solulysaatit immunoblotattiin varten FOXM1, halkaistut kaspaasi-3 ja β-aktiini kuin latauskontrollina.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0017110.s001

(TIF) B

Kiitokset

Haluamme kiittää tohtori Albert Bowers ja Dr. Christopher Walsh ystävällisesti tarjota tiostreptonille metyyliesteriä käytetään tässä asiakirjassa.