Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kolorektaalisyöpää (CRC) on yksi johtavista syistä syöpään liittyvien kuolleisuus kaikkialla maailmassa. MikroRNA (miRNA, Mirs) tärkeä rooli syövän synnyn. MiR-126 on osoitettu olevan säädellä vähentävästi CRC. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet mahdollisia vaikutuksia miR-126 joitakin tärkeitä biologisia ominaisuuksia CRC solujen ja selkeytetty säätelyssä insuliinin reseptorin alustan 1 (IRS-1) ja sen mahdollinen signalointireitille by miR-126.

menetelmät

The effect of miR-126 IRS-1, AKT, ja ERK1 /2 ilmentymistä arvioitiin CRC solulinjoissa HT-29 ja HCT-116 miR-126 matkivat tai -estäjä lisäämiseksi tai vähentää miR-126 ilme. Lisäksi roolit miR-126 säätelyssä biologisia ominaisuuksia CRC-soluja analysoitiin miR-126 matkivat tai inhibiittori-transfektoiduissa soluissa. 3′-transloimaton alue (3′-UTR) IRS-1 säätelee miR-126 analysoitiin käyttämällä kahta ja lusiferaasireportterista määrityksessä.

Tulokset

Huomasimme, että IRS- 1 on toiminnallinen alavirtaan tavoite miR-126 suoraan kohdistamalla 3′-UTR IRS-1. Endogeeninen miR-126 ja eksogeenisen miR-126 matkivat inhiboi IRS-1 ilme. Lisäksi saavat-of-function tai menettämisestä toiminnon osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-126 alassäädetty IRS-1, tukahdutetaan AKT ja ERK1 /2 aktivointi, CRC-solujen proliferaatiota, migraatiota, invaasio, ja aiheutti solusyklin pidätys, mutta ei ollut vaikutusta solujen apoptoosiin. Knockdovvn miR-126 edistänyt nämä prosessit HCT-116-soluissa ja edistää AKT ja ERK1 /2 aktivaation ajan ekspressiota sääteleviä IRS-1-proteiinia.

Johtopäätökset

MiR-126 voi olla rooleja sääntelyn biologisen käyttäytymisen CRC soluja, ainakin osittain, kohdentamalla IRS-1 kautta AKT ja ERK1 /2 signalointireitteihin.

Citation: Zhou Y, Feng X, Liu Yl, Ye sc, Wang H, Tan Wk, et al. (2013) Down-asetus miR-126 liittyy peräsuolen syövän solut leviämisen, Migration and Invasion Targeting IRS-1 kautta AKT ja ERK1 /2 signalointireittejä. PLoS ONE 8 (11): e81203. doi: 10,1371 /journal.pone.0081203

Editor: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Saksa

vastaanotettu: 31 elokuu 2013; Hyväksytty: 14 lokakuu 2013; Julkaistu: 29 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Foundation for Distinguished Young Talents in Higher Education Guangdongin, Kiina (lupanumeroon LYM11103). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä ihmisen ruoansulatuskanavan pahanlaatuisten maailmassa vuosittain kasvava esiintyvyys ja kuolleisuus [1], [2]. Se on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat sekä miehillä että naisilla Kiinassa [3]. Patogeneesissä CRC ei ole vielä täysin ymmärretty. Tällä hetkellä on ehdotettu, että peräsuolen syövän synty liittyy monivaiheinen molekyyliprosessien aktivointiin onkogeenien mutaatio yhteensopimattomuuden korjaavien geenien tai inaktivoida tuumorisuppressorigeeneille, jotka vaikuttavat solujen lisääntymisen, migraation, invaasion, apoptoosin, tai muita näkökohtia syöpäsoluja. Lisäksi geenin aktivaatio ja inaktivaatio, lisäämällä todisteet viittaavat siihen, että MikroRNA (miRNA, MIRS) voi olla rooleja kehityksen CRC [4].

Kypsät miRNA on luokan pienen, ei-koodaavan RNA-molekyylien kanssa pituus on 20-25 nukleotidia. Ne yleensä vuorovaikutuksessa miRNA tunnustamatta elementtien 3′-alue (3′-UTR) kohde- mRNA: iden, säädellä mRNA: n hajoamisen, tai tukahduttaa niiden kääntäminen yhtä tärkeä transkription jälkeisen sääntelyviranomaisten. MiRNA ovat osoittautuneet kriittisiä rooleja monissa biologisissa prosesseissa, kuten solujen erilaistuminen, proliferaatio, apoptoosin, tulehdus- ja immuunivasteet [5], [6]. Lisääntyvä näyttö on osoittanut, että miRNA kriittisesti kasvaimien syntyyn liittyvien. Riippuen Matkapuhelinyhteydessä ja kohdegeenien että ne säätelevät, miRNA voi toimia tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien [7], [8]. MiR-200 ja miR-155 voisi olla mukana syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota säätelemällä epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon tai soluadheesiota [9], [10]. Zhang et ai. raportoitiin käänteinen korrelaatio etäpesäkkeiden liittyvän paksusuolen syöpään-1 (MACC1) ja miR-143 ilmentymisen paksusuolen syöpäsolulinjoissa ja osoittaneet, että suora inhibitio metastaasin liittyvän paksusuolen syöpään-1-mRNA: n translaatio oli välittämä miR-143 [ ,,,0],11]. Yli-ilmentyminen miR-211 HCT-116-solujen muuttunut p53-reittiin liittyvien säätelevien proteiinien, esim., MDM2, Bcl-2, Bcl-xL: n ja Bax [12]. Lukuisat tutkimukset osoittivat, että miR-126 on merkittävästi vähentynyt useita syöpätyyppejä ja siten voi olla merkitystä kasvainten vaimennin. Esimerkiksi alhaisen miR-126 ilmentymistä havaittiin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja todettu epäsuotuisa ennustetekijä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaat [13]; miR-126 ilmentyminen väheni myös ihmisen rintasyövän, ja voi olla rooleja kasvainten synnyssä ja kasvua säätelemällä endoteelikasvutekijä /fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) /AKT-signalointireitin [14]. Ekspression miR-126 CRC kudoksissa oli merkittävästi pienempi kuin ei-tuumorikudoksissa, ja miR-126 yli-ilmentyminen inhiboi kasvua CRC-solujen [15]. Guo C et al. huomattava menetys miR-126 ilmentymistä koolonsyöpäsolulinjoissa verrattuna normaaliin ihmisen paksusuolen epiteelissä ja paljasti, että miR-126 säätelee PI3K signalointia osittain kohdistamalla p85β [16]. Kuitenkin toiminta miR-126 ja sen mahdollista signalointireitille CRC ei ole täysin selvitetty.

Insuliini reseptori substraatti-1 (IRS-1) on perheenjäsen insuliinin reseptorin substraattien, jotka oli aluksi ominaista tyypillisiä soluliman adaptoriproteiineja sekä insuliinin reseptorin (IR) ja insuliinin kaltainen kasvutekijä I reseptori (IGF1 R) signalointia. Viimeaikaiset tutkimukset vahvistettu, että IRS-1 on myös tärkeä rooli edistämisessä mitoosin ja apoptoosin vastus, pahanlaatuisiksi ja leviämisen [17]. Chang et al. [18] havaitsivat, että IRS-1 oli yli-ilmentynyt eri kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien rinta- syöpien, leiomyoomien, Wilmsin kasvaimet, rabdomyosarkoomiin, liposarkooma, leiomyosarkoomat ja lisämunuaiskuoren karsinoomat. Lisäksi IRS-1 on liittynyt CRC [19] ja säädelty syöpäsolulinjoissa [20]. Bioinformatiikan on osoittanut, että 3′-UTR IRS-1 sisältää oletetun sitoutumiskohta miR-126. Kuitenkin sääntely miR-126 CRC ja sen yhdessä IRS-1 ei ole raportoitu vielä.

Tässä tutkimuksessa pyrittiin luonnehtimaan roolit miR-126 ja sen mahdollista signalointireitille vuonna patogeneesi CRC soluja. In voitto-of-function tutkimuksia, huomasimme, että yli-ilmentyminen miR-126 alassäädetty IRS-1 ilmentymisen, tukahdutetaan AKT ja ERK1 /2 aktivointi, CRC-solujen proliferaatiota, migraatiota, invaasio, ja johti solusyklin pysähtymiseen, mutta ei ollut mitään vaikutusta solujen apoptoosia. Knockdovvn miR-126 edistänyt näitä prosesseja CRC soluissa ja sääteli ilmentymistä IRS-1-proteiinia. Käyttämällä lusiferaasi-reportterigeenirakenteilla tunnistimme IRS-1 toiminnallisina alavirtaan kohteena miR-126.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

CRC solulinjat HT -29, HCT-116, SW480 ja SW620 hankittiin solusta pankin kasvain sairaalan Kiinan Academy of Medical Sciences /Biological Detection Center (Beijing, Kiina). Kaikki solut ylläpidettiin RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Gibco), 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä 37 ° C: ssa 5% CO

2-inkubaattorissa.

miRNA matkivat tai estäjä transfektion

Kaikki solut ympättiin 6-kuoppaisille, 12-kuoppaisille, 24-kuoppainen, tai 96-kuoppalevyille 90% yhtymäkohdassa ja säilytetään inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2: ssa yön yli. MiR-126 matkivat, miR-126 negatiivinen kontrolli matkivat (NC matkivat), miR-126 estäjä ja miR-126 negatiivinen kontrolli estäjä (NC estäjä) ostettiin Ribobio (RiboBio, Guangzhou, Kiina) .Varying määriä miR-126 matkivat tai NC matkivat (RiBoBio) transfektoitiin HT-29-soluja, kun taas miR-126-estäjän tai NC-estäjä (RiBoBio) transfektoitiin HCT-116-soluihin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Transfektoituja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa 24 tai 48 tuntia. Solun kokonais-RNA ja proteiini kerättiin erikseen ja varastoitiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

Mahdollisten alavirtaan tavoitteista miR-126

ennustaa mahdollisia kohteita miR-126, kolme silico analyysi ohjelmia käytettiin microRNA tavoite ennustus, eli mikrokosmos Targets (https://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/), Targetscan (http: //www.targetscan .org /), ja PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/). 3′-UTR IRS-1 mRNA (RefSeq NM_005544) on otaksuttu miRNA-126 sitoutumiskohta.

IRS-1 3′-UTR villityypin ja mutantti konstruktioita

Jotta vaikutusten testaamiseksi miR-126 ilmentymistä IRS-1, loimme dual-lusiferaasireportterilla konstrukteja. 3′-UTR IRS-1 mRNA sisältävä otaksuttu miR-126 sitoutuva sekvenssi syntetisoitiin Sangon Biotech (Shanghai, Kiina). Fragmentit, jotka vastaavat 1-298 nukleotidin 3′-UTR IRS-1-mRNA: n (298 bp) subkloonattiin sitten

Xho

I ja

Ei

I sivustoja alavirtaan Renilla lusiferaasin että psiCheck-2 vektorin (Promega). Tuottaa konstruktin, joka sisältää miR-126 sitoutumiskohdan mutantti, me substituoitu kahta nukleotidia, jotka vastaavat 5′-kylvö alueen miR-126 sitoutumiskohta villityypin fragmentti.

Villityypin ja mutantti-konstruktit olivat nimetty psi-IRS-1 ja psi-mutIRS-1, tässä järjestyksessä. Sekvenssit konstruktit todennettiin DNA-sekvensoinnilla. Konstruktioita transformoitiin DH5a soluihin ja plasmidi-DNA puhdistettiin käyttämällä TIANpure MidiPrep Kit (Tiangen Biotech, Peking, Kiina).

Muodosta transfektio ja lusiferaasin reportterianalyysi

määrittämiseksi konkreettisena vaikutuksena miR-126 3′-UTR IRS-1, MIR-126 matkivat ja psi-IRS-1 lusiferaasi-konstrukti (500 ng /kuoppa) kotransfektoitiin HT-29-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 Renilla ja Firefly lusiferaasin tasoja mitattiin 48 tuntia transfektion jälkeen käyttäen Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega Corporation, Madison, WI). Kokeet suoritettiin neljänä rinnakkaisena kuoppiin ja data edustaa keskiarvoa kolmesta itsenäisestä kokeesta.

eristäminen Kokonais-RNA:

Viljellyt solut nopeasti siirrettiin 1,0 ml TRIzol-reagenssia (Invitrogen), ja kokonais-RNA oli uutetaan mukaan valmistajan ohjeiden ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktiolla (qRT-PCR) B

One Step PrimeScript® miRNA cDNA Synthesis Kit ja DRR036A (Takara Bio Inc., Tokio, Japani) käytettiin reverse puhtaaksi miRNA ja mRNA, vastaavasti. Sillä qRT-PCR: llä transfektoiduissa soluissa, 500 ng kokonais-RNA: ta muutettiin cDNA: ksi. Sitten 2 ui cDNA kutakin näytettä monistettiin reaaliaikainen fluoresoiva qPCR käyttäen SYBR® Premix Ex Taq ™ II (Perfect Real Time) (Takara Bio Inc.). Ekspression miR-126 kussakin ryhmässä laskettiin suhteessa kuin U6B, joka on läsnä kaikissa pieni ydin- RNA käytetään sisäisenä kontrollina. Expression of beta-aktiini käytettiin normalisointia valvontaa mRNA qPCR. Sillä miRNA qPCR, käänteinen aluke oli yleismaailmallinen qPCR pohjamaali miRNA (Takara Bio Inc.). Eteenpäin miRNA ja mRNA: n alukkeet syntetisoitiin Sangon Biotech, ja vastaavat sekvenssit on lueteltu taulukossa 1. Vertaileva kynnyssyklinä menetelmää käytettiin vertaamaan kunkin kunnossa verrokkeihin nähden. Reaktiot suoritettiin LightCycler® (Roche Diagnostics, Basel, Sveitsi). PCR-olosuhteet olivat 30 s 95 ° C: ssa, mitä seurasi 40 sykliä 5 s 95 ° C: ssa ja 20 s 60 ° C: ssa. 2

– △ Ct (2

– [(Ct geeni) – (Ct of U6)]) menetelmää käytettiin analyysiin.

Western blot

Western blot suoritettiin standardin protokollaa. Lyhyesti, 20 ug proteiinia per näyte erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja siirrettiin sitten polyvinylideenidifluoridi kalvoja. Kalvot tutkittiin kanin anti-ihmis-IRS-1 primaarista vasta-ainetta (1:1000 laimennus, CST), kanin anti-humaani p-AKT primaarista vasta-ainetta (1:500 laimennus, CST), kanin anti-humaani yhteensä-AKT primäärinen vasta-aine (1:500 laimennus, CST), kanin anti-humaani p-ERK1 /2 primaarista vasta-ainetta (1:500 laimennus, CST), tai kanin anti-humaani yhteensä-ERK1 /2 primaarista vasta-ainetta (1:500 laimennus; CST) yön yli 4 ° C: ssa. Membraanit inkuboitiin sitten piparjuuriperoksidaasi-leimattua vuohen anti-kani-IgG: tä (1:1000; Beyotime, Jiangsu, Kiina) huoneenlämpötilassa (RT) 1 h. Glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi käytettiin lastaus ohjaus ja hiiren anti-ihmis-glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi-vasta-ainetta käytetään sen havaitsemiseksi. Integraali optinen tiheys proteiinivyöhykkeet mitattiin käyttäen Määrä Yksi kuva-analyysi-ohjelmisto (Bio-Rad, Hercules, CA).

Immunofluoresenssi

immunofluoresenssi suoritettiin standardin protokollan (Santa Cruz Biotechnology). Lyhyesti, HCT-116-solut on peitinlasit kiinnitettiin asetonissa 4 ° C: ssa 10 min ja pysäytettiin 10% vuohen seerumin albumiinia huoneenlämpötilassa 1 tunti. Soluja inkuboitiin kanin anti-ihmis-IRS-1 primääristä vasta-ainetta (1:200) (Santa Cruz Biotechnology), yön yli 4 ° C: ssa. Huuhtelun jälkeen fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) ja 3 kertaa, soluja inkuboitiin toissijaisen polyklonaalisten Cy3-leimattua vuohen anti-kani-594-IgG (1:400) (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology, Peking, Kiina) 1 tunnin ajan RT: ssä pimeässä ja sitten pestiin PBS: llä. Anti-IRS-1-vasta-aine oli korvattu PBS: llä negatiivisessa kontrollinäytteessä. 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli käytettiin vasta-värjätä ytimet (5 min huoneenlämpötilassa). Värjäytyminen arvioitiin ja mitattiin fluoresenssi-intensiteetti Leica muunnetaan fluoresenssimikroskoopilla. Kvantitoimme koko Cy3 fluoresenssin intensiteetti (kuten näkyy punaisena) kuin edustus ekspressiotaso IRS-1. Intensiteetti 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli-värjäyksellä (sininen) käytettiin sisäisenä normalisointia säädin fluoresenssisignaalit eri dioja.

Solusyklianalyysiä

Solusyklianalyysiä oli suoritettiin käyttäen Cell Cycle ja apoptoosi Analysis Kit (Beyotime). HT-29-soluja ympättiin tiheydellä noin 5 x 10

5-soluja /kuoppa 12-kuoppalevyille, niitä viljeltiin 48 tuntia transfektion jälkeen, kuten edellä on mainittu, talteen, pestiin PBS: llä, ja sitten kiinnitettiin 70% etanolilla yön yli 4 ° C: ssa. Soluja käsiteltiin 20 ug /ml RNaasi, värjättiin 20 ug /ml propidiumjodidia 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa pimeässä, ja analysoitiin sitten virtaussytometrillä (FACScan, BD Biosciences, San Diego, CA, USA).

apoptoosimäärityksessä

mittaus apoptoosin tehtiin mukaan valmistajan ohjeita anneksiini V-fluoreseiini apoptoosin havaitseminen kit (Beyotime). 48 h transfektion jälkeen, otettiin talteen solut suspendoitiin 500 ul: aan anneksiini V: n sitoutumisen puskuria. Sitten 5 ui anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti ja 10 ui propidiumjodidia lisättiin kuoppiin ja soluja inkuboitiin 5 minuutin ajan pimeässä. Näytteet analysoitiin 1 tunnin kuluessa värjäyksen jälkeen virtaussytometrialla (FACScan, BD Biosciences). Solut eroteltu eläviä soluja, nekroottisten solujen ja apoptoottisten solujen käyttämällä Cell Quest ohjelmisto (BD Biosciences); sitten, prosenttiosuudet apoptoottisten solujen kustakin ryhmästä verrattuna. Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

solukasvumäärityksessä

Solujen elävyys tutkittiin käyttäen Cell Counting Kit-8-määritys (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japani). HT-29-soluja ympättiin tiheydellä 5 x 10

3 kuoppaa kohti 96-kuoppalevylle ja niitä viljeltiin, kuten on kuvattu edellä 48 tuntia transfektion jälkeen. Päätyttyä inkuboinnin solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen Cell Counting Kit-8 mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Väliaine poistettiin ja korvattiin 100 ul: lla tuoretta elatusainetta, johon Cell Counting Kit-8-reagenssia (10 ui) kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Absorbanssi (A) kunkin luettiin 450 nm: ssä käyttäen entsyymi-immunologinen määritys lukija (Thermo, USA). Solujen elävyys (% kontrollista) laskettiin käyttäen seuraavaa yhtälöä: Survival rate (%) = (A

näyte –

tyhjä) /(A

ohjaus –

tyhjä), jossa

näyte oli optinen tiheys miR-126-transfektoiduissa soluissa A

ohjaus oli optinen tiheys NC-transfektoitujen solujen, ja A

tyhjä oli optinen tiheys kuopista ilman soluja. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena.

In vitro siirtokuoppaan maahanmuutto- ja invaasiomääritys

TranswellTM kalvoja (polycarbonic kalvo, halkaisija 6,5 ​​mm, huokoskoko 8 pm) (Corning Costar, NewYork, USA) päällystetty ilman tai matrigeelin (BD Biosciences) käytettiin määrittämään siirtämisestä tai invaasion soluissa in vitro, vastaavasti. 48 h transfektion jälkeen, HT-29 tai HCT-116 solut irrotettiin käsittelemällä 0,25% trypsiini-EDTA: a (Gibco), sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen seerumia. Transfektoidut solut (10 x 10

4 200 ui seerumia) otettiin reseeded saliin. Sitten 600 ui väliaineessa, jota täydensi 20% naudan sikiön seerumia lisättiin alempaan kammioon, kuten kemoattraktantti. 48 tunnin kuluttua inkubaation, ei-vaeltavat tai ei-tunkeutuvat solut yläpinnan kalvon poistettiin pumpulipuikolla. Siirrettyjä tai tunkeutuneet soluja, jotka tunkeutuivat alapinta kalvon, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla (Beyotime). Solujen määrä muuttaa tai tunkeutuvat kalvon laskettiin 5 satunnaisesti valitun näkökentät, jossa käännettyä mikroskooppia 200-kertaisella suurennuksella. Tulokset saatiin kolmesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta.

Tilastollinen analyysi

Kokeelliset tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± keskivirhe. Tilastolliset analyysit tehtiin Studentin t-testiä varten 2 ryhmille SPSS ohjelmistoa, v13.0 (International Business Machines Corporation).

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Expression of miR-126 CRC solulinjoissa

Analysoimme ilmentymistason asennuspalveli- 126 paneelissa CRC solulinjojen eriasteisia erilaistumista ja metastaattisen kyvyn, kuten HT-29, HCT-116, SW480 ja SW620-soluissa. Havaitsimme, että miR-126 ilmentyminen oli suhteellisesti suurempi HCT-116-solut kuin muissa kolmessa solulinjat. Tulokset on esitetty kuviossa 1 osoittavat, että miR-126 ilmentyminen voi liittyä aste CRC-solujen erilaistumisen ja metastaattinen kyky. Tämän perusteella ekspressiokuviota, valitsimme HT-29 ja HCT-116-solut seuraavien voitto-of-function ja menettämisestä toiminnon tutkimuksissa vastaavasti.

ilmentyminen miR-126 oli suhteellisesti suurempi HCT-116-soluissa ja pienempi HT-29, SW620 ja SW480-solujen joukossa 4 eri CRC solulinjoissa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM kolmen erillisen kokeen.

Valinta mahdollisten alavirran tavoitteista miR-126

MiR-126 todettiin alassäädetty CRC [15 ]. Jotta voitaisiin tunnistaa alavirtaan kohteet miR-126, käytimme kolme miRNA tavoite ennustus ohjelmia, toisin sanoen mikrokosmos Targets, Targetscan, ja PicTar, tunnistaa mahdollisia kohteita. Mielenkiintoista on, että IRS-1, joka ilmentyy vahvasti CRC-soluissa [21], on yksi ennustettu tavoitteet miR-126. Oletettu miR-126 sitoutumiskohta, joka kattaa 6 täydellisesti sopivan nukleotidin määriteltiin 3′-UTR IRS-1 (kuvio 2A).

(A) kanta miR-126 kohdepaikkaan 3 ”-UTR IRS-1 mRNA ennusti TargetScan. HT-29-solut transfektoitiin joko alkuperäiseen kaksi lusiferaasireportteri- vektori (psi-vektori) tai IRS-1 3′-UTR rakentaa villityypin miR-126 sitoutumiskohta (psi-IRS-1) tai mutatoitu Kääntäkää 126 sitoutumiskohta (psi-IRS-1-mut). Suhteellinen Renilla lusiferaasiaktiivisuus (normalisoitu Firefly lusiferaasiaktiivisuus) mitattiin 24 tuntia transfektion jälkeen. (B) Suhteellinen Renilla lusiferaasiaktiivisuus vähennettiin soluissa, jotka on transfektoitu villin tyypin IRS-1 3′-UTR rakentamiseksi (psi-IRS-1) verrattuna, jotka on transfektoitu psi-vektorin (500 ng /kuoppa 24-kuoppaisen -levy). Suhteellinen Renilla lusiferaasiaktiivisuus palautettiin transfektoitu mutantti konstruktilla (psi-IRS-1 mut). (*

P

0,05, verrattuna psi-vektori). (C) Co-transfektio HT-29-solujen kanssa 50 nM miR-126 matkivat ja eri lusiferaasireportteri- konstruktioita (500 ng /kuoppa) vähensi suhteellista Renilla lusiferaasiaktiivisuus. (*

P

0,05, verrattuna psi-vektori). Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM kolmen erillisen kokeen.

Kun pyritään rajaamaan mahdollisten alavirran tavoitteet ja edelleen ymmärtää mekanismeja miR-126 alassäätöä patogeneesissä CRC, transfektoimme HT -29 solujen IRS-1 3′-UTR lusiferaasireportteri rakenteen, joka sisältää villin tyypin miR-126 oletetun sitoutumiskohtaa (psi-IRS-1) tai mutantti-konstrukti, joissa mutaatiot miR-126 sitoutumiskohtia (psi-mutIRS-1 ). Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus villityypin psi-IRS-1-rakenne osoitti 45%: n vähennys verrattuna psi-mutIRS-1-rakenne (

P

0,05) (kuvio 2B). Nämä tulokset osoittavat, että endogeeniset miR-126 voidaan säädellä IRS-1 ilmentymisen suoraan kohdentamalla sen 3′-UTR.

edelleen vahvistaa nämä havainnot, MIR-126 matkivat oli kotransfektoitiin edellä lusiferaasireportterilla konstrukteja osaksi HT-29-soluja. MIR-126 matkivat vähentynyt voimakkaasti ( 60%) lusiferaasiaktiivisuutta villityypin IRS-1 3′-UTR reportterikonstruktista psi-IRS-1, kun taas NC matkivat ei ollut vaikutusta lusiferaasiaktiivisuutta mihinkään ryhmään ( Kuva 2C).

kuitenkin miR-126 matkivat ei vähentänyt lusiferaasiaktiivisuutta mutantin konstruktio psi-mutIRS-1 (kuvio 2C), mikä osoittaa sen erityistunnustamista vaikutus. Nämä tulokset osoittavat lisäksi, että miR-126 voidaan säädellä IRS-1 ilmentymisen suoraan kohdentamalla sen 3′-UTR.

muuttaminen miR-126 ilmentyminen muutti IRS-1-proteiinin ilmentymisen taso, mutta ei IRS-1 mRNA taso

Voit testata, onko miR-126 säätelee endogeenisen IRS-1 ilmaisu, miR-126 matkivat ja estäjä transfektoitiin ohimenevästi osaksi HT-29 ja HCT-116-soluissa, vastaavasti. MiR-126 ja IRS-1 mRNA ekspressiotasot arvioitiin. Verrattuna NC matkia, transfektio 50 nM miR-126 jäljittelevät in HT-29-solujen johti noin 48-kertaiseksi miR-126 ekspressiotaso, havaittuna qRT-PCR: llä (kuvio 3A). Vaikka oli laskeva suuntaus IRS-1-mRNA-ilmentymisen määrä transfektoiduissa soluissa miR-126 matkivat, se ei ollut tilastollisesti merkitsevä ryhmien välillä testattiin (

P

0,05) (kuvio 3B) . Samalla olemme huomanneet, että transfektio 100 nM MIR-126-estäjän HCT-116-solut voivat heikentää kypsän miR-126 tason huomattavasti (kuvio 3C), kun taas IRS-1 mRNA pysyi muuttumattomana (kuvio 3D) .

(A, B) HT-29-solut transfektoitiin 50 nM miR-126 matkivat tai negatiivinen kontrolli jäljittelevät 48 tuntia. Expression of miR-126 ja IRS-1 mRNA: n kokonais-RNA näiden solujen havaittiin kvantitatiivisen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio analyysi. (C, D) HCT-116-solut transfektoitiin 100 nM miR-126-estäjän tai negatiivinen kontrolli inhibiittoria 48 tuntia. Expression of miR-126 ja IRS-1 mRNA: n kokonais-RNA näiden solujen havaittiin qRT-PCR-analyysillä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta (*

P

0,05, verrattuna negatiiviseen kontrolliin matkivat hoito).

Seuraavaksi määritetään, onko lauseke IRS-1 proteiinia muuttunut HT-29-solut transfektoitu miR-126 matkivat tai NC matkivat ja HCT-116-solut transfektoitu miR-126 estäjän tai NC estäjä. Kasvu miR-126 tasoilla myös vähensi IRS-1-proteiinin ekspressiotasot määritettynä western blot (

P

0,05) (kuviot 4A, B), kun taas mRNA pysyi muuttumattomana (

P

0,05) (kuvio 3B). Sen sijaan tehdä keskeytys- toiminto kokeita, 100 nM miR-126 estäjä transfektoitiin HCT-116-solut ja verrattuna NC ryhmään. Tulokset osoittivat laskua miR-126 lauseke (kuva 3C) ja lisätä IRS-1-proteiinin ilmentymisen (

P

0,05) (kuviot 4C, D).

(A ) HT-29-solut transfektoitiin miR-126 matkivat tai negatiivinen kontrolli (NC) matkivat, ja yhteensä proteiineja soluja käytetään havaitsemaan IRS-1, p-AKT, yhteensä-AKT, p-ERK1 /2, päätyen ERK1 /2, ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) ilmentyminen western-blottauksella. (B) Suhteellinen proteiinin tasot normalisoitiin kuin GAPDH ja esitetty keskiarvona ± SD kolmesta kokeesta. * Osoittaa, että ekspressiotasot IRS-1, p-AKT, ja p-ERK1 /2 oli merkitsevästi vähemmän miR-126 matkivat transfektoidut solut kuin negatiivisen kontrollin (NC) matkivat ryhmä (

P

0,05). (C) HCT-116-solut transfektoitiin miR-126-estäjän tai negatiivinen kontrolli (NC) estäjä, ja edellä proteiinit havaittiin Western-blottauksella. (D) Suhteellinen proteiinin tasot normalisoitiin kuin GAPDH ja esitetty keskiarvona ± SD kolmesta kokeesta. * Osoittaa, että ekspressiotasot IRS-1, p-AKT, ja p-ERK1 /2 lisääntyivät merkitsevästi MIR-126 inhibiittoriryhmä verrattuna NC inhibiittoriryhmä (

P

0,05 ). (E) HCT-116-solut värjättiin IRS-1 immunofluoresenssilla. IRS-1 ilmentyi sytoplasmassa ja tasot lisääntyivät merkitsevästi miR-126-inhibiittori-transfektoiduissa soluissa. Punainen, IRS-1; sininen, 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli-tumavärjäystä. Kuvia oli kuvattu 630 × suurennuksella Leica muunnetaan fluoresenssimikroskoopilla. (F) Fluoresenssin intensiteetti IRS-1 kussakin ryhmässä laskettiin sitten. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta (*

P

0,05 verrattuna NC-estäjä).

muuttaminen miR-126 ilmaisun vaikutteita AKT ja ERK1 /2 aktivointi

edelleen ymmärtää molekyylitason mekanismi miR-126 inhiboimaan kasvainten synnyssä, huomasimme, että IRS-1 on potentiaalinen uusi välittömänä kohteena miR-126, jossa on sitoutumiskohta sen 3′-UTR alue . IRS-1 voidaan palvelukseen ja fosforyloituu insuliinin kaltainen kasvutekijä I sitoutuessaan reseptoriin, insuliinin kaltainen kasvutekijä I reseptori, jolloin aktivoimalla alavirran signalointireitteihin kuten PI3K /AKT [22]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että IRS-1-proteiinin ilmentyminen in HT-29-solut transfektoitiin 50 nM miR-126 matkivat inhiboitui merkittävästi (47%), kuten havaitaan western blot-analyysi (kuviot 4A, B). Yhdenmukainen lasku IRS-1 tason, yli-ilmentyminen miR-126 HT-29-solujen esti myös p-AKT ja p-ERK1 /2 ekspressiotasot (kuviot 4A, B). Lisäksi transfektointi HCT-116-solujen kanssa 100 nM miR-126 estäjä voi säätää ylös IRS-1, p-AKT, ja p-ERK1 /2-proteiinin ekspressiotasot, mutta ei vaikuttanut koko AKT ja ERK1 /2 ilmaus tasot (kuviot 4C, D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-126 säätelee alavirran molekyylien kautta kohdistaminen IRS-1. Lisäksi olemme suoritetaan edelleen immunofluoresenssivärjäyksellä on HCT-116-solut, jotka on transfektoitu miR-126-estäjän. Värjäytyminen Tulokset osoittivat, että IRS-1 proteiinia selvästi ilmaistu sytoplasmassa HCT-116-solut (kuvio 4E). Sen taso oli merkittävästi lisääntynyt miR-126 inhibiittoriryhmä verrattuna NC inhibiittoriryhmä (

P

0,05) (kuvio 4F), joka on yhtä mieltä saatujen tulosten western blottauksella.

MiR-126 aiheuttama G0 /G1 vaiheen pysähtymisen CRC soluissa

Tutkimme, onko antiproliferatiivista aktiivisuutta miR-126 HT-29-solujen korreloi solusyklin pysähtymiseen. Kuten on osoitettu kuviossa 5A, solusyklin analyysi paljasti, että transfektion kanssa miR-126 matkivat lisäsi CRC solujen G0 /G1 vaiheeseen verrattuna NC jäljitellä (

P

0,05).

(A) MiR-126 matkivat ja NC matkivat transfektoidut solut värjättiin propidiumjodidilla (PI) ja DNA-pitoisuus analysoitiin virtaussytometrialla. Solujen lukumäärä kussakin vaiheessa laskettiin käyttäen ModFit ohjelmistoa. Tulokset näkyvät alaosassa kuvaaja edustivat kolmen erillisen kokeen (*

P

0,05). (B) HT-29-solut transfektoitiin 50 nM miR-126 matkivat tai negatiivinen kontrolli jäljittelevät 48 tuntia. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen (anneksiini V positiivinen) suhteessa koko mitatun solupopulaation näkyy oikeassa alakulmassa neljännekseen Ylemmän levyn. Tulokset ilmaistiin kertainen muutos suhteessa vastaavaan NC matkivat (alhaalla kaavio). (

P

0,05, verrattuna NC matkivat). Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM kolmen erillisen kokeen.

MiR-126 ei ollut vaikutusta apoptoosin CRC soluissa

mitata vaikutusta miR-126 CRC-solujen apoptoosin , apoptoosin mitattiin 48 tunnin kuluttua miR-126 matkivat transfektio käyttämällä virtaussytometria. Ei ollut mitään merkittävää eroa määrä anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti (+) apoptoottisten solujen miR-126 matkivat-transfektoitujen ryhmässä verrattuna NC jäljitellä-transfektoiduissa ryhmä (kuvio 5B,

P

0,05 ). Nämä havainnot osoittavat, että miR-126 ei toista antiapoptoottisena rooli CRC soluissa.

MiR-126 esti CRC solujen lisääntymistä

MiR-126 on raportoitu säädellä vähentävästi CRC [23], syytetään sen mahdollisen roolin biologiset ominaisuudet CRC soluja. Edelleen karakterisoimiseksi toiminnallinen merkitys miR-126 CRC kasvainten synnyssä, tutkimme vaikutus miR-126 proliferaatioon HT-29-soluissa käyttäen Cell Counting Kit-8-määrityksessä. Havaitsimme, että yli-ilmentyminen miR-126 suppressoi merkitsevästi leviämisen HT-29-solujen 48 h transfektion jälkeen (

P

0,05) (kuvio 6A).

(A) HT-29-solut transfektoitiin eri määriä miR-126 matkivat tai negatiivinen kontrolli (NC) matkivat ja solujen lisääntyminen analysoitiin käyttäen Cell Counting Kit-8. MIR-126 jäljittelevät osoitti annoksesta riippuvaa vaikutusta solun uudiskasvun estämiseksi, transfektion jälkeen 48 tuntia. (*

P

0,05, verrattuna NC matkivat). Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta.